專利名稱：肌醇多磷酸酯衍生物及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是在由國(guó)家健康研究院(NIH)資助的編號(hào)為R01 DK47240-01A1的政府資助下完成的。政府對(duì)本發(fā)明享有特定的權(quán)利。
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明主要涉及調(diào)節(jié)氯離子運(yùn)輸?shù)幕衔锖头椒?，更具體地講，涉及肌醇多磷酸酯的拮抗劑和激動(dòng)劑。
背景資料所有的活生物體均是由細(xì)胞組成的。細(xì)胞的界限是由將其內(nèi)外物質(zhì)隔開的質(zhì)膜確定的。細(xì)胞膜對(duì)物質(zhì)如營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞的通行進(jìn)行調(diào)節(jié)。在細(xì)胞中離子跨細(xì)胞膜運(yùn)輸起多方面的重要作用，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞的腫脹壓。離子運(yùn)輸?shù)恼{(diào)節(jié)可以使細(xì)胞具有適宜的離子濃度以保持其完整性和功能。在不適宜的條件下，例如，如果細(xì)胞內(nèi)的離子濃度太高，水就會(huì)進(jìn)入細(xì)胞并導(dǎo)致細(xì)胞腫脹或破裂。如果細(xì)胞內(nèi)的離子濃度太低，細(xì)胞就會(huì)收縮。
生物體利用細(xì)胞膜的離子運(yùn)輸性能來(lái)調(diào)節(jié)在特定組織中的流體。例如，腸細(xì)胞層利用離子運(yùn)輸調(diào)節(jié)水的吸收。細(xì)胞運(yùn)輸?shù)囊环N特別重要的離子是氯離子。在各種細(xì)胞功能如滲透調(diào)節(jié)、細(xì)胞內(nèi)pH調(diào)節(jié)以及鹽和體液分泌中，氯離子運(yùn)輸都起著重要作用。
在腸中，高水平的氯離子分泌與疾病例如分泌性腹瀉有關(guān)。分泌性腹瀉有許多原因，包括由微生物如沙門氏菌(Salmonella)、志賀氏菌(Shigella)和特定的大腸桿菌(Echerichia coli.)菌株引起的感染。與組織中體液水平和氯離子分泌之調(diào)節(jié)有關(guān)的其他條件包括與炎癥、感染或創(chuàng)傷有關(guān)的組織腫脹。因此，用于抑制有害水平之氯離子分泌的方法也可用于緩解這些疾病的癥狀。
囊性纖維性變(Cystic fibrosis)高加索人種(Caucasians)中的最常見的遺傳性疾病，在歐洲裔美洲人中的發(fā)病率為約1/2000。其特征是有異常的粘性粘液分泌，從而導(dǎo)致慢性肺病、胰腺功能不全和腸梗阻。在美國(guó)，約30,000人患有囊性纖維性變，而且每年有約1,000例被首次診斷出患有該疾病。在過(guò)去，患病兒童常常在嬰兒時(shí)期就死亡了，但現(xiàn)在個(gè)體可存活至二十幾和三十幾歲。然而，現(xiàn)在沒(méi)有能夠治愈囊性纖維性變的方法，而且目前的治療方法不能更正本質(zhì)性的細(xì)胞缺陷，而只能控制疾病的癥狀。
目前囊性纖維性變的治療方法大部分局限于癥狀的控制或機(jī)遇性感染的控制。例如，利用針對(duì)病毒性病原體的免疫接種和針對(duì)細(xì)菌感染的培養(yǎng)特異性抗生素可以預(yù)防感染。皮質(zhì)類固醇藥物有時(shí)用于治療因感染引起的炎癥反應(yīng)，但這類藥物有各種不利的長(zhǎng)期副作用。其他治療方法主要是針對(duì)與肺異常粘性粘膜分泌有關(guān)之慢性肺病的癥狀。例如，物理性輔助療法如胸叩擊和姿勢(shì)導(dǎo)液法有助于從肺中清除分泌物。支氣管擴(kuò)張藥對(duì)某些患者有用，但在另一些患者中可能會(huì)導(dǎo)致氣體交換減少。與異常粘性粘膜分泌有關(guān)的其他癥狀包括腸梗阻和胰腺功能不全。腸梗阻發(fā)生于20％的成年人中，可用灌腸法治療，或者灌腸法無(wú)效時(shí)，用外科手術(shù)治療。
胰腺功能不全發(fā)生于80％至90％的患者中，并且是因碳酸氫根離子和體液分泌減少而導(dǎo)致的，所述分泌減少是由細(xì)胞外氯離子再循環(huán)損傷引起的。相應(yīng)的胰液中，蛋白被超濃縮，而且胰液也變得很濃，引起胰管阻塞，從而導(dǎo)致胰腺泡萎縮。通過(guò)補(bǔ)充酶來(lái)治療胰腺功能不全，這樣通?？苫謴?fù)足夠的消化和吸收功能，由此改變營(yíng)養(yǎng)不良的癥狀。但是，產(chǎn)生所述癥狀的疾病仍然存在，常常會(huì)引起胰腺炎復(fù)發(fā)，這樣會(huì)導(dǎo)致胰腺萎縮。
可恢復(fù)正常肺功能、正常結(jié)腸分泌功能或正常胰腺功能的治療比現(xiàn)有方法有更大的優(yōu)越性。已經(jīng)將基因治療用于囊性纖維性變患者。但是，由于多種原因，在基因治療方面進(jìn)行的努力并未取得成功，這些原因包括基因的大小超常，對(duì)用于轉(zhuǎn)移所述基因之腺病毒載體產(chǎn)生免疫反應(yīng)以及上皮組織的迅速更新。
因此，現(xiàn)在仍需要可改變氯離子分泌的方法，以便緩解與異常氯根運(yùn)輸有關(guān)之疾病如囊性纖維性變和分泌性腹瀉的癥狀。本發(fā)明滿足了這種需求并提供了相關(guān)的優(yōu)點(diǎn)。
發(fā)明綜述本發(fā)明提供了肌醇多磷酸酯的細(xì)胞滲透性拮抗劑組合物。例如，本發(fā)明提供了myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸酯和磷脂酰肌醇三磷酸酯的拮抗劑。另外，本發(fā)明提供了通過(guò)將細(xì)胞與肌醇多磷酸酯的細(xì)胞滲透性拮抗劑接觸來(lái)增加氯離子從該細(xì)胞中分泌的方法。本發(fā)明還提供了通過(guò)給個(gè)體施用肌醇多磷酸酯的細(xì)胞滲透性拮抗劑來(lái)增強(qiáng)個(gè)體的氯離子分泌的方法。此外，本發(fā)明還提供了通過(guò)給個(gè)體施用肌醇多磷酸酯的細(xì)胞滲透性拮抗劑來(lái)緩解所述個(gè)體中與囊性纖維性變有關(guān)的體征或癥狀的方法。
本發(fā)明還提供了肌醇多磷酸酯的細(xì)胞滲透性激動(dòng)劑組合物。例如，本發(fā)明提供了myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸酯和磷脂酰肌醇三磷酸酯的激動(dòng)劑。另外，本發(fā)明提供了通過(guò)將細(xì)胞與肌醇多磷酸酯的細(xì)胞滲透性激動(dòng)劑接觸來(lái)減少氯離子從該細(xì)胞中分泌的方法。本發(fā)明還提供了通過(guò)給個(gè)體施用肌醇多磷酸酯的細(xì)胞滲透性激動(dòng)劑來(lái)降低個(gè)體的氯離子分泌的方法。此外，本發(fā)明還提供了通過(guò)給個(gè)體施用肌醇多磷酸酯的細(xì)胞滲透性激動(dòng)劑來(lái)緩解所述個(gè)體中與分泌性腹瀉有關(guān)的體征或癥狀的方法。
附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1表示myo-肌醇、scyllo-肌醇和代表性細(xì)胞滲透性肌醇多磷酸酯衍生物、2-Bt-1-Me-Ins(3，4，5，6)P4/AM的結(jié)構(gòu)。
圖2表示在兔結(jié)腸中氯離子分泌的Bt2-Ins(3，4，5，6)P4/AM抑制作用。
圖3表示由于Bt2-Ins(3，4，5，6)P4/AM介導(dǎo)的對(duì)組胺刺激的氯離子分泌的抑制作用，用200μM2-Bt-1-Me-Ins(3，4，5，6)P4/AM處理的結(jié)腸上皮T84細(xì)胞的氯離子分泌增加。
圖4表示Bt2-Ins(3，4，5，6)P4/AM沒(méi)有增加細(xì)胞內(nèi)鈣，并且不影響對(duì)鈣對(duì)毒胡蘿卜素的反應(yīng)。
圖5表示在用D，L-1，2-亞環(huán)己基-Ins(3，4，5，6)P4/AM(圖5A)；1-Bu-2-Bt-Ins(3，4，5，6)P4/AM(圖5B)；Bu2-Ins(3，4，5，6)P4/AM(圖5C)；3-Bt-2-Bu-Ins(1，4，5，6)P4/AM(圖5D)；Bu2-Ins(1，4，5，6)P4/AM(圖5E)；1-Bt-2-Bu-Ins(3，4，5，6)P4/AM(圖5F)；以及3-Bu-2-Bt-Ins(1，4，5，6)P4/AM(圖5G)處理的結(jié)腸上皮T84細(xì)胞中，氯離子分泌增加。
圖6表示由于EGF-介導(dǎo)的氯離子分泌抑制作用的逆轉(zhuǎn)，在用Bt2-Ins(1，4，5，6)P4/AM處理的結(jié)腸上皮T84細(xì)胞中氯離子分泌增加。
圖7表示用EGF或用PtdInsP3的細(xì)胞滲透性衍生物處理的結(jié)腸上皮T84細(xì)胞中氯離子分泌減少。由于EGF-和PtdInsP3-介導(dǎo)的氯離子分泌抑制作用的逆轉(zhuǎn)，Bt2-Ins(1，4，5，6)P4/AM增加了氯離子分泌。
