專利名稱：一種新的HER2/neu基因改造的樹突細胞疫苗的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物學和醫(yī)學領域，更具體地涉及一種新的HER2/neU基因改造的樹 突細胞疫苗的制備。本發(fā)明可應用于HER2/neU陽性腫瘤的預防和治療。
背景技術：
HER2/neu是一種癌基因，屬于表皮生長因子受體家族。HER2/neu基因的過表達頻 繁發(fā)生于乳腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、肺癌和胃腸道腫瘤，其在乳腺癌的過表達是預后不 良的相關因素。針對HER2/neU的單抗藥物Here印tin能有效降低HER2陽性乳腺癌的復發(fā) 風險。最新的研究表明HER2/neU的過表達能促進腫瘤干細胞的增殖并增強其侵襲性。以 上事實說明HER2/neu是治療HER2/neu陽性腫瘤的一個理想標靶。樹突細胞(DC)是迄今發(fā)現(xiàn)的功能最強大的抗原遞呈細胞，能刺激機體免疫系統(tǒng) 產(chǎn)生針對特異抗原的免疫反應，這些反應包括抗體對特異抗原的中和作用，T細胞對攜帶特 異抗原細胞的直接和間接的殺傷作用等。因此，將HER2/neU基因?qū)霕渫患毎髮θ梭w進 行免疫可以抑制HER2蛋白的信號轉(zhuǎn)導活性，殺傷過表達HER2抗原的腫瘤細胞，達到預防和 治療HER2陽性腫瘤的目的。目前，已經(jīng)有幾種基因?qū)敕椒ū挥糜谥苽銱ER2/neU基因改造的樹突細胞(簡寫 為DChek2)，主要包括重組腺病毒，重組逆轉(zhuǎn)錄病毒和mRNA電穿孔。Sakai等用攜帶neu基因 片段的重組腺病毒感染小鼠骨髓來源的樹突細胞，然后對小鼠進行免疫注射，發(fā)現(xiàn)這種腺 病毒改造的DChek2疫苗能顯著阻止或延遲轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺腫瘤的發(fā)生，另外兩個研究發(fā)現(xiàn) 腺病毒改造的DChek2疫苗能部分或全部阻止小鼠neu陽性移植腫瘤的發(fā)生。Nabekura等用 攜帶HER2基因片段的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染小鼠骨髓來源的樹突細胞制備DChek2疫苗，發(fā)現(xiàn)后者 能部分阻止小鼠HER2陽性移植腫瘤的發(fā)生，此外還能部分延遲轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺腫瘤的發(fā) 生。此外國內(nèi)有研究者采用mRNA電穿孔的方法制備DChek2疫苗，體外實驗表明這種疫苗能 激發(fā)T細胞對neu陽性腫瘤細胞的殺傷。上述提到的三種基因?qū)敕椒m然都能制備有效的DChek2疫苗，但各自都有一些 不足腺病毒感染DC后轉(zhuǎn)基因的表達時間較短，后者可能導致免疫效應的持久性和強度不 夠；逆轉(zhuǎn)錄病毒只能感染分裂期的細胞，而臨床上多采用病人外周血單個核細胞分化誘導 成DC，這一過程很少伴有細胞增殖，因此部分限制了其可能的臨床應用；mRNA電穿孔同樣存 在遞呈抗原的半衰期較短的問題，此外，有研究表明mRNA電穿孔會削弱DC刺激免疫的功能。實際上，重組慢病毒也能高效感染樹突細胞，同時不會削弱DC的功能。另外，重組 慢病毒感染的一個重要特點是轉(zhuǎn)基因的長期表達，這一特點對于DC則有可能刺激免疫系 統(tǒng)產(chǎn)生持久和增強的免疫反應，但另一方面也有可能導致免疫耐受，也就是說用它制備的 疫苗可能沒有效果。目前并沒有使用重組慢病毒制備DChek2疫苗的報導。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的HER2/neU基因改造的樹突細胞疫苗。
