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免疫調(diào)節(jié)性寡糖的制作方法

文檔序號(hào):1092964閱讀:651來(lái)源:國(guó)知局
專利名稱:免疫調(diào)節(jié)性寡糖的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及治療和/或預(yù)防免疫疾病的方法,所述方法包括給予寡糖。
背景技術(shù)
免疫系統(tǒng)具有不同的與抗原反應(yīng)的可能方式。對(duì)于免疫反應(yīng)類型的決定性步驟是不同T細(xì)胞亞群的刺激。所謂的Th1細(xì)胞主要產(chǎn)生刺激細(xì)胞免疫反應(yīng)的細(xì)胞因子(IFN-γ、IL-12、IL-2)。相反,Th2細(xì)胞主要產(chǎn)生IL-4、IL-5和IL-10。這些細(xì)胞因子增強(qiáng)IgE介導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)和炎癥,并認(rèn)為其也參與嗜酸性粒細(xì)胞(即接受伊紅染色的白細(xì)胞)的募集、增殖、分化、維持和存活,這能導(dǎo)致嗜酸性粒細(xì)胞增多。嗜酸性粒細(xì)胞增多是許多Th2介導(dǎo)的疾病例如哮喘、變態(tài)反應(yīng)和特應(yīng)性皮炎的標(biāo)志。Th1和Th2相關(guān)細(xì)胞因子起拮抗作用,在正常生理情況下Th1/Th2反應(yīng)處于良好控制的平衡中。Th1和Th2反應(yīng)都不占優(yōu)勢(shì)。如果失衡,Th1或Th2免疫反應(yīng)之一占主導(dǎo)則在一些病理狀態(tài)中起作用或者是造成這些病理狀態(tài)的原因。
過(guò)度的Th1免疫反應(yīng)最終可能導(dǎo)致自身免疫,個(gè)體自身物質(zhì)的分解,如胰島素依賴型糖尿病、多發(fā)性硬化病、克隆氏病、尋常天皰瘡、自身免疫性血小板減少性紫癜、自身免疫性溶血性貧血。
過(guò)度的Th2反應(yīng)導(dǎo)致對(duì)不應(yīng)該導(dǎo)致任何免疫反應(yīng)的外來(lái)成分的極度敏感,例如變態(tài)反應(yīng)及相關(guān)疾病如特應(yīng)性皮炎、哮喘、職業(yè)性哮喘、食物過(guò)敏(例如牛奶過(guò)敏、蘋果過(guò)敏、花生和其它堅(jiān)果過(guò)敏、羽扇豆過(guò)敏)、過(guò)敏性鼻炎(例如花粉過(guò)敏)、塵螨過(guò)敏和其它形式的超敏反應(yīng)如全身性變態(tài)反應(yīng)和急性蕁麻疹。
已發(fā)現(xiàn)在任何類型的應(yīng)激情況下均有Th2反應(yīng)增加和/或Th1反應(yīng)減少的相對(duì)改變,因此其導(dǎo)致了向Th2反應(yīng)的偏移。這些相對(duì)改變例如在免疫衰老、癌癥患者、慢性感染、運(yùn)動(dòng)過(guò)度、社會(huì)沖突或高工作負(fù)荷、接觸毒性成分或輻射和代謝性應(yīng)激導(dǎo)致的營(yíng)養(yǎng)不良、惡病質(zhì)或食欲缺乏引起的營(yíng)養(yǎng)不良中觀察到。(Janeway(2001)Immunobiology 5thedition,Garland publishing ISBN 0-8153-3642-x;Roitt等(2001)Immunology 6thedition,Harcourt publishing limited,ISBN-0-7234-31892)。
雙歧(Bifidogenic)作用被認(rèn)為是例如減少和/或預(yù)防細(xì)菌感染的原因。已知寡糖能顯示雙歧作用。
已描述酸性寡糖具有有利的作用。WO 02/42484描述了酯化果膠水解產(chǎn)物用于治療感染和/或預(yù)防有害物質(zhì)與真核細(xì)胞的粘附。DE4223613描述了通過(guò)厭氧發(fā)酵使用例如果膠酶從果膠樣物質(zhì)中制備不飽和糖醛酸苷(uronide)的方法。該制備可用于重金屬中毒的醫(yī)學(xué)治療。
酸性和中性寡糖的組合物也已被描述。EP 1105002描述了包含反式半乳寡糖、菊糖和半乳糖醛酸寡糖的益生元(prebiotic)組合物。US 6576251描述了用于預(yù)防與生物體粘附有關(guān)的癥狀例如流行性感冒的唾液酸寡糖(二唾液酸乳-N-四糖(disialolacto-N-tetraose))和半乳寡糖的組合。WO 01/60378描述了用于防止病原體與上皮表面粘附的不飽和果膠水解產(chǎn)物與中性寡糖的混合物。
已知包含脂類、蛋白質(zhì)、糖類、維生素和選自含有半乳糖的二糖或多糖及其衍生物、含有N-乙酰神經(jīng)氨酸的糖類及其衍生物中至少一種的嬰兒制劑(EP 1332759)。

發(fā)明內(nèi)容
至今,認(rèn)為給予(酸性)寡糖通過(guò)刺激雙歧菌群和防止病原體與上皮組織的粘附而提供有利的作用。
本發(fā)明的發(fā)明人現(xiàn)已令人驚奇地發(fā)現(xiàn),免疫系統(tǒng)功能的全身性標(biāo)記物受給予(酸性)寡糖的影響。該發(fā)現(xiàn)開辟了寡糖應(yīng)用的新領(lǐng)域,尤其是用于至多能通過(guò)免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)來(lái)治療的疾病?!罢{(diào)節(jié)(modulation或modulating)”是指特定的特性、質(zhì)量、活性、物質(zhì)或反應(yīng)的增加或降低。換言之,令人驚奇地發(fā)現(xiàn)酸性寡糖和中性寡糖能夠刺激全身性免疫反應(yīng)。
本發(fā)明的發(fā)明人還令人驚奇地發(fā)現(xiàn),不同的寡糖對(duì)免疫系統(tǒng)有不同的刺激作用。已發(fā)現(xiàn)酸性寡糖的給予(相對(duì)地)刺激Th1反應(yīng)并降低Th2細(xì)胞因子的釋放(例如IL-10、IL-4和IL-5)。還發(fā)現(xiàn)酸性寡糖和中性寡糖的組合給予協(xié)同刺激免疫系統(tǒng),尤其是通過(guò)降低Th2反應(yīng)和增加Th1反應(yīng)來(lái)協(xié)同刺激免疫系統(tǒng)。
在本發(fā)明的另一方面,發(fā)現(xiàn)寡糖可有利地用于恢復(fù)Th1/Th2反應(yīng)的失衡,并用于治療和預(yù)防與Th1/Th2失衡相關(guān)的病癥。
尤其是,令人驚奇地發(fā)現(xiàn)任選與中性寡糖組合的酸性寡糖的給予能夠恢復(fù)Th1/Th2失衡和/或維持有利的Th1/Th2平衡。還發(fā)現(xiàn)優(yōu)選與中性寡糖組合的酸性寡糖能夠刺激Th1反應(yīng)。本發(fā)明的發(fā)明人還認(rèn)為,酸性和中性寡糖的給予刺激Th3,即增強(qiáng)調(diào)控性T細(xì)胞活性。認(rèn)為刺激Th1反應(yīng)部分地通過(guò)抑制Th2反應(yīng)實(shí)現(xiàn)。
因此,本發(fā)明提供用于如下的方法-調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng);-刺激免疫系統(tǒng)的發(fā)育,尤其是在年齡為0-1歲的人中;-增強(qiáng)全身性免疫反應(yīng);-治療和/或預(yù)防Th1/Th2失衡;和/或-治療和/或預(yù)防至多能通過(guò)免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)治療的疾病;其中所述方法包括給予酸性寡糖,優(yōu)選酸性和中性寡糖,更優(yōu)選酸性寡糖和兩種在化學(xué)上不同的中性寡糖。
