專利名稱：通過(guò)結(jié)合胞間粘附分子1調(diào)節(jié)樹突細(xì)胞分化和功能的抗體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及結(jié)合人胞間粘附分子1 (ICAM-I)的抗體，其中所述抗體能夠調(diào)制樹突細(xì)胞的分化和功能并且延長(zhǎng)移植物的存活。此外，本發(fā)明還提供包含所述抗體的藥物組合物和用其治療疾病的方法。
背景技術(shù)：
ICAM-I是90kDa的I型細(xì)胞表面糖蛋白，由從N末端到C末端排序并稱為結(jié)構(gòu)域 1至5的5個(gè)胞外免疫球蛋白超家族結(jié)構(gòu)域、一個(gè)跨膜域和一個(gè)胞內(nèi)域組成(Cell. 1990， 61 :243-54)。ICAM-I介導(dǎo)白細(xì)胞/白細(xì)胞相互作用，例如T細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞之間的相互作用。它還在炎癥過(guò)程中介導(dǎo)白細(xì)胞滲入組織(Transplantation. 1999，67 729-736)。體外研究表明干擾ICAM-I/白細(xì)胞功能抗原(LFA-I)相互作用的抗體能夠抑制T細(xì)胞粘附于上皮細(xì)胞并且這些抗體還可顯著降低混雜的淋巴細(xì)胞反應(yīng)中的T細(xì)胞活化(Proc Natl Acad Sci USA. 1988，85 :3095-309)。在使用抗人 ICAM-1 小鼠單克隆抗體R6-5-D6(恩莫單抗)對(duì)猴的研究中，與對(duì)照相比腎臟同種異體移植物的存活延長(zhǎng)并且T細(xì)胞在移植體中的滲潤(rùn)下降(J Immunol. 1990，144 :4604-4612)。還已證明恩莫單抗對(duì)抑制類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的疾病活動(dòng)有益(Arthritis Rheum. 1994,37 :992-999 ;J Rheumatol. 1996,23 :1338-1344)。但是，在隨機(jī)多中心研究中，腎臟移植后的恩莫單抗誘導(dǎo)治療不能降低急性排斥反應(yīng)率或移植物功能延遲發(fā)作的風(fēng)險(xiǎn)(Transplantation. 1999， 67 :729-736)。此外，急性缺血性中風(fēng)患者的臨床試驗(yàn)顯示用恩莫單抗的抗ICAM-I療法并不是有效的療法，并且與安慰劑相比實(shí)際上顯著惡化中風(fēng)后果并引起更不良的作用，主要是感染和發(fā)燒(Neurology. 2001，57 :1428-1434)。恩莫單抗通過(guò)阻斷T細(xì)胞和中性白細(xì)胞粘附于血管上皮細(xì)胞來(lái)起作用，并且已經(jīng)提出干擾中性白細(xì)胞遷移可能增加感染易感性(J Immunol. 1999，162 :2352-2357)。樹突細(xì)胞(DC)是高度特化的抗原呈遞細(xì)胞，它們能整合多種免疫應(yīng)答 (Nature. 1998,382 :245-252)，并且樹突細(xì)胞包括一族多樣化的參與啟動(dòng)免疫和免疫耐受的專門的抗原呈遞細(xì)胞。迄今為止，不成熟的DC被認(rèn)為會(huì)引起T細(xì)胞無(wú)反應(yīng)性，而通過(guò)活化刺激物例如脂多糖(LPS)轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒霥C的DC被認(rèn)為會(huì)誘發(fā)初期T細(xì)胞應(yīng)答(primary T cell response) (Blood. 2006,108 :1435-1440)。此外，具有獨(dú)特的細(xì)胞因子產(chǎn)生特點(diǎn)的半成熟DC可能具有致耐受性功能(Blood. 2006，108 :1435-1440)。ICAM-I在樹突細(xì)胞中高水平表達(dá)。但是迄今為止，樹突細(xì)胞中的ICAM-I被認(rèn)為僅作為在T細(xì)胞-DC相互作用中進(jìn)行LFA-I結(jié)合的簡(jiǎn)單粘附分子。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)涉及結(jié)合人胞間粘附分子-I(ICAM-I)的抗體，其中所述抗體能夠調(diào)制樹突細(xì)胞的分化和功能并且延長(zhǎng)移植物的存活。此外，本發(fā)明提供包含所述抗體的藥物組合物和用其治療疾病的方法。更具體地，本發(fā)明涉及抑制對(duì)移植的細(xì)胞或器官的排斥或抑制由移植的造血細(xì)胞引起的移植物抗宿主病的抗人ICAM-I抗體。本發(fā)明還涉及能夠結(jié)合人ICAM-I的結(jié)構(gòu)域1 但是不能阻斷ICAM-I和其配體LFA-I之間的相互作用的抗體。本發(fā)明還涉及生產(chǎn)所述材料的方法，該方法提供生產(chǎn)所述抗體或其片段的細(xì)胞。 本發(fā)明還包括通過(guò)所述方法得到的雜交瘤細(xì)胞以及由所述雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的抗體。本發(fā)明還包括用于抑制對(duì)移植的細(xì)胞或器官的排斥的藥物組合物。所述藥物組合物包含選自以下的免疫抑制劑能夠結(jié)合ICAM-I但是不抑制ICAM-I和LFA-I之間的相互作用的抗體；和抗體片段，所述片段能夠結(jié)合ICAM-I但是不抑制ICAM-I和LFA-I之間的相互作用。此外，本發(fā)明還涉及使用免疫抑制劑來(lái)抑制對(duì)移植的細(xì)胞或器官的排斥或抑制由移植的造血細(xì)胞引起的移植物抗宿主病的方法，所述免疫抑制劑選自抗體和抗體片段。所述抗體或抗體片段優(yōu)選地選自單克隆和多克隆抗體，更優(yōu)選是人或動(dòng)物(即非人)抗體。


當(dāng)與附圖一起考慮時(shí)，通過(guò)參考下面的具體實(shí)施方式
