一種人循環(huán)miR?122的檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種人循環(huán)miR?122的檢測方法，包括：提取血清總RNA作為樣品，將樣品溶于去核酸酶的蒸餾水中，取部分逆轉錄為cDNA，進行miR?122特異性實時熒光定量PCR反應，得到Ct值對芯片反映的結果進行驗證，即可。本發(fā)明檢測方法提高了靈敏度，為人體肥胖狀態(tài)下循環(huán)miRNAs的變化提供了新的臨床依據，循環(huán)miR?122水平與肥胖、糖調節(jié)、胰島素抵抗密切相關。
【專利說明】
-種人循環(huán)m i R-122的檢測方法
技術領域
[000。 本發(fā)明屬于肥胖癥診斷生物學標志物領域，特別設及一種人循環(huán)miR-122的檢測方法。
【背景技術】
[0002] 研究表明，脂肪細胞在膜島素抵抗的發(fā)病過程中發(fā)揮中屯、作用。機體在肥胖狀態(tài) 下，脂肪細胞分泌功能素亂、脂質過度積聚，進而導致細胞脂毒性、膜島素抵抗等病理過程 的發(fā)生。目前，關于肥胖癥的基礎研究初步掲示了其發(fā)病機制，但可用于肥胖癥診斷生物學 標志物仍較為匿乏、現有治療效果亦不盡如人意。
[0003] 新近基礎研究發(fā)現，miRNAs在肥胖發(fā)生、膜島素抵抗發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作 用，但其調控機制尚未闡明。在腫瘤、屯、血管疾病和代謝性疾病領域，特定miRNAs已成為潛 在生物學標志物和藥物干預祀點。2013年，改造 miR-34分子結構制備的藥物MRX34已進入I 期臨床試驗，目標人群為不適于手術切除的原發(fā)性肝癌或累及肝臟的實體腫瘤患者。
[0004] 內源性循環(huán)miRNAs具有相對穩(wěn)定、微創(chuàng)、易于檢測等特點，在疾病狀態(tài)下其表達譜及 表達量顯著改變，有望用于疾病診斷、病理分型、預后評估。然而，現有的篩選特定循環(huán)miRNAs 用作肥胖癥診療生物學標志物的人群研究樣本量小，不同研究所報道的結果并不一致。新近 研究發(fā)現，血漿 miR-142-化、miR-140-5p、miR-423-5p、miR-520c-3p 及 miR-Ea 可能是肥胖癥風 險評估及疾病分類的新的生物學標志物。另一項研究提示，血清miR-巧b、miR-138、miR-376a 可用作預測肥胖癥的有效生物學指標。關于循環(huán)miRNAs與代謝調節(jié)的關系亟需更多臨床佐證。
【發(fā)明內容】
[0005] 本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種人循環(huán)miR-122的檢測方法，該方法檢測 方法提高了靈敏度，為人體肥胖狀態(tài)下循環(huán)miRNAs的變化提供了新的臨床依據，循環(huán)miR- 122 水平與肥胖、糖調節(jié)、膜島素抵抗密切相關; 尤為重要的是，本發(fā)明證實了循環(huán) miR-122 水平上調是膜島素抵抗的獨立危險因素;循環(huán)miR-122具有用作診治肥胖癥、膜島素抵抗的 血清學標志物的廣闊前景。
[0006] 本發(fā)明的一種人循環(huán)miR-122的檢測方法，包括：
[0007] 提取血清總RNA作為樣品，將樣品溶于去核酸酶的蒸饋水中，取部分逆轉錄為cDNA， 進行miR-122特異性實時巧光定量PCR反應，得到Ct值對忍片反映的結果進行驗證，即可。
[0008] 所述逆轉錄采用的逆轉錄混合液的組成為:5X逆轉錄反應液化1，逆轉錄酶mix 1 ，質控用Sp化e-In溶液0.化1，去核酸酶的蒸饋水4.化1。