本發(fā)明提供的疫苗是是通過將HER2/neU重組到慢病毒載體上，再轉(zhuǎn)染樹突細胞 來制備的。在任意一個商業(yè)化或私人開發(fā)的慢病毒轉(zhuǎn)運載體上構(gòu)建一個HER2/neU基因片段 的表達序列。這里的慢病毒轉(zhuǎn)運載體指慢病毒包裝系統(tǒng)中提供目的基因的載體，通常是一 個質(zhì)粒，此外它還提供病毒所攜帶核酸的轉(zhuǎn)錄表達所需的順式作用元件。HER2/neU基因片 段的表達序列包括5’端的啟動子，可選用廣譜的強啟動子如巨細胞病毒(CMV)啟動子和延 長因子2(EF2)啟動子等或者樹突細胞特異的啟動子如CDllc啟動子等，3’端的多聚腺苷 酸加尾信號，以及位于啟動子和加尾信號之間的HER2/neU基因片段(通常去除其具有酪氨 酸激酶活性的胞內(nèi)段)。構(gòu)建中可能遇到的具體情況包括如果轉(zhuǎn)運載體沒有其它的目的 基因，直接在適當位置插入HER2/neU基因片段。如果轉(zhuǎn)運載體已具備了目的基因，則需用 HER2/neu基因片段替換原有的目的基因。如果載體沒有提供啟動子，則需要在適當?shù)奈恢?插入目的啟動子。如果這一轉(zhuǎn)運載體已具備目的啟動子，則只需在啟動子下游插入HER2/ neu基因片段，轉(zhuǎn)運載體通常會提供加尾信號。所要用到的分子生物學技術可參考已出版的 相關書籍，如《分子克隆》。1.利用上述構(gòu)建的載體包裝制備攜帶HER2/neU基因片段的重組慢病毒，說明如 下采用任意一個商業(yè)化或私人開發(fā)的慢病毒包裝系統(tǒng)包裝制備攜帶HER2/neU基因片段 的重組慢病毒。完整的慢病毒包裝系統(tǒng)通常包含數(shù)個質(zhì)粒和一個包裝細胞系，前者 用于提供慢病毒包裝所需的病毒結(jié)構(gòu)基因和病毒所攜帶核酸的轉(zhuǎn)錄表達所需的順式作用 元件，后者提供病毒包裝所需的反式作用因子。包裝制備過程可遵循生產(chǎn)商的說明書以及 發(fā)表的文獻或相關書籍。包裝所得的攜帶HER2/neU基因片段的重組慢病毒可進一步純化 和/或濃縮，相關操作可參考試劑盒生產(chǎn)商的說明書以及相關文獻或書籍。2.利用2中提到的重組慢病毒感染樹突細胞來制備新的DChek2疫苗，說明如下樹突細胞來源可包括小鼠骨髓細胞，人類外周血單個核細胞或CD14陽性細胞群， 造血干細胞及其亞群，人類胚胎干細胞。通常經(jīng)過數(shù)天的培養(yǎng)，在細胞因子的作用下這些具 有分化潛能的細胞將大部分分化為樹突細胞。從不同的前體細胞誘導培養(yǎng)樹突細胞所花費 的時間不太一樣，除人類胚胎干細胞外通常需6-10天，也有3天的快速誘導方法。在樹突 細胞的誘導培養(yǎng)過程中，將制備好的攜帶HER2/neU基因片段的重組慢病毒在適當時機對 培養(yǎng)體系中的細胞進行感染，感染方式可包括多種，簡單的共培養(yǎng)感染，或者將病毒和細胞 一起離心的共離心感染，或者重復甚至多次感染，或者這些方法的組合。在培養(yǎng)后期可向培 養(yǎng)體系中加入刺激樹突細胞成熟的因子如腫瘤壞死因子α，磷酸脂多糖等以刺激樹突細胞 成熟，原因是未成熟的樹突細胞有可能會導致免疫耐受。最終可得到這種新的DChek2疫苗。 相關操作可參考已發(fā)表的關于樹突細胞培養(yǎng)誘導以及慢病毒感染樹突細胞的文獻，本說明 書中的具體實施方式
將提供從小鼠骨髓細胞中制備這種新的DChek2疫苗的操作方法。根據(jù)本發(fā)明的研究，上述用攜帶HER2/neU基因片段的重組慢病毒對來源于骨髓 細胞誘導培養(yǎng)的第4天所獲得的DC進行感染。按照常規(guī)的方法，一般應在第2天進行感染。 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在第4天感染獲得了更好的出乎意料的效果。有益效果在基于小鼠的體內(nèi)實驗中發(fā)現(xiàn)，這種新的DChek2疫苗只需一次低劑量(1.5X105)