會(huì)更好地理解從而容易明了對(duì)本發(fā)明和隨之產(chǎn)生的本發(fā)明的多個(gè)優(yōu)點(diǎn)的完整理解，附圖中圖1顯示使用單色流式細(xì)胞術(shù)的MD-2和R6-5-D6單克隆抗體對(duì)人ICAM-I轉(zhuǎn)染的 HEK293T細(xì)胞表面的反應(yīng)性的照片。圖2顯示MD-2和R6-5-D6抗體對(duì)hlm2345和hl2m345ICAM_l突變體轉(zhuǎn)染的 HEK293T細(xì)胞的反應(yīng)性的照片。圖3顯示在MD-2或R6-5-D6抗體存在下混雜的淋巴細(xì)胞反應(yīng)后胸苷攝取的結(jié)果。圖4顯示與MD-2或R6-5-D6抗體預(yù)孵育后，R6-5-D6抗體對(duì)人ICAM-I陽(yáng)性DU145 細(xì)胞的反應(yīng)性的照片。圖5顯示樹突細(xì)胞表面上各種分子的表達(dá)水平和在所示抗體的處理后樹突細(xì)胞培養(yǎng)基中的細(xì)胞因子濃度。圖6顯示人化小鼠外周血中⑶45+人白細(xì)胞和⑶3+人T細(xì)胞產(chǎn)生的動(dòng)力學(xué)。圖7顯示由鏈脲菌素誘導(dǎo)糖尿病并且隨后移植大鼠胰島的人化小鼠的外周血葡萄糖水平。圖8顯示對(duì)從用所示抗體處理的每只小鼠取出的胰島移植腎臟的蘇木精-曙紅染色(H&E)和對(duì)胰島素的免疫組織化學(xué)染色的照片。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明就以下實(shí)施例進(jìn)行更詳細(xì)的進(jìn)一步解釋。但是不應(yīng)將這些實(shí)施例理解為以任何方式限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明涉及能夠抑制免疫應(yīng)答的小鼠抗人ICAM-I單克隆抗體MD-2和MD-2片段。 更具體地，本發(fā)明涉及抑制對(duì)移植的細(xì)胞或器官的排斥或者抑制由移植的造血細(xì)胞引起的移植物抗宿主病的抗人ICAM-I抗體。本發(fā)明還提供能夠結(jié)合人ICAM-I結(jié)構(gòu)域1但不能阻斷ICAM-I及其配體LFA-I之間的相互作用的抗體。本發(fā)明還包括能夠產(chǎn)生所述抗體的雜交瘤細(xì)胞。本發(fā)明還涉及生產(chǎn)所述材料的方法，該方法提供生產(chǎn)抗體及其片段的細(xì)胞。所述生產(chǎn)抗體或其片段的方法包括以下步驟(a)用人ICAM-I蛋白或蛋白片段或表達(dá)人ICAM-I 的細(xì)胞來(lái)免疫動(dòng)物，(b)從所免疫的動(dòng)物提取脾細(xì)胞，(c)將所述動(dòng)物的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞系融合，以及(d)篩選所述雜交瘤細(xì)胞并選出所需的雜交瘤細(xì)胞，所述所需的雜交瘤細(xì)胞能夠調(diào)制樹突細(xì)胞的分化和功能，并且能抑制對(duì)移植器官的排斥，但不能抑制ICAM-I和 LFA-I之間的相互作用。所述材料可以通過(guò)體外培養(yǎng)或向動(dòng)物注射生產(chǎn)所述材料的細(xì)胞而得到。所述材料可從經(jīng)腹膜內(nèi)注射生產(chǎn)所述材料的細(xì)胞的動(dòng)物的腹水中得到。所述材料可以通過(guò)離子交換色譜或親和柱層析從培養(yǎng)基上清液中純化。本發(fā)明還包括通過(guò)所述方法得到的雜交瘤細(xì)胞以及由所述雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的抗體。本發(fā)明還包括到用于抑制對(duì)移植的細(xì)胞或器官的排斥的藥物組合物。所述藥物組合物包含選自以下的免疫抑制劑能夠結(jié)合ICAM-I但是不能抑制ICAM-I和LFA-I之間的相互作用的抗體；和抗體片段，所述片段能夠結(jié)合ICAM-I但是不能抑制ICAM-I和LFA之間的相互作用。給予本發(fā)明抗體或其片段可使用給予藥物組合物的任意可接受方式來(lái)進(jìn)行。此外，本發(fā)明還涉及抑制對(duì)移植的細(xì)胞或器官的排斥的方法，所述方法使用選自抗體或抗體片段的材料。所述抗體或抗體片段優(yōu)選地選自單克隆抗體和多克隆抗體，更優(yōu)選是人或動(dòng)物抗體。本發(fā)明還提供使用本文公開的抗ICAM-I的抗體檢測(cè)ICAM-I的方法。這樣的檢測(cè)是有用的，因?yàn)镮CAM-I是炎癥等疾病過(guò)程的標(biāo)記。抗ICAM-I的抗體作為檢測(cè)ICAM-I的研究試劑而被商業(yè)出售。人化抗體是具有來(lái)自供體抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)和來(lái)自人抗體的可變區(qū)構(gòu)架和恒定區(qū)的抗體。⑶R —般如Kabat所定義但是也可以如Chothia所定義或者是Kabat和 Chothia定義的綜合。因此，人化抗體一般包含(i)輕鏈，其包含3個(gè)來(lái)自小鼠抗體——例如MD-2——的CDR，來(lái)自人抗體的可變區(qū)構(gòu)架(其可以，例如，來(lái)自成熟人抗體、人種系序列、2個(gè)或多個(gè)人抗體序列的復(fù)合序列或人抗體序列的共有序列)和人恒定區(qū)；以及(ii) 重鏈，其包含3個(gè)來(lái)自小鼠抗體——例如MD-2——的⑶R，來(lái)自人抗體的可變區(qū)構(gòu)架和人恒定區(qū)。所述可變區(qū)構(gòu)架還可在幾個(gè)(通常少于1、2、3、4、5或10個(gè))選出的位置上包括回復(fù)突變，其中人的殘基被鼠抗體占據(jù)相應(yīng)位置的殘基所替換(參見(jiàn)Queen et al. ,US Patent No. 5，530，101和5，585，089)。具體而言，在所述構(gòu)架中要替換的氨基酸一般基于其與⑶R 相互作用的能力而被選擇。例如，根據(jù)三維空間中的測(cè)量，被替換氨基酸殘基可與供體抗體序列的⑶R毗鄰或者在人化抗體的⑶R的4-6埃內(nèi)。對(duì)一個(gè)或多個(gè)CDR殘基的替換或者一個(gè)或多個(gè)CDR的刪除也是可能的。在科學(xué)文獻(xiàn)中記載了很多為結(jié)合而刪除一個(gè)或兩個(gè)⑶R的抗體。參見(jiàn)Indian et al. , FASEBJournal 9 133-139 (1995) ；Vajdos et al(Journal of Molecular Biology, vol. 320, pp.415-428(2002) ；Iwahashi et al. , Mol. Immunol. 36 :1079-1091, (1999) ；Tamura et al, Journal of Immunology，2000，164 :1432-1441 Q000)。對(duì) CDR 中的某些區(qū)域的替換基于與刪除可省略的CDR相同的原理，即只有一小部分CDR殘基SDR真正與抗原接觸。可以基于先前的研究通過(guò)分子建模和/或根據(jù)經(jīng)驗(yàn)從位于Chothia⑶R之外的 Kabat⑶R的區(qū)域中鑒定不與抗原接觸的⑶R殘基(例如⑶RH2中的殘基H60-H65經(jīng)常是不需要的)。如果一個(gè)CDR或其殘基被刪除，則其經(jīng)常被在提供可變區(qū)構(gòu)架序列的人受體序列中占據(jù)相應(yīng)位置的氨基酸代替換。