[0009] 所述逆轉錄條件為:42°C反應化，95°C反應5min，隨后降至4°C。
[0010] 所述實時巧光定量PCR的反應體系為：cDNA模板化1，引物化1，2XSY服化1。
[0011] 所述實時巧光定量PCR的反應條件為:95°C預變性lOmin; 95°C 10s，60°C延伸Imin， 45個循環(huán)。
[00。] 有益效果
[0013]本發(fā)明檢測方法提高了靈敏度，為人體肥胖狀態(tài)下循環(huán)miRNAs的變化提供了新的 臨床依據，循環(huán)miR-122水平與肥胖、糖調節(jié)、膜島素抵抗密切相關;尤為重要的是，本發(fā)明 證實了循環(huán)miR-122水平上調是膜島素抵抗的獨立危險因素;循環(huán)miR-122具有用作診治肥 胖癥、膜島素抵抗的血清學標志物的廣闊前景。
【附圖說明】
[0014] 圖1(A)為正常體重對照組(n=107)與肥胖癥患者組(n=123)循環(huán)miR-122的比較； (B)為正常體重對照組與肥胖癥患者組循環(huán)miR-122實時巧光定量PCR實驗原始Ct值；（C)為 校正性別、年齡、ALT、皿心(3后，肥胖癥患者組循環(huán)miR-122水平與正常體重對照組的比較；
[0015] 圖2為不同程度肥胖癥患者血清miR-122水平;其中，（A)為輕度肥胖組(n = 28)、中 度肥胖組(n = 66)、重度肥胖組(n = 29)循環(huán)miR-122與正常體重對照組(n = 107)的比較； (B)為校正性別、年齡、41；1\皿心(3后，輕度肥胖組、中度肥胖組、重度肥胖組循環(huán)11111?-122水 平與正常體重對照組的比較。
【具體實施方式】
[0016] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，運些實施例僅用于說明本發(fā)明而 不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內容之后，本領域技術人員可 W對本發(fā)明作各種改動或修改，運些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。 [0017]實施例1
[0018] 研究人群：18~30歲人群。肥胖癥患者均為肥胖專病口診的患者;正常體重受試者 均為在校學生志愿者。
[0019] 1.血清RNA抽提
[0020] 血清總RNA的提取使用microRNA抽提試劑盒(miR化asy Mini Kit),并參照德國 Qiagen公司提供的說明書。
[0021 ] (1)將血清樣本從-80°C冰箱內取出，置于冰上完全融化；
[0022] (2)向每個裝有血清樣本的EP管中，加入1.5ml QIAzol裂解液，W最高速在縱滿混 合器上劇烈振蕩15s后置于冰上，可重復運一過程，直至白色沉淀完全消失，室溫靜置5min;
[0023] (3)每管加入20化1氯仿溶液，W最高速在縱滿混合器上劇烈振蕩15s，靜置3min;
[0024] (4)4°C，12,000g離屯、15min，將上層無色水樣溶液至另一RNAse Free的EP管中，加 入1.5倍體積無水乙醇后輕柔混勻；
[00巧](5)吸取700yr混合物加入RNeasy Mini離屯、柱，室溫9000g離屯、15s，棄2ml收集管 中的液體，重復該步驟直至所有混合物均加入RNeasy Mini離屯、柱；
[00%] (6)向每個RNeasy Mini離屯、柱加入70化1 RWT洗液，室溫9000g離屯、15s，棄2ml收 集管中的液體；
[0027] (7)向每個RNeasy Mini離屯、柱加入50化1 R陽洗液，室溫9000g離屯、15s，棄2ml收 集管中的液體；
[002引 （8)再向每個RNeasy Mini離屯、柱加入500山R陽洗液，室溫9000g離屯、2min，棄2ml 收集管；