圖8表示在用濃度不斷增加的PtdInsP3/AM處理的結(jié)腸上皮T84細(xì)胞中氯離子分泌減少。
圖9表示細(xì)胞滲透性PtdInsP3和二C16-Bt-PtdInsP3/AM的結(jié)構(gòu)。
圖10表示細(xì)胞滲透性PtdInsP3/AM衍生物合成的流程圖。
圖11表示1，2-亞環(huán)己基-Ins(3，4，5，6)P4/AM合成的流程圖。
圖12表示myo-肌醇1，3，4-三磷酸酯和2，5，6-Bt3-Ins(1，3，4)P3/AM的結(jié)構(gòu)。僅表示了所述化合物的D構(gòu)型。
圖13表示細(xì)胞滲透性肌醇多磷酸酯衍生物合成的流程圖。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了通過(guò)將細(xì)胞與作為肌醇多磷酸酯拮抗劑或激動(dòng)劑的細(xì)胞滲透性化合物接觸，以改變氯離子分泌的組合物和方法。文中所用，術(shù)語(yǔ)“改變”指增加或減少氯離子分泌以便使進(jìn)出細(xì)胞的氯離子運(yùn)輸水平不同于未用本發(fā)明激動(dòng)劑或拮抗劑處理之細(xì)胞中的分泌水平。文中所用術(shù)語(yǔ)“拮抗劑”指具有降低另一種化合物的生理學(xué)活性之功能的化合物。例如抑制氯離子分泌的化合物的拮抗劑可逆轉(zhuǎn)該抑制作用。同樣，術(shù)語(yǔ)“激動(dòng)劑”指具有模擬另一種化合物之生理學(xué)活性之功能的化合物。
本發(fā)明的拮抗劑可增加細(xì)胞的氯離子分泌作用。文中所用術(shù)語(yǔ)“增加”當(dāng)用于增加氯離子的分泌作用時(shí)，指將氯離子運(yùn)輸出細(xì)胞的水平高于未用拮抗劑處理的相應(yīng)細(xì)胞中的分泌水平。相反，術(shù)語(yǔ)“減少”當(dāng)用于降低氯離子的分泌作用時(shí)，指將氯離子運(yùn)輸出細(xì)胞的水平低于未用激動(dòng)劑處理的相應(yīng)細(xì)胞的分泌水平。文中所用術(shù)語(yǔ)“接觸”指將細(xì)胞保溫或暴露于細(xì)胞滲透性化合物以便所述化合物可穿過(guò)該細(xì)胞的膜。
異常的氯離子分泌作用與各種疾病有關(guān)。因此，本發(fā)明的化合物用于增加或降低氯離子分泌作用，由此緩解所述疾病的癥狀。在特定疾病如囊性纖維性變中，增加氯離子分泌作用對(duì)于緩解該疾病的癥狀有利，而在其他疾病如分泌性腹瀉中，降低氯根分泌作用可緩解該癥狀。文中所用術(shù)語(yǔ)“緩解”指減輕疾病的癥狀。因此，根據(jù)氯離子分泌作用的異常性，本發(fā)明提供了組合物和方法以補(bǔ)償與具體疾病有關(guān)的異常氯離子分泌作用。
本發(fā)明提供了作為肌醇多磷酸酯激動(dòng)劑或拮抗劑的化合物。肌醇多磷酸酯衍生物可作為肌醇多磷酸酯激動(dòng)劑和拮抗劑發(fā)揮功能。本發(fā)明化合物對(duì)Ins(3，4，5，6)P4-和PtdInsP3-介導(dǎo)的鈣-介導(dǎo)之氯離子分泌的抑制作用在實(shí)施例中作了描述并總結(jié)于表I中。
本發(fā)明提供了細(xì)胞滲透性化合物，該化合物經(jīng)鈣依賴性鈣離子通道，通過(guò)模擬或抵銷鈣-介導(dǎo)的氯離子分泌的內(nèi)源抑制劑Ins(3，4，5，6)P4和PtdInsP3的活性來(lái)調(diào)節(jié)氯離子分泌。文中所述，增加Ins(3，4，5，6)P4或PtdInsP3的細(xì)胞內(nèi)濃度的化合物用于抑制氯離子分泌。相反，拮抗Ins(3，4，5，6)P4或PtdInsP3的作用的化合物可用于增加氯離子分泌。表I肌醇多磷酸酯衍生物對(duì)氯離子分泌的作用表I
1所列的衍生物使用下列縮寫TK，四磷酸酯；oct，十，hex，六。除非特別說(shuō)明，所有化合物均是D型。2表和本申請(qǐng)中所用的縮寫Ins，肌醇；P，磷酸酯；Pn，n表示磷酸酯數(shù)；AM，乙酰氧基甲基酯；Bt，丁酰；Me，甲基；Bu，丁基；C16，棕櫚酰；C8，辛酰；PtdIns，磷脂酰肌醇。除非特別說(shuō)明，所有衍生物均是myo-肌醇衍生物。
本發(fā)明的細(xì)胞滲透性化合物可用于直接增加Ins(3，4，5，6)P4或PtdInsP3的細(xì)胞內(nèi)濃度或由于結(jié)構(gòu)相似性用于模擬Ins(3，4，5，6)P4或PtdInsP3的作用，所述化合物很容易通過(guò)細(xì)胞膜?；蛘撸景l(fā)明的細(xì)胞滲透性化合物用于拮抗Ins(3，4，5，6)P4或PtdInsP3的作用。文中所述，肌醇多磷酸酯衍生物可作為Ins(3，4，5，6)P4或PtdInsP3的細(xì)胞滲透性激動(dòng)劑或拮抗劑發(fā)揮功能。
按實(shí)施例XI中所述合成細(xì)胞滲透性肌醇多磷酸酯衍生物。這些化合物是細(xì)胞滲透性的，因?yàn)閹щ姷牧姿峄鶊F(tuán)被乙酰氧基甲基酯基團(tuán)掩蔽，而羥基被疏水性化學(xué)基團(tuán)(見圖1)掩蔽。用于掩蔽親水基團(tuán)的疏水化學(xué)基團(tuán)可以是例如，?；?、烷基、亞烷基基團(tuán)，或可掩蔽肌醇多磷酸酯上之親水基團(tuán)的任何疏水化學(xué)基團(tuán)。烷基基團(tuán)包括甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、仲丁基、1-甲基丁基、2，2-二甲基丁基、2-甲基戊基、2，2-二甲基丙基、戊基和己基以及亞烷基基團(tuán)，碳原子的環(huán)鏈如環(huán)己基和環(huán)戊基，以及直鏈或支鏈與碳原子環(huán)鏈的組合如甲基-環(huán)己基或環(huán)丙基-亞甲基。但是，就甲基衍生物而言，2-Bt-1-Me-Ins(3，4，5，6)P4/AM，Me2-Ins(3，4，5，6)P4/AM，Me2-Ins(1，4，5，6)P4/AM，2-Bt-3-Me-Ins(1，4，5，6)P4/AM和D，L-1-Bt-2-Me-Ins(3，4，5，6)P4/AM不在所要求的組合物范圍內(nèi)。另外，應(yīng)認(rèn)識(shí)到文中所定義的烷基可以被取代基所取得。亞烷基是乙縮醛，包括例如亞甲基、亞乙基、亞丙基、亞丁基、亞戊基、亞己基、環(huán)亞丁基、環(huán)亞戊基、環(huán)亞己基和環(huán)亞庚基(Kemp and Vellaccio，Organic Chemistry(有機(jī)化學(xué))，Worth Publishers，New York(1980))，該文獻(xiàn)引入本文作為參考。酰基包括例如乙?；?、丙?；?、丁?；?、己酰基和戊?；?。但是就酰基衍生物而言，Bt2-Ins(3，4，5，6)P4/AM，D，L-Bt2-scyllo-Ins(3，4，5，6)P4/AM和Bt2-Ins(1，4，5，6)P4/AM不在所要求的組合物范圍內(nèi)。一旦進(jìn)入細(xì)胞，丁酰和乙酰氧甲基酯的基團(tuán)就被細(xì)胞內(nèi)的酯酶裂解。因此，用這些疏水功能基團(tuán)修飾可以使化合物跨過(guò)細(xì)胞膜，在細(xì)胞膜內(nèi)，所述化合物被水解，從而暴露了非衍生化合物的親水基團(tuán)。相反，烷基和亞烷基是不可水解的，因此，在其跨過(guò)細(xì)胞膜后，所述基團(tuán)仍能被保留在所述衍生物上。
肌醇多磷酸酯的其他修飾可得到細(xì)胞滲透性衍生物。例如，Ins(3，4，5，6)P4衍生物，包括1，2-二脫氧-Ins(3，4，5，6)P4/AM，1-Bt-2-脫氧-Ins(3，4，5，6)P4/AM，2-Bt-1-脫氧-Ins(3，4，5，6)P4/AM和1，2-二氯-1，2-二脫氧-myo-Ins(3，4，5，6)P4/AM也是細(xì)胞滲透性衍生物(參見表I)。另外，細(xì)胞滲透性PtdInsP3衍生物包括，例如二C16-6-O-Bt-PtdIns(3，4，5)P3/AM和二C8-6-O-Bt-PtdIns(3，4，5)P3/AM以及二C16-2-O-Bt-PtdIns(3，4，5)P3/AM，二C8-2-O-Bt-PtdIns(3，4，5)P3/AM，二C16-2，6-O-Bt2-PtdIns(3，4，5)P3/AM和二C8-2，6-O-Bt2-PtdIns(3，4，5)P3/AM。Roemer等(J.Chem.Soc.，Chem.Commun.N4411(fat 1995)；J.Chem.Soc.，Perkins Trans.1 N141683(fat 1996))描述了合成?；鸵阴Ｑ跫谆パ苌锏姆椒?，所述文獻(xiàn)均引入本文作為參考。