換言之,因此可以說(shuō),酸性寡糖對(duì)炎癥細(xì)胞因子(Th1反應(yīng))具有有益作用。另外,酸性寡糖和中性寡糖的組合對(duì)炎癥細(xì)胞因子(Th2反應(yīng))具有有益作用。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明涉及治療和/或預(yù)防哺乳動(dòng)物中免疫系統(tǒng)相關(guān)病癥的方法,所述方法包括給予所述哺乳動(dòng)物包含治療有效量的酸性寡糖和中性寡糖的組合物,即酸性寡糖和中性寡糖在生產(chǎn)組合物中的用途,所述組合物用于治療和/或預(yù)防哺乳動(dòng)物中免疫系統(tǒng)相關(guān)病癥。
另一方面,本發(fā)明涉及酸性寡糖和中性寡糖在生產(chǎn)用于增強(qiáng)哺乳動(dòng)物中免疫反應(yīng)的組合物中的用途和/或調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的方法中的用途。
另一方面,本發(fā)明涉及包含5-50en%脂類、10-60en%蛋白質(zhì)、15至90en%碳水化合物、酸性寡糖和中性寡糖并優(yōu)選熱量密度為0.5-2kcal/ml的食物組合物,其中所述酸性寡糖包含至少一個(gè)末端糖醛酸單元;并且所述中性寡糖選自纖維二糖、纖維糊精、B-環(huán)糊精、不消化的糊精、龍膽寡糖、葡寡糖、異麥芽寡糖、異麥芽糖、異麥芽三糖(isomaltriose)、潘糖、明串珠菌二糖、帕拉金糖(palatinose)、theanderose、D-塔格糖、D-來(lái)蘇-己酮糖、乳蔗糖、α-半乳寡糖、β-半乳寡糖、反式半乳寡糖、乳果糖、4′-半乳糖基乳糖(4′-galatosyllactose)、合成的半乳寡糖、左聚糖型果聚糖、菊糖型果聚糖、1f-β-呋喃果糖基霉菌赤蘚醛糖(1f-β-fructofuranosylnystose)、木寡糖(xylooligosaccharide)、lafinose、乳蔗糖和阿拉伯寡糖(arabinooligosaccharide)。
另一方面,本發(fā)明涉及治療和/或預(yù)防免疫系統(tǒng)相關(guān)病癥的方法,所述病癥選自自身免疫性病癥、遺傳或條件誘導(dǎo)的免疫缺陷、接種支持(support for vaccination)、1型變態(tài)反應(yīng)、2型變態(tài)反應(yīng)和3型變態(tài)反應(yīng),所述方法包括給予所述哺乳動(dòng)物包含治療有效量的酸性寡糖的組合物。
一些認(rèn)為相當(dāng)大部分地由Th2免疫反應(yīng)、IL-4/IL-5細(xì)胞因子誘導(dǎo)和/或嗜酸性粒細(xì)胞增多(以及對(duì)根據(jù)本發(fā)明的治療的相應(yīng)反應(yīng))引起/介導(dǎo)的疾病包括哮喘、過(guò)敏性鼻炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、Ommen氏綜合征(嗜酸性粒細(xì)胞增多綜合征)。這些是非病毒和非腫瘤性Th2介導(dǎo)的疾病的實(shí)例,它們用本發(fā)明的方法有效治療顯然不可能已被預(yù)見。特別優(yōu)選的本發(fā)明的方法用于治療與嗜酸性粒細(xì)胞增多相關(guān)的疾病,例如哮喘和過(guò)敏性鼻炎。
對(duì)特定病癥的治療有效量可由本領(lǐng)域技術(shù)人員經(jīng)劑量探索試驗(yàn)(dose-finding study)常規(guī)地確定。
免疫系統(tǒng)相關(guān)病癥現(xiàn)已發(fā)現(xiàn),給予優(yōu)選與中性寡糖組合的酸性寡糖給個(gè)體提供有益的全身作用。全身是指作為血液和/或淋巴(全身)循環(huán)的結(jié)果來(lái)影響整個(gè)機(jī)體。
一方面,本發(fā)明提供調(diào)節(jié)和/或增強(qiáng)免疫系統(tǒng)的方法,所述方法包括給予酸性和中性寡糖。該方法可合適地用于平衡Th1/Th2反應(yīng)的方法,尤其是通過(guò)刺激Th1反應(yīng)而平衡Th1/Th2反應(yīng)的方法。因此,包含本發(fā)明寡糖的組合物是本發(fā)明的一部分,認(rèn)為所述寡糖例如刺激免疫系統(tǒng)成熟、通過(guò)增強(qiáng)免疫系統(tǒng)來(lái)增強(qiáng)對(duì)病原體的抵抗力和/或支持免疫系統(tǒng)。
另一方面,本發(fā)明提供治療和/或預(yù)防免疫系統(tǒng)相關(guān)病癥的方法,所述方法包括給予所述哺乳動(dòng)物包含治療有效量的酸性寡糖的組合物。
另一方面,本發(fā)明提供增強(qiáng)哺乳動(dòng)物中免疫反應(yīng)的方法,所述方法包括給予哺乳動(dòng)物包含任選與中性寡糖組合的酸性寡糖的組合物。
尤其令人驚奇地,腸道給予本發(fā)明寡糖提供有益的全身作用。因此,本發(fā)明的方法優(yōu)選包括腸道給予,更優(yōu)選口服給予酸性寡糖或酸性和中性寡糖。
在另外的實(shí)施方案中,本發(fā)明的方法涉及將寡糖給予嬰兒,優(yōu)選年齡0-6歲的人,優(yōu)選年齡0至1歲的人。由于該群體中有特定的Th1/Th2比率失衡(在許多病例中Th2占優(yōu)勢(shì)),所以本發(fā)明的方法可適用于恢復(fù)該群體中的失衡。還認(rèn)為給予優(yōu)選與中性寡糖組合的酸性寡糖促進(jìn)新生兒(胃)腸道成熟,使得本發(fā)明的方法和組合物尤其適于給予早產(chǎn)嬰兒。在優(yōu)選實(shí)施方案中,本發(fā)明的方法涉及刺激0-6歲,優(yōu)選0至1歲的人個(gè)體中免疫系統(tǒng)的成熟。
下面描述可合適地用于本發(fā)明方法的組合物的其它優(yōu)選組分特征,例如蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂類、重量克分子滲透濃度、粘度和熱量密度。
免疫系統(tǒng)相關(guān)病癥優(yōu)選選自自身免疫性病癥、遺傳或條件誘導(dǎo)的免疫缺陷、接種支持、1型變態(tài)反應(yīng)、2型變態(tài)反應(yīng)、3型變態(tài)反應(yīng)和4型變態(tài)反應(yīng)。
可合適地治療的自身免疫性病癥包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、慢性腎小球腎炎、結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎、鏈球菌感染后(poststreotococcal)急性腎小球腎炎、格雷夫斯病、重癥肌無(wú)力、胰島素抵抗性糖尿病、橋本氏甲狀腺炎、溶血性貧血、惡性貧血、肺出血腎炎綜合征、尋常天皰瘡、自身免疫性血小板減少性紫癜、急性風(fēng)濕熱、混合型原發(fā)性冷球蛋白血癥、自身免疫性惡性(preniciopus)貧血、自身免疫性阿狄森氏病、白癜風(fēng)、低血糖癥、新生兒狼瘡疹、IDDM(胰島素依賴型糖尿病)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化病、銀屑病、硬皮病、克隆氏病、IBD(炎癥性腸病)、神經(jīng)病變,優(yōu)選胰島素抵抗性糖尿病。
可合適地治療的遺傳或條件誘導(dǎo)的免疫缺陷病癥包括免疫衰老、孤獨(dú)癥、慢性疾病例如癌癥、COPD(慢性阻塞性肺病)、AIDS、關(guān)節(jié)炎、糖尿病、食欲缺乏、惡病質(zhì)、吞咽困難、腎衰竭、放射引起的營(yíng)養(yǎng)不良、患慢性潰瘍和應(yīng)激尤其是社會(huì)壓力后應(yīng)激的患者、慢性感染或吸煙、空氣污染、放射、化學(xué)治療。