要包括的這樣的替換的數(shù)目反映了競(jìng)爭(zhēng)因素的平衡。 這樣的替換對(duì)降低人化抗體中小鼠氨基酸的數(shù)目并因此降低可能的免疫原性可能是有利的。但是，替換也可以導(dǎo)致親和力的改變，并且最好避免親和力的顯著下降。在CDR中的替換位置和要替換的氨基酸還可以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)來(lái)篩選。經(jīng)驗(yàn)性替換可以是保守性或非保守性替換。但是，總的來(lái)說(shuō)，經(jīng)驗(yàn)性替換沒(méi)有小鼠至人替換在降低免疫原性方面的優(yōu)點(diǎn)。經(jīng)驗(yàn)性替換可增加或降低所得人化抗體的親和力。總的來(lái)說(shuō)，具有令人滿意的對(duì)ICAM-I的親和力并且沒(méi)有很大免疫原性的人化抗體可通過(guò)對(duì)根據(jù)上述原則得到的幾個(gè)變體的分別篩選來(lái)獲得。但是，極大量的變體可使用諸如噬菌體展示的展示選擇(display selection)方法同時(shí)篩選(參見(jiàn)Dower et al., W091/17271 ；McCafferty et al. , W092/001047 ；和 Winter，W092/20791)。嵌合抗體是來(lái)自小鼠(或其他嚙齒動(dòng)物)抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)與人抗體的重鏈和輕鏈恒定區(qū)組合的抗體；通過(guò)遺傳工程對(duì)它們的構(gòu)建是眾所周知的。這樣的抗體保留有小鼠抗體的結(jié)合特異性，同時(shí)具有約2/3的人抗體部分。存在于小鼠抗體、嵌合抗體和人化抗體中的非人序列的比例表明嵌合抗體的免疫原性介于小鼠和人抗體之間。通常人化抗體和嵌合抗體是具有κ輕鏈的IgGl、IgG2、IgG3或IgG4同種型抗體。單克隆抗體(mAb)可源自動(dòng)物(例如，小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠或雞)，或者它們可以是遺傳工程設(shè)計(jì)的。嚙齒動(dòng)物mAb由本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)方法制備，所述方法包括用合適佐劑中的ICAM-I在腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或爪墊內(nèi)多次免疫，然后提取脾或淋巴結(jié)細(xì)胞并與合適的永生化細(xì)胞系融合，然后選擇產(chǎn)生結(jié)合ICAM-I的抗體的雜交瘤，參見(jiàn)下文實(shí)施例部分。人抗體還可通過(guò)噬菌體展示制備(參見(jiàn)Dower et al. , W091/17271 ；McCafferty et al.， W092/001047 ；Winter, W092/20791 ；和 Winter，F(xiàn)EBS Lett. 23 :92,1998)或者通過(guò)使用轉(zhuǎn)基因小鼠制備(參見(jiàn)例如 Lonberg et al. , W093/12227 ；Kucherlapati W091/10741)。嵌合和人化mAb是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案?？贵w是具有復(fù)雜內(nèi)部結(jié)構(gòu)的非常大而復(fù)雜的分子(分子量為約150，000或約1320 個(gè)氨基酸)。天然抗體分子包含2對(duì)相同的肽鏈，每對(duì)均有1條輕鏈和1條重鏈。每條輕鏈和重鏈相應(yīng)地由兩個(gè)區(qū)域組成一個(gè)參與結(jié)合靶抗原的可變(“V”)區(qū)和一個(gè)與免疫系統(tǒng)的其他組分相互作用的恒定(“C”)區(qū)。輕鏈和重鏈可變區(qū)在3維空間中折疊在一起形成與抗原(例如，細(xì)胞表面的受體)結(jié)合的可變區(qū)。在每個(gè)輕鏈或重鏈可變區(qū)內(nèi)，有3個(gè)被稱為互補(bǔ)決定區(qū)(“CDR”)的短區(qū)段(平均長(zhǎng)度為10個(gè)氨基酸)?？贵w可變結(jié)構(gòu)域中的6 個(gè)CDR(3個(gè)來(lái)自輕鏈，3個(gè)來(lái)自重鏈)在3維空間中折疊在一起形成鎖定到靶抗原上的實(shí)際抗體結(jié)合位點(diǎn)。CDR的位置和長(zhǎng)度已被精確地定義。參見(jiàn)Kabat，E. et al. , Sequences of Proteins of Immunological Interest,U. S. Department of Health and Human Services,1983，1987。未包含在⑶R中的可變區(qū)部分被稱為構(gòu)架，其形成⑶R的環(huán)境。抗體可與特定靶蛋白特異地結(jié)合；即在包含靶蛋白的混合物中優(yōu)先與靶蛋白結(jié)合。特異性結(jié)合通常還意味著小于約10、、IO-7MUO-8M或IO-9M的解離常數(shù)(KD)。本發(fā)明的天然mAb可由其雜交瘤產(chǎn)生?；蚬こ淘O(shè)計(jì)的mAb，例如嵌合或人化mAb， 可通過(guò)多種本領(lǐng)域已知方法表達(dá)。例如，編碼mAB的輕鏈和重鏈V區(qū)的基因可由部分重疊的寡核苷酸合成，并與可用的C區(qū)一起插入提供必要調(diào)控區(qū)例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、poly A位點(diǎn)等的表達(dá)載體(例如hvitrogen市售)。優(yōu)選使用CMV啟動(dòng)子-增強(qiáng)子。然后可使用多種公知的方法，例如脂質(zhì)轉(zhuǎn)染或電穿孔，將所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中，例如CHO或者包括Sp2/0和NSO的非生產(chǎn)性骨髓瘤，再通過(guò)合適的抗生素選擇選出表達(dá)所述抗體的細(xì)胞。一旦表達(dá)，本發(fā)明的mAb或其他抗體就可通過(guò)本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法純化，所述方法例如微孔過(guò)濾、超濾、蛋白A或G親和層析、尺寸排阻色譜、陰離子交換色譜、陽(yáng)離子交換色譜和/或基于有機(jī)染料等的其他形式的親和層析。