4的免疫接種就可以完全預防HER2/neU陽性移植腫瘤在小鼠體內(nèi)的生長，保護時間至少超 過100天。而采用其他方法制備得到的DChek2疫苗通常需要大劑量(5 X IO5-I X IO6)，并且經(jīng) 過2-3次免疫接種才能達到甚至還達不到類似效果(表1)。說明這種慢病毒制備的DChek2 疫苗比用其他方法制備的DChek2疫苗更有效。另一個支持上述結(jié)論的依據(jù)是，用這種新DChek2 疫苗低劑量單次免疫后，即可在小鼠體內(nèi)檢測到足夠水平的抗HER2/neU抗體，而在此前的 兩個采用腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒制備DChek2疫苗的研究中，單次較高劑量的免疫只能在小鼠 體內(nèi)誘導產(chǎn)生少量或者根本無法產(chǎn)生抗體，而體內(nèi)相關抗體的產(chǎn)生是評價疫苗效果的一個 重要指標。這種新的DChek2疫苗的預防效應被進一步證明是長效的免疫后100天小鼠血漿 中的HER2/neU抗體仍然維持在較高的水平(平均7倍于未接種DChek2疫苗的小鼠)，對這 些免疫后100天的小鼠進行第二次HER2/neU陽性腫瘤細胞接種，50天后發(fā)現(xiàn)小鼠仍未發(fā)生 腫瘤。除預防效應外，這種新的DChek2疫苗對小鼠已發(fā)生的HER2/neU陽性移植腫瘤還具有 治療效果，一次低劑量(2X105)的皮下注射即能顯著抑制腫瘤的生長。在這個發(fā)明中，包含了一系列本領域技術人員已知的操作。但本發(fā)明的創(chuàng)造性在 于成功地運用已知的慢病毒載體將HER2/neU基因轉(zhuǎn)染到樹突細胞上，實現(xiàn)了穩(wěn)定高效表 達，并能是動物體產(chǎn)生相應的免疫反應。表1慢病毒制備的DChek2疫苗與其他方法制備的DChek2疫苗預防效果比較
研究團隊 改造方法 DCheri劑量
免疫 腫瘤細 次數(shù) 胞劑量
小鼠種系 預防效果*
Chen 等， 2002 年 Sakai 等， 2004 年 Chan 等’ 2006 年 Nabekura
腺病毒
腺病毒
腺病毒
等，2008年
我們 慢病毒
Ixio6
IxlO0
Ixio0
逆轉(zhuǎn)錄病毒 5X105
1.5x10'
3x10s
BALB/c 60 天，25%
3 5x10s,兩次 BALB/c 121 天，100%
3χ IO5 BALB/c, FVB/N 60 天，100%
5x10'
,6
C57BL/6 12 天，50%
2χ105，兩次 C57BL/6 150 天，100% ·顯示為觀察持續(xù)時間(腫瘤細胞接種計為第0天)和最后一次觀察時健康無瘤 小鼠的百分比。


圖1為實施例中pSin-EF2-neuET-Pur陽性克隆的PCR篩選；其中預期陽性克隆應 擴增出大小為2100bp的片段，可見4個菌落都擴增出了這一條帶，說明可能均為陽性克隆。 neg為陰性對照，一個無關質(zhì)粒，pos為陽性對照pMMTV-neu ；