[00巧](9)將RNeasy Mini離屯、柱置于新的2ml收集管上，室溫最大轉速離屯、lmin，W去除 離屯、柱殘存的無水乙醇；
[0030] (10)將RNeasy Mini離屯、柱置于RNAse Rree的1.5ml離屯、管上，向每個離屯、柱濾膜 中央加入30iil RNAse化ee的蒸饋水，室溫12,000g離屯、Imin洗脫RNA;
[00川 （11)室溫最大轉速離屯、Imin，充分洗脫濾膜上的RNA，將RNA轉移入新的RNAse 化ee的離屯、管中。
[0032] 2.血清miRNAs Microarray忍片
[0033] (1)為盡可能排除樣品間個體差異的影響，將發(fā)現人群肥胖組患者的血清miRNAs 樣本隨機混合為2個混合樣品（pooled sample)，每個肥胖組混合樣品含28個患者的血清 miRNAs樣本，正常體重組也W此方法隨機混合為2個混合樣品；
[0034] (2)據由Aglient 2100生物分析儀測得的混合樣品濃度，取總量為l(K)ng的RNA樣 品，放入1.5ml離屯、管，置于冰上；
[OO%] (3)加入化1小牛腸憐酸醋酶（calf intestinal地osphatase,CIP)mix，輕柔混 勻，37°C水浴30min，W使樣品去憐酸化，CIP mix現用現配、置于冰上，具體如下表：
[0037]每次多配10%的量備用；
[003引 （4)加入2.祉1 DMSOaOOr水浴5~lOmin變性；
[0039] (5)立即將樣品轉移至冰上，每個樣品加入4.化1連接酶mi X，輕柔混勻，16 °C水浴 2h，T4RNA連接酶mix現用現配、置于冰上，具體如下表： 「AA>1Al
[0041] 每次多配10%的量備用；
[0042] (6)50°C真空濃縮30min~化，直至樣品完全干燥；
[0043] (7)用17iil RNAse Free的蒸饋水重懸樣品，每管加入2祉1雜交mix(每次多配10% 的量備用），如下表所示： L0045」總體系為45iil，充分混勻；
[0046] (8)100°C水浴5min，立即轉移至冰浴5min;
[0047] (9)將樣品與miRNA(8*70K)V16.0忍片在滾動雜交爐中55°C，20巧m滾動雜交20h;
[004引 （10)雜交完成后，將忍片置于洗缸中，用加入10%化iton X-102的基因洗涂劑(GE Wash Buffer)l、基因洗涂劑2洗片5-6次；
[0049] (11)忍片結果采用4旨116111:基因忍片掃描儀進行掃描，用化日1:山"6 6義化日(31:;[0]1軟 件10.7讀取結果，設置掃描分辨率=5皿，PMT100 %、5 % ;
[0050] (12)使用Gene Spring軟件11.0將所有數據進行歸一化處理，所用算法為分位數 法(Qu曰ntile)。
[0化1] 3.miRNAs的逆轉錄
[0052] miRNAs的逆轉錄使用miRCURY LNA通用逆轉錄試劑盒(miRCURY LNA Universal RT Kit)，并參照丹麥Exiqon公司提供的說明書。
[005；3] (1)從30山RNA溶液中精確吸取2山RNA溶液置于新的RNAse Free的EP管中，置于冰上；
[0054] (2)按照Exiqon公司提供的說明書每個樣本按W下的體系配制逆轉錄mix混合酶 溶液，具體如下： 「nncKl
[0056]每次多配10%的量備用；
[0化7] (3)向每個樣本加入如1 mix混合溶液，快速離屯、，放入PCR儀42。(：反應化，95C 5min，立即降至4°C ;
[005引 （4)向cDNA產物中加入39化1去核酸酶的蒸饋水稀釋至40化1備用(40倍稀釋）。
[0059] 4.實時定量？〇?^6￡^-^1116?〇0