對(duì)于醫(yī)藥用途，優(yōu)選具有至少約50、90 或95%同質(zhì)性、并且最優(yōu)選具有98、99%或更高的同質(zhì)性的基本純的抗體。術(shù)語(yǔ)“分離的”和“純化的”是指大體上或基本上從其天然環(huán)境和/或不需要的雜質(zhì)中提取或濃縮的物質(zhì)。例如，將一種分離的抗體從針對(duì)其他抗原的其他抗體中分離出來(lái)， 并從其他與其天然結(jié)合的生物材料(例如，其他核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、細(xì)胞組分)中分離出來(lái)。本發(fā)明的抗體還包括抗體的結(jié)合片段，例如Fv、Fab和F(ab’ )2 ；雙功能雜合抗體(例如 Lanzavecchia et al. , Eur. J. Immunol. 17 :105,1987)；單鏈抗體(Huston et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :5879,1988 ；Bird et al.，Science 242 :423,1988)；和具有改變的恒定區(qū)的抗體(例如，美國(guó)專利No. 5，624，821)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種包含本文描述的抗體的藥物制劑。也就是說(shuō)，所述抗體可用于制備治療疾病的藥劑。所述抗體的藥物制劑(即藥劑)含有生理可接受載體中的mAb，任選地含有賦形劑或穩(wěn)定劑，為凍干的或水溶液形式?？山邮茌d體、賦形劑或穩(wěn)定劑在使用的劑量和濃度下對(duì)接受者無(wú)毒，并且包含緩沖劑，例如PH—般為5. 0 至8. 0、最常為6. 0至7. 0的磷酸鹽、檸檬酸鹽或乙酸鹽；維持等滲的鹽，例如氯化鈉、氯化鉀等；抗氧化劑；防腐劑；低分子量多肽；蛋白質(zhì)；親水聚合物，例如聚山梨酯80 ；氨基酸； 碳水化合物；螯合劑；糖以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他標(biāo)準(zhǔn)成分。所述mAb通常以l-100mg/ml (例如10mg/ml)的濃度存在。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種用藥物制劑中的抗ICAM-I的mAb治療有疾病的患者——一般是人——的方法。制備在藥物制劑中的mAb可以任意合適的途徑給予患者，特別是通過(guò)靜脈內(nèi)輸注或推注、肌肉內(nèi)或皮下途徑的腸胃外給藥。靜脈內(nèi)輸注可進(jìn)行少至15分鐘，但是更經(jīng)常進(jìn)行30分鐘，或者進(jìn)行1、2或者甚至3小時(shí)。所述mAb還可被直接注入疾病位點(diǎn)(例如，腫瘤)，或者被裝入諸如脂質(zhì)體的載劑(carrying agent)中。 所給的劑量應(yīng)足以減輕被治療的病癥(“治療有效劑量”)并且可能是0. 1至5mg/kg體重， 例如1、2、3或％ig/kg，但是可高達(dá)10mg/kg甚至15或20mg/kg。也可給予固定的單位劑量， 例如50、100、200、500或lOOOmg，或者劑量可基于患者的體表面積計(jì)，例如100mg/m2。所述mAb可以每日、每周、每?jī)芍?、隔周、每月或以其他間隔時(shí)間——這取決于例如 mAb的半衰期——給藥，持續(xù)1周、2周、4周、8周、3-6個(gè)月或更長(zhǎng)。重復(fù)療程以及長(zhǎng)期給藥也是可能的。減輕或至少部分抑制疾病的(生物化學(xué)的、組織學(xué)的和/或臨床的)癥狀—— 包括其疾病發(fā)展中的并發(fā)癥和中間病理表型——的給藥劑量方案和間隔時(shí)間被稱為治療有效方案。ICAM-I是熟知的人蛋白質(zhì)，其氨基酸序列由Simmons等，Nature331, 624-627(1988)和 GenBank 登錄號(hào) 06990. 1 提供。LFA 是 CDlla 和 CD18 的異二聚體。人 CDlla 的氨基酸序列由 Larson 等，J. Cell. Biol. 108，703-712 (1989)和 GenBank Y00796. 1 提供。人CD18 的氨基酸序列由 Kishimoto 等，Cell 48，681-690 (1987)和GenBank M15395. 1提供。本發(fā)明就以下實(shí)施例進(jìn)行更詳細(xì)的解釋。但是不應(yīng)將這些實(shí)施例理解為以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1能夠生產(chǎn)抗人ICAM-I單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞的分離為生產(chǎn)ICAM-1/Fc蛋白，從PHA活化的人外周血單核細(xì)胞中提取mRNA并且通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增與人ICAM-I的前導(dǎo)區(qū)基因區(qū)段和胞外結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)的cDNA片段。 通過(guò)在5’和3’端分別引入NheI和EcoRI位點(diǎn)來(lái)克隆編碼ICAM-I的胞外結(jié)構(gòu)域的片段。 為了形成人ICAM-I和人IgG Fc的融合構(gòu)建體，將此片段連接到EcoRI和B10I消化的編碼 hlgGl的鉸鏈CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的質(zhì)粒中。將HEK293T細(xì)胞用所述質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，并且使用蛋白G柱將從培養(yǎng)上清液中純化ICAM-1/Fc蛋白質(zhì)。用在弗氏完全佐劑中乳化的100 μ g ICAM-1/Fc蛋白對(duì)Balb/c小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)免疫，隨后以兩周的間隔用在弗氏不完全佐劑中乳化的100 μ g ICAM-1/Fc蛋白再進(jìn)行兩次免疫。兩周后，用lOOyglCAM-l/Fc蛋白對(duì)免疫的小鼠進(jìn)行加強(qiáng)。在最后一次給藥后3天取出Balb/c小鼠的脾臟以制備脾細(xì)胞懸浮液。通過(guò)將用人ICAM-1/Fc免疫的Balb/c脾細(xì)胞與耐9-氮鳥嘌呤的SP2/0-Agl4小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合來(lái)生產(chǎn)單克隆抗體。