由于在患有獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)和/或人免疫缺陷病毒(HIV)感染的個(gè)體中刺激免疫系統(tǒng)尤其重要,所以在優(yōu)選實(shí)施方案中,本發(fā)明特別提供治療和/或預(yù)防AIDS和/或HIV感染的方法,所述方法包括腸道給予本發(fā)明的酸性寡糖,優(yōu)選與本發(fā)明的中性寡糖組合。本發(fā)明還提供治療和/或預(yù)防患有AIDS和/或HIV感染的個(gè)體中的腹瀉的方法,所述方法包括腸道給予本發(fā)明的酸性寡糖,優(yōu)選與本發(fā)明的中性寡糖組合。本發(fā)明的(酸性)寡糖優(yōu)選在營(yíng)養(yǎng)基質(zhì),即包含脂類、蛋白質(zhì)和碳水化合物的組合物中提供給患有AIDS和/或HIV感染的個(gè)體。
可合適地治療的變態(tài)反應(yīng)包括1型變態(tài)反應(yīng)遺傳性過(guò)敏癥、哮喘、花粉癥、濕疹、食物過(guò)敏、藥物過(guò)敏;2型變態(tài)反應(yīng)新生兒溶血癥、自身免疫性溶血性貧血、強(qiáng)直性脊柱炎、急性前葡萄膜炎;3型變態(tài)反應(yīng)阿圖斯反應(yīng)、血清??;4型變態(tài)反應(yīng)遲發(fā)型超敏反應(yīng)、接觸性過(guò)敏、乳糜瀉。
還發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的方法可合適地用于支持接種處理,例如增強(qiáng)接種處理的效果。這些包括在術(shù)語(yǔ)免疫系統(tǒng)相關(guān)病癥中。在接種前、接種時(shí)和/或接種后優(yōu)選(經(jīng)口)給予優(yōu)選與中性寡糖組合的酸性寡糖。尤其是白喉-破傷風(fēng)-百日咳(diptheria-tetanu-spertussis)、脊髓灰質(zhì)炎疫苗、麻疹/腮腺炎/風(fēng)疹、肺炎球菌綴合物、嗜血桿菌B綴合物、乙型肝炎、甲型肝炎、水痘、流感的接種效果可合適地被增強(qiáng)。
優(yōu)選地,本發(fā)明的方法涉及治療和/或預(yù)防營(yíng)養(yǎng)不良、遺傳性過(guò)敏癥、哮喘或COPD。
本發(fā)明還涉及酸性寡糖在生產(chǎn)組合物中的用途,所述組合物用于治療和/或預(yù)防選自自身免疫性病癥、遺傳或條件誘導(dǎo)的免疫缺陷(優(yōu)選不是AIDS)、接種支持、1型變態(tài)反應(yīng)、2型變態(tài)反應(yīng)和3型變態(tài)反應(yīng)的免疫系統(tǒng)相關(guān)病癥。
酸性寡糖術(shù)語(yǔ)酸性寡糖是指包含至少一個(gè)酸性基團(tuán)的寡糖,該酸性基團(tuán)選自N-乙酰神經(jīng)氨酸、N-乙醇酰神經(jīng)氨酸、游離或酯化的羧酸、硫酸基團(tuán)和磷酸基團(tuán)。該酸性寡糖優(yōu)選是聚己糖。優(yōu)選地,至少一個(gè)前述的酸性基團(tuán)位于酸性寡糖的末端己糖。優(yōu)選地,酸性寡糖具有如

圖1所示的結(jié)構(gòu),其中末端己糖(左側(cè))優(yōu)選包含雙鍵。優(yōu)選地,酸性寡糖含有在末端己糖單元的羧酸,其中所述羧酸基團(tuán)可為游離的或酯化的。WO 01/60378和/或WO 02/42484中提供了制備可合適地用于本發(fā)明的方法和組合物中的酯化果膠水解產(chǎn)物的方法,這兩篇文獻(xiàn)在此引入本文作為參考。
除了末端己糖單元外,己糖單元優(yōu)選是糖醛酸單元,更優(yōu)選是半乳糖醛酸單元。在這些單元上的羧酸基團(tuán)可以是游離的或(部分)酯化的,優(yōu)選至少10%是甲基化的(參見下文)。
圖1聚合的酸性寡糖 其中R優(yōu)選選自氫、羥基或酸性基團(tuán),優(yōu)選羥基;且選自R2、R3、R4和R5中的至少一個(gè)表示N-乙酰神經(jīng)氨酸、N-乙醇酰神經(jīng)氨酸、游離或酯化的羧酸、硫酸基團(tuán)和磷酸基團(tuán),而R2、R3、R4和R5中其余的表示羥基和/或氫。優(yōu)選選自R2、R3、R4和R5中的一個(gè)表示N-乙酰神經(jīng)氨酸、N-乙醇酰神經(jīng)氨酸、游離或酯化的羧酸、硫酸基團(tuán)和磷酸基團(tuán),其余的表示羥基和/或氫。更優(yōu)選地,選自R2、R3、R4和R5中的一個(gè)表示游離或酯化的羧酸,而R2、R3、R4和R5中其余的表示羥基和/或氫;且n是整數(shù),指己糖單元的數(shù)目(參見下文的聚合度),其可以是任意己糖單元。合適地,n是1-5000的整數(shù)。
優(yōu)選地,己糖單元是糖醛酸單元。
最優(yōu)選地,R1、R2和R3表示羥基,R4表示氫,R5表示羧酸,n是1-250,優(yōu)選1-10的任意整數(shù),并且己糖單元是半乳糖醛酸。
在本發(fā)明方法中使用的優(yōu)選酸性寡糖的檢測(cè)、測(cè)量和分析已在本發(fā)明申請(qǐng)人的涉及酸性寡糖的在先專利申請(qǐng)即WO 0/160378中給出,該文獻(xiàn)在此引入本文作為參考。
優(yōu)選地,酸性寡糖具有一個(gè)末端糖醛酸單元,優(yōu)選兩個(gè)末端糖醛酸單元,其可以是游離的或酯化的。優(yōu)選地,末端糖醛酸單元選自半乳糖醛酸、葡糖醛酸、古洛糖醛酸(guluronic acid)、艾杜糖醛酸、甘露糖醛酸、核酮糖醛酸(riburonic acid)和alturonic acid。這些單元可以是游離的或酯化的。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中,末端己糖單元具有雙鍵,其優(yōu)選位于末端己糖單元的C4和C5位置之間。優(yōu)選地,末端己糖單元之一包含雙鍵。末端己糖(例如糖醛酸)優(yōu)選具有圖2的結(jié)構(gòu)。
圖2優(yōu)選的末端己糖酸基團(tuán)
其中R優(yōu)選選自氫、羥基或酸性基團(tuán),優(yōu)選羥基(見上文);且選自R2、R3、R4和R5中的至少一個(gè)表示N-乙酰神經(jīng)氨酸、N-乙醇酰神經(jīng)氨酸、游離或酯化的羧酸、硫酸基團(tuán)和磷酸基團(tuán),而R2、R3、R4和R5中其余的表示羥基和/或氫。優(yōu)選地,選自R2、R3、R4和R5中的一個(gè)表示N-乙酰神經(jīng)氨酸、N-乙醇酰神經(jīng)氨酸、游離或酯化的羧酸、硫酸基團(tuán)和磷酸基團(tuán),而R2、R3、R4和R5中其余的表示羥基和/或氫。更優(yōu)選地,選自R2、R3、R4和R5中的一個(gè)表示游離或酯化的羧酸,而R2、R3、R4和R5中其余的表示羥基和/或氫;且n是整數(shù),指己糖單元的數(shù)目(參見下文的聚合度),其可以是任意己糖單元。合適地,n是1-5000的整數(shù),表示己糖單元的數(shù)目,所述己糖單元優(yōu)選是糖醛酸,更優(yōu)選是半乳糖醛酸單元。在這些單元上的羧酸基團(tuán)可以是游離的或(部分)酯化的,優(yōu)選至少部分甲基化的。更優(yōu)選地,R2和R3表示羥基,R4表示氫,而R5表示游離或酯化的羧酸。
在另外的實(shí)施方案中,使用酸性寡糖的混合物,其具有不同的DP和/或包含不飽和和飽和的末端己糖單元。酸性寡糖的末端己糖單元優(yōu)選至少5%,更優(yōu)選至少10%,更優(yōu)選至少25%是不飽和的己糖單元(參見例如圖2)。由于每個(gè)單個(gè)的酸性寡糖優(yōu)選僅包含一個(gè)不飽和的末端己糖單元,所以優(yōu)選不超過(guò)50%的末端己糖單元是不飽和的己糖單元(即包含雙鍵)。
酸性寡糖的混合物優(yōu)選含有以己糖單元總量計(jì)2-50%的不飽和己糖單元,優(yōu)選10至40%。
