專利名稱：從前體產(chǎn)生加載有抗原的樹(shù)突細(xì)胞疫苗的快速一步法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從前體(precursors)、特別是從單核細(xì)胞和可溶性或顆粒性抗原、更特別是從殺傷的腫瘤細(xì)胞快速產(chǎn)生加載有抗原的樹(shù)突細(xì)胞的組合物和方法。
背景在過(guò)去的十年中，癌癥免疫治療的觀念通過(guò)人類癌癥抗原的分子鑒定得到加強(qiáng)。允許大量樹(shù)突細(xì)胞(DC)生成的體外培養(yǎng)方法的鑒定進(jìn)一步促進(jìn)了這些治療途徑，在所述樹(shù)突細(xì)胞上，可以將癌癥抗原呈遞給T細(xì)胞。在動(dòng)物中的大量研究證實(shí)，以在DC上送遞的腫瘤抗原的免疫可誘導(dǎo)保護(hù)性抗腫瘤應(yīng)答。開(kāi)拓性的臨床試驗(yàn)使用血液衍生的DC或單核細(xì)胞衍生的DC，并且顯示一些臨床反應(yīng)應(yīng)答以及更新近的免疫應(yīng)答。(Bell等人，1999.“Dendritic cells，”Adv Immunol 72255；Boczkowski等人，1996.“Dendritic cells pulsed with RNA arepotent antigen-presenting cells in vitro and in vivo，”J Exp Med 184465-472；Celluzzi等人，1996.“Peptide-pulsed dendritic cells induceantigen-specific CTL-mediated protective tumor immunity，”J ExpMed 183283-287；Flamand等人，1994.“Murine dendritic cells pulsedin vitro with tumor antigen induce tumor resistance in vivo，”Eur Jlmmunol 24605-610；Gilboa等人，1998.“Immunotherapy of cancerwith dendritic-cell-based vaccines，”Cancer Immunol Immunother4682；Gilboa，E.1999.“The makings of a tumor rejection antigen，”Immunity 11263-270；Hsu等人，1996.“Vaccination of patients withB-cell lymphoma using autologous antigen-pulsed dendritic cells，”NatMed 252；Mayordomo等人，1995.“Bone marrow-derived dendriticcells pulsed with synthetic tumour peptides elicit protective andtherapeutic antitumour immunity，”Nat Med 11297-1302；Mayordomo等人，1997.“Bone marrow-derived dendritic cells serve aspotent adjuvants for peptide-based antitumor vaccines，”Stem Cells1594-103；Mukherji等人，1995.“Induction of antigen-specificcytolytic T cells in situ in human melanoma by immunization withsynthetic peptide-pulsed autologous antigen presenting cells，”ProcNatl Acad Sci USA 928078；Nestle等人，1998.“Vaccination ofmelanoma patients with peptide-or tumor lysate-pulsed dendriticcells，”Nat Med 4328；Porgador，A.和Gilboa，E.1995.“Bonemarrow-generated dendritic cells pulsed with a class I-restrictedpeptide are potent inducers of cytotoxic T lymphocytes，”J Exp Med182255-260；Song等人，1997.“Dendritic cells genetically modifiedwith an adenovirus vector encoding the cDNA for a model antigeninduce protective and therapeutic antitumor immunity，”J Exp Med1861247-1256；Song，J.A.1998.“Tumor immunologythe glass is halffull，”Immunity 9757-763；Specht等人，1997.“Dendritic cellsretrovirally transduced with a model antigen gene are therapeuticallyeffective against established pulmonary metastases，”J Exp Med 1861213-1221；Tjoa等人，1998.“Evaluation of phase I/II clinical trials inprostate cancer with dendritic cells and PSMA peptides，”Prostate3639-44；Toes等人，1996.“Protective antitumor immunity inducedby immunization with completely allogeneic tumor cells，”Cancer Res563782-3787；Zitvogel等人，1996.“Therapy of murine tumors withtumor peptide-pulsed dendritic cellsdependence on T cells，B7costimulation，and T helper cell 1-associated cytokines，”J Exp Med18387-97；Schuler-Thurner等人，2000.“Mage-3 and influenza-matrixpeptide-specific cytotoxic T cells are inducible in terminal stage HLA-A2.1+ melanoma patients by mature monocyte-derived dendriticcells，”J Immunol 1653492-3496；Mackensen等人，2000.“Phase Istudy in melanoma patients of a vaccine with peptide-pulsed dendriticcells generated in vitro from CD34(+) hematopoietic progenitorcells，”Int J Cancer 86385-392；Geiger等人，2001.“Vaccination ofpediatric solid tumor patients with tumor lysate-pulsed dendritic cellscan expand specific T cells and mediate tumor regression，”Cancer Res618513-8519；Heiser，2002.“Autologous dendritic cells transfectedwith prostate-specific antigen RNA stimulate CTL responses againstmetastatic prostate tumors，”J Clin Invest 109409-417；Lodge等人，2000.“Dendritic cell-based immunotherapy of prostate cancerimmune monitoring of a phase II clinical trial，”Cancer Res 60829-833；Fong等人，2001.“Dendritic cells injected via different routesinduce immunity in cancer patients，”J Immunol 1664254-4259；以及Banchereau等人，2002.“Dendritic cells as vectors for therapy，”Cell 106271-274)。盡管這些結(jié)果是有前途的，但需要確定DC接種的幾個(gè)參數(shù)，其中包括DC的類型。
到目前為止，DC從造血祖先(progenitor)或從血液前體即單核細(xì)胞的長(zhǎng)期培養(yǎng)產(chǎn)生。(Caux等人，1992.“GM-CSF and TNF-alphacooperate in the generation of dendritic Langerhans cells，”Nature360258-261；Romani等人，1994.“Proliferating dendritic cellprogenitors in human blood，”J Exp Med 18083-93；Sallusto，F(xiàn)和Lanzavecchia，A.1994.“Efficient presentation of soluble antigen bycultured human dendritic cells is maintained bygranulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4and downregulated by tumor necrosis factor alpha，”J Exp Med l791109-1118；Reid等人，1992.“Interaction of tumor necrosis factor withgrannlocyte-macrophage colony-stimulating factor and other cytokinesin the regulation of dendritic cell growth in vitro form bipotent CD34+progenitors in human bone marrow，”J Immunol 1492681-2688；Arrighi等人，1999.“Long-term culture of humah CD34(+)progenitorswith FLT3-ligand，thrombopoietin，and stem cell factor inducesextensive amplification of a CD34(-)CD14(-)and a CD34(-)CD14(+)dendritic cell precursor，”Blood 932244-2252；Caux等人，1990.“Tumor necrosis factor α strongly potentiates interleukin-3 andgranulocyte-macrophage colony-stimulating factor-inducedproliferation of human CD34+hematopoietic progenitor cells，”Blood752292-2298；Chang等人，2000.“Monocyte-derived CDla+ andCDla-dendritic cell subsets differ in their cytokine production profiles，susceptibilities to transfection，and capacities to direct Th celldifferentiation，”Immunology 1653584-3591；以及Weissman等人，2000.“HIV gag mRNA transfection of dendritic cells(DC)deliversencoded antigen to MHC class I and II molecules，causes DCmaturation，and induces a potent human in vitro primary immuneresponse，”Immunology 1654710-4717)。
CD34+造血祖先細(xì)胞(HPCs)在用GM-CSF加TNF(GM-CSF/TNF)培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生DC制劑，該DC制劑由兩個(gè)不同的DC亞群即朗格漢斯細(xì)胞(LC)和間質(zhì)DC(intDCs)組成。這與將單核細(xì)胞用GM-CSF加IL-4(GM-CSF/IL-4)進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生的DC形成對(duì)照，后者含有與intDC類似的未成熟DC的均一群體。盡管GM-CSF/IL-4誘導(dǎo)的DC要求額外的成熟因子，但CD34-DC并不需要，因其是在DC激活因子TNFα的存在下產(chǎn)生的。美國(guó)專利No.6,004,807教導(dǎo)了使用補(bǔ)充了10％(v/v)熱滅活胎牛血清的組織培養(yǎng)基從CD34造血祖先產(chǎn)生樹(shù)突細(xì)胞。
從臍帶血CD34+HPC培養(yǎng)物出現(xiàn)的具有不同生物學(xué)功能的兩個(gè)DC亞群早期研究以臍帶血CD34+HPC進(jìn)行，并通過(guò)用GM-CSF/TNF或IL-3/TNF培養(yǎng)使其分化偏轉(zhuǎn)為DC。在這些培養(yǎng)條件中，TNF-α和GM-CSF/IL-3之間的協(xié)同作用對(duì)于DC從CD34+HPC的發(fā)育是關(guān)鍵的。事實(shí)上，盡管早期研究提示TNF為血細(xì)胞生成的抑制劑，但更近來(lái)觀察到TNF是由IL-3或GM-CSF誘導(dǎo)的CD34+HPC增殖的刺激物。有限稀釋分析顯示，TNF增加IL-3應(yīng)答細(xì)胞的頻率和IL-3依賴性克隆的平均大小。12天的液體培養(yǎng)之后，用GM-CSF和TNF培養(yǎng)的CD34+HPC產(chǎn)生具有樹(shù)突形態(tài)的貼壁或非貼壁細(xì)胞。對(duì)于DC的最佳產(chǎn)生，在培養(yǎng)的最初幾天最需要TNF，其中TNF上調(diào)GM-CSF/IL-3/IL-5受體的通用鏈亞基的表達(dá)。TNF在CD34+HPC培養(yǎng)中作用的另一個(gè)重要的位點(diǎn)是粒細(xì)胞生成的分化和增殖的抑制。特別地，TNF在未定型CD13-CD15-母細(xì)胞水平上可逆地阻斷粒細(xì)胞分化，未定型CD13-CD15-母細(xì)胞在TNF富集的培養(yǎng)物中積聚。此外，通過(guò)將細(xì)胞周期停滯于G0/G1來(lái)抑制定型粒細(xì)胞祖先(CD15+)的生長(zhǎng)(Caux等人，1991.“Potentiation of early hematopoiesis by tumor necrosisfactor-alpha is followed by inhibition of granulopoietic differentiationand proliferation，”Blood 78635-644；Jacobsen等人，1992.“Tumornecrosis factor alpha directly and indirectly regulates hematopoieticprogenitor cell proliferationrole of colony-stimulating factor receptormodulation，”J Exp Med 1751759-1772)。TNF在這些培養(yǎng)物中也阻斷紅細(xì)胞發(fā)生。TNF對(duì)生長(zhǎng)的CD34+HPC的這些作用通過(guò)p55TNF受體介導(dǎo)(Rusten等人，1994.“Bifunctional effects of tumor necrosisfactor alpha(TNF alpha)on the growth of mature and primitivehuman hematopoietic progenitor cellsinvolvement of p55 and p75TNF receptors，”Blood 833152-3159)。