圖2為pSin-EF2-neu-Pur的酶切鑒定圖；其中預期單酶切片段為8500bp，雙酶切 片段為6400bp，2100bp。酶切結(jié)果與預測一致。E+S表示EcoR I和Spe I雙酶切；圖3為預防實驗中各組小鼠的無瘤生存曲線圖；其中小鼠經(jīng)過DPBS或DC免疫 (1. 5X IO5/只，5只/組)后7天，用Bieneu細胞(2X IO5/只)進行皮下接種，持續(xù)觀察各 組小鼠的腫瘤發(fā)生情況?？梢奃Cnw免疫組的所有小鼠在腫瘤細胞接種后第100天仍未發(fā) 生腫瘤，而DPBS組和DCetel組分別在第24和31天全部發(fā)生了腫瘤；圖4為治療實驗中各組小鼠的腫瘤生長曲線圖；首先用2X 105B16neU對每只小 鼠進行腫瘤接種，然后在7天或15天后用DPBS或DC進行治療。DC劑量為2X IO5/只， 之后每周對小鼠腫瘤進行兩次觀察和測量，小鼠腫瘤體積使用橢圓體積公式進行計算 aXb2X0. 5236，其中a和b分別代表腫瘤的長短徑，0. 5236為計算橢圓體積的一個常數(shù)。 左圖和右圖分別為小鼠在腫瘤接種后第7天和第15天接受治療的腫瘤生長曲線。圖中數(shù) 據(jù)顯示為均數(shù)士標準誤的均值，箭頭下數(shù)字表示免疫治療的時間。第7天治療實驗每組5 只小鼠，其中DPBS治療組有一只荷瘤小鼠在第17天不明原因死亡，DCneu治療組有一只無瘤 小鼠在第25天不明原因死亡，這兩只小鼠從死亡時間開始均不參與統(tǒng)計，在觀察期最后一 天(腫瘤接種后25天)的各組小鼠腫瘤平均體積分別為2627mm3 (DPBS)，2359mm3 (DCetel)， 374mm3 (DCneu) ’第15天治療實驗中，DBPS, DCctrl和DCneu三組小鼠數(shù)目分別為4只，4只和6 只。治療觀察期間沒有小鼠死亡，在觀察期最后一天(腫瘤接種后21天)各組小鼠腫瘤平 均體積分別為1052mm3，2306mm3and 472. 6mm3。對兩次實驗觀察期結(jié)束時各組小鼠腫瘤平均 體積進行統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn)，相比DCctrl (P = 0. 023)和DPBS (P = 0. 03)，DCneu能顯著抑制小 鼠腫瘤生長，而DPBS組和DCetel組的小鼠腫瘤平均體積沒有顯著性差異(P = 0. 587)。
具體實施例方式實施例1攜帶HER2/neU基因片段的重組慢病毒載體的構(gòu)建1. Neu基因片段的PCR擴增和純化弓丨物序列上游 5，-ggaattccagcctggtccagcctgag-3，；下游 5，-gactagttcactgtct ccttcgtttgatt-3’。反應模板為攜帶neu全長cDNA的質(zhì)粒pMMTV-neu，系本單位按現(xiàn)有技術 中的方法構(gòu)建。擴增反應使用NEB公司的Phusion超保真PCR試劑盒。反應體系如下(體
積單位均為μ 1)
權(quán)利要求
一種新的HER2/neu基因改造的樹突細胞疫苗，其特征在于是通過將HER2/neu重組到慢病毒載體上，再轉(zhuǎn)染樹突細胞來制備的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征在于用攜帶HER2/neU基因片段的重組慢病毒對 樹突細胞進行感染。
3.權(quán)利要求1或2所說的疫苗在制備治療或預防HER2/neU陽性腫瘤藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的HER2/neu基因改造的樹突細胞疫苗的制備方案。它包括1.構(gòu)建攜帶HER2/neu基因片段的慢病毒載體；2.利用上述載體制備攜帶HER2/neu基因片段的重組慢病毒；3.用上述重組慢病毒感染樹突狀細胞并最終獲得疫苗。動物實驗證明這種新的HER2/neu基因改造的樹突細胞疫苗能有效預防和治療HER2/neu陽性腫瘤。
文檔編號A61K39/00GK101966335SQ20091004397
公開日2011年2月9日 申請日期2009年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月27日
發(fā)明者盧光琇, 盧光瑩, 李工博, 陳濂生 申請人:湖南惠霖生命科技有限公司