在本發(fā)明方法中使用的酸性寡糖的聚合度(DP)為1至5000,優(yōu)選為1至1000,更優(yōu)選為2至250,更優(yōu)選為2至50,最優(yōu)選2至10。如果使用具有不同聚合度的酸性寡糖的混合物,該酸性寡糖混合物的平均DP優(yōu)選為2至1000,更優(yōu)選為3至250,更優(yōu)選為3至50。參見圖1,其中“n”和末端單元的總和(即n+1)表示聚合度。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn),如果酸性寡糖以液體形式給予,較低DP的寡糖改善口味,并導(dǎo)致粘度下降的產(chǎn)物。酸性寡糖可以是同質(zhì)或異質(zhì)的碳水化合物。
本發(fā)明中使用的酸性寡糖優(yōu)選由果膠、果膠酸鹽、藻酸鹽、軟骨素、透明質(zhì)酸、肝素、乙酰肝素、細(xì)菌糖類(bacterial carbohydrate)、唾液酸聚糖(sialoglycan)、巖藻聚糖、巖藻寡糖或角叉菜膠制備,優(yōu)選由果膠或藻酸制備。酸性寡糖可通過(guò)WO 01/60378中描述的方法制備,該文獻(xiàn)在此引入作為參考。
藻酸鹽是包含β-(1→4)-連接D-甘露糖醛酸和α-(1→4)-連接L-古洛糖醛酸殘基的線性非支鏈聚合物,其具有寬的平均分子量范圍(100-100000個(gè)殘基)。藻酸鹽的合適來(lái)源包括海藻和細(xì)菌性藻酸鹽。
果膠分為兩大類高甲氧基化果膠,其特征在于甲氧基化度超過(guò)50%,以及低甲氧基化果膠,其特征在于甲氧基化度低于50%。如本文使用的“甲氧基化度”(也稱作DE或“酯化度”)用于指聚半乳糖醛酸鏈中包含的游離羧酸基團(tuán)被酯化(例如通過(guò)甲基化)的程度。本發(fā)明的酸性寡糖優(yōu)選由高甲氧基化果膠制備。
酸性寡糖的特征優(yōu)選為甲氧基化度大于20%,優(yōu)選大于50%,更優(yōu)選大于70%。優(yōu)選地,酸性寡糖的甲基化度大于20%,優(yōu)選大于50%,更優(yōu)選大于70%。
酸性寡糖優(yōu)選以每日10mg至100g的量給予,更優(yōu)選每日100mg至50g,更優(yōu)選每日0.5-20g。
中性寡糖本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)中性寡糖是指聚合度為超過(guò)2個(gè)單糖單元的糖類,更優(yōu)選為超過(guò)3個(gè),更優(yōu)選為超過(guò)4個(gè),最優(yōu)選為超過(guò)10個(gè),其通過(guò)人上消化道(小腸和胃)中的酸或消化酶的作用在腸道中不被或僅部分被消化,但通過(guò)人腸道菌群而發(fā)酵,并優(yōu)選不含酸性基團(tuán)。中性寡糖在結(jié)構(gòu)上(化學(xué)上)不同于酸性寡糖。
本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)中性寡糖優(yōu)選指聚合度低于60個(gè)單糖單元的糖類,優(yōu)選低于40個(gè),更優(yōu)選低于20個(gè),最優(yōu)選低于10個(gè)。
術(shù)語(yǔ)單糖單元是指具有閉環(huán)結(jié)構(gòu)的單元,優(yōu)選己糖,例如吡喃糖或呋喃糖形式。
中性寡糖優(yōu)選包含以其中所包含的單糖單元的總數(shù)計(jì)至少90%,更優(yōu)選至少95%的選自如下的單糖單元甘露糖、阿拉伯糖、果糖、巖藻糖、鼠李糖、半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、核糖、葡萄糖、木糖及其衍生物。
合適的中性寡糖優(yōu)選通過(guò)腸道菌群發(fā)酵。優(yōu)選地,寡糖選自纖維二糖(4-O-β-D-吡喃葡糖基-D-葡萄糖)、纖維糊精((4-O-β-D-吡喃葡糖基)n-D-葡萄糖)、B-環(huán)糊精(α-1-4-連接D-葡萄糖環(huán)狀分子;α-環(huán)糊精六聚物、β-環(huán)糊精七聚物和γ-環(huán)糊精八聚物)、不消化的糊精、龍膽寡糖(β-1-6連接葡萄糖殘基,一些是1-4連接的混合物)、葡糖寡糖(α-D-葡萄糖的混合物)、異麥芽寡糖(線性α-1-6-連接葡萄糖殘基,具有一些1-4連接)、異麥芽糖(6-O-α-D-吡喃葡糖基-D-葡萄糖)、異麥芽三糖(6-O-α-D-吡喃葡糖基-(1-6)-α-D-吡喃葡糖基-D-葡萄糖)、潘糖(6-O-α-D-吡喃葡糖基-(1-6)-α-D-吡喃葡糖基-(1-4)-D-葡萄糖)、明串珠菌二糖(5-O-α-D-吡喃葡糖基-D-吡喃果糖苷)、帕拉金糖或異麥酮糖(isomaltulose)(6-O-α-D-吡喃葡糖基-D-果糖)、theanderose(O-α-D-吡喃葡糖基-(1-6)-O-α-D-吡喃葡萄糖-(1-2)-B-D-呋喃果糖苷)、D-塔格糖、D-來(lái)蘇-己酮糖、乳蔗糖(O-β-D-吡喃半乳糖基-(1-4)-O-α-D-吡喃葡糖基-(1-2)-β-D-呋喃果糖苷)、包括棉子糖、木蘇糖和其它大豆寡糖的α-半乳寡糖(O-α-D-吡喃半乳糖基-(1-6)-α-D-吡喃葡糖基-β-D-呋喃果糖苷)、β-半乳寡糖或反式半乳寡糖(β-D-吡喃半乳糖基-(1-6)-[β-D-吡喃葡糖基]n-(1-4)α-D葡萄糖)、乳果糖(4-O-β-吡喃半乳糖基-D-果糖)、4’-半乳糖基乳糖(O-D-吡喃半乳糖基-(1-4)-O-β-吡喃葡糖基-(1-4)-D-吡喃葡萄糖)、合成的半乳寡糖(新半乳二糖、異半乳二糖、galsucrose、異乳糖I、II和III)、左聚糖型果聚糖(β-D-(2→6)-呋喃果糖基)nα-D-吡喃葡萄苷)、菊糖型果聚糖(β-D-(2→1)-呋喃果糖基)nα-D-吡喃葡萄苷)、1f-β-呋喃果糖基霉菌赤蘚醛糖(β-D-(2→1)-呋喃型果糖基)nB-D-呋喃果糖苷)、木寡糖(B-D-(1→4)-木糖)n)、lafinose、乳蔗糖和阿拉伯寡糖。
根據(jù)進(jìn)一步的優(yōu)選實(shí)施方案,中性寡糖選自果聚糖、果寡糖(fructooligosaccharide)、不消化的糊精、半乳寡糖(包括反式半乳寡糖)、木寡糖、阿拉伯寡糖、葡寡糖、甘露寡糖、巖藻寡糖(fucooligosaccharide)及其混合物。最優(yōu)選的中性寡糖選自果寡糖、半乳寡糖和反式半乳寡糖。
合適的寡糖及它們的生產(chǎn)方法在Laere K.J.M.(Laere,K.J.M.,Degradation of structurally different non-digestible oligosaccharides byintestinal bacteriaglycosylhydrolases of Bi.adolescentis.PhD-thesis(2000),Wageningen Agricultural University,Wageningen,TheNetherlands)中有進(jìn)一步的描述,其全部?jī)?nèi)容在此引入作為參考。
例如,反式半乳寡糖(TOS)以商標(biāo)VivinalTM(Burculo DomoIngredients,Netherlands)出售。
不消化的糊精,其可通過(guò)玉米淀粉的熱解生產(chǎn),包含如在天然淀粉中存在的α(1→4)和α(1→6)糖苷鍵,并包含1→2和1→3連接和左旋葡聚糖。由于這些結(jié)構(gòu)特征,不消化的糊精含有形成良好的并被人消化酶部分水解的支鏈顆粒。
許多其它不消化的寡糖的商業(yè)來(lái)源是容易得到并為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。例如,反式半乳寡糖可從Yakult Honsha Co.Tokyo,Japan得到。大豆寡糖可從由Ajinomoto U.S.A.Inc.,Teaneck,N.J.配銷的Calpis Corporation獲得。
在另外的優(yōu)選實(shí)施方案中,本發(fā)明的方法包括給予兩種在化學(xué)上不同的寡糖?,F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)酸性寡糖與兩種在化學(xué)上不同的中性寡糖組合給予提供最佳的作用。優(yōu)選地,本發(fā)明的方法包括給予下述物質(zhì)