如上所述，在這些培養(yǎng)條件下，出現(xiàn)了CD1a+和CD14+兩個(gè)前體亞群，它們可以分別分化為L(zhǎng)C和intDC(Caux等人，1996.“CD34+hematopoietic progenitors from human cord blood differentiate alongtwo independent dendritic cell pathways in response to GM-CSF+TNFalpha，”J Exp Med 184695-706；Caux等人，1997.“CD34+hematopoietic progenitors from human cord blood differentiate alongtwo independent dendritic cell pathways in response to granulocyte-macrophage colony-stimulating factor plus tumor necrosis factoralphaII.Functional analysis；”Blood 901458-1470)。兩個(gè)前體亞群都在第12-14天成熟為具有典型形態(tài)學(xué)、表型(CD80、CD83、CD86、CD58、高HLA II類)和功能的DC。CD1a+前體產(chǎn)生具有朗格漢斯細(xì)胞特征(伯貝克顆粒、Lag抗原和E-鈣粘著蛋白(E-cadherin))的細(xì)胞。不同的是，CD14+前體成熟為缺乏伯貝克顆粒、E-鈣粘著蛋白和Lag抗原、但是表達(dá)皮膚樹(shù)突細(xì)胞中描述的CD2、CD9、CD68和凝血因子X(jué)IIIa的CD1a+DC。有趣的是，CD14+前體，而非CD1a+前體，代表了雙潛能細(xì)胞，其可以應(yīng)答M-CSF、被誘導(dǎo)分化為缺乏對(duì)T細(xì)胞的附屬功能的巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞。這些DC亞群差別在于(1)抗原捕獲；intDC在葡聚糖攝取和結(jié)合免疫復(fù)合物中比LC更有效；(2)溶酶體活性，intDC表達(dá)較高水平的酶活性；(3)誘導(dǎo)原初B細(xì)胞分化的能力，intDC能夠通過(guò)IL-12的分泌而獨(dú)特地誘導(dǎo)原初B細(xì)胞的引發(fā)及其向分泌IgM的漿細(xì)胞的分化(Dubois等人，1997.“Dendritic cells enhance growth and differentiation of CD40-activated B lymphocytes，”J Exp Med 185941-951；Dubois等人，1998.“Critical role of IL-12 in dendritic cell-induced differentiation ofnaive B lymphocytes，”J Immunol 1612223-2231)；以及(4)盡管與CD40連接時(shí)兩個(gè)亞群都表達(dá)IL-12，但僅僅intDC表達(dá)IL-10。盡管LC的獨(dú)特功能有待確定，但有些報(bào)告提示，具有LC成分的CD34-DC在CD8 T細(xì)胞引發(fā)中比單核細(xì)胞衍生的DC更有效(Mortarini等人，1997.“Autologous dendritic cells derived from CD34+progenitors and from monocytes are not functionally equivalentantigen-presenting cells in the induction of melan-A/Mart-1(27-35)-specific CTLs from peripheral blood lymphocytes of melanomapatients with low frequency of CTL precursors，”Cancer Res 575534-5541；以及Ferlazzo等人，2000.“Dendritic cells generated fromCD34+ progenitor cells with flt3 ligand，c-kit ligand，GM-CSF，IL-4，and TNF-alpha are functional antigen-presenting cells resemblingmature monocyte-derived dendritic cells，”J Immunother 2348-58)。這些觀察在我們自己的研究當(dāng)中得到證實(shí)，我們的研究證實(shí)，通過(guò)用GM-CSF和lL-15培養(yǎng)單核細(xì)胞誘導(dǎo)的具有朗罕氏細(xì)胞表型的DC，在CTL應(yīng)答的體外誘導(dǎo)中，比GM-CSF/IL-4 DC更有效(Mohamadzadeh等人，2001.“Interleukin 15 skews monocytedifferentiation into dendritic cells with features of Langerhans cells，”J Exp Med 1941013-20)。在類似腫瘤特異性CTL的誘導(dǎo)的環(huán)境中，CD34-DC或含有朗格漢斯細(xì)胞的任何其他DC制劑因此可能是有利的。
G-CSF動(dòng)員的血液CD34+HPC也產(chǎn)生兩個(gè)DC亞群以G-CSF動(dòng)員、并從晚期黑素瘤患者分離的外周血遵循對(duì)臍帶血公認(rèn)的分化途徑，且在培養(yǎng)第九天，可以鑒定兩個(gè)群體，即CD1a+CD14-LC和CD1a-CD14+intDC。然而，這些培養(yǎng)物中約50％的細(xì)胞保持在祖先/前體階段，并可以在進(jìn)一步培養(yǎng)中產(chǎn)生DC。因此，這些培養(yǎng)是不同步的，這是使用這些DC制劑作為疫苗時(shí)需要考慮的參數(shù)。兩個(gè)亞群都為CD83lowCD86+HLA-DR+、MHC I類+(intDC表達(dá)略高水平的I類)，LC表達(dá)較高水平的CD11c和CD80。通過(guò)共聚焦顯微鏡證實(shí)其朗格漢斯細(xì)胞表型，共聚焦顯微鏡顯示了Lag表達(dá)和相應(yīng)于伯貝克顆粒的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)，兩者均為L(zhǎng)C專有。從第九天培養(yǎng)物分選的LC和intDC顯示如下確定的DC性質(zhì)1)形態(tài)學(xué)，其中吉姆薩染色顯示不同的核以及具有顯著樹(shù)突的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)；2)抗原捕獲，其中intDC比LC捕獲多得多的FITC-葡聚糖；以及3)T細(xì)胞應(yīng)答的誘導(dǎo)，其中盡管CD1a+CD14-和CD1a-CD14+細(xì)胞都可以誘導(dǎo)異源T細(xì)胞增殖，但分選的CD1a+細(xì)胞在誘導(dǎo)對(duì)TT的回憶應(yīng)答(使用自身CD4 T細(xì)胞)和異源CD8 T細(xì)胞的增殖中，比CD14+細(xì)胞效率高很多。由CD40L、IFNα或合成的dsRNA(多聚I:C)誘導(dǎo)成熟的LC和intDC引起同等增加的增殖性T細(xì)胞應(yīng)答。
加載有抗原的CD34+HPC衍生的DC引起免疫及臨床反應(yīng)如國(guó)際申請(qǐng)No.PCT/US02/07232(WO 02/072013)中所公開(kāi)的，將CD34+HPC衍生的DC用以下六個(gè)Ag進(jìn)行脈沖，并用于接種十八個(gè)IV期黑素瘤的HLA A*0201+患者流行性感冒基質(zhì)肽(matrix peptide)(Flu-MP)、KLH，以及從四個(gè)黑素瘤Ag(MART-1/Melan A、gp100、酪氨酸酶和MAGE-3)衍生的肽。以KLH、Flu間質(zhì)肽和HLA-A2結(jié)合肽對(duì)DC進(jìn)行加載，并在六周內(nèi)進(jìn)行每?jī)芍芤淮蔚氖┯?四次皮下注射)，其中HLA-A2結(jié)合肽衍生自四個(gè)黑素瘤抗原MAGE-3、MART-1/MELAN A、GP-100和酪氨酸酶。如上所述，這些DC含有朗格漢斯細(xì)胞成分。用抗原脈沖的CD34-DC對(duì)晚期黑素瘤患者的接種，經(jīng)證明是充分耐受的，并且引起對(duì)“非自身”(病毒肽和KLH蛋白)和“自身”(黑素瘤肽)抗原的加強(qiáng)的免疫性。觀察到血液中的免疫應(yīng)答水平與該腫瘤位點(diǎn)的早期結(jié)果相關(guān)，因此，為血液中免疫應(yīng)答測(cè)量有助于評(píng)價(jià)疫苗功效的想法提供進(jìn)一步的促進(jìn)。事實(shí)上，抗原脈沖的CD34+HPC衍生的DC誘導(dǎo)可以直接在血液中檢測(cè)的初次和回憶免疫應(yīng)答。在18個(gè)患者的16個(gè)中觀察到對(duì)對(duì)照抗原(KLH、Flu-MP)的免疫應(yīng)答。在相同的16個(gè)患者中觀察到對(duì)一個(gè)或多個(gè)黑素瘤抗原(MelAg)的加強(qiáng)的免疫應(yīng)答，所述患者包括10個(gè)對(duì)＞2MelAg應(yīng)答的患者。DC接種后引起的MelAg特異性T細(xì)胞在無(wú)需事先離體(ex vivo)擴(kuò)增的效應(yīng)T細(xì)胞試驗(yàn)中是有功能并且可檢測(cè)的。在與加載有抗原的DC的短期(1周)共培養(yǎng)后，無(wú)需外源細(xì)胞因子或用抗原多次重復(fù)刺激，它們就也能夠增殖并具有效應(yīng)功能。未能對(duì)對(duì)照和腫瘤抗原應(yīng)答的兩個(gè)患者經(jīng)歷了快速腫瘤進(jìn)展。患有可評(píng)價(jià)疾病的17個(gè)患者中，對(duì)兩個(gè)或更少的MelAg具有免疫性的患者中，6/7在研究入組(study entry)后10周患有漸進(jìn)性疾病，形成對(duì)比的是，對(duì)＞2個(gè)MelAg具有免疫性的患者中，僅1/10有腫瘤進(jìn)展。在這些患者中的7個(gè)中觀察到＞1個(gè)腫瘤轉(zhuǎn)移的衰退。DC接種后對(duì)黑素瘤抗原的總體免疫性與臨床結(jié)果有關(guān)(p＝0.015)。
血液免疫應(yīng)答分析證實(shí)，Ag-脈沖的CD34-DC可以導(dǎo)致CD4+和CD8+ T細(xì)胞免疫性的快速誘導(dǎo)。事實(shí)上，單次DC接種對(duì)于在6個(gè)患者中的KLH特異性應(yīng)答和8個(gè)患者中的Flu-MP特異性應(yīng)答的誘導(dǎo)是足夠的。單獨(dú)的DC疫苗足以在5個(gè)患者中誘導(dǎo)對(duì)≥1個(gè)黑素瘤抗原的腫瘤特異性效應(yīng)物。這5個(gè)患者中無(wú)一顯示早期疾病進(jìn)展。具有快速KLH應(yīng)答的患者僅1/6經(jīng)歷早期疾病進(jìn)展?？焖俸吐貴lu-MP應(yīng)答者在疾病進(jìn)展方面沒(méi)有區(qū)別。因此，患者對(duì)CD4表位或?qū)谒亓鯝g快速應(yīng)答的能力可以成為基于DC的接種之后臨床結(jié)果的早期指示。
十一個(gè)患者接受4個(gè)額外的“加強(qiáng)”注射。研究入組的總存活分析顯示，在第一年12/18的患者存活，在第二年9/18的患者存活。研究入組的總存活與10周時(shí)(即最初的4次注射之后)檢測(cè)到的疫苗特異性免疫應(yīng)答水平有關(guān)，如通過(guò)(1)量級(jí)，即黑素瘤Ag-特異性IFNγELISPOTS的數(shù)量，以及(2)幅度，即T細(xì)胞應(yīng)答的黑素瘤抗原的數(shù)量來(lái)測(cè)量。最后，長(zhǎng)期腫瘤衰退與表位的擴(kuò)展相關(guān)。因此，顯示DC疫苗中的朗格漢斯細(xì)胞成分是有益的。
樹(shù)突細(xì)胞越來(lái)越多地用作接種載體來(lái)誘導(dǎo)抗原特異性免疫應(yīng)答，例如在癌癥患者中。由于用送遞到DC上的腫瘤抗原進(jìn)行免疫可誘導(dǎo)保護(hù)性抗腫瘤應(yīng)答，以及用加載有抗原的DC對(duì)患者接種可以引起對(duì)腫瘤抗原的增加的免疫應(yīng)答的證據(jù)，對(duì)腫瘤和感染性劑的治療推薦用加載有抗原的DC進(jìn)行接種。因此，產(chǎn)生加載有抗原的DC的方法的改進(jìn)有利于任何接種程序。DC疫苗離體生產(chǎn)的現(xiàn)有方法基于培養(yǎng)CD34+造血祖先(美國(guó)專利No.6,004,807)或單核細(xì)胞(與GM-CSF和IL-4，繼之以成熟步驟)，這些細(xì)胞組成樹(shù)突細(xì)胞前體。然而，這些培養(yǎng)是長(zhǎng)期的，且對(duì)于祖先和前體，分別需要至少9天和7天。另外，產(chǎn)生樹(shù)突細(xì)胞后，DC需要用抗原進(jìn)行脈沖，這要求額外的培養(yǎng)。
發(fā)現(xiàn)了在少至三(3)天內(nèi)快速產(chǎn)生加載有抗原的樹(shù)突細(xì)胞疫苗的方法。通過(guò)該方法產(chǎn)生的加載有抗原的樹(shù)突細(xì)胞可以用于任何治療性、診斷性、預(yù)防性或研究程序中。
發(fā)明概述在一方面，本發(fā)明是從單核細(xì)胞離體生產(chǎn)加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞的方法，包括同時(shí)將單核細(xì)胞與可溶性或顆粒性抗原性材料、腫瘤壞死因子α和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子接觸。加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞優(yōu)選在少于四天內(nèi)產(chǎn)生。在本方法中有用的抗原性材料由一種或多種材料組成，該材料選自抗原性肽、肽模擬物(peptidemimetics)、蛋白、多蛋白、免疫復(fù)合物、完整垂死細(xì)胞體、垂死細(xì)胞體片段、病毒載體和脂質(zhì)體。在優(yōu)選的方法中，抗原性材料由可溶性抗原性材料組成。在另一個(gè)優(yōu)選的方法中，抗原性材料由完整垂死細(xì)胞體、垂死細(xì)胞體片段或兩者組成。在另一個(gè)優(yōu)選的方法中，可以將加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞分離為含有一個(gè)或多個(gè)亞群的級(jí)分，這些亞群選自具有表面標(biāo)志物(CD1a+CD207+)的細(xì)胞；具有表面標(biāo)志物(CD1a+CD207-)的細(xì)胞；具有表面標(biāo)志物(CD1a-CD14-)的細(xì)胞；以及具有表面標(biāo)志物(CD14+CD1a-CD209+)的細(xì)胞。