[0060] 采用實時巧光定量PCR試劑盒及人miR-122特異性引物化xiqon公司產品），參照丹 麥Exiqon公司提供的說明書，在羅氏Li曲t切cler 480儀器上進行實時定量PCR，每個樣本 設置3個復孔。
[0061] (1)反應體系 「noA^I
[0063] (2)反應條件
[0064] S 化 ge 1 預變性：95°C10min
[00化]S化ge 2擴增：95°C10s，6(TClmin(1.6°C/s)，45Cycles;
[0066] S化ge 3溶解曲線分析。
[0067] (3)實驗結果分析:實驗組與對照組的表達變化表示。
[006引 5.結果
[0069] (1)人群循環(huán)miRNAs的表達水平
[0070] 表1肥胖痛患者表達量改巧的循環(huán)miRNAs
[0071]
[0072]
[0073]
[0074]
[0075] 為盡可能排除個體差異對實驗結果的影響、富集最具差異性表達的miRNAs，將肥 胖癥患者組、正常體重對照組各做2個隨機混合樣品。倍數差異(fold changes,FC)〉3或FC <-3的miRNAs納入進一步分析。忍片結果表明，單純性肥胖癥患者血清中共有34個miRNAs表 達量發(fā)生顯著性改變(表1);其中，共有4個miRNAs表達顯著上調、30個miRNAs表達顯著下 調。在所有表達水平顯著性改變的miRNAs中，微小RNA-122(microRNA-122，miR-122)是循環(huán) 中表達豐度最高的miRNA;先前研究表明，肝臟代謝素亂狀態(tài)下，miR-122表達量失調；其在 小鼠體內調節(jié)血漿膽固醇及血脂含量。因此，選用循環(huán)miR-122表達水平與肥胖和膜島素抵 抗的關系。
[0076] (2)肥胖癥患者循環(huán)miR-122表達水平上調
[0077] 巧光定量PCR與微陣列忍片結果一致，較之正常體重對照組，驗證人群肥胖癥患者 血清miR-122水平升高至3.07 ±0.24倍(P = 7.10 X 1〇-12，圖1A)。肥胖癥患者組血清miR-122 的CT值為30.85± 1.17，正常體重組血清miR-122的CT值為32.37± 1.55(圖1B)。校正性別、 年齡、血脂和肝功能后，肥胖癥患者組循環(huán)miR-122水平仍顯著高于正常體重對照組（P< 0.001，圖1C)。
[0078] 為進一步探究循環(huán)miR-122水平與肥胖發(fā)生的關系，將肥胖癥患者分為輕度肥胖 組、中度肥胖組和重度肥胖組。與正常體重對照組相比，輕度肥胖組、中度肥胖組和重度肥 胖組循環(huán)miR-122水平均顯著升高(P均<0.05,圖2A);循環(huán)miR-122水平呈現隨肥胖程度加 重而升高的趨勢，盡管不具有統(tǒng)計學差異。校正性別、年齡、血脂和肝功能后，較之正常體重 對照組，輕度肥胖組、中度肥胖組、重度肥胖組循環(huán)miR-122水平仍顯著升高（P<0.01，圖 2B)。（3)循環(huán)miR-122水平與多個變量的相關性分析
[0079] 表2循環(huán)miR-122水平與各變量的相關性和多元逐步回歸分析
[0080]
[0081]
[0082] 注:r，Pearson相關系數;0，標準回歸系數；表示該變量未進入最優(yōu)回歸方程。
[0083] Pearson相關性分析顯示，循環(huán)miR-122水平與BMI、腰臀比、體脂含量、血壓、肝酶、 TG、HDkc、空腹血糖和膜島素、0GTT-2h血糖和膜島素、H0MA-IR、性別顯著相關(P均<0.01， 表2)。多元逐步回歸分析發(fā)現，循環(huán)miR-122水平與血清ALT水平獨立相關(0 = 0.648，P< 0.001;表 2)。
[0084] 表3正常體重受試者循環(huán)miR-122水平與各變量的相關性和多元逐步回歸分析
[0085]