-酸性寡糖(參見上文);-半乳糖基中性寡糖(>50%的單糖單元是半乳糖),優(yōu)選選自半乳寡糖和反式半乳寡糖;和-果糖和/或葡糖基中性寡糖(>50%的單糖單元是果糖和/或葡萄糖,優(yōu)選果糖),優(yōu)選菊糖、果聚糖和/或果寡糖,最優(yōu)選長(zhǎng)鏈果寡糖(平均DP為10至60)。
該組合物尤其適合給予0至1歲的嬰兒。
在另外的實(shí)施方案中,本發(fā)明的方法包括給予兩個(gè)在結(jié)構(gòu)上(在化學(xué)上)不同的寡糖,其中兩個(gè)在結(jié)構(gòu)上(在化學(xué)上)不同的寡糖的差別在于它們的糖苷連接類型。
優(yōu)選地,所述方法包括給予兩種在化學(xué)上不同的中性寡糖,所述在化學(xué)上不同的寡糖具有不同的DP和/或不同的平均DP,優(yōu)選不同的平均DP。在另一個(gè)實(shí)施方案中,給予具有不同平均DP的在化學(xué)上不同的中性寡糖提供更優(yōu)的免疫調(diào)節(jié)作用。優(yōu)選地,半乳糖基中性寡糖的平均DP為2至10,果糖和/或葡糖基中性寡糖的平均DP為10至60。
中性寡糖優(yōu)選以每日10mg至100g的量給予,優(yōu)選每日100mg至50g,更優(yōu)選每日0.5至20g。
酸性和中性寡糖的協(xié)同作用已發(fā)現(xiàn)酸性和中性寡糖具有協(xié)同免疫刺激作用。因此,優(yōu)選地,本發(fā)明的方法包括給予治療有效量的酸性寡糖和中性寡糖。
酸性和中性寡糖的混合物優(yōu)選以每日10mg至100g的量給予,優(yōu)選每日100mg至25g,更優(yōu)選每日0.5至20g。
酸性寡糖和中性寡糖的優(yōu)選組合包含圖2的酸性寡糖,其中R表示氫、羥基或酸性基團(tuán),優(yōu)選羥基;且選自R2、R3、R4和R5中的一個(gè)表示游離或酯化的羧酸,而R2、R3、R4和R5中其余的表示羥基和/或氫;和半乳寡糖和/或反式半乳寡糖。
優(yōu)選地,酸性和中性寡糖以重量比0.01∶1至1∶0.01給予,優(yōu)選以重量比0.1∶1至1∶0.1給予。
LCPUFA在優(yōu)選的實(shí)施方案中,本發(fā)明的方法還包括給予長(zhǎng)鏈多不飽和酸(LCPUFA)。由于認(rèn)為寡糖與LCPUFA的組合通過(guò)不同于酸性寡糖或中性寡糖的機(jī)制作用于免疫系統(tǒng),所以認(rèn)為寡糖與LCPUFA的組合協(xié)同起作用。本發(fā)明的方法優(yōu)選包括每日給予0.1至100g的LCPUFA,更優(yōu)選每日給予1至25g的LCPUFA。
食物發(fā)現(xiàn)酸性寡糖尤其是酸性和中性寡糖的協(xié)同混合物可有利地應(yīng)用于食物,例如嬰兒食物和臨床食物。這些食物優(yōu)選包含脂類、蛋白質(zhì)和碳水化合物,并且優(yōu)選以液體形式給予。在本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)“液體食物”包括干食物(例如粉末狀食物),其附有關(guān)于混合所述干食物混合物與合適的液體(例如水)的說(shuō)明書。
因此,本發(fā)明還涉及營(yíng)養(yǎng)組合物,所述營(yíng)養(yǎng)組合物優(yōu)選包含5-50en%脂類、10-60en%蛋白質(zhì)、15-90en%碳水化合物以及本發(fā)明的優(yōu)選與中性寡糖組合的酸性寡糖。優(yōu)選地,本發(fā)明的營(yíng)養(yǎng)組合物優(yōu)選包含10至30en%脂類、15至40en%蛋白質(zhì)和25至75en%碳水化合物(en%是能量百分?jǐn)?shù)的縮寫,表示各個(gè)組分占制劑總熱量的相對(duì)量)。
這些食物優(yōu)選是液體形式并具有有限的粘度。發(fā)現(xiàn)包含任選與中性寡糖組合的酸性寡糖的食物提供足夠低粘度的液體營(yíng)養(yǎng)物,這使得它可以作為例如可通過(guò)管子或吸管喂食,同時(shí)保持低粘度的液體嬰兒食物和臨床食物應(yīng)用。在優(yōu)選的實(shí)施方案中,本發(fā)明組合物的粘度在20℃和剪切速率為100s-1下低于600mPas,優(yōu)選低于250mPas,更優(yōu)選低于50mPas,最優(yōu)選低于25mPas。無(wú)論在本文中何時(shí)使用到術(shù)語(yǔ)粘度,其指根據(jù)下面的方法測(cè)定的物理參數(shù)粘度可使用Carri-Med CSL流變儀測(cè)定。所使用的幾何體為圓錐形(6cm 2deg丙烯酸圓錐體),在板與幾何體之間的間距設(shè)置為55μm。使用的線性連續(xù)斜線剪切速率為20秒內(nèi)從0至150s-1。
優(yōu)選使用植物脂類。植物脂優(yōu)選至少一種選自大豆油、棕櫚油、椰子油、紅花油、向日葵油、玉米油、低芥酸菜子油(canola oil)和卵磷脂。如果需要,也可加入動(dòng)物脂例如乳脂。
在營(yíng)養(yǎng)制劑中使用的蛋白質(zhì)優(yōu)選選自非人動(dòng)物蛋白質(zhì)(例如乳蛋白質(zhì)、肉蛋白質(zhì)和卵蛋白質(zhì))、植物蛋白質(zhì)(例如大豆蛋白質(zhì)、小麥蛋白質(zhì)、米蛋白質(zhì)和豌豆蛋白質(zhì))、游離氨基酸及其混合物。尤其優(yōu)選牛乳蛋白質(zhì)例如酪蛋白和乳清蛋白。
可將可消化碳水化合物源加入營(yíng)養(yǎng)制劑中。它優(yōu)選提供該營(yíng)養(yǎng)組合物的約40%至約80%的能量??墒褂萌魏魏线m的碳水化合物(源),例如蔗糖、乳糖、葡萄糖、果糖、玉米糖漿干粉和麥芽糖糊精及其混合物。
本發(fā)明的組合物優(yōu)選基本上不含有活性的雙歧菌(bifinogenicbacteria)。
在接受液體食物的許多嬰兒和患病個(gè)體中,大便不規(guī)則(例如硬便、便量不足、腹瀉)是主要問(wèn)題。發(fā)現(xiàn)通過(guò)給予于液體食物中的本發(fā)明的寡糖可減少大便問(wèn)題,它們的重量克分子滲透濃度為50至500m Osm/kg,更優(yōu)選100至400m Osm/kg。
鑒于以上,液體食物不具有過(guò)多的熱量密度但是仍提供足夠的熱量給個(gè)體也是重要的。因此,液體食物優(yōu)選具有0.1至2.5kcal/ml熱量密度,更優(yōu)選具有0.5至1.5kcal/ml熱量密度。
嬰兒制劑發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的組合物可有利地應(yīng)用于嬰兒制劑。這些嬰兒制劑優(yōu)選包含脂類、蛋白質(zhì)和碳水化合物,并優(yōu)選以液體形式給予。在本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)“液體食物”包括干食物(例如粉末狀食物),其附有關(guān)于混合所述干食物混合物與合適的液體(例如水)的說(shuō)明書。
因此,本發(fā)明還涉及嬰兒制劑,所述嬰兒制劑優(yōu)選包含5至60en%脂類、5至40en%蛋白質(zhì)、15至90en%碳水化合物以及本發(fā)明的寡糖和LC-PUFA的組合。優(yōu)選地,本發(fā)明的嬰兒制劑包含30至60en%脂類、6至15en%蛋白質(zhì)和25至75en%碳水化合物(en%是能量百分?jǐn)?shù)的縮寫,表示各個(gè)組分占制劑總熱量的相對(duì)量)。
優(yōu)選使用植物脂和選自魚油和含ω-3的植物油、藻類油或細(xì)菌油中至少一種的組合。
在營(yíng)養(yǎng)制劑中使用的蛋白質(zhì)優(yōu)選選自非人動(dòng)物蛋白質(zhì)(例如乳蛋白質(zhì)、肉蛋白質(zhì)和卵蛋白質(zhì))、植物蛋白質(zhì)(例如大豆蛋白質(zhì)、小麥蛋白質(zhì)、米蛋白質(zhì)和豌豆蛋白質(zhì))、游離氨基酸及其混合物。尤其優(yōu)選牛乳蛋白質(zhì)例如酪蛋白和乳清蛋白。