在另一方面，本發(fā)明是從單核細(xì)胞離體生產(chǎn)加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞的方法，包括在一個(gè)時(shí)間點(diǎn)將單核細(xì)胞與腫瘤壞死因子α和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子接觸，以形成抗原呈遞細(xì)胞，并在第二個(gè)時(shí)間點(diǎn)將抗原呈遞細(xì)胞與可溶性或顆粒性抗原性材料接觸，以形成加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞，其中所述加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞在少于四天內(nèi)產(chǎn)生。在本方法中有用的抗原性材料由一種或多種材料組成，該材料選自抗原性肽、肽模擬物、蛋白、多蛋白、免疫復(fù)合物、完整垂死細(xì)胞體、垂死細(xì)胞體片段、病毒載體和脂質(zhì)體。在優(yōu)選的方法中，抗原性材料由可溶性抗原性材料組成。在另一個(gè)優(yōu)選的方法中，抗原性材料由完整垂死細(xì)胞體、垂死細(xì)胞體片段或兩者組成。在另一個(gè)優(yōu)選的方法中，可以將加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞分離為含有一個(gè)或多個(gè)亞群的級(jí)分，這些亞群選自具有表面標(biāo)志物(CD1a+CD207+)的細(xì)胞；具有表面標(biāo)志物(CD1a+CD207-)的細(xì)胞；具有表面標(biāo)志物(CD1a-CD14-)的細(xì)胞；以及具有表面標(biāo)志物(CD14+CD1a-CD209+)的細(xì)胞。
在另一方面，本發(fā)明是包括加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞的疫苗，根據(jù)下列步驟制備該細(xì)胞同時(shí)將單核細(xì)胞與可溶性或顆粒性抗原性材料、腫瘤壞死因子α和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子離體接觸，以形成加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞。加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞優(yōu)選在少于四天內(nèi)產(chǎn)生。該疫苗中的抗原性材料由一種或多種材料組成，該材料選自抗原性肽、肽模擬物、蛋白、多蛋白、免疫復(fù)合物、完整垂死細(xì)胞體、垂死細(xì)胞體片段、病毒載體和脂質(zhì)體。在優(yōu)選的疫苗中，抗原性材料由可溶性抗原性材料組成。在另一個(gè)優(yōu)選的疫苗中，抗原性材料由完整垂死細(xì)胞體、垂死細(xì)胞體片段或兩者組成。
在另一方面，本發(fā)明是包括加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞的疫苗，根據(jù)下列步驟制備該細(xì)胞在一個(gè)時(shí)間點(diǎn)將單核細(xì)胞與腫瘤壞死因子α和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子離體接觸，以形成抗原呈遞細(xì)胞，在第二個(gè)時(shí)間點(diǎn)將抗原呈遞細(xì)胞與可溶性或顆粒性抗原性材料接觸，以形成加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞，其中所述加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞在少于四天內(nèi)產(chǎn)生。該疫苗中的抗原性材料由一種或多種材料組成，該材料選自抗原性肽、肽模擬物、蛋白、多蛋白、免疫復(fù)合物、完整垂死細(xì)胞體、垂死細(xì)胞體片段、病毒載體和脂質(zhì)體。在優(yōu)選的疫苗中，抗原性材料由可溶性抗原性材料組成。在另一個(gè)優(yōu)選的疫苗中，抗原性材料由完整垂死細(xì)胞體、垂死細(xì)胞體片段或兩者組成。
在另一方面，本發(fā)明是包括單核細(xì)胞衍生的加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞的疫苗，其中所述抗原呈遞細(xì)胞包括朗格漢斯細(xì)胞和間質(zhì)樹(shù)突細(xì)胞。
在另一方面，本發(fā)明是包括單核細(xì)胞衍生的加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞的疫苗，其中所述抗原呈遞細(xì)胞兩個(gè)或更多個(gè)亞群組成，該亞群選自具有表面標(biāo)志物(CD1a+CD207+)的細(xì)胞；具有表面標(biāo)志物(CD1a+CD207-)的細(xì)胞；具有表面標(biāo)志物(CD1a-CD14-)的細(xì)胞；以及具有表面標(biāo)志物(CD14+CD1a-CD209+)的細(xì)胞。
在另一方面，本發(fā)明是在腫瘤患者中誘導(dǎo)腫瘤特異性免疫應(yīng)答的方法，包括(1)產(chǎn)生包括加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞的疫苗，其中加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞通過(guò)同時(shí)將單核細(xì)胞與擁有至少一種腫瘤抗原的可溶性或顆粒性抗原性材料、腫瘤壞死因子α和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子接觸，離體衍生自單核細(xì)胞；以及(2)將該疫苗施用于患者，其中患者的細(xì)胞在與疫苗中加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞接觸后成熟以形成對(duì)腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)細(xì)胞毒性活性的細(xì)胞毒性細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)在一個(gè)時(shí)間點(diǎn)將單核細(xì)胞與腫瘤壞死因子α和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子離體接觸，以形成抗原呈遞細(xì)胞，在第二個(gè)時(shí)間點(diǎn)將所述抗原呈遞細(xì)胞與擁有至少一種腫瘤抗原的可溶性或顆粒性抗原性材料接觸，以形成加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞，來(lái)制備加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞，其中加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞在少于四天內(nèi)產(chǎn)生。在優(yōu)選的方法中，抗原性材料由可溶性抗原性材料組成。在另一個(gè)優(yōu)選的方法中，抗原性材料由完整垂死細(xì)胞體、垂死細(xì)胞體片段或兩者組成。在另一個(gè)優(yōu)選的方法中，靶向的細(xì)胞毒性細(xì)胞為CD4陽(yáng)性。在另一個(gè)優(yōu)選的方法中，靶向的細(xì)胞毒性細(xì)胞為CD8陽(yáng)性。
在另一方面，本發(fā)明是在腫瘤患者體內(nèi)誘導(dǎo)腫瘤特異性應(yīng)答的方法，包括(1)從患者分離單核細(xì)胞和細(xì)胞毒性細(xì)胞前體；(2)通過(guò)同時(shí)將所述單核細(xì)胞與擁有至少一種腫瘤抗原的可溶性或顆粒性抗原性材料、腫瘤壞死因子α和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子接觸，從患者的單核細(xì)胞產(chǎn)生加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞；(3)將加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞與分離的細(xì)胞毒性細(xì)胞前體在其可以成熟以形成細(xì)胞毒性細(xì)胞的條件下共培養(yǎng)；以及(4)將該細(xì)胞毒性細(xì)胞施用于患者，該細(xì)胞毒性細(xì)胞由此表現(xiàn)抗腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞通過(guò)如下步驟產(chǎn)生在一個(gè)時(shí)間點(diǎn)將單核細(xì)胞與腫瘤壞死因子α和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子離體接觸，以形成抗原呈遞細(xì)胞，在第二個(gè)時(shí)間點(diǎn)將所述抗原呈遞細(xì)胞與擁有至少一種腫瘤抗原的可溶性或顆粒性抗原性材料接觸，以形成加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞，其中所述加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞在少于四天內(nèi)產(chǎn)生。在優(yōu)選的方法中。在優(yōu)選的方法中，抗原性材料由可溶性抗原性材料組成。在另一個(gè)優(yōu)選的方法中，抗原性材料由完整垂死細(xì)胞體、垂死細(xì)胞體片段或兩者組成。在一個(gè)優(yōu)選的方法中，細(xì)胞毒性細(xì)胞為CD4陽(yáng)性。在另一個(gè)優(yōu)選的方法中，細(xì)胞毒性細(xì)胞為CD8陽(yáng)性。
在另一方面，本發(fā)明是在患者體內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，包括(1)產(chǎn)生包括加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞的疫苗，其中加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞通過(guò)同時(shí)將單核細(xì)胞與擁有至少一種免疫應(yīng)答所需抗原的可溶性或顆粒性抗原性材料、腫瘤壞死因子α和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子接觸，離體衍生于單核細(xì)胞；以及(2)將該疫苗施用于患者，其中患者的細(xì)胞在與疫苗中加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞接觸后成熟，以形成表現(xiàn)抗該抗原免疫活性的細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞通過(guò)以下步驟制備在一個(gè)時(shí)間點(diǎn)將單核細(xì)胞與腫瘤壞死因子α和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子離體接觸以形成抗原呈遞細(xì)胞，在第二個(gè)時(shí)間點(diǎn)將所述抗原呈遞細(xì)胞與擁有至少一種免疫應(yīng)答所需抗原的可溶性或顆粒性抗原性材料接觸，以形成加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞，其中所述加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞在少于四天內(nèi)產(chǎn)生。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該抗原性材料由可溶性抗原性材料組成。在另一個(gè)優(yōu)選的方法中，抗原性材料由完整垂死細(xì)胞體、垂死細(xì)胞體片段或兩者組成。在一個(gè)優(yōu)選的方法中，靶向的細(xì)胞毒性細(xì)胞為CD4陽(yáng)性。在另一個(gè)優(yōu)選的方法中，靶向的細(xì)胞毒性細(xì)胞為CD8陽(yáng)性。
在另一方面，本發(fā)明是確立(mount)由細(xì)胞毒性T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的方法，包括(1)通過(guò)同時(shí)將單核細(xì)胞與擁有至少一種免疫應(yīng)答所需抗原的可溶性或顆粒性抗原性材料、腫瘤壞死因子α和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子接觸，從單核細(xì)胞離體產(chǎn)生加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞；(2)在T細(xì)胞可以成熟形成細(xì)胞毒性T細(xì)胞的條件下，將該加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞與原初T細(xì)胞共培養(yǎng)；以及(3)將該細(xì)胞毒性T細(xì)胞與擁有該抗原的靶細(xì)胞接觸，其中細(xì)胞毒性T細(xì)胞對(duì)擁有該抗原的靶細(xì)胞表現(xiàn)細(xì)胞毒活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞通過(guò)以下步驟制備在一個(gè)時(shí)間點(diǎn)將單核細(xì)胞與腫瘤壞死因子α和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子離體接觸以形成抗原呈遞細(xì)胞，在第二個(gè)時(shí)間點(diǎn)將所述抗原呈遞細(xì)胞與擁有至少一種免疫應(yīng)答所需抗原的可溶性或顆粒性抗原性材料接觸，以形成加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞，其中所述加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞在少于四天內(nèi)產(chǎn)生。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該抗原性材料由可溶性抗原性材料組成。在另一個(gè)優(yōu)選的方法中，抗原性材料由完整垂死細(xì)胞體、垂死細(xì)胞體片段或兩者組成。在一個(gè)優(yōu)選的方法中，細(xì)胞毒性細(xì)胞為CD4陽(yáng)性。在另一個(gè)優(yōu)選的方法中，細(xì)胞毒性細(xì)胞為CD8陽(yáng)性。
在另一方面，本發(fā)明是修飾患者免疫應(yīng)答的方法，包括(1)產(chǎn)生加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞，其中加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞通過(guò)同時(shí)將單核細(xì)胞與擁有至少一種免疫應(yīng)答所需抗原的可溶性或顆粒性抗原性材料、腫瘤壞死因子α和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子接觸，離體衍生于單核細(xì)胞；以及(2)將該抗原呈遞細(xì)胞施用于患者，其中與加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞接觸的患者細(xì)胞被調(diào)節(jié)為不對(duì)該抗原表現(xiàn)免疫活性。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明是產(chǎn)生由兩個(gè)或更多個(gè)亞群組成的加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞級(jí)分的方法，包括(1)同時(shí)將單核細(xì)胞與可溶性或顆粒性抗原性材料、腫瘤壞死因子α和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子離體接觸，以形成加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞；(2)從該加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞分離兩個(gè)或更多個(gè)亞群，其中各亞群在施用于患者時(shí)，能引起不同的T細(xì)胞應(yīng)答并確立不同的免疫應(yīng)答；以及(3)聯(lián)合兩個(gè)或更多個(gè)亞群以形成加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞級(jí)分。