本發(fā)明提供了作為肌醇多磷酸酯拮抗劑的細(xì)胞滲透性化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，該細(xì)胞滲透性化合物是Ins(3，4，5，6)P4拮抗劑。如本文所公開的，Ins(3，4，5，6)P4衍生物可起到Ins(3，4，5，6)P4拮抗劑的作用。例如，帶有與位置1、位置2或這兩個(gè)位置上的羥基相連的烷基的Ins(3，4，5，6)P4衍生物可起到Ins(3，4，5，6)P4拮抗劑的作用(參見表I和實(shí)施例III和IV)。特別有用的烷基衍生物是甲基(Me)和丁基(Bu)衍生物。例如2-Bt-1-Me-Ins(3，4，5，6)P4/AM，Me2-Ins-(3，4，5，6)P4/AM，1-Bu-2-Bt-Ins(3，4，5，6)P4/AM和Bu2-Ins(3，4，5，6)P4/AM均可逆轉(zhuǎn)Ins(3，4，5，6)P4-介導(dǎo)的氯離子分泌抑制作用，因此，是Ins(3，4，5，6)P4拮抗劑。其他有用的Ins(3，4，5，6)P4衍生物是在位置1和位置2上含亞烷基的化合物。例如，D，L-1，2-環(huán)亞己基-Ins(3，4，5，6)P4/AM可逆轉(zhuǎn)卡巴膽堿-介導(dǎo)的氯離子分泌抑制作用，因此，是Ins(3，4，5，6)P4拮抗劑。另外，在位置2和位置3上帶有亞烷基的Ins(1，4，5，6)P4/AM衍生物也作為Ins(1，4，5，6)P4衍生物。
在另一實(shí)施方案中，細(xì)胞滲透性化合物是PtdInsP3拮抗劑。如本文所公開的，細(xì)胞滲透性Ins(1，4，5，6)P4衍生物是PtdInsP3拮抗劑。例如，在位置2和3上連有丁酰基的Ins(1，4，5，6)P4衍生物可逆轉(zhuǎn)EGF-介導(dǎo)的和PtdInsP3-介導(dǎo)的對(duì)鈣介導(dǎo)的氯離子分泌的抑制作用，因此是PtdInsP3拮抗劑(參見表I和實(shí)施例VII和VIII)。
本發(fā)明還提供了作為肌醇多磷酸酯激動(dòng)劑的細(xì)胞滲透性化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞滲透性化合物是Ins(3，4，5，6)P4激動(dòng)劑。如本文所公開的，Ins(3，4，5，6)P4衍生物是Ins(3，4，5，6)P4激動(dòng)劑。例如，Bt2-Ins(3，4，5，6)P4/AM，Bt2-scyllo-Ins(3，4，5，6)P4/AM和1-Bt-2-脫氧-Ins(3，4，5，6)P4/AM(36％的抑制作用)通過(guò)使氯離子分泌與細(xì)胞內(nèi)鈣濃度解偶聯(lián)(uncoupling)來(lái)抑制鈣介導(dǎo)的氯離子分泌，因比，是Ins(3，4，5，6)P4激動(dòng)劑(參見表I和實(shí)施例I-III)。另外，Ins(1，3，4)P3衍生物是Ins(3，4，5，6)P4激動(dòng)劑。例如Bt3-Ins(1，3，4)P3/AM通過(guò)提高Ins(3，4，5，6)P4的細(xì)胞內(nèi)濃度來(lái)抑制鈣介導(dǎo)的氯離子分泌，因此是Ins(3，4，5，6)P4激動(dòng)劑(參見實(shí)施例V)。
在另一實(shí)施方案中，細(xì)胞滲透性化合物是PtdInsP3激動(dòng)劑。如本文所公開的，PtdInsP3衍生物是PtdInsP3激動(dòng)劑。例如，二C16-Bt-PtdInsP3/AM和二C8-Bt-PtdInsP3/AM抑制鈣介導(dǎo)的氯離子分泌，因此是PtdInsP3激動(dòng)劑(參見表I和實(shí)施例VIII)。
可以對(duì)肌醇多磷酸酯衍生物之結(jié)構(gòu)的分子造型來(lái)設(shè)計(jì)具有模擬肌醇多磷酸酯衍生物所需活性的結(jié)構(gòu)特征的合成化合物。或者，例如通過(guò)篩選組合化學(xué)庫(kù)，鑒定可作為肌醇多磷酸酯激動(dòng)劑或拮抗劑的細(xì)胞滲透性合成化合物。用本文描述的方法，可以篩選具有所需活性的合成化合物，所述活性指模擬或拮抗特定肌醇多磷酸酯對(duì)鈣介導(dǎo)的氯離子分泌的影響。制備和篩選組合化學(xué)庫(kù)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(組合肽和非肽庫(kù)手冊(cè)(Combinatorial Peptide and NonpeptideLibrariesA Handbook)，Jung，ed.，VCH，New York(1996))，該文獻(xiàn)引入本文作為參考。
本發(fā)明還提供了通過(guò)將細(xì)胞與作為肌醇多磷酸酯拮抗劑或激動(dòng)劑的細(xì)胞滲透性化合物接觸來(lái)改變氯離子分泌作用的方法。細(xì)胞利用氯離子的運(yùn)動(dòng)來(lái)調(diào)節(jié)生物體內(nèi)的水流。細(xì)胞具有特異性的氯離子通道，該通道在開放時(shí)，僅允許氯離子通過(guò)膜。這些通道對(duì)在粘膜中的細(xì)胞是特別重要的，它們分泌粘蛋白并調(diào)節(jié)水流。當(dāng)流入和流出細(xì)胞的水不足時(shí)，粘蛋白分泌會(huì)引起粘塞，這會(huì)阻塞肺中的導(dǎo)氣管和如囊性纖維性變這類疾病的腸粘膜層。但是，不是所有的氯離子通道都相同，不同的通道以不同的方式受到調(diào)節(jié)。
一種具體的氯離子通道，鈣-依賴性氯離子通道與鈣離子流相聯(lián)系。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度增加時(shí)，氯離子分泌增加。文中所用術(shù)語(yǔ)“氯離子分泌”指氯離子跨細(xì)胞質(zhì)膜的運(yùn)輸。用特定的化合物如組胺處理細(xì)胞會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的增加，從而導(dǎo)致氯離子分泌增加，所述化合物是對(duì)肌醇多磷酸酯代謝機(jī)理沒(méi)有長(zhǎng)期可檢測(cè)的結(jié)果的一類生理學(xué)相關(guān)激動(dòng)劑。
卡巴膽堿，一種毒蕈鹼膽堿能化合物，短期給藥也可以增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度并刺激氯離子分泌。但是，在用卡巴膽堿長(zhǎng)期處理結(jié)腸上皮T84細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的增加不再刺激氯離子分泌(Kachintom等，Am.J.Physiol.Cell264C671(1993))，該文獻(xiàn)引入本文作為參考。用卡巴膽堿長(zhǎng)期治療會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)Ins(3，4，5，6)P4水平緩慢而持續(xù)地升高(Vajanaphanich，等，Nature，371711(1994))，該文獻(xiàn)引入本文作為參考。用Bt2-Ins(3，4，5，6)P4/AM和Bt2-Ins(1，4，5，6)P4/AM的混合物處理T84細(xì)胞會(huì)抑制氯離子分泌作用對(duì)因毒胡蘿卜素誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣濃度增加作出反應(yīng)，而Bt2-Ins(1，4，5，6)P4/AM沒(méi)有影響。如本文所舉證的，旋光對(duì)應(yīng)體純的Bt2-Ins(3，4，5，6)P4/AM會(huì)抑制氯離子分泌作用對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的增加作出反應(yīng)(參見實(shí)施例I)。因此，Ins(3，4，5，6)P4鈣-介導(dǎo)的氯離子分泌作用的內(nèi)源負(fù)調(diào)節(jié)劑，因?yàn)?，它從鈣離子濃度中解偶聯(lián)氯離子分泌。
不同于Ins(3，4，5，6)P4介導(dǎo)的抑制鈣介導(dǎo)的氯離子分泌的另一種機(jī)理是增加PtdInsP3水平。在T84細(xì)胞中，EGF抑制由卡巴膽堿和毒胡蘿卜素誘導(dǎo)的鈣介導(dǎo)的氯離子分泌(Uribe，等Am.J.Physiol.271C914(1996a))。與卡巴膽堿相比，EGF使Ins(3，4，5，6)P4的水平增加1.7倍，而卡巴膽堿使Ins(3，4，5，6)P4的水平增加20倍。這些結(jié)果表明EGF通過(guò)一種不同于Ins(3，4，5，6)P4的機(jī)理來(lái)調(diào)節(jié)鈣介導(dǎo)的氯離子分泌。
EGF激活磷脂酰肌醇3-激酶(PI 3-激酶)，EGF對(duì)鈣介導(dǎo)的氯離子分泌的抑制作用由PI 3-激酶介導(dǎo)(Uribee等，J.Biol.Chem.27126588(1996b))。EGF刺激PI 3-激酶產(chǎn)物，磷脂酰肌醇3，4-二磷酸酯(PtdInsP2)和PtdInsP3水平的增加。在EGF抑制氯離子分泌的同時(shí)，這些PI 3-激酶產(chǎn)物會(huì)增加。渥曼青霉素是一種高特異性的PI 3-激酶抑制劑，它可以阻斷PtdInsP3和PtdInsP2的形成并可逆轉(zhuǎn)EGF誘導(dǎo)的氯離子分泌抑制作用。因此，涉及PtdInsP3的機(jī)理可以解釋EGF誘導(dǎo)的鈣介導(dǎo)的氯離子分泌的抑制作用。