可將可消化碳水化合物源加入營(yíng)養(yǎng)制劑中。它優(yōu)選提供該營(yíng)養(yǎng)組合物的約40%至約80%的能量??墒褂萌魏魏线m的碳水化合物(源),例如蔗糖、乳糖、葡萄糖、果糖、玉米糖漿干粉和麥芽糖糊精及其混合物。
根據(jù)特別優(yōu)選的實(shí)施方案,本發(fā)明的嬰兒制劑包含7至12en%蛋白質(zhì)、40至55en%碳水化合物和35至50en%脂肪。由于該組合物尤其適合用于減少嬰兒中的變態(tài)反應(yīng),所以嬰兒制劑中的蛋白質(zhì)優(yōu)選選自水解的乳蛋白質(zhì)(例如水解的酪蛋白或水解的乳清蛋白)、植物蛋白質(zhì)和/或氨基酸。這些蛋白質(zhì)的使用進(jìn)一步減少嬰兒的變態(tài)反應(yīng)。
在接受液體食物的許多嬰兒和患病個(gè)體中,大便不規(guī)則(例如硬便、便量不足、腹瀉)是主要問(wèn)題。發(fā)現(xiàn)通過(guò)給予于液體食物中的本發(fā)明的寡糖可減少大便問(wèn)題,它們的重量克分子滲透濃度為50至500m Osm/kg,更優(yōu)選100至400m Osm/kg。
在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中,本發(fā)明還提供特別適合在本發(fā)明方法中使用的組合物。該組合物與天然人乳在功能和分子結(jié)構(gòu)上具有高的相似性。因此,該組合物尤其適合作為嬰兒制劑。本發(fā)明的組合物包含脂肪、碳水化合物、蛋白質(zhì);且每100ml液體產(chǎn)品含有0.5至1g可溶性不消化的寡糖,優(yōu)選0.7至0.9g/100ml。而且,本發(fā)明的組合物每100ml液體產(chǎn)品包含0.4至0.7g反式半乳寡糖(含有β-連接糖的不消化的[半乳糖]n-葡萄糖;其中n是1至60的整數(shù),即2、3、4、5、6、……、59、60;優(yōu)選n選自2、3、4、5、6、7、8、9或10);和0.01至0.1g的菊糖(含有至少10個(gè)β-連接果糖單元鏈的不消化的多糖碳水化合物);和0.04至0.3g如圖2所示的酸性寡糖。本發(fā)明的液體產(chǎn)品適合于由消費(fèi)者從粉末狀產(chǎn)品制備。本發(fā)明的液體產(chǎn)品優(yōu)選含有這些成分,并具有如本文中所描述的特征,且可有利地在本文所述的方法中使用。
寡糖酸性寡糖優(yōu)選以組合物總干重計(jì)以超過(guò)0.1重量%,優(yōu)選超過(guò)0.2重量%,更優(yōu)選超過(guò)0.5重量%,更優(yōu)選超過(guò)1重量%的量包含在根據(jù)本發(fā)明的組合物中。盡管給予相當(dāng)大量的寡糖一般不會(huì)導(dǎo)致不希望的副作用,不過(guò)本發(fā)明組合物中的寡糖含量?jī)?yōu)選低于20重量%,更優(yōu)選低于10重量%,更優(yōu)選低于5重量%。
中性寡糖以組合物總干重計(jì)以超過(guò)0.1重量%,優(yōu)選超過(guò)0.2重量%,更優(yōu)選超過(guò)0.5重量%,更優(yōu)選超過(guò)1重量%的量包含在根據(jù)本發(fā)明的組合物中。盡管給予相當(dāng)大量的寡糖一般不會(huì)導(dǎo)致不希望的副作用,不過(guò)本發(fā)明組合物中的寡糖含量?jī)?yōu)選低于20重量%,更優(yōu)選低于10重量%,更優(yōu)選低于5重量%。
發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的組合物協(xié)同刺激免疫系統(tǒng)。因此,本發(fā)明的組合物可合適地用于治療和/或預(yù)防感染的方法,所述方法包括口服給予人優(yōu)選嬰兒本發(fā)明的組合物。通過(guò)刺激免疫系統(tǒng)和促進(jìn)健康腸道菌群,本發(fā)明的組合物還具有全身性抗感染作用。因此,優(yōu)選與本發(fā)明的中性寡糖組合的本發(fā)明的酸性寡糖可有利地用于治療和/或預(yù)防腸道感染和/或呼吸道感染。在另外的實(shí)施方案中,所述寡糖以在上文所述的食物基質(zhì)中的形式口服給予。
因?yàn)槊庖呦到y(tǒng)的刺激在患有癌癥的個(gè)體中,尤其是經(jīng)受或已經(jīng)經(jīng)受化療、放療的患者和(如在癌癥晚期通常發(fā)生的)惡病質(zhì)患者中特別重要,因此本發(fā)明提供治療這些個(gè)體的方法,所述方法包括腸道給予本發(fā)明的酸性寡糖,優(yōu)選與本發(fā)明的中性寡糖組合。本發(fā)明的(酸性)寡糖優(yōu)選以營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)即包含脂肪、蛋白質(zhì)和碳水化合物的組合物的形式提供給這些個(gè)體。
實(shí)施例實(shí)施例1實(shí)驗(yàn)建立測(cè)試含有任選與中性寡糖組合的酸性寡糖的飲食對(duì)遲發(fā)型超敏(DTH)反應(yīng)的作用,遲發(fā)型超敏反應(yīng)是Th1免疫反應(yīng)的參數(shù),通過(guò)局部抗原激發(fā)后測(cè)量耳腫脹的增加來(lái)確定。
所用的平均DP為2至10的酸性寡糖(AcO1)通過(guò)WO 02/42484中描述的方法(參見實(shí)施例1)獲得。對(duì)含有以飲食總重計(jì)1重量%、2.5重量%、5重量%和10重量%AcO1的飲食進(jìn)行測(cè)試。含有半乳寡糖(GOS)(Vivinal-GOSTM(Borculo Domo Ingredients,Netherlands)和果寡糖(FOS)(Raftiline HPTM,Orafti,Tienen,Belgium)的中性寡糖混合物以GOS∶FOS的重量比為9∶1使用。對(duì)含有以飲食總重計(jì)1、2.5和5重量%GF的飲食進(jìn)行測(cè)試。用含有以飲食總重計(jì)1重量%GF和1重量%AcO1的飲食測(cè)試酸性和中性寡糖(GF和AcO1)組合的作用。
所有的數(shù)據(jù)表示作相對(duì)于對(duì)照值的百分?jǐn)?shù),即補(bǔ)充寡糖組與接受對(duì)照飲食(不含寡糖)組相比的相對(duì)值。
動(dòng)物與飲食雌性6周齡C57B1/6小鼠(Harlan Nederland BV,Horst,theNetherlands)在規(guī)律的12小時(shí)光/暗條件下分組豢養(yǎng)。組的大小為每組10只,陰性對(duì)照組3只動(dòng)物。給予動(dòng)物半合成飲食(Research DietServices,Wijk bij Duurstede,the Netherlands)。對(duì)照飲食按照AIN93G說(shuō)明制備(Reeves等人(1993)Development and Testing of the AIN93purified diets for rodentsresults on growth kidney calcification and bonemineralisation in rats and mice.J Nutrition 123(11)1923-31),補(bǔ)充有寡糖的飲食以這些說(shuō)明為基礎(chǔ)。通過(guò)以重量計(jì)用總碳水化合物交換寡糖來(lái)保持補(bǔ)充飲食中碳水化合物含量的恒定。單獨(dú)的碳水化合物成分按照它們?cè)陲嬍持械耐ǔ1壤謩e被替換。通常飲食中的碳水化合物由玉米淀粉(總重的40%)、糊精化玉米淀粉(13.2%)、蔗糖(10%)和纖維素(5%)組成。