附圖簡(jiǎn)述

圖1A-F描述與用GM-CSF/IL-4(圖1D-1F)培養(yǎng)的單核細(xì)胞相比，用GM-CSF/TNFα(圖1A-1C)培養(yǎng)第三天的單核細(xì)胞在FSC/SSC、CD1a/CD14和CD1a/HLA-DR方面的表型。如在用GM-CSF和IL-4的對(duì)照培養(yǎng)物中所預(yù)期的，細(xì)胞成為CD14陰性，且約50％的細(xì)胞獲得與DC分化一致的CD1a表達(dá)(圖1E)。然而，在用GM-CSF和TNFα的第三天培養(yǎng)物中，可見(jiàn)兩個(gè)分離的群體CD1a+CD14-(20％)細(xì)胞和CD1a-CD14+(24％)細(xì)胞(圖1B)。
圖2A和2B描述與用GM-CSF/IL-4(圖2A)培養(yǎng)的單核細(xì)胞相比，以GM-CSF/TNFα(圖2B)培養(yǎng)第三天的單核細(xì)胞在DC-SIGN和Langerin(分別為間質(zhì)DC(intDC)和朗格漢斯細(xì)胞(LC)的表面標(biāo)志物)方面的表型。TNF培養(yǎng)物含有差異地表達(dá)DC-SIGN和Langerin的細(xì)胞。與TNF-DC不同，IL4-DC是均一的，細(xì)胞大部分為與intDC分化一致的DC-SIGN+ Langerin-。
圖3A-3F描述與使用GM-CSF/IL-4處理方法制備的樹(shù)突細(xì)胞相比，用GM-CSF/TNFα對(duì)單核細(xì)胞培養(yǎng)三天產(chǎn)生的樹(shù)突細(xì)胞的抗原捕獲效率。TNF-DC在捕獲可溶性(FITC-葡聚糖)(圖3A-3B)和顆粒性(殺傷的腫瘤細(xì)胞)抗原(圖3C)中都和GM-CSF/IL-4 DC(可溶性FITC-葡聚糖在圖3D和3E中；顆粒性抗原在圖3F中)一樣有效。
圖4描述與GM-CSF/IL-4 DC相比，第三天的GM-CSF/TNF DC啟動(dòng)免疫應(yīng)答的能力，如通過(guò)異源CD4 T細(xì)胞增殖的誘導(dǎo)所證實(shí)的。第三天的GM-CSF/TNF DC和GM-CSF/IL-4 DC都證實(shí)了誘導(dǎo)CD4 T細(xì)胞增殖的能力。
圖5描述與GM-CSF/IL-4 DC相比，第三天的GM-CSF/TNF DC誘導(dǎo)異源CD8 T細(xì)胞增殖的能力。第三天的GM-CSF/TNF DC和GM-CSF/IL-4 DC都證實(shí)了誘導(dǎo)CD8 T細(xì)胞增殖的能力。
圖6A和6B描述單核細(xì)胞誘導(dǎo)異源CD4 T細(xì)胞增殖的能力，所述單核細(xì)胞用或不用殺傷的腫瘤細(xì)胞以及GM-CSF/TNFα(圖6B)或GM-CSF/IL-4(圖6A)培養(yǎng)3天。第三天的GM-CSF/TNFα/殺傷的腫瘤細(xì)胞的一步疫苗(one-step vaccine)能夠誘導(dǎo)異源CD4 T細(xì)胞增殖。
圖7A和7B描述單核細(xì)胞誘導(dǎo)異源CD8 T細(xì)胞增殖的能力，所述單核細(xì)胞用或不用殺傷的腫瘤細(xì)胞以及GM-CSF/TNFα(圖7B)或GM-CSF/IL-4(圖7A)培養(yǎng)3天。第三天的GM-CSF/TNFα/殺傷的腫瘤細(xì)胞的一步疫苗能夠誘導(dǎo)異源CD8 T細(xì)胞增殖。
圖8A和8B描述單核細(xì)胞向自身CD4 T細(xì)胞呈遞腫瘤細(xì)胞抗原的能力，所述單核細(xì)胞用或不用殺傷的腫瘤細(xì)胞以及GM-CSF/TNFα(圖8B)或GM-CSF/IL-4(圖8A)培養(yǎng)3天。如通過(guò)其誘導(dǎo)自身CD4 T細(xì)胞增殖所證實(shí)的，第三天的GM-CSF/TNFα/殺傷的腫瘤細(xì)胞的一步疫苗能夠向自身CD4 T細(xì)胞呈遞腫瘤細(xì)胞抗原。
圖9A-9L描述單核細(xì)胞分化為樹(shù)突細(xì)胞的兩個(gè)亞群，即朗格漢斯細(xì)胞(Langerin+及DC-SIGN-)和間質(zhì)樹(shù)突細(xì)胞(Langerin-和DC-SIGN+)的能力，所述單核細(xì)胞用或不用殺傷的腫瘤細(xì)胞以及GM-CSF/TNFα培養(yǎng)3天。在單核細(xì)胞腫瘤體比率為1∶0.1時(shí)，腫瘤體的滴定顯示最佳分化(圖9L)。
圖10A-10I描述單核細(xì)胞分化為樹(shù)突細(xì)胞的兩個(gè)亞群，即朗格漢斯細(xì)胞(Langerin+及DC-SIGN-)和間質(zhì)樹(shù)突細(xì)胞(Langerin-和DC-SIGN+)的能力，所述單核細(xì)胞用GM-CSF/TNFα培養(yǎng)3天，并在單核細(xì)胞培養(yǎng)第二天以分級(jí)劑量添加殺傷的腫瘤細(xì)胞來(lái)培養(yǎng)。
圖11描述單核細(xì)胞向自身免疫效應(yīng)細(xì)胞(外周血淋巴細(xì)胞)呈遞腫瘤細(xì)胞抗原的能力，所述單核細(xì)胞用或不用殺傷的腫瘤細(xì)胞以及GM-CSF/TNFα培養(yǎng)3天。在單核細(xì)胞∶腫瘤體比率為1∶0.3時(shí)觀察到最佳呈遞。
圖12A和12B描述單核細(xì)胞誘導(dǎo)自身CD8+ T細(xì)胞分化為細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的能力，該細(xì)胞毒性T細(xì)胞能夠在已經(jīng)培養(yǎng)2周之后殺傷黑素瘤細(xì)胞，所述單核細(xì)胞用(圖12B)或不用(圖12A)殺傷的腫瘤細(xì)胞以及GM-CSF/TNFα培養(yǎng)3天。
圖13A和13B描述單核細(xì)胞誘導(dǎo)自身CD8+ T細(xì)胞分化為細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的能力，該細(xì)胞毒性T細(xì)胞能夠在3次刺激之后殺傷黑素瘤細(xì)胞，所述單核細(xì)胞用(圖13B)或不用(圖13A)殺傷的腫瘤細(xì)胞以及GM-CSF/TNFα培養(yǎng)3天。
圖14A和14B描述單核細(xì)胞誘導(dǎo)自身CD8+ T細(xì)胞分化為細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的能力，該細(xì)胞毒性T細(xì)胞能夠在2次刺激之后殺傷黑素瘤細(xì)胞，所述單核細(xì)胞用(圖14B)或不用(圖14A)殺傷的腫瘤細(xì)胞以及GM-CSF/IL-4培養(yǎng)3天。
圖15A-15D描述GM-CSF/TNFα DC誘導(dǎo)肽特異性回憶CD8 T細(xì)胞應(yīng)答的能力。將Flu-MP肽脈沖的GM-CSF/IL-4 DC或GM-CSF/TNFαDC以1∶10的比例，與自身CD8 T細(xì)胞和細(xì)胞因子補(bǔ)料(IL-7和IL-2，10U/ml)培養(yǎng)。在第10天，以抗-CD8(橫坐標(biāo))和Flu-MP四聚物(縱坐標(biāo))標(biāo)記T細(xì)胞，以確定特異性CD8 T細(xì)胞的擴(kuò)增。Flu-MP肽脈沖的GM-CSF/TNFα DC顯示在10天培養(yǎng)物中可有效誘導(dǎo)Flu-MP特異性CD8 T細(xì)胞的擴(kuò)增。
圖16描述在GM-CSF/TNFα DC不同亞群的表面表型方面的DC基因表達(dá)模式，顯示CD14+intDC(水平條紋)、CD1a+LC(打點(diǎn)的)以及CD14-CD1a-DN-DC(垂直條紋)的指示基因(橫坐標(biāo))的表達(dá)倍數(shù)(縱坐標(biāo))。呈遞的基因CD1a、DC-SIGN(也被稱為CD209)以及Langerin(也被稱為CD207)選自這些DC亞群間統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的差異表達(dá)基因。CD14+亞群表達(dá)DC-SIGN，表示是intDC。CD1a+亞群表達(dá)Langerin，表示是LC。DN(雙陰性)亞群不顯著表達(dá)任何上述選擇的標(biāo)志物。
圖17描述GM-CSF/TNFα DC不同亞群的細(xì)胞因子mRNA的差異表達(dá)，顯示CD14+intDC(水平條紋)、CD1a+LC(打點(diǎn)的)以及CD14-CD1a-DN-DC(垂直條紋)的指示基因(橫坐標(biāo))的表達(dá)倍數(shù)(縱坐標(biāo))。DC亞群表現(xiàn)細(xì)胞因子IL-1、IL-15、IL-8、LTB(淋巴毒素β)和TGFA(轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α)的顯著差異表達(dá)，CD14+亞群表達(dá)IL-1；CD1a+DC亞群主要表達(dá)TGFA和IL-8；以及DN亞群表達(dá)IL-15和LTB。
圖18描述GM-CSF/TNFαDC亞群誘導(dǎo)原初異源CD4 T細(xì)胞旺盛增殖的能力。將總DC培養(yǎng)物或分選的亞群以分級(jí)劑量(橫坐標(biāo))與原初(CD45RA+CCR7+CD45RO-)CD4+ T細(xì)胞平板接種。通過(guò)于第5天胸苷整合(縱坐標(biāo))來(lái)測(cè)量增殖。所有亞群能夠引發(fā)原初CD4T細(xì)胞；然而，用intDC(CD14+)的培養(yǎng)物中的CD4 T細(xì)胞增殖較不明顯。
圖19描述由GM-CSF/TNFα DC不同亞群引發(fā)的CD4 T細(xì)胞中趨化因子受體的差異表達(dá)，顯示用intDC(CD14，水平條紋)、CD1a DC(LC，打點(diǎn)的)或DN-DC(垂直條紋)的培養(yǎng)物中的表達(dá)倍數(shù)(縱坐標(biāo))。
詳述本發(fā)明涉及離體產(chǎn)生人類抗原呈遞細(xì)胞的組合物和方法。本發(fā)明更特別地涉及使用激活劑產(chǎn)生抗原呈遞細(xì)胞的方法和組合物，該激活劑包括但是不限于TNFα，優(yōu)選與生長(zhǎng)因子組合，該生長(zhǎng)因子包括但是不限于粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)。本發(fā)明特別適于從血液前體離體產(chǎn)生樹(shù)突細(xì)胞。
本發(fā)明是離體或體外從血液前體例如單核細(xì)胞生產(chǎn)抗原呈遞細(xì)胞的方法，以用于治療(疫苗)、診斷(免疫監(jiān)控)和研究(腫瘤抗原的鑒定)目的，該方法包括將血液前體與組合物接觸，所述組合物包括優(yōu)選與至少一種生長(zhǎng)因子(包括但是不限于GM-CSF)組合的激活劑，該激活劑包括但是不限于腫瘤壞死因子(TNF)α。如此處所使用，將TNFα定義為在本發(fā)明方法中起激活劑功能的TNFα或任何TNF或TNF樣蛋白。與本發(fā)明有關(guān)的生長(zhǎng)因子和/或激活因子的制劑包括但是不限于重組分子和/或病毒載體和/或類肽(peptoids)和/或任何可以觸發(fā)前體進(jìn)行生長(zhǎng)因子和/或激活劑內(nèi)源性釋放的分子。這些包括間質(zhì)DC和朗格漢斯細(xì)胞(LC)混合物的樹(shù)突細(xì)胞可以對(duì)抗原進(jìn)行致敏，并施用于患者以調(diào)節(jié)患者體內(nèi)對(duì)該抗原的免疫應(yīng)答。本發(fā)明也包括含有樹(shù)突細(xì)胞的組合物，該樹(shù)突細(xì)胞根據(jù)本方法產(chǎn)生。本發(fā)明中有用的抗原性材料包括可溶性或顆粒性抗原性材料。當(dāng)使用完整腫瘤細(xì)胞作為抗原性材料時(shí)，該細(xì)胞既可以是死亡的也可以是垂死的，且如此處所使用，認(rèn)為任一術(shù)語(yǔ)是等價(jià)的。
一方面，本發(fā)明是離體從單核細(xì)胞生產(chǎn)疫苗的一步法，包括將單核細(xì)胞與組合物接觸，所述組合物包括例如優(yōu)選與至少一種生長(zhǎng)因子例如GM-CSF和至少一種可溶性或顆粒性抗原組合的TNFα。本發(fā)明也包括根據(jù)本方法產(chǎn)生的一步疫苗。根據(jù)本發(fā)明的方法，加載有抗原樹(shù)突細(xì)胞疫苗可以在少至三(3)天之內(nèi)產(chǎn)生。通過(guò)將單核細(xì)胞和可溶性或顆粒性抗原(例如殺傷的腫瘤細(xì)胞)與生長(zhǎng)因子(例如GM-CSF)和激活劑(例如TNFα)培養(yǎng)，可制備這些樹(shù)突細(xì)胞。重要的是，報(bào)道的作為癌癥疫苗的單核細(xì)胞衍生的樹(shù)突細(xì)胞的產(chǎn)生需要與白細(xì)胞介素4(IL-4)或IL-13組合的GM-CSF或IL-3的使用。這些細(xì)胞因子都與T細(xì)胞應(yīng)答向2型或調(diào)節(jié)T細(xì)胞的極化強(qiáng)烈相關(guān)，這并非腫瘤疫苗接種的情況中所希望的。本發(fā)明因此有助于樹(shù)突細(xì)胞疫苗的產(chǎn)生，且這類疫苗現(xiàn)在可以用于大規(guī)模臨床試驗(yàn)。
目前發(fā)現(xiàn)，促炎細(xì)胞因子例如GM-CSF和TNFα將促進(jìn)單核細(xì)胞向樹(shù)突細(xì)胞的分化，樹(shù)突細(xì)胞包括至少四個(gè)樹(shù)突細(xì)胞亞群，即具有表面標(biāo)志物(CD1a+CD14-CD207+)的朗格漢斯細(xì)胞(LC)、具有表面標(biāo)志物(CD1a+CD14+CD207-)的間質(zhì)DC(intDC)、具有表面標(biāo)志物(CD1a-CD14-)的雙陰性DC(DN-DC)以及具有表面標(biāo)志物(CD1a-CD14+CD209+)的第四個(gè)亞群。這些樹(shù)突細(xì)胞前體可以捕獲抗原并隨后離體分化為可用于臨床試驗(yàn)的加載有抗原的及抗原呈遞的樹(shù)突細(xì)胞。另外，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生樹(shù)突細(xì)胞疫苗所需的三個(gè)因子，即樹(shù)突細(xì)胞前體、抗原和細(xì)胞因子，可以同時(shí)置于一起以快速產(chǎn)生加載有抗原的樹(shù)突細(xì)胞疫苗。和現(xiàn)有的耗時(shí)并且需要三個(gè)步驟的技術(shù)(即，從祖先或前體的樹(shù)突細(xì)胞離體產(chǎn)生，分別用9和7天；隨后的抗原加載，以及從單核細(xì)胞產(chǎn)生樹(shù)突細(xì)胞時(shí)該細(xì)胞的活化)不同，本發(fā)明允許樹(shù)突細(xì)胞的快速、一步產(chǎn)生，其中組合了所述過(guò)程中所有必需的因子。
根據(jù)本發(fā)明方法，該疫苗由血液白細(xì)胞提取法制備，其中通過(guò)粘附或通過(guò)排除或通過(guò)正選擇分離單核細(xì)胞。然后在組織培養(yǎng)袋或塑料培養(yǎng)皿或Nunc Cell factories中培養(yǎng)這種分離的單核細(xì)胞。在第一天添加細(xì)胞因子；在第一天或第二天添加抗原，例如以殺傷的腫瘤細(xì)胞的形式；在第三天施用疫苗。
在本發(fā)明的另一方面，該疫苗為冷凍的，用于加強(qiáng)注射。另一方面，該疫苗用于制備用于加強(qiáng)注射的外來(lái)體。另一方面，由該疫苗制備的外來(lái)體用作抗原制劑，以與單核細(xì)胞和細(xì)胞因子混合以制備疫苗。
根據(jù)本發(fā)明的方法，該疫苗由血液?jiǎn)挝恢苽?，其中通過(guò)粘附或通過(guò)排除或通過(guò)正選擇分離單核細(xì)胞。然后在組織培養(yǎng)袋或塑料培養(yǎng)皿或Nunc Cell factories中培養(yǎng)這種分離的單核細(xì)胞。在第一天添加細(xì)胞因子；在第一天或第二天添加抗原，例如以殺傷的腫瘤細(xì)胞的形式；在第三天施用疫苗。在本發(fā)明的這個(gè)實(shí)施方案中，為各注射新鮮制備該疫苗，并每月制備血液汲取物(draw)。