[0086]
[0087] 注:r，Pearson相關系數;0，標準回歸系數；表示該變量未進入最優(yōu)回歸方程。
[0088] 鑒于正常體重組與肥胖癥患者組在膜島素敏感性、血糖調節(jié)、肝功能等方面存在 較為明顯的差別，我們分別在正常體重組及肥胖癥患者組中分析了循環(huán)miR-122水平與各 代謝指標的相關性。在正常體重受試者中，循環(huán)miR-122表達水平與ALT、ALP、丫 -GTJDkc、 血糖、空腹膜島素、性別顯著相關(P均<0.05,表3)。多元逐步回歸分析顯示，循環(huán)miR-122表 達水平與性別(0 = -〇.425，？<〇.〇〇1)和皿1-(：(0 = -〇.287，？<〇.〇〇1)獨立相關(表3)。
[0089] 表4肥胖癥患者循環(huán)miR-122水平與各變量的相關性和多元逐步回歸分析
[0090]
[0091]
[0092] 注:r，Pearson相關系數;0，標準回歸系數；表示該變量未進入最優(yōu)回歸方程。
[0093] 在肥胖癥患者中，循環(huán)miR-122表達水平與ALT、AST、丫 -GT、TG及血糖顯著相關(P 均<0.05，表4)。多元逐步回歸分析結果表明，循環(huán)miR-122表達水平與血清ALT水平獨立相 關(e = 0.554，P<0.001;表 4)。
[0094] 結果表明，人循環(huán)miR-122水平與肝酶水平顯著相關。此外，多元逐步回歸分析發(fā) 現，人循環(huán)miR-122水平與血清ALT濃度獨立相關。Wang等研究發(fā)現，小鼠血漿miR-122濃度 與ALT水平、肝臟病變成劑量依賴性、暴露時間依賴性相關;較之ALT水平，循環(huán)miR-122水平 變化的靈敏度、可信度更高。W后的研究可進一步比較人體循環(huán)miR-122水平、ALT水平的靈 敏度、可信度，從而推廣循環(huán)miR-122水平的臨床應用。此外，未來的基礎研究可進一步研究 循環(huán)miR-122是否具有調控膜島素敏感性的生物學功能。
【主權項】
1. 一種人循環(huán)miR-122的檢測方法，包括： 提取血清總RNA作為樣品，將樣品溶于去核酸酶的蒸餾水中，取部分逆轉錄為cDNA，進 行miR-122特異性實時熒光定量PCR反應，得到Ct值對芯片反映的結果進行驗證，即可。2. 根據權利要求1所述的一種人循環(huán)miR-122的檢測方法，其特征在于:所述逆轉錄采 用的逆轉錄混合液的組成為：5 X逆轉錄反應液2μ1，逆轉錄酶mix ΙμL，質控用Spike-In溶 液0.5μ1，去核酸酶的蒸餾水4.5μ1。3. 根據權利要求1所述的一種人循環(huán)miR-122的檢測方法，其特征在于:所述逆轉錄條 件為:42°C反應lh，95°C反應5min，隨后降至4°C。4. 根據權利要求1所述的一種人循環(huán)miR-122的檢測方法，其特征在于:所述實時熒光 定量PCR的反應體系為:cDNA模板4μ1，引物ΙμL，2 X SYBR 5μ1。5. 根據權利要求1所述的一種人循環(huán)miR-122的檢測方法，其特征在于:所述實時熒光 定量PCR的反應條件為:95°C預變性1〇11^11 ;95°(：1〇8,60°(：延伸111^11，45個循環(huán)。
【文檔編號】C12Q1/68GK106048037SQ201610527650
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年7月6日
【發(fā)明人】王衛(wèi)慶, 王睿, 曹亞南, 洪潔, 顧衛(wèi)瓊, 張翼飛, 石娟
【申請人】上海市內分泌代謝病研究所, 上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院