接種實(shí)驗(yàn)方案在適應(yīng)新的豢養(yǎng)和飲食2至4周后,開始接種。在第0日,在接種前收集血樣。在第1日,通過(guò)皮下給予進(jìn)行第一次接種。3周后收集血樣(第21日),并進(jìn)行加強(qiáng)接種(第22日)。在加強(qiáng)注射九日(第31日),用Digimatic外徑測(cè)微器測(cè)量基礎(chǔ)(basal)耳厚(Mitutoyo,Veenendaal,the Netherlands),并通過(guò)在小鼠耳緣i.c.(皮內(nèi))注射抗原溶液誘導(dǎo)遲發(fā)型超敏(DTH)反應(yīng)。24小時(shí)后(第32日),測(cè)量DTH反應(yīng),取血樣并處死小鼠。分離脾并制備以用于離體再刺激。
接種液由抗原溶液和Stimune佐劑(Specol,Cedi-diagnostics BV,Lelystad,the Netherlands)1∶1混合組成,100μl i.c.(皮內(nèi))注射??乖芤簽镮nfluvac 2002/2003(Solvay Pharmaceuticals,Weesp,theNetherlands)在PBS中的1∶100稀釋液。Influvac是三價(jià)蛋白疫苗,其包含三種不同流感株的3×30μg/ml血細(xì)胞凝集素。
對(duì)于DTH反應(yīng),在小鼠雙耳i.c.注射25μl透析的Influvac作為DTH激發(fā)。
細(xì)胞培養(yǎng)使用細(xì)篩細(xì)胞過(guò)濾器(Becton Dickinson,Erembodegem,Belgium)從脾中分離脾細(xì)胞。通過(guò)在冰上溫育5分鐘溶解紅細(xì)胞。用不含酚紅的培養(yǎng)基洗滌后,進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)(Coulter Counter,Beckman Coulter,theNetherlands),并保存在冰上。用0.1μg/ml透析的Influvac作為刺激物進(jìn)行培養(yǎng)。將細(xì)胞以每孔1*106個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中。培養(yǎng)基由具有HEPES緩沖液的RPMI-1640和具有10%胎牛血清(FCS)的2mML-谷氨酰胺(Invitrogen,Merelbeke,Belgium)組成。在37℃和5%CO2下培養(yǎng)5日。然后收集上清液并在-80℃下冷凍至分析。利用3H-胸苷摻入測(cè)定平行培養(yǎng)物中的細(xì)胞增殖,3H-胸苷在最后18小時(shí)以0.4μCu/孔加入培養(yǎng)物中。5日后,用Filtermate收集器(Perkin Elmer,Zaventem,Belgium)收集細(xì)胞,并用Micro-Beta計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。每孔測(cè)量放射性衰變1分鐘,并且記錄每分鐘的計(jì)數(shù)(cpm)作為增殖速度的量度。
細(xì)胞因子用Influvac刺激的培養(yǎng)物的上清液進(jìn)行分析。使用Bio-Plex系統(tǒng)測(cè)量IL-2、IL-5、IL-10和IL-γ,該系統(tǒng)具有針對(duì)所提及的細(xì)胞因子的常規(guī)混合的珠組(beadset)(Bio-Rad,Veenendaal,theNetherlands)。根據(jù)制造商的說(shuō)明書測(cè)量細(xì)胞因子。根據(jù)制造商的說(shuō)明書,使用Pharmingen OptEIA小鼠IL-4試劑盒(Becton Dickinson,Erembodegem,Belgium)通過(guò)ELISA測(cè)量IL-4。
結(jié)果酸性寡糖的DTH反應(yīng)含有劑量1重量%、2.5重量%和5重量%AcO1的飲食誘導(dǎo)DTH反應(yīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性增加,顯示劑量依賴性增加(見表1)。所觀察到的效果表明酸性寡糖在本發(fā)明方法中的有利用途。
表1

*表示與對(duì)照組有顯著性差異(P<0.05)酸性和中性寡糖的DTH反應(yīng)1重量%GF和1重量%AcO1的組合誘導(dǎo)DTH統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性增加(見表2)。由于比單獨(dú)含有酸性或中性寡糖的飲食的DTH反應(yīng)相比效果顯著提高,因此這些結(jié)果表明給予酸性和中性寡糖提供協(xié)同作用。所觀察到的效果表明酸性和中性寡糖的組合在本發(fā)明方法中的有利用途。
表2

*表示與對(duì)照組有顯著性差異(P<0.05)酸性寡糖的Influvac特異性增殖給予含有2.5重量%和5重量%酸性寡糖(AcO1)的飲食誘導(dǎo)對(duì)離體Influvac特異性增殖的顯著性降低作用(見表3)。所觀察到的效果表明酸性寡糖在本發(fā)明方法中的有利用途。
酸性和中性寡糖的組合的Influvac特異性增殖給予1%GF和1重量%AcO1的組合誘導(dǎo)對(duì)抗原特異性增殖的顯著性降低作用(見表3)。由于與單獨(dú)含有酸性或中性寡糖的飲食的DTH反應(yīng)相比效果顯著改善,因此這些結(jié)果表明給予酸性和中性寡糖提供協(xié)同作用。所觀察到的效果表明酸性和中性寡糖的組合在本發(fā)明方法中的有利用途。減少的增殖表明本發(fā)明方法的降低Th2反應(yīng)的作用和Th1/Th2平衡作用。
表3

*表示與對(duì)照組有顯著性差異(P<0.05)Th1/Th2平衡給予酸性寡糖后細(xì)胞因子的特征(profile)細(xì)胞因子的特征用influvc特異性脾細(xì)胞培養(yǎng)物上清液進(jìn)行測(cè)量。數(shù)據(jù)表示作相對(duì)于接種對(duì)照組(即未接受寡糖)的百分?jǐn)?shù)。與對(duì)照組相比,含有2.5重量%和5重量%AcO1的飲食導(dǎo)致Th2相關(guān)細(xì)胞因子IL-4、IL-5和IL-10的減少,而Th1相關(guān)細(xì)胞因子IL-2增加,INF-γ沒(méi)有顯著性下降(見表4)。這些結(jié)果表明酸性寡糖的Th1/Th2平衡作用,并表明酸性寡糖在本發(fā)明方法中例如用于治療和/或預(yù)防相對(duì)低Th1免疫性的疾病的有利用途。
Th1/Th2平衡給予酸性和中性寡糖后細(xì)胞因子的特征與對(duì)照組相比,給予1重量%GT和1重量%AcO1的組合導(dǎo)致Th2相關(guān)細(xì)胞因子IL-4、IL-5和IL-10減少,而Th1相關(guān)細(xì)胞因子IL-2和INF-γ沒(méi)有下降(見表4,其中數(shù)據(jù)表示作相對(duì)于接種對(duì)照組(即未接受寡糖)的百分?jǐn)?shù))。這些結(jié)果表明酸性和中性寡糖組合的Th1/Th2平衡作用,并表明酸性寡糖在本發(fā)明方法中例如用于治療和/或預(yù)防相對(duì)低Th1免疫性的疾病的有利用途。特別是IL-4/IFN比例反映Th2/Th1平衡。換言之,低比例表明對(duì)Th1的刺激和/或?qū)h2的抑制,且在任何情況下均表明本發(fā)明的寡糖的Th1-Th2平衡作用。
表4

*表示與對(duì)照組有顯著性差異(P<0.05)
權(quán)利要求
1.酸性寡糖和中性寡糖在生產(chǎn)組合物中的用途,所述組合物用于用以治療和/或預(yù)防哺乳動(dòng)物中免疫系統(tǒng)相關(guān)病癥的方法中,所述方法包括給予所述哺乳動(dòng)物包含治療有效量的酸性寡糖和中性寡糖的組合物。