一方面，本發(fā)明是體外或離體產(chǎn)生抗原特異性CD4+ T淋巴細(xì)胞的方法，包括提供抗原致敏的樹(shù)突細(xì)胞，該細(xì)胞通過(guò)以下步驟制備將血液前體與包括例如優(yōu)選與至少一種生長(zhǎng)因子如GM-CSF組合的TNFα的組合物接觸，以形成樹(shù)突細(xì)胞；使該樹(shù)突細(xì)胞對(duì)至少一種可溶性或顆粒性抗原致敏以形成抗原致敏的樹(shù)突細(xì)胞；將該抗原致敏的樹(shù)突細(xì)胞與包括T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞群體接觸，以形成活化的抗原特異性CD4+ T淋巴細(xì)胞?？梢詫⑦@些抗原特異性CD4+ T淋巴細(xì)胞施用于患者以調(diào)節(jié)該患者體內(nèi)的免疫應(yīng)答。本發(fā)明也包含包括抗原特異性CD4+ T淋巴細(xì)胞的組合物，所述CD4+ T淋巴細(xì)胞根據(jù)此方法產(chǎn)生。
一方面，本發(fā)明是體外或離體產(chǎn)生抗原特異性CD4+ T淋巴細(xì)胞的方法，包括提供抗原致敏的樹(shù)突細(xì)胞，該細(xì)胞通過(guò)以下步驟制備將血液前體與包括例如優(yōu)選與至少一種生長(zhǎng)因子例如GM-CSF、以及可溶性或顆粒性抗原組合的TNFα的組合物接觸，以形成抗原致敏的樹(shù)突細(xì)胞；將該抗原致敏的樹(shù)突細(xì)胞與包括T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞群體接觸，以形成活化的抗原特異性CD4+ T淋巴細(xì)胞?？梢詫⑦@些抗原特異性CD4+ T淋巴細(xì)胞施用于患者以調(diào)節(jié)該患者體內(nèi)的免疫應(yīng)答。本發(fā)明也包含包括抗原特異性CD4+ T淋巴細(xì)胞的組合物，所述CD4+ T淋巴細(xì)胞根據(jù)此方法產(chǎn)生。
一方面，本發(fā)明是體外或離體產(chǎn)生抗原特異性CD8+ T淋巴細(xì)胞的方法，包括提供抗原致敏的樹(shù)突細(xì)胞，該細(xì)胞通過(guò)以下步驟制備將血液前體與包括例如優(yōu)選與至少一種生長(zhǎng)因子例如GM-CSF組合的TNFα的組合物接觸，以形成樹(shù)突細(xì)胞；使該樹(shù)突細(xì)胞對(duì)至少一種抗原致敏以形成抗原致敏的樹(shù)突細(xì)胞；將該抗原致敏的樹(shù)突細(xì)胞與包括T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞群體接觸，以形成活化的抗原特異性CD8+T淋巴細(xì)胞?？梢詫⑦@些抗原特異性CD8+T淋巴細(xì)胞施用于患者以調(diào)節(jié)該患者體內(nèi)的免疫應(yīng)答。本發(fā)明也包含包括抗原特異性CD8+T淋巴細(xì)胞的組合物，所述CD8+T淋巴細(xì)胞根據(jù)此方法產(chǎn)生。
一方面，本發(fā)明是體外或離體產(chǎn)生抗原特異性CD8+T淋巴細(xì)胞的方法，包括提供抗原致敏的樹(shù)突細(xì)胞，該細(xì)胞通過(guò)以下步驟制備將血液前體與包括例如優(yōu)選與至少一種生長(zhǎng)因子例如GM-CSF、以及至少一種可溶性或顆粒性抗原組合的TNFα的組合物接觸，以形成抗原致敏的樹(shù)突細(xì)胞；將該抗原致敏的樹(shù)突細(xì)胞與包括T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞群體接觸，以形成活化的抗原特異性CD8+T淋巴細(xì)胞?？梢詫⑦@些抗原特異性CD8+T淋巴細(xì)胞施用于患者以調(diào)節(jié)該患者體內(nèi)的免疫應(yīng)答。本發(fā)明也包含包括抗原特異性CD8+T淋巴細(xì)胞的組合物，所述CD8+T淋巴細(xì)胞根據(jù)此方法產(chǎn)生。
通用方法此處所用本發(fā)明的加載有抗原的DC的快速生產(chǎn)方法在下面詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，這些方法意為具有代表性的，并將諸如本領(lǐng)域所知的修改預(yù)期為本發(fā)明的部分。
細(xì)胞培養(yǎng)。使用Ficoll-Paque密度梯度離心，從健康志愿者或晚期黑素瘤患者的外周血分離單核的細(xì)胞。通過(guò)使用微珠進(jìn)行排除或2小時(shí)塑料粘附方法富集單核細(xì)胞。將單核細(xì)胞以1×106細(xì)胞/孔、在3ml補(bǔ)充了2mM L-谷氨酰胺、200UI/ml青霉素、200μg/ml鏈霉素和10％FBS或5％自身血清的血清補(bǔ)料的RPMI 1640培養(yǎng)基中，接種于6孔板中。將殺傷的腫瘤細(xì)胞以1×106個(gè)死細(xì)胞/孔的密度加入6孔板中。將單核細(xì)胞用GM-CSF(100ng/ml，Immunex，Seattle，WA)和TNFα(20ng/ml，R & D)培養(yǎng)三天。
腫瘤細(xì)胞系的殺傷。
可以從多個(gè)癌細(xì)胞系制備殺傷的腫瘤細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞來(lái)源包括但是不限于此處列出的那些，另外的細(xì)胞系的選擇和殺傷這些細(xì)胞的方法的變化完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)之內(nèi)。本發(fā)明中有用的殺傷癌細(xì)胞的方法包括但是不限于引起DNA損傷的條件例如輻射，或經(jīng)Fas連接、TNF或TRAIL的受體介導(dǎo)的細(xì)胞死亡。下面提供示例性方法。
一旦匯合，就收獲細(xì)胞系并以1×106細(xì)胞/ml的密度在小瓶中培養(yǎng)。對(duì)于1806乳腺癌細(xì)胞系和Colo 829黑素瘤細(xì)胞系，經(jīng)過(guò)以TNF-α(以100ng/ml使用)的致敏步驟后，將細(xì)胞照射90分鐘，并在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時(shí)。對(duì)于Me275黑素瘤細(xì)胞系，將細(xì)胞用樺木酸(BA)(10μg/ml，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)培養(yǎng)48小時(shí)。通過(guò)FITC-膜聯(lián)蛋白V和碘化丙錠雙染、以及通過(guò)錐蟲(chóng)藍(lán)排除(＜25％生存力)評(píng)價(jià)細(xì)胞死亡。
流式細(xì)胞術(shù)(FACS)分析。
培養(yǎng)3天后，處理細(xì)胞以使用FITC-CD1a和PE-CD14、PE-CD80、PE-CD83或PE-CD86雙染(于4℃進(jìn)行30分鐘)。
自身增殖測(cè)定。
培養(yǎng)3天后，使用該細(xì)胞作為自身CD4T細(xì)胞的刺激物。將分級(jí)劑量的刺激細(xì)胞與1×105個(gè)CD4+T細(xì)胞在含有10％人AB血清的完全RPMI 1640中接種于圓底微量(microtest)組織培養(yǎng)板中。溫育4天后，細(xì)胞以1μCi[3H]胸苷脈沖過(guò)夜以測(cè)定T細(xì)胞增殖。
細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)產(chǎn)生測(cè)定。
培養(yǎng)3天后，使用該細(xì)胞作為自身CD8T細(xì)胞和/或自身外周血淋巴細(xì)胞(PBL)的刺激物。每周對(duì)培養(yǎng)物重復(fù)刺激，并在第一周內(nèi)補(bǔ)充IL-7，接下來(lái)的星期補(bǔ)充IL-2。在使用產(chǎn)生腫瘤體的黑素瘤細(xì)胞作為靶的標(biāo)準(zhǔn)鉻釋放測(cè)定中測(cè)試CTL活性。
疫苗的產(chǎn)生本發(fā)明的疫苗可用于產(chǎn)生能夠免疫應(yīng)答的DC，是相對(duì)于已報(bào)導(dǎo)的要求多重步驟和長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間的方法的顯著進(jìn)步。下文描述了產(chǎn)生一步疫苗的詳細(xì)示例性程序。應(yīng)當(dāng)理解，在本領(lǐng)域技術(shù)人員能力之內(nèi)的培養(yǎng)條件和制備方法中的修改或變化被預(yù)期為本發(fā)明的部分。
從健康志愿者或晚期黑素瘤患者的外周血分離單核的細(xì)胞。血液采集之前，為了外周血干細(xì)胞的動(dòng)員，任選地將重組的人類G-CSF(Amgen，Thousand Oaks，CA)施用于個(gè)體(Banchereau等人，2001)。使用Ficoll-Paque密度梯度離心收集單核細(xì)胞，并重懸于CM培養(yǎng)基中?？梢酝ㄟ^(guò)在37℃將單核細(xì)胞在塑料皿上粘附2小時(shí)而對(duì)其進(jìn)行富集(Falcon 6-well，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ)。作為選擇，可以根據(jù)廠商程序使用DynalMonocyte Negative Isolation Kit(Dynal，LakeSuccess，NY)去除T細(xì)胞、B細(xì)胞、天然殺傷細(xì)胞和粒細(xì)胞，從而富集單核細(xì)胞。
將單核細(xì)胞以1×106細(xì)胞/孔、在3ml補(bǔ)充了2mM L-谷氨酰胺、200UI/ml青霉素、200μg/ml鏈霉素(均購(gòu)自Sigma Chemical Co.，St.Louis，Mo)和10％胎牛血清(FBS，Hyclone)或5％自身血清(R & D)的血清補(bǔ)料的RPMI 1640培養(yǎng)基中，接種于6孔板中(Falcon)。將單核細(xì)胞用100ng/ml的GM-CSF(Immunex，Seattle，WA)和20ng/ml的TNFα(R & D)培養(yǎng)三天。將殺傷的腫瘤細(xì)胞以l×106個(gè)死細(xì)胞/孔的密度加入6孔板中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在第二天而非第一天添加殺傷的腫瘤細(xì)胞，不影響DC的免疫應(yīng)答能力。將培養(yǎng)物在37℃溫育3天。
可以通過(guò)許多方法評(píng)價(jià)培養(yǎng)物(1)檢查DC的形態(tài)學(xué)；(2)通過(guò)下面描述的FACS分析細(xì)胞標(biāo)志物的存在；(3)在下面自身增殖測(cè)定中描述的促進(jìn)CD4+/CD8+T細(xì)胞增殖的能力；以及(4)在細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)產(chǎn)生測(cè)定中描述的誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞誘導(dǎo)的裂解的能力。
實(shí)施例1用GM-CSF和TNFα培養(yǎng)3天的單核細(xì)胞產(chǎn)生兩個(gè)能夠捕獲抗原并誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的樹(shù)突細(xì)胞亞群從用GM-CSF和TNFα培養(yǎng)3天的單核細(xì)胞產(chǎn)生的兩個(gè)類型的DC通過(guò)排除分離單核細(xì)胞，并用GM-CSF/IL-4或GM-CSF/TNFα培養(yǎng)三(3)天。GM-CSF/IL-4和GM-CSF/TNFα培養(yǎng)物都表現(xiàn)出典型的樹(shù)突細(xì)胞形態(tài)學(xué)，當(dāng)在相差顯微鏡下觀察活體時(shí)，所述典型的樹(shù)突細(xì)胞形態(tài)學(xué)以龐大精巧的從細(xì)胞體向許多方向突出的突起或蓋膜(veils)為特征(Banchereau和Steinman，1998)。培養(yǎng)的單核細(xì)胞在細(xì)胞因子的刺激下發(fā)育出細(xì)胞標(biāo)志物?？梢酝ㄟ^(guò)使用熒光染料標(biāo)記的單克隆抗體對(duì)細(xì)胞染色來(lái)觀察這些新的細(xì)胞標(biāo)志物，并在熒光顯微鏡下觀察形態(tài)學(xué)和細(xì)胞分布。作為選擇，可以如圖1A-1F中通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析具有某種類型標(biāo)志物的群體中的細(xì)胞百分比。
如在用GM-CSF和IL-4進(jìn)行的對(duì)照培養(yǎng)物(下文中稱為GM-CSF/IL4-DC)中所預(yù)期，第三天的細(xì)胞成為CD14-(陰性)，且約50％的細(xì)胞獲得與DC分化一致的CD1a表達(dá)(圖1E)，其注定成為intDC。用GM-CSF和TNFα進(jìn)行的第三天培養(yǎng)物(下文中稱為GM-CSF/TNF-DC)則不同，觀察到專有地表達(dá)CD1a或CD14的兩個(gè)分離的群體。CD1a+CD14-和CD1a-CD14+細(xì)胞分別代表約20％和24％的細(xì)胞群，分別代表朗格漢斯DC和intDC(圖1B)。
可以使用另一套標(biāo)志物區(qū)分朗格漢斯細(xì)胞和間質(zhì)DC，即朗格漢斯細(xì)胞(LC)僅表達(dá)Langerin標(biāo)志物，而間質(zhì)DC(intDC)僅表達(dá)DC-SIGN。當(dāng)以FITC標(biāo)記的DC-SIGN或熒光染料PE-CD207染色時(shí)，可以對(duì)細(xì)胞群體檢查這兩種標(biāo)志物的存在或不存在，輔助以流式細(xì)胞術(shù)時(shí)，可以計(jì)算其百分比。如圖2B中所示，用GM-CSF/TNFα進(jìn)行的第三天單核細(xì)胞培養(yǎng)物含有差異表達(dá)DC-SIGN(％)和Langerin(％)的細(xì)胞，顯示朗格漢斯細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞兩者的形成。相反地，在GM-CSF/IL4存在下培養(yǎng)的第三天單核細(xì)胞僅被FITC-DC-SIGN染色，而不被PE-CD207/Langerin染色，顯示僅產(chǎn)生朗格漢斯細(xì)胞(圖2A)。上述結(jié)果顯示，TNF誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化為兩個(gè)樹(shù)突細(xì)胞亞群朗格漢斯細(xì)胞和間質(zhì)DC。
由GM-CSF/TNFα誘導(dǎo)的DC在抗原捕獲中有效本發(fā)明顯示，在GM-CSF/TNFα存在下產(chǎn)生的樹(shù)突細(xì)胞在抗原捕獲中與目前使用GM-CSF/IL4的方法一樣有效。
未成熟DC的主要功能是捕獲抗原作為抗原捕獲并將抗原呈遞給細(xì)胞表面過(guò)程中起始的第一步驟。DC通過(guò)幾個(gè)不同的方法捕獲抗原，包括(1)能夠捕獲大顆粒的吞噬作用或(2)受體介導(dǎo)的胞吞作用。圖3A-3F闡明了在GM-CSF/TNF或GM-CSF/IL-4存在下產(chǎn)生的樹(shù)突細(xì)胞捕獲可溶性抗原或大顆粒的能力。對(duì)于可溶性抗原，如先前所描述的使用FITC標(biāo)記的葡聚糖(Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)(Caux等人，1997.“CD34+ hematopoietic progenitors fromhuman cord blood differentiate along two independent dendritic cellpathways in response to granulocyte-macrophage colony-stimulatingfactor plus tumor necrosis factor alphaII.Functional analysis，”Blood901458-1470)。對(duì)于大的顆粒性抗原，收獲垂死的腫瘤細(xì)胞(黑素瘤或乳腺癌)，以磷酸緩沖鹽水(PBS)洗滌，并如先前所描述的以DNA特異性熒光染料7-氨基放線菌素(7-aminoactinomycin，7-AAD)(Sigma Chemical Co.，St Louis，MO)進(jìn)行標(biāo)記(Nouri-Shirazi等人，2000.“Dendritic cells capture tumor ceIl bodies and process/presenttheir antigens to elicit primary immune responses，”J Immunol 1653797-3803；以及Berard等人，2000.“Priming of CD8 T cellsagainst melanoma antigens using dendritic cells loaded with killedallogeneic melanoma cells，”J Exp Med 1921535-1544)。收獲、洗滌未成熟的DC，并以抗CD11c單克隆抗體進(jìn)行標(biāo)記，該抗體以熒光染料藻紅蛋白(BDIS)使用常規(guī)程序進(jìn)行標(biāo)記。染色后，將DC洗滌并以2×105細(xì)胞/ml的濃度重懸。將FITC-葡聚糖以1mg/ml的濃度、在4℃或37℃與DC細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)。同時(shí)將殺傷的腫瘤細(xì)胞與DC細(xì)胞以1∶l的比率于37℃共培養(yǎng)1小時(shí)。