細(xì)胞融合方法按照 Koeler 和 Milstein 方法(Koeler&Milstein Nature，1975，256，495-497)。用 50%聚乙二醇4000將IO8個(gè)脾細(xì)胞與IO7個(gè)骨髓瘤細(xì)胞融合。在含有20%胎牛血清(FBQUOOyM 次黃嘌呤、0. 44 μ M氨基蝶呤和16 μ M胸苷的Dulbeco改良fegle培養(yǎng)基(DMEM) (HAT培養(yǎng)基)中洗滌并重懸所得細(xì)胞。將所述細(xì)胞引入4個(gè)96孔板并于37°C在5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)2周后集落形成時(shí)，用人ICAM-I轉(zhuǎn)染的HEK 293T細(xì)胞篩選上清液。ICAM-I轉(zhuǎn)染的HEK293T細(xì)胞和野生型HEK293T細(xì)胞均以培養(yǎng)基上清液染色并且選出產(chǎn)生對(duì)ICAM-I 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞有上清液反應(yīng)性但不對(duì)野生型細(xì)胞有上清液反應(yīng)性的細(xì)胞。通過(guò)有限稀釋試驗(yàn)將取自陽(yáng)性孔的細(xì)胞以0. 5細(xì)胞/孔亞克隆，以產(chǎn)生穩(wěn)定的具有高抗體反應(yīng)性的雜交瘤克隆。此實(shí)驗(yàn)鑒定并克隆出了 3個(gè)不同的生產(chǎn)抗ICAM-I單克隆抗體的雜交瘤系。這些雜交瘤系之一生產(chǎn)具有κ輕鏈的IgGl抗體并且被命名為MD-2。被命名為MD-2的雜交瘤于2008年12月24日被保藏于位于韓國(guó)，110-744，首爾，Chongno-Gu, Yongon-dong 28，首爾國(guó)立大學(xué)醫(yī)學(xué)院的癌癥研究所，登錄號(hào)為KCLRF-BP-00198。此保藏物將在以下時(shí)間的最長(zhǎng)時(shí)間保存在指定保藏單位并且在突變、死亡或遭破壞時(shí)進(jìn)行替換所述指定保藏單位收到最近的公開樣本的要求后至少5年、保藏日期后至少30年或者相關(guān)專利可實(shí)施期間。公眾獲得此細(xì)胞系的所有限制將在所述申請(qǐng)被授予專利權(quán)后不可撤回地解除。如圖1所示，ICAM-I轉(zhuǎn)染的細(xì)胞被MD_2抗體以及已知的抗人ICAM-I抗體 R6-5-D6陽(yáng)性染色，而這兩種抗體都不具有對(duì)野生型未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的反應(yīng)性。一旦鑒定出一種示例性抗體(例如MD-2)，就可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定鑒定與ICAM-I 上相同或部分重疊的表位結(jié)合的其他抗體。如果兩種抗體的每一種均競(jìng)爭(zhēng)性地抑制(阻斷)另一種抗體與抗原的結(jié)合，則這兩種抗體結(jié)合相同或部分重疊的表位。也就是說(shuō)，如在競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定中所測(cè)量的，1X、5X、10X、20X或100X過(guò)量的一種抗體將另一種抗體的結(jié)合抑制至少50%，優(yōu)選75%、90%、甚或99% (參見(jiàn)，例如Junghans et al. , Cancer Res. 50 :1495,1990) 0所述競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定可以對(duì)完整ICAM-1、其包括5個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域的胞外結(jié)構(gòu)域或從其他免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域分離的結(jié)構(gòu)域1進(jìn)行?；蛘撸捎靡砸梅绞郊{入本文的Jespers等，Biotechnology 12 :899,1994的方法來(lái)指導(dǎo)與原型 (archtypal)mAb MD-2具有相同表位并且因此具有相似特點(diǎn)的mAb的篩選。使用噬菌體展示，首先使該原型抗體的重鏈與(優(yōu)選人的)輕鏈的全部組成部分配對(duì)以選出HGF-結(jié)合 mAb，然后使此新的輕鏈與(優(yōu)選人的)重鏈的全部組成部分配對(duì)以選出與該原型mAb具有相同表位的ICAM-I-結(jié)合mAb。MD-2的變體及其人化形式和嵌合形式也可通過(guò)氨基酸替換、特別是在可變區(qū)構(gòu)架位置上的氨基酸替換來(lái)替換制備。這樣的替換可以是保守性或非保守性的。出于將氨基酸替換分為保守性替換或非保守性替換的目的，可對(duì)氨基酸做如下分類1組(疏水側(cè)鏈) Met、Ala、Val、Leu、lie ;11 組(中性親水側(cè)鏈)=Cys, Ser, Thr ；III (酸性側(cè)鏈):Asp、 Glu;IV 組(堿性側(cè)鏈):Asn、Gln、His、Lys、Arg ;V 組(影響鏈方向的殘基)=Gly, Pro ；^P VI組(芳香族側(cè)鏈)Trp、Tyr、W!e。保守性替換是涉及同組內(nèi)氨基酸之間的替換。可篩選結(jié)合ICAM-I特別是其第一個(gè)結(jié)構(gòu)域、并任選地與MD-2抗體競(jìng)爭(zhēng)的變體。變體的重鏈和輕鏈優(yōu)選呈現(xiàn)與參考抗體例如MD-2、特別是在CDR區(qū)域中具有至少90或95%的氨基酸序列同一性。通過(guò)以不計(jì)缺口的Kabat編號(hào)方式比較與參考抗體的重鏈或輕鏈可變區(qū)最大程度比對(duì)的重鏈或輕鏈可變區(qū)來(lái)確定序列同一性。實(shí)施例2抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的定位ICAM-I具有由5個(gè)免疫球蛋白樣(Ig樣)結(jié)構(gòu)域、一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域組成的結(jié)構(gòu)(Cell. 1992,68 :71-81)。為了定位MD-2與具體ICAM-I的Ig-樣結(jié)構(gòu)域結(jié)合的位點(diǎn)，使用人和小鼠ICAM-I的cDNA克隆制備了兩種嵌合cDNA，所述嵌合cDNA編碼人結(jié)構(gòu)域1/小鼠結(jié)構(gòu)域2-5——包括小鼠跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(hlm2345)，編碼人結(jié)構(gòu)域1-2/小鼠結(jié)構(gòu)域3-5(hiaii345)。