2.酸性寡糖和中性寡糖在生產(chǎn)組合物中的用途,所述組合物用于用以增強(qiáng)哺乳動(dòng)物中免疫反應(yīng)的方法和/或用以調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物中免疫系統(tǒng)的方法中,所述方法包括給予所述哺乳動(dòng)物包含酸性寡糖和中性寡糖的組合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的用途,其中所述免疫系統(tǒng)相關(guān)病癥選自自身免疫性病癥、遺傳或條件誘導(dǎo)的免疫缺陷、接種支持、1型變態(tài)反應(yīng)、2型變態(tài)反應(yīng)、3型變態(tài)反應(yīng)和4型變態(tài)反應(yīng)。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的用途,其中所述酸性寡糖包含至少一個(gè)末端糖醛酸單元。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的用途,其中所述糖醛酸單元選自半乳糖醛酸、葡糖醛酸、古洛糖醛酸、艾杜糖醛酸、甘露糖醛酸、核酮糖醛酸和alturonic acid。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的用途,其中所述末端己糖單元具有下述結(jié)構(gòu) 其中R選自氫、羥基或酸性基團(tuán);且選自R2、R3、R4和R5中的至少一個(gè)表示N-乙酰神經(jīng)氨酸、N-乙醇酰神經(jīng)氨酸、游離或酯化的羧酸、硫酸基團(tuán)和磷酸基團(tuán),而R2、R3、R4和R5中其余的表示羥基和/或氫;且n為1-5000的整數(shù)。
7.根據(jù)權(quán)利要求4的用途,其中所述末端糖醛酸具有如權(quán)利要求7中所示的結(jié)構(gòu),并且其中R表示選自氫、羥基或酸性基團(tuán)中的一個(gè);且選自R2、R3、R4和R5中的一個(gè)表示游離或酯化的羧酸;而R2、R3、R4和R5中其余的表示羥基和/或氫。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的用途,其中所述酸性寡糖的聚合度為1至250,優(yōu)選1至10。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的用途,其中所述中性寡糖選自纖維二糖、纖維糊精、B-環(huán)糊精、不消化的糊精、龍膽寡糖、葡寡糖、異麥芽寡糖、異麥芽糖、異麥芽三糖、潘糖、明串珠菌二糖、帕拉金糖、theanderose、D-塔格糖、D-來(lái)蘇-己酮糖、乳蔗糖、α-半乳寡糖、β-半乳寡糖、反式半乳寡糖、乳果糖、4′-半乳糖基乳糖、合成的半乳寡糖、左聚糖型果聚糖、菊糖型果聚糖、1f-β-呋喃果糖基霉菌赤蘚醛糖、木寡糖、lafinose、乳蔗糖和阿拉伯寡糖。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的用途,其中所述中性寡糖選自半乳寡糖、果寡糖和反式半乳寡糖。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的用途,其中所述組合物包含兩種在化學(xué)上不同的中性寡糖,一種選自半乳糖基中性寡糖,而另一種選自果糖基寡糖和/或葡糖基寡糖。
12.權(quán)利要求11的用途,其中所述組合物包含果寡糖和選自反式半乳寡糖和半乳寡糖中的至少一種。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的用途,其中所述方法包括腸道給予所述組合物。
14.根據(jù)前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的用途,其中將所述組合物給予0-1歲的人。
15.一種食物組合物,所述食物組合物包含5至50en%脂類、10至60en%蛋白質(zhì)、15至90en%碳水化合物、酸性寡糖和中性寡糖,其中所述酸性寡糖包含至少一個(gè)末端糖醛酸單元,所述中性寡糖選自纖維二糖、纖維糊精、B-環(huán)糊精、不消化的糊精、龍膽寡糖、葡寡糖、異麥芽寡糖、異麥芽糖、異麥芽三糖、潘糖、明串珠菌二糖、帕拉金糖、theanderose、D-塔格糖、D-來(lái)蘇-己酮糖、乳蔗糖、α-半乳寡糖、β-半乳寡糖、反式半乳寡糖、乳果糖、4′-半乳糖基乳糖、合成的半乳寡糖、左聚糖型果聚糖、菊糖型果聚糖、1f-β-呋喃果糖基霉菌赤蘚醛糖、木寡糖、lafinose、乳蔗糖和阿拉伯寡糖。
16.根據(jù)權(quán)利要求14的組合物,其中所述酸性寡糖具有下式結(jié)構(gòu) 其中R選自氫、羥基或酸性基團(tuán);且選自R2、R3、R4和R5中的至少一個(gè)表示游離或酯化的羧酸,而R2、R3、R4和R5中其余的表示羥基和/或氫,n為1-5000的整數(shù)表示己糖單元的數(shù)目,所述己糖單元為糖醛酸。
17.根據(jù)權(quán)利要求14或15之任一項(xiàng)的組合物,其中所述組合物的熱量密度為0.1至2.5kcal/ml。
18.根據(jù)權(quán)利要求14-17之任一項(xiàng)的組合物,其中所述組合物的粘度在20℃和剪切速率為100s-1下低于250mPas。
19.液體組合物,所述液體組合物包含脂肪、碳水化合物和蛋白質(zhì),且每100ml所述液體組合物包含0.5至1g可溶性不消化的寡糖,包含0.4至0.7g含有β-連接糖的不消化的[半乳糖]n-葡萄糖;其中n是1至60的整數(shù),即2、3、4、5、6、......、59、60;0.01至0.1g的包含至少10個(gè)β-連接果糖單元鏈的不消化的多糖碳水化合物;和0.04至0.3g酸性寡糖,所述酸性寡糖具有如權(quán)利要求16中定義的結(jié)構(gòu)。
20.酸性寡糖在生產(chǎn)組合物中的用途,所述組合物用于用以治療和/或預(yù)防哺乳動(dòng)物中免疫系統(tǒng)相關(guān)病癥的方法中,所述免疫系統(tǒng)相關(guān)病癥選自自身免疫性病癥、遺傳或條件誘導(dǎo)的免疫缺陷、接種支持、1型變態(tài)反應(yīng)、2型變態(tài)反應(yīng)和3型變態(tài)反應(yīng),所述方法包括給予所述哺乳動(dòng)物包含治療有效量的如權(quán)利要求22中定義的酸性寡糖的組合物。
21.酸性寡糖在生產(chǎn)組合物中的用途,所述組合物用于用以治療和/或預(yù)防患有癌癥的個(gè)體,尤其是經(jīng)受或已經(jīng)經(jīng)受化療、放射的癌癥患者和惡病質(zhì)癌癥患者的方法中,所述方法包括給予所述個(gè)體包含治療有效量的如權(quán)利要求22中定義的酸性寡糖的組合物。
22.具有下式的酸性寡糖在生產(chǎn)組合物中的用途,所述組合物用于治療和/或預(yù)防AIDS和/或HIV感染, 其中R選自氫、羥基或酸性基團(tuán);且選自R2、R3、R4和R5中的至少一個(gè)表示N-乙酰神經(jīng)氨酸、N-乙醇酰神經(jīng)氨酸、游離或酯化的羧酸、硫酸基團(tuán)和磷酸基團(tuán),而R2、R3、R4和R5中其余的表示羥基和/或氫;且n為1-5000的整數(shù)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種增強(qiáng)哺乳動(dòng)物尤其是新生兒中的免疫系統(tǒng)以及治療和/或預(yù)防免疫系統(tǒng)相關(guān)病癥的方法,所述方法包括給予酸性寡糖和中性寡糖。本發(fā)明還提供適用于上述方法的食物組合物。
文檔編號(hào)A61K31/732GK1871015SQ200480031243
公開日2006年11月29日 申請(qǐng)日期2004年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月24日
發(fā)明者貝恩德·施塔爾, 勞拉·姆拉貝, 阿爾詹·保羅·福斯, 約翰·加森, 京特·伯姆 申請(qǐng)人:努特里奇亞有限公司
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