使用流式細(xì)胞術(shù)，以對(duì)CD11c和葡聚糖(圖3A、3B、3D和3E)或?qū)D11c和7-AAD(圖3C和3F)雙陽(yáng)性的DC的百分比測(cè)量DC對(duì)FITC-葡聚糖或7-AAD標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞體的加載。與GM-CSF/IL-4-DC相比，第三天的GM-CSF/TNF-DC以相似的水平捕獲可溶性(FITC-葡聚糖)和顆粒性(殺傷的腫瘤細(xì)胞)抗原。
經(jīng)GM-CSF/TNF產(chǎn)生的第三天的DC有效地啟動(dòng)免疫反應(yīng)本發(fā)明顯示，以GM-CSF/TNF方法產(chǎn)生的第三天的DC通過(guò)誘導(dǎo)CD4+和CD8+ T細(xì)胞的增殖有效地啟動(dòng)免疫反應(yīng)。
捕獲和加工抗原后，未成熟DC成熟并獲得誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力。DC可以刺激多種T細(xì)胞的向外生長(zhǎng)(outgrowth)和活化，例如通過(guò)具有I類MHC的DC刺激CD8 T細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞毒性T細(xì)胞，或者通過(guò)具有II類MHC的DC刺激CD4+ T細(xì)胞進(jìn)入輔助T細(xì)胞(Banchereau和Steinman，1998)。
在增殖測(cè)定中，將從GM-CSF/TNF或GM-CSF/IL4產(chǎn)生的第三天的DC以每孔0至2500個(gè)抗原呈遞細(xì)胞(APC)的分級(jí)劑量接種于96孔板內(nèi)。從Ficoll分離的健康個(gè)體的PBMC獲得純化的CD4+和CD8+細(xì)胞，通過(guò)多種單克隆抗體排除其他細(xì)胞類型(Nouri-Sbirazi等人，2000.“Dendritic cells capture killed tumor cells and present theirantigens to elicit tumor-specific immune responses，”J Immunol 1653797-3803)，并以5×104/孔/200μl加入含有DC的孔中。經(jīng)過(guò)四天的溫育，以1μCi/孔的活性加入含氚胸苷(Wallace，Inc.，Gaithersburg，MD)。將板于16小時(shí)后收獲，根據(jù)廠商說(shuō)明，通過(guò)液體閃爍照相術(shù)測(cè)量整合的放射性。
如圖4所示，通過(guò)與GM-CSF/IL4 DC同樣有效的異源CD4 T細(xì)胞增殖的誘導(dǎo)證實(shí)，第三天的GM-CSF/TNF-DC可以啟動(dòng)免疫反應(yīng)，這種能力似乎是劑量依賴的。來(lái)自GM-CSF/TNFα和GM/CSF/IL4的DC都能夠以相對(duì)少量的細(xì)胞刺激CD8型T細(xì)胞的增殖(圖5)。
總而言之，本發(fā)明證實(shí)，用GM-CSF和TNFα培養(yǎng)三天的單核細(xì)胞產(chǎn)生朗格漢斯細(xì)胞和intDC，這些DC能夠捕獲抗原并誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。
實(shí)施例2一步疫苗引起兩個(gè)能夠捕獲抗原并誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的樹(shù)突細(xì)胞亞群本發(fā)明提供了全新的、可以在僅三天之內(nèi)產(chǎn)生能夠免疫應(yīng)答的DC細(xì)胞的一步法。與已報(bào)導(dǎo)的需要多重步驟和長(zhǎng)期溫育從單核細(xì)胞制備樹(shù)突細(xì)胞的方法不同，本發(fā)明方法包括在GM-CSF/TNFα存在下同時(shí)將單核細(xì)胞與抗原性材料溫育，將抗原呈遞給在早期的DC。由幾種量度標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)為以所述方法產(chǎn)生的DC是成熟的(1)被捕獲并加工的抗原；(2)誘導(dǎo)CD4和CD8細(xì)胞增殖的能力；以及(3)向T細(xì)胞呈遞抗原的能力。下文描述該一步疫苗的不同方面。
將單核細(xì)胞與殺傷的腫瘤細(xì)胞混合，并在含有或不含有IL-4或TNFα的GM-CSF存在下培養(yǎng)3天，來(lái)證實(shí)該一步疫苗捕獲抗原的能力。在第3天，吉姆薩染色的細(xì)胞顯示殺傷的腫瘤細(xì)胞的捕獲。特別是在第3天的GM-CSF/TNF培養(yǎng)物中，剩下很少的未捕獲的腫瘤體。
與殺傷的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)的第3天的GM-CSF/TNF細(xì)胞保留DC特性，且它們能夠誘導(dǎo)CD4(圖6A和6B)和CD8型(圖7A和7B)異源T細(xì)胞的增殖。與殺傷的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)的第3天的GM-CSF/TNF細(xì)胞比在不存在抗原時(shí)產(chǎn)生的DC更有能力刺激CD8型T細(xì)胞增殖(圖7B)。更重要的是，如通過(guò)其誘導(dǎo)自身CD4 T細(xì)胞增殖的能力所證實(shí)的，GM-CSF/TNF-DC可以呈遞腫瘤細(xì)胞抗原(圖8B)。通過(guò)該一步疫苗產(chǎn)生的已接觸過(guò)抗原的那些DC，在向自身CD4 T細(xì)胞呈遞腫瘤細(xì)胞抗原中大大優(yōu)越。
用腫瘤體和GM-CSF/TNFα培養(yǎng)的單核細(xì)胞的詳細(xì)表型分析顯示，單核細(xì)胞保持其分化為樹(shù)突細(xì)胞兩個(gè)亞群(即朗格漢斯細(xì)胞和間質(zhì)DC)的能力(圖9A-9L)。在1∶0.1的單核細(xì)胞殺傷的腫瘤細(xì)胞比率時(shí)見(jiàn)到最佳分化。在更高的單核細(xì)胞腫瘤體比率例如1∶1和1∶0.3時(shí)，通過(guò)Langerin標(biāo)志物減少的出現(xiàn)，證實(shí)朗格漢斯細(xì)胞比例。如圖10A-10I所示，也可以在第2天向單核細(xì)胞培養(yǎng)物添加殺傷的腫瘤細(xì)胞，其中單核細(xì)胞在此分化為朗格漢斯細(xì)胞和間質(zhì)DC。前向散射/側(cè)向散射流式細(xì)胞術(shù)圖顯示，該細(xì)胞群體含有指示朗格漢斯和intDC的CD14+型和CD1a型(圖10E-10F)。這些實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，在第1天或第2天添加抗原不影響產(chǎn)生這兩種類型樹(shù)突細(xì)胞的過(guò)程。另外，這些實(shí)驗(yàn)說(shuō)明使用目前稀釋滴度作為指南實(shí)驗(yàn)性確定特定抗原比率的需要。
一步疫苗的細(xì)胞也能夠?qū)⒛[瘤細(xì)胞抗原呈遞給免疫效應(yīng)物的混合物。實(shí)際上，如圖11所示，用殺傷的腫瘤細(xì)胞和GM-CSF/TNFα培養(yǎng)3天的單核細(xì)胞能夠誘導(dǎo)自身外周血淋巴細(xì)胞的增殖。在此情況下，單核細(xì)胞∶腫瘤體比率在1∶0.3最佳。
一步疫苗誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞殺傷黑素瘤本發(fā)明的一步疫苗證實(shí)誘導(dǎo)抗黑素瘤的細(xì)胞毒性作用的能力。該一步疫苗的產(chǎn)生如實(shí)施例1和2中所描述，只是除了殺傷的黑素瘤Colo829細(xì)胞作為抗原性材料存在于單核細(xì)胞培養(yǎng)物中。
一旦匯合，收獲Colo 829黑素瘤細(xì)胞系，并以1×106細(xì)胞/ml的密度在小瓶中培養(yǎng)。用TNF-α(100ng/ml)的致敏步驟之后，將細(xì)胞照射90分鐘，并在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時(shí)。通過(guò)FITC-膜聯(lián)蛋白V和碘化丙錠雙染以及錐蟲(chóng)藍(lán)排除(＜25％生存力)評(píng)價(jià)細(xì)胞死亡。
CTL產(chǎn)生測(cè)定培養(yǎng)3天后，使用該細(xì)胞作為自身CD8 T細(xì)胞和/或自身外周血淋巴細(xì)胞(PBL)的刺激物。每周對(duì)培養(yǎng)物重復(fù)刺激，并在第一周內(nèi)補(bǔ)充IL-7，接下來(lái)的星期補(bǔ)充IL-2。在使用產(chǎn)生腫瘤體的黑素瘤細(xì)胞作為靶的標(biāo)準(zhǔn)鉻釋放測(cè)定中測(cè)試CTL活性。
最后，一步疫苗的細(xì)胞誘導(dǎo)自身CD8 T細(xì)胞分化為能夠殺傷用作抗原的黑素瘤細(xì)胞的CTL(圖12A、12B、13A、13B、14A和14B)。沒(méi)有以抗原(殺傷的Colo 829黑素瘤細(xì)胞)脈沖的疫苗不能誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞介導(dǎo)的K562和Colo黑素瘤腫瘤細(xì)胞的裂解。以殺傷的Colo 829黑素瘤細(xì)胞脈沖的一步疫苗，通過(guò)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的刺激選擇性地引起黑素瘤腫瘤細(xì)胞而不是對(duì)照腫瘤細(xì)胞系K562的裂解。刺激細(xì)胞毒性T細(xì)胞兩次與三次刺激一樣有效(圖13B和14B)。另外，該一步疫苗誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞介導(dǎo)的黑素瘤細(xì)胞的能力與先前報(bào)導(dǎo)方法中的GM-CSF/IL-4疫苗相似。
使用此處說(shuō)明的方法，可以使用其他類型的腫瘤細(xì)胞脈沖DC細(xì)胞，可以使用此處概括的測(cè)定來(lái)測(cè)量對(duì)這些腫瘤的毒性，且可以使用此處概括的方法和范圍實(shí)驗(yàn)性確定效應(yīng)物對(duì)靶比率的最佳比率?？傊?，此處提供的數(shù)據(jù)證實(shí)了一步疫苗在治療和根除黑素瘤中抗黑素瘤的能力。另外，使用此處概括的方法，證實(shí)了該方法在治療其他類型癌癥中的潛力。
實(shí)施例3從用GM-CSF和TNFα培養(yǎng)3天的單核細(xì)胞衍生樹(shù)突細(xì)胞的進(jìn)一步表征在另一個(gè)研究中，通過(guò)排除分離單核細(xì)胞并用GM-CSF/TNFα培養(yǎng)3天。產(chǎn)生的GM-CSF/TNF-DC能夠向自身T細(xì)胞呈遞抗原。如圖15D所示，F(xiàn)lu-MP肽脈沖的GM-CSF/TNF-DC在一周培養(yǎng)中對(duì)誘導(dǎo)Flu-MP特異性CD8 T細(xì)胞的擴(kuò)增有效。
在進(jìn)一步的檢查中，發(fā)現(xiàn)GM-CSF/TNF-DC由具有不同生物學(xué)特性的不同亞群組成LC(CD1a+CD14-CD207+)，intDC(CD1a+CD14+CD207-)以及DN-DC(CD1a-CD14-)。使用抗指出的表面標(biāo)志物CD1a(Biosource)、CD207(Beckman-Coulter)、CD14(BDIS)抗體的表面染色，并使用流式細(xì)胞術(shù)(FACSVantage，BDIS)分選之后，亞群得以分離。微陣列分析證實(shí)，這些DC亞群顯示獨(dú)特的可以轉(zhuǎn)化為獨(dú)特的生物學(xué)功能的分子特征。特定基因家族的預(yù)分析顯示抗原加工性分子、趨化因子及其受體、細(xì)胞因子及其受體和粘附分子的差異表達(dá)。在圖16和17中給出少數(shù)差異表達(dá)的實(shí)例。如圖16所示，與表面表型一致，GM-CSF/TNF-DC的CD1a+亞群表達(dá)指示朗格漢斯細(xì)胞分化的高水平CD1a和Langerin mRNA(CD207+)。CD14+亞群表達(dá)與間質(zhì)DC分化一致的DC-SIGN mRNA(CD209+)。DN-DC不顯著地表達(dá)任何選擇的標(biāo)志物。如圖17所示，三個(gè)亞群表達(dá)不同的細(xì)胞因子，即CD1a+DC主要表達(dá)TGF-α和IL-8，而CD14+DC表達(dá)IL-1。有趣的是，DN-DC表達(dá)高水平的淋巴毒素β(LTB)mRNA和IL-15，IL-15是CD8+效應(yīng)/記憶T細(xì)胞成熟所必需的細(xì)胞因子。
GM-CSF/TNF-DC的不同亞群誘導(dǎo)不同的T細(xì)胞應(yīng)答，從而表現(xiàn)不同的功能。與原初的異源CD8或CD4 T細(xì)胞培養(yǎng)未活化GM-CSF/TNF-DC的分選的亞群。在兩個(gè)水平分析T細(xì)胞應(yīng)答(a)培養(yǎng)5天后的增殖(含氚胸苷整合)，以及(b)使用Affymetrix微陣列芯片的總體mRNA分析。GM-CSF/TNF-DC的所有亞群誘導(dǎo)原初異源CD8 T細(xì)胞的旺盛增殖。所有亞群也能夠引發(fā)原初CD4 T細(xì)胞；然而，在與intDC(CD14+)的培養(yǎng)物中，CD4 T細(xì)胞增殖較不明顯(圖18)。與其他GM-CSF/TNF-DC亞群相比，CD4 T細(xì)胞中的總體mRNA表達(dá)分析顯示出對(duì)intDC(CD14+)的CD4 T細(xì)胞應(yīng)答的驚人差異。例如，我們觀察到由不同GM-CSF/TNF-DC亞群引發(fā)的趨化因子受體(CXCR4、CCR5、CCR2和CCR7)在CD4 T細(xì)胞中的差異表達(dá)(圖19)，顯示這些T細(xì)胞可以表現(xiàn)不同的遷移能力。
在GM-CSF/TNF-DC的進(jìn)一步研究中，第四個(gè)亞群特征為(CD1a-CD14+CD209+)。
實(shí)施例4以單核細(xì)胞衍生疫苗治療黑素瘤患者為了證明以本發(fā)明的單核細(xì)胞衍生疫苗對(duì)黑素瘤患者的治療，以與CD34+祖先衍生的DC的試驗(yàn)相似的程序，將疫苗施用于經(jīng)活組織檢查證實(shí)為IV期黑素瘤的患者(Banchereau等人，2001.“Immune andclinical responses in patients with metastatic melanoma to CD34(+)progenitor-derived dendritic cell vaccine，”Cancer Res 616451-6458)。