用部分重疊PCR技術(shù)來(lái)構(gòu)建這些嵌合突變體。首先使用如下的引物擴(kuò)增包含人結(jié)構(gòu)域1 (hi)的cDNA :5，引物GAA TTC ATG GCT CCC AGC AGC CCC CGG CCC GCG CT (SEQ ID NO 1) ；3，引物AGG TCT CAG CTC CAC CCG TTC TGG AGT CCA GTA CAC GGT GAG GAA G(SEQ ID NO :2)。用于產(chǎn)生小鼠結(jié)構(gòu)域2-5、一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(m2345)的引物如下5，引物，CTG GAC TCC AGA ACG G GTG GAG CTG AGA CCT CTG CCA GCC TGG CAG (SEQ ID NO 3) ；3，引物 GGA TCC GGG AGG TGG GGC TTG TCC CTT GAG TTT TAT GGC (SEQ ID NO :4)。將這兩種 cDNA 混合并用 SEQ ID NO: IfPSEQ ID NO: 4引物重新擴(kuò)增并且將最終產(chǎn)物(hlm2345)克隆到pcDNA3. 1載體中。使用如下引物，也以與克隆hlm2345相同的方法克隆編碼hl2m345的突變體:hl2的5，引物，GAA TTC ATG GCT CCC AGC AGC CCC CGG CCC GCG CT(SEQ ID NO 5) ；hl2 的 3’ 引物，GGT AGC TGG AAG ATC AM GGT CTG GAG CTG GTA GGG GGC CGA GGT (SEQ ID NO 6) ；m345 的 5，引物，CAG CTC CAG ACC TTT GAT CTT CCA GCT ACC ATC CCA AAG CTC GAC ACC(SEQ ID NO 7) ；m345 的 3，引物，GGA TCC GGG AGG TGG GGC TTG TCC CTT GAG TTT TAT GGC(SEQ ID NO 8)。對(duì)整個(gè)構(gòu)建體測(cè)序以確認(rèn)得到了正確的連接，然后使用磷酸鈣沉淀法將質(zhì)粒DNA 轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞。在HEK293T細(xì)胞與磷酸鈣和質(zhì)粒DNA的共沉淀物孵育16-20小時(shí)之后，用IOml新鮮溶液替換培養(yǎng)基并將所述細(xì)胞再孵育M小時(shí)。然后在冰中用MD-2或 R6-5-D6抗體對(duì)所述轉(zhuǎn)染細(xì)胞染色。在孵育30分鐘后，將細(xì)胞在含有5%胎牛血清和0. 1% 疊氮化物的磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)中洗滌3次，然后與FITC綴合的山羊抗小鼠Ig抗體 (二抗)孵育30分鐘。再進(jìn)行3次洗滌后，進(jìn)行流式細(xì)胞分析來(lái)檢測(cè)它們與每種抗體反應(yīng)的能力(圖2)。用僅用二抗染色的細(xì)胞作為陰性對(duì)照。如圖2所示，MD-2和R6-5-D6抗體均陽(yáng)性染色完整人ICAM-I轉(zhuǎn)染細(xì)胞，但是每種抗體都不與完整小鼠ICAM-I轉(zhuǎn)染細(xì)胞反應(yīng)， 表明這些抗人ICAM-I抗體不與小鼠ICAM-I交叉反應(yīng)。對(duì)于嵌合突變體，MD-2抗體與兩種嵌合體——1111112345和111&1345都反應(yīng)，而之前已經(jīng)歸于結(jié)構(gòu)域2(0611. 1992，68 :71-81)的 R6-5-D6抗體僅與hl2m345嵌合體反應(yīng)。因此，所有這些結(jié)果均表明，MD-2抗體對(duì)結(jié)構(gòu)域1 上的表位是特異的，并且R6-5-D6抗體定位至結(jié)構(gòu)域2。實(shí)施例3抗ICAM-I抗體在混雜的淋巴細(xì)胞反應(yīng)中的作用盡管LFA-I結(jié)合位點(diǎn)位于ICAM-I的結(jié)構(gòu)域中，但已知結(jié)構(gòu)域2在結(jié)構(gòu)域1的構(gòu)象(confirmation)中具有必不可少的作用(Cell. 1992,68 :71-81)。因此，阻斷LFA-I和 ICAM-I之間的相互作用的一些抗體定位于結(jié)構(gòu)域1，但是定位結(jié)構(gòu)域2的其他抗體—— 例如R6-5-D6抗體也能夠抑制所述相互作用(Cell. 1992,68 :71-81)。本發(fā)明人還研究了 LFA-I和ICAM-I之間的相互作用是否可被MD-2抗體影響。當(dāng)來(lái)自兩個(gè)無(wú)親屬關(guān)系的人的淋巴細(xì)胞在彼此存在的情況下培養(yǎng)時(shí)，觀察到淋巴細(xì)胞的增殖，并且已知這種混雜的淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)依賴于ICAM-1/LFA-1相互作用 (Proc Natl Acad Sci USA. 1988，85 :3095-3099)。因此，進(jìn)行 MLR 測(cè)定以評(píng)估抗 ICAM-1 抗體MD2是否能夠干擾LFA-I對(duì)ICAM-I的粘附。從兩名無(wú)親屬關(guān)系的供體獲取新鮮血細(xì)胞，并且在置于 Ficol 1-hypaque (Pharmacia, Uppsala, Sweden)之上并以 2，OOOrpm 離心 20 分鐘之后，收集外周血單核細(xì)胞，然后將其在加有10%胎牛血清的DMEM中重懸浮。用實(shí)施例5中描述的磁活化細(xì)胞分選(MACQ系統(tǒng)從一名供體中純化CD4+T細(xì)胞。用鈷輻射源以 2000cGy輻射來(lái)自另一名供體的細(xì)胞。然后，在將來(lái)自兩名供體的細(xì)胞混合之后，將混合的細(xì)胞以IX IO6細(xì)胞/孔鋪在平底96孔組織培養(yǎng)板上，并在抗ICAM-I抗體(20 μ g/ml)存在或不存在的條件下培養(yǎng)。3天后將所述培養(yǎng)物用[3H]胸苷(0.5 μ Ci/孔)進(jìn)行脈沖，16 小時(shí)后將其收獲至玻璃纖維過(guò)濾器上，然后在液體閃爍β計(jì)數(shù)儀上計(jì)數(shù)。如圖3所示，抗 ICAM-I阻斷抗體R6-5-D6抑制了 MLR，但是培養(yǎng)細(xì)胞的增殖沒(méi)有被MD-2抗體影響。這些結(jié)果表明MD-2抗體沒(méi)有阻斷ICAM-I和LFA-I之間相互作用的活性。實(shí)施例4MD-2和R6-5-D6抗體的結(jié)合表位的比較