由于本發(fā)明化合物是肌醇多磷酸酯的激動(dòng)劑和拮抗劑，它們調(diào)節(jié)氯離子分泌，所以這些化合物對(duì)于改變細(xì)胞中的氯離子分泌是有用的?；衔锏募?xì)胞滲透性使得通過(guò)將細(xì)胞與所述化合物接觸，可將所述化合物傳遞至胞質(zhì)中肌醇多磷酸酯的作用位點(diǎn)。
本發(fā)明提供了通過(guò)將細(xì)胞與肌醇多磷酸酯的細(xì)胞滲透性拮抗劑接觸來(lái)增加跨細(xì)胞膜的氯離子分泌的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，用Ins(3，4，5，6)P4的拮抗劑增加氯離子分泌。如本文所公開的，可用Ins(3，4，5，6)P4衍生物作為Ins(3，4，5，6)P4拮抗劑。在另一實(shí)施方案中，用PtdInsP3拮抗劑增加氯離子分泌。如本文所公開的，可用Ins(3，4，5，6)P4衍生物作為PtdInsP3拮抗劑。
本發(fā)明還提供了通過(guò)將細(xì)胞與肌醇多磷酸酯的細(xì)胞滲透性激動(dòng)劑接觸來(lái)減少跨細(xì)胞膜的氯離子分泌的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，用Ins(3，4，5，6)P4激動(dòng)劑減少氯離子分泌。如本文所公開的，可用Ins(3，4，5，6)P4衍生物作為Ins(3，4，5，6)P4激動(dòng)劑。另外，可用Ins(1，3，4)P3衍生物作為Ins(3，4，5，6)P4激動(dòng)劑。在另一實(shí)施方案中，用PtdInsP3激動(dòng)劑減少氯離子分泌。如本文所公開的，可用PtdInsP3衍生物作為PtdInsP3激動(dòng)劑。
本發(fā)明提供了通過(guò)給個(gè)體施用Ins(3，4，5，6)P4或PtdInsP3拮抗劑來(lái)增加個(gè)體的氯離子分泌的方法。如文中所用，術(shù)語(yǔ)“個(gè)體”指用增加或減少氯離子分泌的本發(fā)明激動(dòng)性或拮抗性化合物治療的生物體，一般是哺乳動(dòng)物，尤其是人。氯離子分泌增加或減少發(fā)生在個(gè)體中一個(gè)或多個(gè)組織器官的細(xì)胞中。文中所用術(shù)語(yǔ)“施用”指以一種方式和形式將拮抗劑或激動(dòng)劑導(dǎo)入個(gè)體，一般將所述拮抗劑或激動(dòng)劑傳遞至適宜的靶組織中，在所述組織中，與靶細(xì)胞接觸，由此改變所述細(xì)胞的氯離子分泌。本發(fā)明還提供了緩解與囊性纖維性變有關(guān)之體征或癥狀的方法，該方法包括給表現(xiàn)出所述體征或癥狀的個(gè)體施用Ins(3，4，5，6)P4或PtdInsP3的拮抗劑或同時(shí)施用兩種拮抗劑。
本發(fā)明還提供了通過(guò)給個(gè)體施用Ins(3，4，5，6)P4或PtdInsP3的激動(dòng)劑來(lái)減少個(gè)體的氯離子分泌的方法。另外，本發(fā)明還提供了緩解與分泌性腹瀉有關(guān)的體征或癥狀的方法，該方法包括給表現(xiàn)出所述體征或癥狀的個(gè)體施用Ins(3，4，5，6)P4或PtdInsP3的激動(dòng)劑。
通常將拮抗劑或激動(dòng)劑作為藥物組合物施用給個(gè)體。所述藥物組合物含有所述拮抗劑或激動(dòng)劑和可藥用載體?？伤幱幂d體是本領(lǐng)域熟知的，包括如作為生理緩沖鹽的水溶液或其他溶劑或載體如乙二醇、甘油、油如橄欖油或可注射用有機(jī)酯。
可藥用載體可含有生理學(xué)可接受的化合物，所述化合物可以例如穩(wěn)定所述拮抗劑或激動(dòng)劑或增加所述試劑的吸收。所述生理學(xué)可接受的化合物包括例如碳水化合物如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖，抗氧化劑如抗壞血酸或谷胱甘肽，螯合劑，低分子量蛋白質(zhì)或其他穩(wěn)定劑或賦形劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道可藥用載體，包括生理學(xué)可接受的化合物的選擇取決于例如所述發(fā)明的拮抗劑或激動(dòng)劑的給藥途徑和靶組織。
根據(jù)待治療的個(gè)體和靶組織，可以利用不同的給藥途徑?？蓪⑺幬锝M合物分別通過(guò)包括例如口、直腸或胃腸外，如靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、眼眶內(nèi)、囊內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦池內(nèi)給藥或通過(guò)消極或積極的經(jīng)皮吸收，例如利用皮膚貼劑或跨皮離子電滲療法給藥。此外，可通過(guò)注射、插管或局部施用所述組合物，后者可以是消極的，例如通過(guò)直接施用軟膏或粉劑，或積極的，例如用鼻噴霧劑或吸入劑。
作為單次劑量的總有效劑量或者作為藥團(tuán)(bolus)或在一個(gè)相對(duì)短的期間內(nèi)通過(guò)輸注施用給個(gè)體，或者可用分級(jí)治療法(fractionatedtreatment protacol)施用，其中在一個(gè)更長(zhǎng)的期間內(nèi)施用多次劑量。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知道，在一個(gè)個(gè)體中，得到有效劑量所需的試劑濃度取決于許多因素，包括年齡和個(gè)體的健康狀況以及給藥途徑和待給藥的次數(shù)。從這些因素看，本領(lǐng)域人員可調(diào)整具體劑量以便得到有效劑量。
具體化合物的劑量是由達(dá)到所需效果，例如增加或減少氯離子分泌所需的細(xì)胞內(nèi)濃度所決定的。用本文公開的或本領(lǐng)域已知的方法確定有效細(xì)胞內(nèi)濃度。例如用體外Ins(1，3，4)P3-5/6-激酶試驗(yàn)(Vajanaphanich等，同上文，1994)得出激動(dòng)劑Bt2-Ins(3，4，5，6)P4/AM的有效細(xì)胞內(nèi)濃度為約4μM。因此，對(duì)于Bt2-Ins(3，4，5，6)P4/AM，可選擇劑量以便使細(xì)胞內(nèi)衍生物濃度為約4-20μM，優(yōu)選4μM。用一模型系統(tǒng)完成開始的研究以便確定具體化合物的效力。在個(gè)體中治療疾病所需的有效濃度用I期和II期臨床試驗(yàn)確定。
本發(fā)明化合物可單獨(dú)使用，或彼此聯(lián)用，或與其他治療試劑聯(lián)用以治療與異常氯離子分泌有關(guān)的疾病。例如，治療方法可從一種化合物開始，如果由于第一種化合物效力不足，可根據(jù)需要將其他化合物與第一種化合物一起施用。所述治療也可與其他治療方式結(jié)合，例如施用尿苷5’-三磷酸加阿米洛利(參見Bennett等，Am.J.Respir.Crit.Care Med.1531796(1996))，該文獻(xiàn)引入本文作為參考。
本發(fā)明組合物和方法用于治療各種疾病，例如囊性纖維性變或分泌性腹瀉，所述疾病的部分特征是氯離子分泌異常。在囊性纖維性變中發(fā)生缺陷型氯離子分泌是由于上皮細(xì)胞氯離子通道中囊性纖維性變跨膜調(diào)節(jié)因子(CFTR)的突變。與上皮細(xì)胞端面有關(guān)的氯離子通道是調(diào)節(jié)鹽和液體分泌的主要控制點(diǎn)。大部分囊性纖維性變是因單個(gè)點(diǎn)突變(ΔF508突變)造成的，所述突變導(dǎo)致508位上苯丙氨酸的丟失。該突變干擾CFTR轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜，由此減少細(xì)胞的氯離子分泌。
治療囊性纖維性變的一種方法是人工激活其他氯離子通道。例如，在上皮細(xì)胞中，外調(diào)整氯根通道(outwardly rectifying chloridechannel，ORCC)是由環(huán)AMP調(diào)節(jié)的一個(gè)氯離子通道。但是，認(rèn)為ORCC也受CFTR的調(diào)節(jié)，因此，在囊性纖維性變中活性較低(Schwiebert等，Cell，811063(1995)；Egan等，Nature，358581(1992)；和Gabriel等，Nature，363263 1993)。相反，鈣依賴性氯離子通道在囊性纖維性變的小鼠模型的細(xì)胞中更豐富(Grubb等，Am.J.Physiol.266C1478(1994))。由于鈣依賴性氯離子通道與CFTR不同并且可能在囊性纖維性變患者的細(xì)胞中更豐富，因此，可以增大通過(guò)這些通道的流量以補(bǔ)償通過(guò)CFTR的流量短缺。如本文所公開的，可以用一種或多種Ins(3，4，5，6)P4或PtdInsP3的拮抗劑恢復(fù)受CFTR缺陷影響的上皮細(xì)胞中的氯離子分泌。