為了制備疫苗，也通過(guò)Ficoll-Paque密度梯度離心從每個(gè)患者的外周血分離單核細(xì)胞，通過(guò)排除或粘附方法富集，并接種到具有培養(yǎng)基的微量培養(yǎng)板上，該培養(yǎng)基含有GM-CSF和TNFα。通過(guò)下列方法之一制備疫苗(1)在第1天，以本領(lǐng)域公知的優(yōu)選方法殺傷黑素瘤細(xì)胞(來(lái)自細(xì)胞系Colo 829或來(lái)自每個(gè)單獨(dú)患者)，并添加到具有單核細(xì)胞和GM-CSF/TNFα的培養(yǎng)基中；(2)在第1天，將所有細(xì)胞暴露于匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)，用限制的流行性感冒基質(zhì)肽(Flu-MP)脈沖細(xì)胞亞群，即20％，用衍生于四個(gè)黑素瘤抗原的肽，例如MalanA/MART-1、酪氨酸酶、MAGE-3和gp100，脈沖剩余的細(xì)胞(即80％)；(3)在第2天，通過(guò)照射殺傷黑素瘤細(xì)胞(來(lái)自細(xì)胞系Colo 829或來(lái)自每個(gè)單獨(dú)患者)，并添加到具有單核細(xì)胞和GM-CSF/TNFα的培養(yǎng)基中；或(4)在第2天，將所有細(xì)胞暴露于匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)，用限制的流行性感冒基質(zhì)肽(Flu-MP)脈沖細(xì)胞亞群，即20％，用衍生于四個(gè)黑素瘤抗原的肽，例如MalanA/MART-1、酪氨酸酶、MAGE-3和gp100，脈沖剩余的細(xì)胞(即80％)。在培養(yǎng)第3天，收獲并洗滌加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞，并配制為疫苗。然后使用標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)疫苗，該標(biāo)準(zhǔn)包括但是不限于使用下列在實(shí)施例1和2中充分說(shuō)明的程序DC形態(tài)學(xué)；通過(guò)表型分析確定的細(xì)胞制劑中至少20％ DC的最小值(剩余部分含有DC前體等)；和/或與一個(gè)單克隆抗體實(shí)驗(yàn)組的反應(yīng)性，以確定細(xì)胞標(biāo)志物，和/或在患者體內(nèi)使用之前刺激淋巴細(xì)胞反應(yīng)的能力。
以本發(fā)明的疫苗在6周長(zhǎng)的門診病人療程中治療患者，每14天進(jìn)行接種，總共4次接種。將疫苗在包括大腿和上臂的三個(gè)注射位點(diǎn)施用于患者。在接種前至少兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)、以及每次接種后5和/或14天和第四次接種后14或28天進(jìn)行免疫學(xué)監(jiān)控。所有患者在試驗(yàn)前以及第四次接種后四周經(jīng)受腫瘤狀況評(píng)價(jià)。將靶損害增加高于25％和/或出現(xiàn)新的損害定義為疾病進(jìn)展。將患者應(yīng)答的分析分成幾組，即對(duì)至少一種黑素瘤抗原的應(yīng)答；對(duì)多個(gè)黑素瘤抗原的應(yīng)答；對(duì)殺傷的完整黑素瘤細(xì)胞的應(yīng)答；以及對(duì)對(duì)照抗原例如KLH和Flu-MP的應(yīng)答。免疫學(xué)應(yīng)答與腫瘤進(jìn)展數(shù)據(jù)相關(guān)。
實(shí)施例5以單核細(xì)胞衍生的加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞誘導(dǎo)抗原特異的無(wú)應(yīng)答性用抗原性材料加載根據(jù)本發(fā)明制備的樹(shù)突細(xì)胞，T細(xì)胞對(duì)該抗原性材料可表現(xiàn)無(wú)反應(yīng)性。在本方法中，將T細(xì)胞暴露于GM-CFS和TNFα產(chǎn)生的加載有抗原的DC的CD14+CD1a-亞群。這樣，T細(xì)胞可以識(shí)別抗原，但是在用相同抗原重復(fù)刺激時(shí)，變得無(wú)反應(yīng)性，不能增殖。
從由Ficoll分離的健康志愿者PBMC獲得純化的CD4+ T細(xì)胞，并使用CD8(B9.11)、CD14(RMO52)、CD16(3G8)、CD19(J4.119)、CD56(NKH-1)、抗-HLA-DR(B8.12.2)、抗血型糖蛋白A(D2.10)單克隆抗體(mAbs)(Beckman-Coulter，Miami，F(xiàn)L)和山羊抗小鼠IgG Dynabeads(Dynal，Lake Success，NY)排除其他細(xì)胞。富集群體的純度＞90％。如此處所描述的制備加載有抗原的DC并用于刺激原初CD4 T細(xì)胞。
可以進(jìn)行耐受測(cè)定，其中在24孔板中將純化的CD4+ T細(xì)胞(106/孔)與單核細(xì)胞衍生的DC的CD14+CD1a-亞群共培養(yǎng)，該亞群是如此處所述用TNFα和GM-CSF制備的。五天后，收獲并洗滌T細(xì)胞，并靜置額外2天。在增殖測(cè)定中以適宜的抗原重新攻擊來(lái)自原代培養(yǎng)物的T細(xì)胞，其中通過(guò)含氚胸苷的攝入(最后16小時(shí)中1μCi/孔)測(cè)定增殖。
總體而言，本發(fā)明是在三天內(nèi)制備樹(shù)突細(xì)胞疫苗的方法。在優(yōu)選的方法中，用可用的加載有抗原的樹(shù)突細(xì)胞疫苗在三天內(nèi)以一個(gè)步驟產(chǎn)生樹(shù)突細(xì)胞并向其加載抗原。在另一個(gè)方法中，用可用的加載有抗原的樹(shù)突細(xì)胞疫苗在三天內(nèi)以兩個(gè)步驟產(chǎn)生樹(shù)突細(xì)胞并向其加載抗原。在優(yōu)選的方法中，從血液白細(xì)胞提取法制備樹(shù)突細(xì)胞疫苗。在另一個(gè)優(yōu)選的方法中，從血液?jiǎn)挝恢兄苽湟呙?。在?yōu)選的方法中，通過(guò)將前體暴露于化學(xué)物/肽/模擬細(xì)胞因子的類肽來(lái)制備疫苗。在另一個(gè)優(yōu)選的方法中，可以使用觸發(fā)細(xì)胞因子從單核細(xì)胞釋放的分子和/或顆粒制備疫苗。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選方法制備的樹(shù)突細(xì)胞疫苗使用優(yōu)選與生長(zhǎng)因子組合的激活劑衍生自單核細(xì)胞，所述激活劑包括但是不限于TNFα，所述生長(zhǎng)因子包括但是不限于粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，而不使用白細(xì)胞介素4也不使用白細(xì)胞介素13。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選方法制備的樹(shù)突細(xì)胞疫苗優(yōu)選含有朗格漢斯細(xì)胞，并使用優(yōu)選與生長(zhǎng)因子組合的激活劑衍生自單核細(xì)胞，所述激活劑包括但是不限于TNFα，所述生長(zhǎng)因子包括但是不限于粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，而不使用白細(xì)胞介素4、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β或白細(xì)胞介素15。關(guān)于抗原的加載，優(yōu)選以可溶性或顆粒性抗原性材料加載本發(fā)明的樹(shù)突細(xì)胞疫苗，所述抗原性材料包括但是不限于可溶性蛋白例如免疫復(fù)合物或殺傷的腫瘤細(xì)胞。在另一個(gè)方法中，使用外來(lái)體加載本發(fā)明的樹(shù)突細(xì)胞疫苗。
根據(jù)這些方法，產(chǎn)生的疫苗優(yōu)選由來(lái)自血液前體的樹(shù)突細(xì)胞的兩個(gè)亞群組成，包括但是不限于朗格漢斯細(xì)胞和間質(zhì)樹(shù)突細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明方法制備的樹(shù)突細(xì)胞疫苗可以用于多種目的，包括但是不限于下列(1)疾病的治療，包括但是不限于癌癥、感染性疾病、病毒性疾病以及自身免疫?。?2)產(chǎn)生外來(lái)體；(3)在體外測(cè)定中監(jiān)控腫瘤特異性免疫應(yīng)答；以及(4)在體外測(cè)定中監(jiān)控抗原特異性免疫應(yīng)答。
本發(fā)明也是使用一步三天樹(shù)突細(xì)胞疫苗在體外或體內(nèi)誘導(dǎo)抗腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性免疫應(yīng)答的方法。根據(jù)本發(fā)明的方法，可以誘導(dǎo)抗共有的腫瘤抗原或抗多個(gè)腫瘤抗原的細(xì)胞毒性免疫應(yīng)答。產(chǎn)生的免疫效應(yīng)細(xì)胞可以是CD4陽(yáng)性細(xì)胞、CD8陽(yáng)性細(xì)胞、天然殺傷細(xì)胞或天然殺傷T細(xì)胞。在優(yōu)選的方法中，在體內(nèi)產(chǎn)生免疫效應(yīng)細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選方法中，離體產(chǎn)生免疫效應(yīng)細(xì)胞，并施用于患者。在另一個(gè)優(yōu)選方法中，為體外研究目的產(chǎn)生免疫效應(yīng)細(xì)胞。
權(quán)利要求
1.從單核細(xì)胞離體生產(chǎn)加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞的方法，包括同時(shí)將所述單核細(xì)胞與可溶性或顆粒性抗原性材料、腫瘤壞死因子α和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子接觸。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞在少于四天內(nèi)產(chǎn)生。
3.從單核細(xì)胞離體生產(chǎn)加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞的方法，包括在一個(gè)時(shí)間點(diǎn)將所述單核細(xì)胞與腫瘤壞死因子α和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子接觸，以形成抗原呈遞細(xì)胞，并在第二個(gè)時(shí)間點(diǎn)將所述抗原呈遞細(xì)胞與可溶性或顆粒性抗原性材料接觸，以形成加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞，其中所述加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞在少于四天內(nèi)產(chǎn)生。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗原性材料由一種或多種材料組成，該材料選自抗原性肽、肽模擬物、蛋白、多蛋白、免疫復(fù)合物、完整垂死細(xì)胞體、垂死細(xì)胞體片段、病毒載體和脂質(zhì)體。
5.權(quán)利要求2的方法，其中所述抗原性材料由一種或多種材料組成，該材料選自抗原性肽、肽模擬物、蛋白、多蛋白、免疫復(fù)合物、完整垂死細(xì)胞體、垂死細(xì)胞體片段、病毒載體和脂質(zhì)體。
6.權(quán)利要求3的方法，其中所述抗原性材料由一種或多種材料組成，該材料選自抗原性肽、肽模擬物、蛋白、多蛋白、免疫復(fù)合物、完整垂死細(xì)胞體、垂死細(xì)胞體片段、病毒載體和脂質(zhì)體。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗原性材料由可溶性抗原性材料組成。
8.權(quán)利要求2的方法，其中所述抗原性材料由可溶性抗原性材料組成。
9.權(quán)利要求3的方法，其中所述抗原性材料由可溶性抗原性材料組成。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗原性材料由完整垂死細(xì)胞體、垂死細(xì)胞體片段或兩者組成。
11.權(quán)利要求2的方法，其中所述抗原性材料由完整垂死細(xì)胞體、垂死細(xì)胞體片段或兩者組成。
12.權(quán)利要求3的方法，其中所述抗原性材料由完整垂死細(xì)胞體、垂死細(xì)胞體片段或兩者組成。
13.權(quán)利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12的方法，進(jìn)一步包括將所述加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞分離為包含一個(gè)或多個(gè)亞群的級(jí)分，所述亞群選自具有表面標(biāo)志物(CD1a+CD207+)的細(xì)胞；具有表面標(biāo)志物(CD1a+CD207-)的細(xì)胞；具有表面標(biāo)志物(CD1a-CD14-)的細(xì)胞；以及具有表面標(biāo)志物(CD14+CD1a-CD209+)的細(xì)胞。
14.包括加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞的疫苗，所述加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞按照如下步驟制備同時(shí)將所述單核細(xì)胞與可溶性或顆粒性抗原性材料、腫瘤壞死因子α和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子離體接觸，以形成加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞。
15.權(quán)利要求14的疫苗，其中所述加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞在少于四天內(nèi)產(chǎn)生。
16.包括加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞的疫苗，所述加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞按照如下步驟制備在一個(gè)時(shí)間點(diǎn)將單核細(xì)胞與腫瘤壞死因子α和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子離體接觸，以形成抗原呈遞細(xì)胞，并在第二個(gè)時(shí)間點(diǎn)將所述抗原呈遞細(xì)胞與可溶性或顆粒性抗原性材料接觸，以形成加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞，其中所述加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞在少于四天內(nèi)產(chǎn)生。
17.權(quán)利要求14、15或16的疫苗，其中所述抗原性材料由一種或多種材料組成，該材料選自抗原性肽、肽模擬物、蛋白、多蛋白、完整垂死細(xì)胞體和垂死細(xì)胞體片段。
18.權(quán)利要求14、15或16的疫苗，其中所述抗原性材料由可溶性抗原性材料組成。
19.權(quán)利要求14、15或16的疫苗，其中所述抗原性材料由完整垂死細(xì)胞體、垂死細(xì)胞體片段或兩者組成。
20.包括單核細(xì)胞衍生的加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞的疫苗，其中所述抗原呈遞細(xì)胞包括朗格漢斯細(xì)胞和間質(zhì)樹(shù)突細(xì)胞。
21.包括單核細(xì)胞衍生的加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞的疫苗，其中所述抗原呈遞細(xì)胞由一個(gè)或多個(gè)亞群組成，該亞群選自具有表面標(biāo)志物(CD1a+CD207+)的細(xì)胞；具有表面標(biāo)志物(CD1a+CD207-)的細(xì)胞；具有表面標(biāo)志物(CD1a-CD14-)的細(xì)胞；以及具有表面標(biāo)志物(CD14+CD1a-CD209+)的細(xì)胞。