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實(shí)施例2的結(jié)果提示，MD-2抗體的結(jié)合表位可能與R6_5_D6的不同。為確證這一點(diǎn)，進(jìn)行交叉阻斷研究，在所述研究中，一種抗體的結(jié)合相應(yīng)地受到另一種抗體的競(jìng)爭(zhēng) (Cell. 1992,68 :71-81)。將 10、1 或 0. 1 μ g 的 MD-2 或 R6-5-D6 抗體與 ICAM-I 陽(yáng)性 DU145 細(xì)胞在冰上預(yù)孵育30分鐘，洗滌2次，然后與1 μ g的FITC綴合的R6-5-D6抗體孵育。使用的對(duì)照是在所述測(cè)定中省略競(jìng)爭(zhēng)抗體。將細(xì)胞洗滌2次并且用流式細(xì)胞術(shù)分析。如圖4 所示，F(xiàn)ITC綴合的R6-5-D6抗體的結(jié)合被與未綴合的R6-5-D6抗體的預(yù)孵育以劑量依賴的方式所抑制。但是DU145細(xì)胞與MD-2抗體的預(yù)孵育對(duì)R6-5-D6抗體的結(jié)合沒(méi)有作用，表明 MD-2抗體的結(jié)合表位與R6-5-D6的不同。實(shí)施例5抗ICAM-I抗體在單核細(xì)胞衍生的樹突細(xì)胞的分化中的作用通過(guò)Ficoll-hypaque密度梯度離心從健康供體血液中分離外周血單核細(xì)胞。用 PBS清洗2次后，將細(xì)胞以IX IO8細(xì)胞/ml的濃度重懸于MACS緩沖液，再與抗⑶14磁珠 (20 μ 1/107 細(xì)胞；Miltenyi Biotec,Bergisch Gladbach,Germany)在冰中孵育 15 分鐘，之后用MAcS(Milteny-Biotech)進(jìn)行磁分離。將純化的CD14+單核細(xì)胞重懸于加有10% FBS 的RPMI并與粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF，1000U/ml)和IL_4 (1000U/ml)培養(yǎng)6 天。在第0天和第3天對(duì)所述培養(yǎng)物添加抗體(10mg/ml)，并在第6天將LPS加入所述培養(yǎng)物。1天之后，收獲培養(yǎng)的細(xì)胞并且用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MHC I類、MHC II類、⑶80、⑶86、 CD40和CD83的表達(dá)。還進(jìn)行ELISA以測(cè)量培養(yǎng)基中IL-6、IL-10、IL_12p70、IFN-γ和 TNF- α的量。當(dāng)在GM-CSF和IL-4存在下培養(yǎng)CD14+單核細(xì)胞時(shí)，它們能夠分化為不成熟的DC，并且LPS處理會(huì)誘導(dǎo)不成熟DC的成熟。圖5B中顯示每種培養(yǎng)基中的所示抗原的平均熒光強(qiáng)度(MFI)和細(xì)胞因子濃度。如所預(yù)料的，在不成熟DC中的LPS處理增強(qiáng)了 MHC I 類、MHC II類、⑶80、⑶86和⑶40的表達(dá)和細(xì)胞因子的產(chǎn)生。LPS刺激的DC中這些分子的表面表達(dá)和細(xì)胞因子產(chǎn)生的上調(diào)未被抗ICAM-I阻斷抗體R6-5-D6抑制。但是，與R6-5-D6 抗體不同的是，在LPS刺激之前的MD-2抗體的預(yù)處理顯著抑制了 DC中表面分子表達(dá)和細(xì)胞因子產(chǎn)生的上調(diào)，表明MD-2抗體能夠抑制單核細(xì)胞衍生的DC的成熟。實(shí)施例6人化小鼠的產(chǎn)生為研究抗ICAM-I抗體的體內(nèi)作用，按照Ito, M.等，Blood. 2002，100 :3175-82的方法通過(guò)將人造血干細(xì)胞移植到免疫缺陷小鼠中來(lái)產(chǎn)生人化小鼠。在正常足月分娩過(guò)程中收集臍帶血細(xì)胞，并用Ficoll-hypaque離心分離單核細(xì)胞。將分離的單核細(xì)胞以3. 3X IO8細(xì)胞/ml懸浮于含有5% FBS和2mM EDTA的PBS中， 并在冰中與Fc封閉抗體孵育30分鐘，然后在冰中與抗CD34磁珠(Milteny-Biotech)孵育 30分鐘。洗滌2次之后，使用MACS通過(guò)磁分離收集磁珠吸附的細(xì)胞。在兩輪磁分離之后， 用流式細(xì)胞術(shù)估算純度，不少于95%的收集到的細(xì)胞是CD34+。用鈷輻射源以MOcGy輻射 8 至 12 周齡的 NOD. SCID/ y cnu11 小鼠(Central Institute for Experimental Animals, Japan)，并在1天后將1 X IO5⑶34+細(xì)胞通過(guò)尾靜脈注入每只小鼠。在移植后4至16周連續(xù)地從后眼窩(retro-orbital)靜脈叢取靜脈血，并用抗人⑶45和抗人⑶3抗體染色，用于流式細(xì)胞術(shù)。圖6顯示了在細(xì)胞移植后所示周數(shù)的小鼠外周血中的人細(xì)胞的嵌合比率。 在移植后11周在所有的小鼠中都檢測(cè)到了人白細(xì)胞，并且外周血中超過(guò)60%的白細(xì)胞是人⑶45+(圖6A)，并且在移植后16周大約10%的人⑶45+細(xì)胞表達(dá)⑶3 (圖6B)。實(shí)施例7抗ICAM-I抗體在抑制移植的異種胰島的排斥中的作用為了證明MD-2抗體在抑制移植排斥中的作用，使用了胰島異種移植模型。通過(guò)連續(xù)兩天兩次腹膜內(nèi)注射100mg/kg溶于pH 4.5的檸檬酸鹽緩沖液的鏈脲菌素 (streptozotocin) (Sigma, St. Louis, MO)使人化小鼠患糖尿病。在鏈脲菌素注射后第3 天，用ACXU-CHECK血糖儀(Roche，Mannheim, Germany)測(cè)定血液葡萄糖水平，并且僅使用血液葡萄糖> 250mg/dl的動(dòng)物作為糖尿病受者。通過(guò)靜止膠原酶消化(0. 07% XI型膠原酶，Sigma)，然后進(jìn)行如前(Transplantation. 2000，69 1567-1571)所述的不連續(xù) Ficoll (Ficoll 400，Pharmacia)密度梯度離心，從Sprague-Dolley大鼠中分離用于移植的胰島。分離后，將粗制的胰島細(xì)胞在加有10% FBS的DMEM中于37°C在5% CO2培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)，然后在鏈脲菌素注射后第4天，將500個(gè)胰島移植至每只糖尿病人化小鼠的左腎囊下空間中。