數(shù)個(gè)模型系統(tǒng)可用于評(píng)估本發(fā)明肌醇多磷酸酯衍生物增加氯離子分泌的能力。一個(gè)所述模型是人結(jié)腸上皮T84細(xì)胞系，作為一個(gè)分泌性上皮模型，該細(xì)胞系已經(jīng)被進(jìn)行了廣泛的研究(Dharmsathaphorn等，Am.J.Physiol.246G204(1984))。當(dāng)在可滲透支持物上生長(zhǎng)至匯合時(shí)，T84細(xì)胞有相對(duì)分化的表型，形成有緊密連接和向量運(yùn)輸?shù)亩鄻O化單層。T84單層保留了許多受體介導(dǎo)的氯離子分泌機(jī)理，包括與游離胞質(zhì)鈣和CFTR變化有關(guān)的機(jī)理(Cohn等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA892340(1992))。組胺、卡巴膽堿、鈣離子載體和毒胡蘿卜素等試劑可提高細(xì)胞內(nèi)鈣離子并在不同程度上刺激跨T84單層的氯離子分泌(Dharmsathaphorn等，J.Clin.Invest.84945(1989)；Kachintorn等，同上文，1993)。在T84細(xì)胞中，環(huán)AMP也通過(guò)CFTR刺激氯離子分泌(Anderson and Welsh，Proc.Natl.Acad.Sci.USA886003(1991))。因此，T84細(xì)胞提供了在正常和與氯離子運(yùn)輸缺陷有關(guān)的疾病如囊性纖維性變中調(diào)節(jié)氯離子分泌的體外模型。另外，兔結(jié)腸的上皮細(xì)胞也提供了結(jié)腸上皮細(xì)胞模型。
囊性纖維性變的三個(gè)最使人衰弱的癥狀是慢性肺病、胰腺功能不全和腸梗阻。有數(shù)個(gè)模型系統(tǒng)可用于表征本發(fā)明肌醇多磷酸酯衍生物的治療這些癥狀的效力，例如，剔除T84細(xì)胞中的CFTR基因(CFTR-T84細(xì)胞)提供了結(jié)腸上皮細(xì)胞模型，該模型的遺傳背景與囊性纖維性變患者的結(jié)腸細(xì)胞相似(參見實(shí)施例X)。在不斷增加氯離子分泌的條件下，CFTR-T84細(xì)胞系用于評(píng)估本發(fā)明化合物的效力，所述化合物是Ins(3，4，5，6)P4和PtdInsP3的拮抗劑。
初級(jí)人鼻上皮細(xì)胞是用于檢測(cè)各種化合物對(duì)氯離子分泌之作用的呼吸上皮模型。初級(jí)人鼻上皮細(xì)胞用于檢測(cè)本發(fā)明化合物對(duì)這些細(xì)胞中的氯離子分泌的功能，所述化合物是Ins(3，4，5，6)P4和PtdInsP3的拮抗劑(參見實(shí)施例IX)。
用于研究胰腺功能的適宜模型系統(tǒng)使用胰腺管上皮細(xì)胞CFTR-細(xì)胞系，CFPAC，該細(xì)胞系是衍生于純合ΔF508突變之患者的胰腺腺癌的人細(xì)胞系。CFPAC細(xì)胞沒(méi)有cAMP-刺激的通道功能，但顯示鈣激活的氯離子通道活性(Shoemacher等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA874012(1990))。狗胰腺管上皮細(xì)胞也用于檢測(cè)本發(fā)明化合物對(duì)這些細(xì)胞中的氯離子分泌的功能，所述化合物是Ins(3，4，5，6)P4和PtdInsP3的拮抗劑(Nguyen等，Am.J.Physiol.272G172(1997))，該文獻(xiàn)引入本文作為參考。
還可用囊性纖維性變動(dòng)物模型評(píng)估Ins(3，4，5，6)P4和PtdInsP3拮抗劑的活性。例如已經(jīng)產(chǎn)生了CFTR剔除小鼠，提供了囊性纖維性變模型(Rozmahel等，Nature Gen.12280(1996)；Snouwaert等，Science2571083(1992)；Ratiff等，Nature Gen.435(1992)；O′Neal等，Hum.Molec.Genet.21561(1993)和Dorin等，Nature359211(1992))，所述文獻(xiàn)均引入本文作為參考。鈣依賴性氯離子通道表達(dá)水平的提高增加了CFTR剔除小鼠的生存力(Clarke等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91479(1994)；和Rozmahel等，同上文1996)。用動(dòng)物模型檢測(cè)本發(fā)明化合物對(duì)這些動(dòng)物氯離子分泌的效力，所述化合物是Ins(3，4，5，6)P4和PtdInsP3的拮抗劑。動(dòng)物模型還用于檢測(cè)本發(fā)明化合物對(duì)動(dòng)物具體組織的效力。
由于囊性纖維性變癥狀在多種器官系統(tǒng)中產(chǎn)生，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)待治療的癥狀可選擇所述化合物的具體給藥途徑和給藥方法。所述化合物有兩親性并溶于水溶液?；蛘?，可將所述化合物溶解在含表面活性劑的二甲亞砜中。還可將所述化合物溶解在含F(xiàn)REON(1，1，2三氯三氟甲烷)的溶液中，所述溶液有粘度低的優(yōu)點(diǎn)，并且更容易接近患病組織，因此，對(duì)于疾病的急性炎癥或疾病早期的治療是有用的。例如，在患呼吸性疾病的患者中，可將本發(fā)明的拮抗劑懸浮或溶解于適宜的可藥用載體中，然后用吸入裝置如吸入器、噴霧器或渦輪吸入器直接施用至肺中。因此，為了緩解肺中的粘液積累，可將化合物以氣霧劑形式直接施用到靶肺組織?；蛘?，可將化合物溶解于FREON中，然后通過(guò)肺灌注給藥。在霧化水溶液的定期呼吸過(guò)程中，可保持所述治療。
囊性纖維性變的臨床癥狀如粘液粘度是熟知的，本領(lǐng)域人員知道如何確定治療方法是否可有效緩解或預(yù)防囊性纖維性變的這些已知呼吸體征和癥狀。例如用(99MTc)氧化鐵顆粒測(cè)量粘液纖毛清除率可確定本發(fā)明化合物的治療效力(Bennett，同上文，1996)。
通過(guò)適宜的給藥方式，用Ins(3，4，5，6)P4和PtdInsP3的拮抗劑可治療囊性纖維性變的其他臨床癥狀。例如，用鼻噴霧劑施用藥物組合物可治療竇并發(fā)癥。這種治療方法比治療竇并發(fā)癥的現(xiàn)有方法有利，現(xiàn)有的方法常常需進(jìn)行多次內(nèi)窺鏡外科手術(shù)，這樣會(huì)使患囊性纖維性變的患者面部變形。為了緩解囊性纖維性變的腸失調(diào)，用適宜的藥用載體，通過(guò)栓劑或灌腸劑施用試劑?；蛘呓?jīng)口施用包腸溶衣的片劑。在患胰腺炎的患者中，將藥物組合物以靜脈內(nèi)、經(jīng)口或通過(guò)全身性施用化合物，包括施用至胰腺的其他方法施用。
除囊性纖維性變外，與組織中體液積累有關(guān)的其他疾病通過(guò)改變氯離子分泌很容易治療。例如與炎癥、感染或創(chuàng)傷有關(guān)的腫脹如腦腫脹可通過(guò)減少氯離子分泌而得到緩解(Berger等，Acta Neurochir.Suppl.(Wien)60534(1994)；和Staub等，J.Neurotrauma11679(1994))。
與氯離子分泌異常低的疾病如囊性纖維性變相反，其他疾病的部分特征在于氯離子分泌水平異常高。例如在分泌性腹瀉中發(fā)生高水平氯離子分泌。引起分泌性腹瀉的侵襲性腸細(xì)菌沙門氏菌是發(fā)展中國(guó)家兒童死亡和發(fā)達(dá)國(guó)家健康問(wèn)題的一個(gè)最重要原因。每年因沙門氏菌(Salmonella)感染有1.3億以上例患腸炎，有約3百萬(wàn)人死亡。由于分泌性腹瀉與跨腸上皮的氯離子流增加有關(guān)，因此，減少氯離子分泌可緩解分泌性腹瀉的癥狀。本領(lǐng)域人員應(yīng)了解用肌醇多磷酸酯的激動(dòng)劑治療個(gè)體以緩解與上述相似的分泌性腹瀉之癥狀的方法。
本發(fā)明提供了通過(guò)將細(xì)胞與肌醇多磷酸酯的細(xì)胞滲透性激動(dòng)劑或拮抗劑接觸來(lái)改變跨細(xì)胞膜的氯離子分泌的組合物和匯合。本發(fā)明還提供了通過(guò)給個(gè)體施用肌醇多磷酸酯的激動(dòng)劑或拮抗劑來(lái)改變個(gè)體的氯離子分泌的方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供了通過(guò)施用含肌醇多磷酸酯的激動(dòng)劑或拮抗劑的藥物組合物來(lái)緩解與異常氯離子分泌有關(guān)之疾病的癥狀的方法。因此，本發(fā)明的化合物可作為藥物用于緩解部分特征在于氯離子分泌異常的疾病的體征和癥狀。
下列實(shí)施例只是為了說(shuō)明而不是限制本發(fā)明。
實(shí)施例I用Ins(3.4.5，6)P4的細(xì)胞滲透性衍生物減少T84細(xì)胞中鈣介導(dǎo)的氯離子分泌本實(shí)施例說(shuō)明通過(guò)增加Ins(3，4，5，6)P4的細(xì)胞內(nèi)濃度，Ins(3，4，5，6)P4的細(xì)胞滲透性衍生物減少了結(jié)腸上皮T84細(xì)胞系中鈣介導(dǎo)的氯離子分泌。