22.在腫瘤患者體內(nèi)誘導(dǎo)腫瘤特異性免疫應(yīng)答的方法，包括產(chǎn)生包括加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞的疫苗，所述加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞是通過(guò)同時(shí)將單核細(xì)胞與擁有至少一種腫瘤抗原的可溶性或顆粒性抗原性材料、腫瘤壞死因子α和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子接觸，從所述單核細(xì)胞離體制備的；將所述疫苗施用于所述患者，其中所述患者的細(xì)胞在與所述疫苗中所述加載的抗原呈遞細(xì)胞接觸后成熟，形成表現(xiàn)抗所述腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性的細(xì)胞毒性細(xì)胞。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞在少于四天內(nèi)產(chǎn)生。
24.在腫瘤患者體內(nèi)誘導(dǎo)腫瘤特異性免疫應(yīng)答的方法，包括產(chǎn)生包括加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞的疫苗，所述加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞通過(guò)如下步驟制備在一個(gè)時(shí)間點(diǎn)將單核細(xì)胞與腫瘤壞死因子α和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子離體接觸，以形成抗原呈遞細(xì)胞，并在第二個(gè)時(shí)間點(diǎn)將所述抗原呈遞細(xì)胞與擁有至少一種腫瘤抗原的可溶性或顆粒性抗原性材料接觸，以形成加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞，其中所述加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞在少于四天內(nèi)產(chǎn)生；將所述疫苗施用于所述患者，其中所述患者的細(xì)胞在與所述疫苗中所述加載的抗原呈遞細(xì)胞接觸后成熟，形成表現(xiàn)抗所述腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性的細(xì)胞毒性細(xì)胞。
25.在腫瘤患者體內(nèi)誘導(dǎo)腫瘤特異性應(yīng)答的方法，包括從所述患者分離單核細(xì)胞和細(xì)胞毒性細(xì)胞前體；通過(guò)同時(shí)將所述單核細(xì)胞與擁有至少一種腫瘤抗原的可溶性或顆粒性抗原性材料、腫瘤壞死因子α和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子接觸，從所述單核細(xì)胞制備所述加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞；將該加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞與所述分離的細(xì)胞毒性細(xì)胞前體在適合其成熟以形成細(xì)胞毒性細(xì)胞的條件下共培養(yǎng)；以及將該細(xì)胞毒性細(xì)胞施用于該患者，其中所述細(xì)胞毒性細(xì)胞表現(xiàn)抗所述腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞在少于四天內(nèi)產(chǎn)生。
27.在腫瘤患者體內(nèi)誘導(dǎo)腫瘤特異性應(yīng)答的方法，包括從所述患者分離單核細(xì)胞和細(xì)胞毒性細(xì)胞前體；該加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞通過(guò)如下步驟產(chǎn)生在一個(gè)時(shí)間點(diǎn)將所述單核細(xì)胞與腫瘤壞死因子α和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子離體接觸，以形成抗原呈遞細(xì)胞，并在第二個(gè)時(shí)間點(diǎn)將所述抗原呈遞細(xì)胞與擁有至少一種腫瘤抗原的可溶性或顆粒性抗原性材料接觸，以形成加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞，其中所述加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞在少于四天內(nèi)產(chǎn)生；將該加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞與所述分離的細(xì)胞毒性細(xì)胞前體在適合其成熟以形成細(xì)胞毒性細(xì)胞的條件下共培養(yǎng)；以及將該細(xì)胞毒性細(xì)胞施用于該患者，其中所述細(xì)胞毒性細(xì)胞表現(xiàn)抗所述腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性。
28.在腫瘤患者體內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，包括產(chǎn)生包括加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞的疫苗，所述加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞是通過(guò)同時(shí)將單核細(xì)胞與擁有至少一種免疫應(yīng)答所需抗原的可溶性或顆粒性抗原性材料、腫瘤壞死因子α和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子接觸，從所述單核細(xì)胞離體制備的；將所述疫苗施用于所述患者，其中所述患者的細(xì)胞在與所述疫苗中所述加載的抗原呈遞細(xì)胞接觸后成熟，形成表現(xiàn)抗所述抗原的免疫活性的細(xì)胞。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞在少于四天內(nèi)產(chǎn)生。
30.在腫瘤患者體內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，包括產(chǎn)生包括加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞的疫苗，所述加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞通過(guò)如下步驟制備在一個(gè)時(shí)間點(diǎn)將單核細(xì)胞與腫瘤壞死因子α和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子離體接觸，以形成抗原呈遞細(xì)胞，并在第二個(gè)時(shí)間點(diǎn)將所述抗原呈遞細(xì)胞與擁有至少一種免疫應(yīng)答所需抗原的可溶性或顆粒性抗原性材料接觸，以形成加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞，其中所述加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞在少于四天內(nèi)產(chǎn)生；將所述疫苗施用于所述患者，其中所述患者的細(xì)胞在與所述疫苗中所述加載的抗原呈遞細(xì)胞接觸后成熟，形成表現(xiàn)抗所述抗原的免疫活性的細(xì)胞。
31.確立由細(xì)胞毒性T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的方法，包括通過(guò)同時(shí)將單核細(xì)胞與擁有至少一種免疫應(yīng)答所需抗原的可溶性或顆粒性抗原性材料、腫瘤壞死因子α和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子接觸，從所述單核細(xì)胞離體產(chǎn)生加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞；將所述加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞與原初T細(xì)胞在適合T細(xì)胞成熟以形成細(xì)胞毒性T細(xì)胞的條件下共培養(yǎng)；以及將所述細(xì)胞毒性T細(xì)胞與擁有所述抗原的靶細(xì)胞接觸，其中所述細(xì)胞毒性T細(xì)胞表現(xiàn)對(duì)所述擁有所述抗原的靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞在少于四天內(nèi)產(chǎn)生。
33.確立由細(xì)胞毒性T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的方法，包括產(chǎn)生包括加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞的疫苗，所述加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞通過(guò)如下步驟制備在一個(gè)時(shí)間點(diǎn)將單核細(xì)胞與腫瘤壞死因子α和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子離體接觸，以形成抗原呈遞細(xì)胞，并在第二個(gè)時(shí)間點(diǎn)將所述抗原呈遞細(xì)胞與擁有至少一種免疫應(yīng)答所需抗原的可溶性或顆粒性抗原性材料接觸，以形成加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞，其中所述加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞在少于四天內(nèi)產(chǎn)生；將所述加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞與原初T細(xì)胞在適合T細(xì)胞成熟以形成細(xì)胞毒性T細(xì)胞的條件下共培養(yǎng)；以及將所述細(xì)胞毒性T細(xì)胞與擁有所述抗原的靶細(xì)胞接觸，其中所述細(xì)胞毒性T細(xì)胞表現(xiàn)對(duì)所述擁有所述抗原的靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性。
34.權(quán)利要求22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33的方法，其中所述抗原性材料由可溶性抗原性材料組成。
35.權(quán)利要求22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33的方法，其中所述抗原性材料由完整垂死細(xì)胞體、垂死細(xì)胞體片段或兩者組成。
36.權(quán)利要求22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33的方法，其中細(xì)胞毒性細(xì)胞為CD4陽(yáng)性。
37.權(quán)利要求34的方法，其中細(xì)胞毒性細(xì)胞為CD4陽(yáng)性。
38.權(quán)利要求35的方法，其中細(xì)胞毒性細(xì)胞為CD4陽(yáng)性。
39.權(quán)利要求22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33的方法，其中細(xì)胞毒性細(xì)胞為CD8陽(yáng)性。
40.權(quán)利要求34的方法，其中細(xì)胞毒性細(xì)胞為CD8陽(yáng)性。
41.權(quán)利要求35的方法，其中細(xì)胞毒性細(xì)胞為CD8陽(yáng)性。
42.修飾患者體內(nèi)免疫應(yīng)答的方法，包括產(chǎn)生加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞，通過(guò)同時(shí)將單核細(xì)胞與擁有至少一種免疫應(yīng)答所需抗原的可溶性或顆粒性抗原性材料、腫瘤壞死因子α和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子接觸，從單核細(xì)胞離體衍生所述加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞；將所述抗原呈遞細(xì)胞施用于所述患者，其中該患者的細(xì)胞在與所述加載的抗原呈遞細(xì)胞接觸后被調(diào)節(jié)為不表現(xiàn)抗所述抗原的免疫學(xué)活性。
43.產(chǎn)生由兩個(gè)或更多個(gè)亞群組成的加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞級(jí)分的方法，包括同時(shí)將單核細(xì)胞與可溶性或顆粒性抗原性材料、腫瘤壞死因子α和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子離體接觸，以形成加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞；從所述加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞分離兩個(gè)或更多個(gè)亞群，其中各亞群能夠在施用于患者時(shí)引起不同的T細(xì)胞應(yīng)答并確立不同的免疫應(yīng)答；組合兩個(gè)或更多個(gè)所述亞群以形成所述加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞級(jí)分。
全文摘要
發(fā)現(xiàn)了從單核細(xì)胞離體產(chǎn)生加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞的一步法，該方法包括將單核細(xì)胞與組合物接觸，所述組合物包括優(yōu)選與至少一種生長(zhǎng)因子例如GM－CSF和至少一種可溶性或顆粒性抗原組合的激活劑如TNFα。根據(jù)本發(fā)明的方法，可以在少至三(3)天的時(shí)間內(nèi)生成加載有抗原的樹(shù)突細(xì)胞疫苗。在本發(fā)明的另一個(gè)方法中，在一個(gè)時(shí)間點(diǎn)將單核細(xì)胞與TNFα和粒細(xì)胞－巨噬細(xì)胞集落刺激因子接觸以形成抗原呈遞細(xì)胞，然后在第二個(gè)時(shí)間點(diǎn)將抗原呈遞細(xì)胞與可溶性或顆粒性抗原性材料接觸以形成加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞，由此從單核細(xì)胞離體產(chǎn)生加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞，其中所述加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞在少于四天內(nèi)產(chǎn)生。本發(fā)明也包括疫苗，該疫苗包括單核細(xì)胞衍生的加載有抗原的抗原呈遞細(xì)胞，其中抗原呈遞細(xì)胞由兩個(gè)或更多個(gè)亞群組成，所述亞群選自具有表面標(biāo)志物(CD1a+CD207+)的朗格漢斯細(xì)胞；具有表面標(biāo)志物(CD1a+CD207－)的間質(zhì)樹(shù)突細(xì)胞；具有表面標(biāo)志物20(CD1a－CD14－)的雙陰性樹(shù)突細(xì)胞；以及具有表面標(biāo)志物(CD14+CD1a－CD209+)的樹(shù)突細(xì)胞。
文檔編號(hào)A61K45/00GK1744822SQ200380109488
公開(kāi)日2006年3月8日 申請(qǐng)日期2003年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月4日
發(fā)明者J·F·邦舍羅, A·K·帕盧卡 申請(qǐng)人:貝勒研究院