在胰島移植前第6天和第3天腹膜內(nèi)注射抗ICAM-I抗體(300μ g/小鼠)。 對(duì)照組動(dòng)物接受不相關(guān)的小鼠IgG。將血液葡萄糖水平恢復(fù)至低于200mg/dl用作移植物功能的指標(biāo)，而連續(xù)兩天突然升高至> 250mg/dl的水平指示有排斥。如圖7所示，對(duì)照組小鼠在胰島移植后3周內(nèi)死亡或移植物被排斥，而在胰島移植前接受MD-2抗體的所有小鼠中，在整個(gè)隨訪期內(nèi)血液葡萄糖水平均仍保持在低于200mg/dl。當(dāng)小鼠表現(xiàn)出病態(tài)時(shí)將其處死并對(duì)左腎切除樣本進(jìn)行組織學(xué)分析以獲取移植物排斥證據(jù)。在移植后第9、21和44天將對(duì)照小鼠處死。在MD-抗體處理組中，在移植后第 34、77和87天將小鼠處死。將每只小鼠的腎切除樣本都在10%的中性福爾馬林中固定，包埋在石蠟中然后連續(xù)切成4μ m厚的切片，用于常規(guī)蘇木精-曙紅染色或免疫組織化學(xué)分析。胰島素染色使用抗人胰島素的第一山羊抗血清(DAK0，Carpenteria, CA)，然后進(jìn)行親和素-生物素過(guò)氧化物酶法，并用二氨基聯(lián)苯胺作為底物。如圖8所示，在接受對(duì)照抗體的小鼠的囊下區(qū)域中明顯地觀察到單核細(xì)胞的浸潤(rùn)，并且在這些小鼠中免疫組織化學(xué)未能發(fā)現(xiàn)有活力的胰島。但是與對(duì)照小鼠不同，在MD-2處理的小鼠中，移植物存活仍非常明顯，并且沒(méi)有觀察到單核細(xì)胞浸潤(rùn)。此外，移植的胰島繼續(xù)產(chǎn)生胰島素。因此，移植前的MD-2處理能夠?qū)е乱葝u異種移植物的存活延長(zhǎng)。本文引用的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)均以引用的方式出于全部目的全文納入本文，其納入的程度為如同每篇出版物、專利或?qū)＠暾?qǐng)均具體、逐一地明確以引用的方式出于全部目的全文納入。國(guó)際承認(rèn)用于專利程序的微生物保存布達(dá)佩斯條約國(guó)際表原始保藏的情況下的收據(jù)根據(jù)第7. 1條發(fā)布TO :Park, Seong Hoe，Town Apt 33-1104, Sindang 3-dong, Jung-gu, Seoul, Republic of korea
權(quán)利要求
1.一種抗體，其與由以KCLRF-BP-00198的登錄號(hào)保藏的雜交瘤產(chǎn)生的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合人胞間粘附分子-1 (ICAM-I)的結(jié)構(gòu)域1。
2.一種抗體，其結(jié)合人ICAM-I的結(jié)構(gòu)域1，但不抑制人ICAM-I與人白細(xì)胞功能抗原-I(LFA-I)的結(jié)合。
3.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體是分離的形式。
4.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體是嵌合抗體或人化抗體。
5.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。
6.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體通過(guò)結(jié)合ICAM-I調(diào)制樹突細(xì)胞的分化。
7.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體是MD-2(登錄號(hào)為KCRF-BP-OO198)。
8.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體是MD-2(登錄號(hào)為KCRF-BP-00198)的嵌合形式或人化形式。
9.一種包含重鏈和輕鏈的結(jié)合人ICAM-I的抗體，所述重鏈包含來(lái)自由以 KCLRF-BP-00198的登錄號(hào)保藏的雜交瘤產(chǎn)生的抗體的重鏈的3個(gè)⑶R，并且所述輕鏈包含來(lái)自由以KCLRF-BP-00198的登錄號(hào)保藏的雜交瘤產(chǎn)生的抗體的輕鏈的3個(gè)⑶R。
10.一種藥物組合物，包含權(quán)利要求1的抗體。
11.權(quán)利要求10的藥物組合物，其中所述抗體是分離的形式。
12.權(quán)利要求10的藥物組合物，其中所述抗體是嵌合抗體或人化抗體。
13.權(quán)利要求10的藥物組合物，其中所述抗體是單克隆抗體。
14.權(quán)利要求10的藥物組合物，其中所述抗體通過(guò)結(jié)合ICAM-I調(diào)制樹突細(xì)胞的分化。
15.權(quán)利要求10的藥物組合物，其中所述抗體抑制對(duì)移植的細(xì)胞或器官的排斥，或者抑制由移植的造血細(xì)胞引起的移植物抗宿主病。
16.一種包含結(jié)合人ICAM-I的抗體的藥物組合物，所述抗體包含重鏈和輕鏈，所述重鏈包含來(lái)自由以KCLRF-BP-00198的登錄號(hào)保藏的雜交瘤產(chǎn)生的抗體的重鏈的3個(gè)⑶R，并且所述輕鏈包含來(lái)自由以KCLRF-BP-00198的登錄號(hào)保藏的雜交瘤產(chǎn)生的抗體的輕鏈的3 個(gè) CDR。
17.權(quán)利要求16的藥物組合物，其中所述抗體抑制對(duì)移植的細(xì)胞或器官的排斥，或者抑制由移植的造血細(xì)胞引起的移植物抗宿主病。
18.—種產(chǎn)生抗體的雜交瘤，其中所述抗體結(jié)合人胞間粘附分子-I(ICAM-I)的結(jié)構(gòu)域 1，所述雜交瘤以KCLRF-BP-00198的登錄號(hào)保藏。
19.權(quán)利要求18的雜交瘤，其中所述抗體結(jié)合人胞間粘附分子-1(ICAM-I)，但不抑制人ICAM-I與人白細(xì)胞功能抗原-1 (LFA-I)的結(jié)合。
全文摘要
本發(fā)明涉及與人胞間粘附分子1(ICAM-1)結(jié)合的抗體，其中所述抗體能夠調(diào)制樹突細(xì)胞的分化狀態(tài)并且延長(zhǎng)移植物的存活。此外，本發(fā)明還提供包含所述抗體的藥物組合物和用其治療疾病的方法。
文檔編號(hào)A61K39/395GK102307900SQ200980140165
公開日2012年1月4日 申請(qǐng)日期2009年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月8日
發(fā)明者全允敬, 樸圣會(huì), 樸承杓, 裵英美, 鄭景天 申請(qǐng)人:狄諾納有限公司