合成旋光對(duì)應(yīng)體純的1，2-Bt2-Ins(3，4，5，6)P4/AM以確定1，2-Bt2-Ins(3，4，5，6)P4/AM是否介導(dǎo)了氯離子分泌從細(xì)胞內(nèi)鈣濃度中解偶聯(lián)。將T84細(xì)胞(傳代18-48次)按以前所述保持(Weymer等，J.Clin.Invest.761828(1985))，該文獻(xiàn)引入本文作為參考。在SNAP-WELLS(ComingCostar；Cambridge，MA)上保溫7-10天后，形成緊密結(jié)合的單層。在固定前，將細(xì)胞單層與100，200或400μM Bt2-Ins(3，4，5，6)P4/AM預(yù)保溫30分鐘。再過(guò)30分鐘，加入0.1mM組胺，然后檢測(cè)氯離子分泌。將氯離子分泌測(cè)量為跨T84單層生長(zhǎng)至匯合的短環(huán)流(Isc)，然后用備電壓鉗的Ussing室(Physiologic Instruments；San Diego，CA)固定。得到數(shù)據(jù)并用“Acquire and Analyze”軟件(Physiologic Instruments)分析。
用200μM 1，2-Bt2-Ins(3，4，5，6)P4/AM時(shí)，組胺-刺激的氯離子分泌減少最多，用400μM沒(méi)有進(jìn)一步減少(表II)。該結(jié)果與以前的研究一致，以前的研究表明Ins(3，4，5，6)P4的細(xì)胞內(nèi)水平接近4μM(等于200μM細(xì)胞外濃度)，對(duì)應(yīng)于開始的最大抑制作用(Vajanaphanich等，同上文，1994)。表II用細(xì)胞滲透性Ins(3，4，5，6)P4衍生物減少鈣依賴性氯離子分泌表II
與Ins(3，4，5，6)P4的細(xì)胞滲透性衍生物減少氯離子分泌相反，二丁酰環(huán)AMP乙酰氧基甲基酯刺激的氯離子分泌沒(méi)有受到抑制(峰ΔIsc＝96.3±9.1％或?qū)φ?；平均值±SEM；n＝4)。該結(jié)果與下列觀察結(jié)果一致環(huán)AMP-介導(dǎo)的氯離子分泌是通過(guò)一個(gè)與鈣-介導(dǎo)的氯離子分泌之通道不同的氯離子通道發(fā)生的(McRoberts等，J.Biol.Chem.26014163(1985))。
這些結(jié)果表明通過(guò)使細(xì)胞與Ins(3，4，5，6)P4的細(xì)胞滲透性衍生物接觸，不斷增加的Ins(3，4，5，6)P4細(xì)胞內(nèi)濃度，通過(guò)使氯離子分泌從細(xì)胞內(nèi)鈣濃度中解偶聯(lián)而減少了鈣介導(dǎo)的氯離子分泌，而且Ins(3，4，5，6)P4的細(xì)胞滲透性衍生物是Ins(3，4，5，6)P4的激動(dòng)劑。
實(shí)施例II在兔結(jié)腸中用細(xì)胞滲透性Ins(3，4，5，6)P4衍生物減少鈣介導(dǎo)的氯離子分泌本實(shí)施例說(shuō)明用濃度不斷增加的Ins(3，4，5，6)P4的細(xì)胞滲透性衍生物可減少兔結(jié)腸組織中鈣介導(dǎo)的氯離子分泌。
用兔結(jié)腸模型系統(tǒng)(Frizzell等，J.Membrane Biol.27297(1976)和Frizzell and Schultz，Int.Rev.Physiol.19205(1979)，所述文獻(xiàn)均引入本文作為參考)證實(shí)了用培養(yǎng)的T84結(jié)腸上皮細(xì)胞得到的上述結(jié)果。將兔結(jié)腸切割成段作為兔結(jié)腸上皮源。簡(jiǎn)而言之，用含141mM Na+，5mM K+，1.2mM Ca2+，1.2mM Mg2+，122mM Cl-，25mM HCO3，1.6mMHPO4，0.4mMH2PO4和10mM葡萄糖的Ringers溶液洗滌兔結(jié)腸段。37℃，用5％CO2和95％O2充氣時(shí)，該溶液的pH為7.4。將上皮與下面的肌肉層剝離并用改性SNAP WELLS(Frizzell等，同上文，1976)固定。在37℃，將上皮與200μM 1，2-Bt2-Ins(3，4，5，6)P4/AM預(yù)保溫30分鐘，然后用Ussing室固定。按實(shí)施例I所述，以4秒的間隔測(cè)量短回流(short circuite current)、電導(dǎo)率和電阻。峰Isc是對(duì)照的50.9％±10.4，對(duì)照是與載體一起保溫(圖2；平均值±SEM，n＝3；用Student′s雙尾t試驗(yàn)，p＜0.05)。圖2中表示的％對(duì)照代表ΔIsc比用組胺刺激的對(duì)照單層的峰Isc。
這些結(jié)果表明細(xì)胞滲透性衍生物Bt2-Ins(3，4，5，6)P4/AM通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)的Ins(3，4，5，6)P4濃度而作為Ins(3，4，5，6)P4激動(dòng)劑并可減少兔結(jié)腸中的氯離子分泌。這些結(jié)果還證實(shí)細(xì)胞內(nèi)Ins(3，4，5，6)P4的升高將從結(jié)腸上皮組織中的細(xì)胞內(nèi)鈣濃度中解偶聯(lián)氯離子分泌。
實(shí)施例III用Ins(3，4，5，6)P4拮抗劑逆轉(zhuǎn)Ins(3，4，5，6)P4對(duì)組胺-刺激的氯離子分泌的抑制作用本實(shí)施例說(shuō)明Ins(3，4，5，6)P4對(duì)組胺刺激的氯離子分泌的抑制作用可通過(guò)Ins(3，4，5，6)P4的細(xì)胞滲透性衍生物逆轉(zhuǎn)，所述衍生物作為Ins(3，4，5，6)P4的拮抗劑。
實(shí)施例I和II中所列的結(jié)果表明濃度不斷增加的Ins(3，4，5，6)P4減少了鈣介導(dǎo)的氯離子分泌。因此，細(xì)胞中拮抗Ins(3，4，5，6)P4功能的化合物應(yīng)該可逆轉(zhuǎn)這種減少。
開始的研究是主要是針對(duì)了解Ins(3，4，5，6)P4的結(jié)構(gòu)決定基，所述決定基引起對(duì)鈣介導(dǎo)的氯離子分泌的抑制作用。合成了一系列細(xì)胞滲透性肌醇多磷酸酯衍生物。這些衍生物在1，2或3位上含有一個(gè)或兩個(gè)不可水解的化學(xué)基團(tuán)。將T84單層與200μM 2-Bt-1-Me-Ins(3，4，5，6)P4/AM，Me2-Ins(3，4，5，6)P4/AM，Me2-Ins(1，4，5，6)P4/AM或2-Bt-3-Me-Ins(1，4，5，6)P4/AM一起預(yù)保溫。
保溫后，用Ussing室固定細(xì)胞。用組胺(10-4M)刺激鈣介導(dǎo)的氯離子分泌。對(duì)照值是對(duì)共保溫單層中組胺的反應(yīng)。將數(shù)據(jù)表示為平均值峰ΔIsc±SEM，表示為8-10個(gè)試驗(yàn)的％對(duì)照。用Student′s雙尾t試驗(yàn)鑒定顯著性差異。
如表III所示，在用任何衍生物處理的細(xì)胞中，均沒(méi)有抑制作用。這些結(jié)果表明在1和2位的氫-鍵供體電勢(shì)參與介導(dǎo)了Ins(3，4，5，6)P4對(duì)鈣介導(dǎo)的氯離子分泌的抑制作用。細(xì)胞滲透性Bt2-Ins(3，4，5，6)P4/AM的scyllo衍生物至少與myo衍生物一樣是有效的抑制劑，這表明2-羥基位置的方向性與抑制活性無(wú)關(guān)。
按上述將T84細(xì)胞與上述的細(xì)胞滲透性肌醇多磷酸酯一起預(yù)保溫以確定是否有肌醇多磷酸酯衍生物可作為鈣介導(dǎo)的氯離子分泌的Ins(3，4，5，6)P4抑制作用的拮抗劑。組胺刺激后，測(cè)量短回流。如圖3所示，相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞，與Bt2-Ins(3，4，5，6)P4/AM保溫減少了組胺刺激的氯離子分泌。圖3中的％對(duì)照代表ΔIsc比用組胺刺激的對(duì)照單層的峰Isc。但是，與2-Bt-1-Me-Ins(3，4，5，6)P4/AM的預(yù)保溫逆轉(zhuǎn)了Bt2-Ins(3，4，5，6)P4/AM的抑制作用。表III用Ins(3，4，5，6)P4的衍生物逆轉(zhuǎn)Ins(3，4，5，6)P4-介導(dǎo)的氯離子分泌的減少表III
在表III中列出了各種肌醇多磷酸酯衍生物對(duì)組胺刺激的氯離子分泌的作用。Ins(3，4，5，6)P4衍生物2-Bt-1-Me-Ins(3，4，5，6)P4/AM和Me2-Ins(3，4，5，6)P4/AM逆轉(zhuǎn)了Bt2-Ins(3，4，5，6)P4/AM對(duì)組胺刺激的氯離子分泌的抑制作用。相反，Ins(1，4，5，6)P4的衍生物Me2-Ins(1，4，5，6)P4/AM和2-Bt-3-Me-Ins(1，4，5，6)P4/AM基本上沒(méi)有作用。這些結(jié)果表明Bt2-Ins(3，4，5，6)P4/AM對(duì)氯離子分泌減少的逆轉(zhuǎn)是立體特異性的并表明Ins(3，4，5，6)P4的這些烷基衍生物可作為Ins(3，4，5，6)P4的拮抗劑。
還檢測(cè)了其他衍生物。與Bt2-Ins(1，4，5，6)P4/AM預(yù)保溫不能抑制氯離子分泌，而且事實(shí)上，使氯離子分泌有輕微的增加。Ins(3，4，5，6)P4衍生物，D，L-1，2-Cl2-二脫氧-Ins(3，4，5，6)P4/AM對(duì)氯離子分泌有輕微的抑制作用。D，L-1-Bt-2-Me-Ins(3，4，5，6)P4/AM對(duì)氯離子分泌沒(méi)有抑制并且沒(méi)有逆轉(zhuǎn)抑制作用Bt2-Ins(1，4，5，6)P4/AM的抑制作用。
細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的升高導(dǎo)致氯離子分泌增加。為了確保肌醇多磷酸酯衍生物對(duì)氯離子分泌的影響都不是因鈣水平的變化而引起的，在用肌醇多磷酸酯衍生物處理的細(xì)胞中測(cè)量細(xì)胞內(nèi)鈣濃度。如圖4所示，Bt2-Ins(1，4，5，6)P4/AM沒(méi)有升高細(xì)胞內(nèi)鈣或者鈣對(duì)毒胡蘿卜素的反應(yīng)。所檢測(cè)的化合物中，沒(méi)有一個(gè)通過(guò)其本身改變了細(xì)胞內(nèi)鈣水平或改變了用卡巴膽堿或毒胡蘿卜素刺激的細(xì)胞內(nèi)鈣水平。因此，肌醇多磷酸酯衍生物對(duì)氯離子分泌的影響不是因?yàn)閷?duì)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的作用而引起的。
這些結(jié)果說(shuō)明Ins(3，4，5，6)P4的細(xì)胞滲透性衍生物逆轉(zhuǎn)了鈣介導(dǎo)的氯離子分泌的減少，這種減少是起因于由于用1，2-Bt2-Ins(3，4，5，6)P4/AM處理細(xì)胞引起的Ins(3，4，5，6)P4的細(xì)胞內(nèi)濃度增加，由此增加了鈣介導(dǎo)的由這些細(xì)胞的氯離子分泌。相反，立體異構(gòu)體Ins(1，4，5，6)P4的衍生物不影響由Ins(3，4，5，6)P4介導(dǎo)的氯離子分泌的抑制作用。因此，Ins(3，4，5，6)P4的細(xì)胞滲透性衍生物可作為Ins(3，4，5，6)P4拮抗劑。
實(shí)施例IV用Ins(3，4，5，6)P4拮抗劑逆轉(zhuǎn)卡巴膽堿介導(dǎo)的氯離子分泌的減少本實(shí)施例說(shuō)明用可作為Ins(3，4，5，6)P4拮抗劑的細(xì)胞滲透性Ins(3，4，5，6)P4衍生物可逆轉(zhuǎn)卡巴膽堿介導(dǎo)的氯離子分泌減少。
在上述實(shí)施例III中，通過(guò)加入細(xì)胞滲透性衍生物Bt2-Ins(3，4，5，6)P4增加了細(xì)胞內(nèi)Ins(3，4，5，6)P4，該衍生物被內(nèi)源酯酶水解產(chǎn)生了Ins(3，4，5，6)P4/AM。在本實(shí)施例中，通過(guò)用卡巴膽堿延長(zhǎng)對(duì)細(xì)胞的處理來(lái)增加細(xì)胞內(nèi)Ins(3，4，5，6)P4。
用D，L-1，2-環(huán)亞己基-Ins(3，4，5，6)P4/AM，1-Bu-2-Bt-Ins(3，4，5，6)P4/AM，Bu2-Ins(3，4，5，6)P4/AM，3-Bt-2-Bu-Ins(1，4，5，6)P4/AM，Bu2-Ins(1，4，5，6)P4/AM，1-Bt-2-Bu-Ins(3，4，5，6)P4/AM或3-Bu-2-Bt-Ins(1，4，5，6)P4/AM處理T84結(jié)腸上皮細(xì)胞，并測(cè)量短回流。
將一組細(xì)胞與一種肌醇多磷酸酯衍生物預(yù)保溫30分鐘。將另兩組細(xì)胞與載體或單獨(dú)預(yù)保溫。在0時(shí)開始測(cè)量Isc。在5分鐘時(shí)，將卡巴膽堿(10-4M)加至與載體單獨(dú)預(yù)保溫的一組細(xì)胞(在圖5中稱為“卡巴膽堿”)中，將卡巴膽堿加至與肌醇多磷酸酯衍生物預(yù)保溫的細(xì)胞(在圖5A中稱為“卡巴膽堿+D，L-1，2-環(huán)亞己基-Ins(3，4，5，6)P4/AM”)中。在30分鐘時(shí)，加入1μM毒胡蘿卜素。收集n＝4-6次試驗(yàn)的數(shù)據(jù)。
圖5A列出了使用D，L-1，2-環(huán)亞己基-Ins(3，4，5，6)P4/AM的試驗(yàn)。在與Ins(3，4，5，6)P4衍生物預(yù)保溫的細(xì)胞和僅用卡巴膽堿處理的細(xì)胞中，加入卡巴膽堿引起短回流的暫時(shí)增加。在30分鐘時(shí)，ΔIsc回到對(duì)照水平后，加入1μM毒胡蘿卜素以刺激細(xì)胞內(nèi)鈣增加。在用毒胡蘿卜素處理的對(duì)照細(xì)胞中可觀察到ΔIsc的預(yù)期增加，而用卡巴膽堿進(jìn)行延長(zhǎng)處理的細(xì)胞中ΔIsc減弱。用D，L-1，2-環(huán)亞己基-Ins(3，4，5，6)P4/AM預(yù)處理逆轉(zhuǎn)了卡巴膽堿對(duì)鈣介導(dǎo)的氯離子分泌的抑制作用。因此，D，L-1，2-環(huán)亞己基-Ins(3，4，5，6)P4/AM可作為Ins(3，4，5，6)P4的拮抗劑。
如圖5所示，Ins(3，4，5，6)P4衍生物D，L-1，2-環(huán)亞己基-Ins(3，4，5，6)P4/AM、1-Bu-2-Bt-Ins(3，4，5，6)P4/AM和Bu2-Ins(3，4，5，6)P4/AM逆轉(zhuǎn)了由毒胡蘿卜素刺激的卡巴膽堿介導(dǎo)的氯離子分泌的抑制作用，這表明這些Ins(3，4，5，6)P4衍生物可作為Ins(3，4，5，6)P4的拮抗劑(分別為圖5A至5C)。相反，1-Bt-2-Bu-Ins(3，4，5，6)P4/AM以及3-Bt-2-Bu-Ins(1，4，5，6)P4/AM、2，3-Bu2-Ins(1，4，5，6)P4/AM和3-Bu-2-Bt-Ins(1，4，5，6)P4/AM不能逆轉(zhuǎn)由毒胡蘿卜素刺激的卡巴膽堿介導(dǎo)的氯離子分泌的抑制作用。
這些結(jié)果表明Ins(3，4，5，6)P4的細(xì)胞滲透性衍生物逆轉(zhuǎn)了用卡巴膽堿延長(zhǎng)處理對(duì)鈣介導(dǎo)的氯離子分泌的抑制作用，因此，可作為Ins(3，4，5，6)P4的拮抗劑。
實(shí)施例V細(xì)胞內(nèi)Ins(1，3，4)P3水平的升高增加Ins(3，4，5，6)P4并減少鈣介導(dǎo)的氯離子分泌本實(shí)施例說(shuō)明用Ins(1，3，4)P3的細(xì)胞滲透性衍生物處理細(xì)胞增加了Ins(3，4，5，6)P4，并減少了鈣介導(dǎo)的氯離子分泌。
用細(xì)胞鑒定了幾乎30種肌醇多磷酸酯。用5′肌醇多磷酸酯磷酸酶，將Ins(3，4，5，6)P4轉(zhuǎn)變成Ins(1，3，4)P3。在一體外檢測(cè)系統(tǒng)中，Ins(1，3，4)P3抑制肌醇1激酶，該激酶催化Ins(3，4，5，6)P4轉(zhuǎn)變成Ins(1，3，4，5，6)P5(Tan等，J.Biol.Chem.2722285(1997))，該文獻(xiàn)引入本文作為參考。
合成細(xì)胞滲透性衍生物D，L-Bt3-Ins(1，3，4)P3/AM。在用Ussing室固定前，將結(jié)腸上皮T84細(xì)胞與400μM D，L-Bt3-Ins(1，3，4)P3/AM預(yù)保溫30分鐘并測(cè)量ΔIsc。在10分鐘時(shí)，加入卡巴膽堿(10-4M)暫時(shí)刺激鈣介導(dǎo)的氯離子分泌。數(shù)據(jù)是8次試驗(yàn)的平均值，p＜0.04，未配對(duì)的，雙邊student′s t試驗(yàn)。
與400μM D，L-Bt3-Ins(1，3，4)P3/AM保溫、使用(3H)-肌醇標(biāo)記的細(xì)胞中的Ins(3，4，5，6)P4增加了3倍，這表明Ins(1，3，4)P3在體內(nèi)增加了Ins(3，4，5，6)P4。與載體預(yù)保溫的對(duì)照細(xì)胞的峰ΔIsc為15.2±2.8。與D，L-Bt3-Ins(1，3，4)P3/AM預(yù)保溫的細(xì)胞的峰ΔIsc為7.9±1.6。因此，通過(guò)用細(xì)胞滲透性D，L-Bt3-Ins(1，3，4)P3/AM衍生物處理細(xì)胞，使鈣介導(dǎo)的氯離子分泌降低了約50％。
這些結(jié)果表明細(xì)胞滲透性Ins(1，3，4)P3衍生物可增加Ins(3，4，5，6)P4的細(xì)胞內(nèi)濃度，從而減少了鈣介導(dǎo)的氯離子分泌，因此，可作為Ins(3，4，5，6)P4的激動(dòng)劑。
實(shí)施例VI沙門氏菌侵染人結(jié)腸上皮細(xì)胞增加了Ins(1，4，5，6)P4的細(xì)胞內(nèi)濃度本實(shí)施例說(shuō)明沙門氏菌(Salmonella)侵染人結(jié)腸上皮細(xì)胞增加了Ins(1，4，5，6)P4的細(xì)胞內(nèi)濃度。
侵染性腸細(xì)菌進(jìn)入并穿透腸上皮以接近下層粘膜并開始全身性感染。以前的研究表明沙門氏菌侵染上皮細(xì)胞引起肌醇多磷酸酯更新增加，這表明肌醇多磷酸酯在上皮細(xì)胞對(duì)細(xì)菌侵染的反應(yīng)中起作用(Ruschkowski等，F(xiàn)EMS Microbiol.Lett.74121(1992))。為了表征由細(xì)菌侵染誘導(dǎo)的肌醇多磷酸酯變化，評(píng)估侵染細(xì)菌對(duì)結(jié)腸上皮細(xì)胞的作用。
在用5％透析新生牛血清補(bǔ)充的無(wú)肌醇50％Dulbecco′s改性的Eagle′s(DME)培養(yǎng)基和50％Ham′s F12培養(yǎng)基中，將匯合的結(jié)腸上皮T84細(xì)胞在6孔平板中與50μCi/孔(3H)-肌醇一起保溫4天。用預(yù)熱培養(yǎng)基(50％DME，50％Ham′s F12和1mg/ml牛血清白蛋白)將培養(yǎng)物洗滌3次，然后用各時(shí)期相同培養(yǎng)基中的5×108細(xì)菌/孔感染培養(yǎng)物。用冰冷的磷酸緩沖的鹽(PBS)將培養(yǎng)物洗滌2次，然后在冰上于10％三氯乙酸和10mM植酸中裂解5分鐘。用FREON/叔胺(alamine)中和提取物，然后在Adsorbosphere SAX柱上分辨以分離(3H)-肌醇多磷酸酯。用配有在線放射性檢測(cè)儀的HPLC，按前述定量分析放射性峰(Kachintorn等，同上文，1993)。為了定量分析HPLC上未分辨出的對(duì)映異構(gòu)體用HPLC從所有其他(3H)-InsP4異構(gòu)體中分離對(duì)應(yīng)于(3H)-Ins(3，4，5，6)P4和Ins(1，4，5，6)P4的峰，脫鹽，然后按前述(Vajanaphanich等，同上文，1994)與帶有(32P)-標(biāo)記的Ins(1，4，5，6)P4的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)的部分純化的Ins(1，4，5，6)P43-激酶一起保溫。通過(guò)比較相應(yīng)量的形成的(3H)-和(32P)-標(biāo)記的Ins(1，3，4，5，6)P5，在確定在原峰中(3H)-Ins(3，4，5，6)P4和(3H)-Ins(1，4，5，6)P4的比例。
將T84細(xì)胞單層用(3H)-肌醇標(biāo)記并在不同時(shí)期用都柏林沙門氏菌(Salmonella dublin)感染。在感染后的60分鐘內(nèi)，myo-肌醇六磷酸酯(InsP6)或其他肌醇多磷酸酯如Ins(1，4，5)P3的水平?jīng)]有顯著變化，這些多磷酸酯一般是在磷酸脂酶C被激活時(shí)積累的。相反，在都柏林沙門氏菌感染后10分鐘內(nèi)，未分辨的對(duì)映異構(gòu)體(3H)-Ins(3，4，5，6)P4和(3H)-Ins(1，4，5，6)P4的水平增加。該峰的約85％對(duì)應(yīng)于(3H)-Ins(1，4，5，6)P4。在感染后30-40分鐘，比未感染的對(duì)照細(xì)胞最大增加了14倍(參見表IV)。在40分鐘后，(3H)-Ins(1，4，5，6)P4水平緩慢下降，并在感染后3小時(shí)恢復(fù)至接近基線(參見表IV)。用另一種人腸上皮細(xì)胞系LS174T可得到相似的觀察結(jié)果。在都柏林沙門氏菌感染后，發(fā)現(xiàn)(3H)-Ins(1，4，5，6)P4增加了11.3倍，這表明感染后細(xì)胞肌醇多磷酸酯的變化反映了上皮細(xì)胞的一般反應(yīng)。
用另一種沙門氏菌菌株傷寒沙門氏菌BRD691(Salmonella typhiBRD691)感染T84細(xì)胞也增加了(3H)-Ins(1，4，5，6)P4的水平(參見表IV)。相反，都柏林沙門氏菌的突變株SB 133正常粘附于上皮細(xì)胞但不侵染上皮細(xì)胞，使(3H)-Ins(1，4，5，6)P4的水平增加最少，這表明由沙門氏菌侵染宿主細(xì)胞對(duì)于該反應(yīng)是必需的。但是，僅僅細(xì)菌侵染不足以提高Ins(1，4，5，6)P4水平，因?yàn)橛闷渌恍┣秩拘愿锾m氏陰性菌包括韋氏志賀氏菌(Shigella flexneri)、痢疾志賀氏菌(Shigelladysenteriae)、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Yersinia enterocolitica)和腸侵染性大腸桿菌(Escherichia coli)(血清型O29NM)感染T84細(xì)胞只會(huì)使(3H)-Ins(1，4，5，6)P4水平有很小的增加。此外，將非侵染性革蘭氏陰性菌如腸出血性大腸桿菌(血清型O157)或非致病性大腸桿菌(DH5α)加至T84單層，對(duì)(3H)-Ins(1，4，5，6)P4水平幾乎沒(méi)有影響。加入10μg/ml細(xì)菌脂多糖(LPS)對(duì)(3H)-Ins(1，4，5，6)P4水平?jīng)]有影響。表IV沙門氏菌感染上皮細(xì)胞后Ins(1，4，5，6)P4水平的增加
這些結(jié)果表明沙門氏菌侵染結(jié)腸上皮細(xì)胞增加了Ins(1，4，5，6)P4的細(xì)胞內(nèi)濃度。在分泌性腹瀉中氯離子分泌增加，說(shuō)明與Ins(1，4，5，6)P4濃度有關(guān)，分泌性腹瀉是沙門氏菌感染的一種病理學(xué)表現(xiàn)。
實(shí)施例VIIIns(1，4，5，6)P4逆轉(zhuǎn)EGF-誘導(dǎo)的氯離子分泌的抑制作用本實(shí)施例說(shuō)明通過(guò)將細(xì)胞與細(xì)胞滲透性Ins(3，4，5，6)P4衍生物一起保溫而使Ins(1，4，5，6)P4細(xì)胞內(nèi)濃度不斷增加，逆轉(zhuǎn)了上皮生長(zhǎng)因子(EGF)誘導(dǎo)的氯離子分泌抑制作用。
在上述實(shí)施例III和IV中，Ins(1，4，5，6)P4衍生物對(duì)Ins(3，4，5，6)P4介導(dǎo)的氯離子分泌減少?zèng)]有影響。為了檢測(cè)Ins(1，4，5，6)P4是否影響EGF誘導(dǎo)的氯離子分泌的抑制作用，將T84細(xì)胞單層與Bt2Ins(1，4，5，6)P4/AM預(yù)保溫30分鐘。首先測(cè)量ΔIsc，在測(cè)量5分鐘后，將16.3 nM EGF加至細(xì)胞的嗜堿側(cè)(basolateral)表面。再保溫15分鐘后，加入100μM卡巴膽堿以急速升高細(xì)胞內(nèi)鈣濃度。對(duì)照組也用卡巴膽堿刺激，但不與EGF預(yù)保溫。數(shù)據(jù)是來(lái)自一組代表性試驗(yàn)的兩個(gè)測(cè)量值(共3個(gè)試驗(yàn))的平均值。
如圖6和圖7所示(組a和b)，EGF抑制卡巴膽堿刺激的氯離子分泌。與被內(nèi)源細(xì)胞酯酶水解成Ins(1，4，5，6)P4的細(xì)胞滲透性衍生物Bt2Ins(1，4，5，6)P4/AM預(yù)保溫，顯著逆轉(zhuǎn)了EGF誘導(dǎo)的氯離子分泌抑制作用。相反，加入Ins(1，3，4，5，6)P4的細(xì)胞滲透性衍生物未減弱EGF的抑制功能(圖7，組C)。加入細(xì)胞滲透性Ins(3，4，5，6)P4衍生物，Ins(1，4，5，6)P4的對(duì)映異構(gòu)體也未減弱EGF對(duì)氯離子分泌的抑制作用。
加入Bt2Ins(1，4，5，6)P4/AM沒(méi)有逆轉(zhuǎn)EGF對(duì)環(huán)AMP介導(dǎo)的氯離子分泌的抑制作用，這表明Ins(1，4，5，6)P4的作用對(duì)于鈣介導(dǎo)的氯離子分泌是特異性的。
這些結(jié)果表明Ins(1，4，5，6)P4作為細(xì)胞滲透性衍生物傳遞至細(xì)胞，其水平的升高通過(guò)逆轉(zhuǎn)EGF介導(dǎo)的氯離子分泌的抑制作用而提高了鈣介導(dǎo)的氯離子分泌。
實(shí)施例VIIIIns(1，4，5，6)P4逆轉(zhuǎn)PtdInsP3對(duì)鈣介導(dǎo)的氯離子分泌的減少作用本實(shí)施例說(shuō)明PtdInsP3的細(xì)胞滲透衍生物減少了鈣介導(dǎo)的氯離子分泌。細(xì)胞滲透Ins(1，4，5，6)P4衍生物逆轉(zhuǎn)了PtdInsP3介導(dǎo)的氯離子分泌的減少。
將T84細(xì)胞單層與PtdInsP3/AM預(yù)保溫30分鐘，然后測(cè)量ΔIsc。如圖8中所示，濃度不斷增加的PtdInsP3/AM抑制卡巴膽堿刺激的氯離子分泌，這表明肌醇多磷酸酯與Ins(3，4，5，6)P4不同，也抑制鈣介導(dǎo)的氯離子分泌。
合成其他PI 3-激酶產(chǎn)物PtdInsP3的細(xì)胞滲透性衍生物并檢測(cè)其對(duì)氯離子分泌的作用。將細(xì)胞與二C16-Bt-PtdInsP3/AM或二C8-Bt-PtdInsP3/AM預(yù)保溫并按實(shí)施例VII所述測(cè)量ΔIsc。
如圖7所示，用二C16-Bt-PtdInsP3/AM預(yù)處理T84細(xì)胞(圖7d)對(duì)鈣介導(dǎo)的氯離子分泌的抑制高達(dá)74％。同樣，二C8-Bt-PtdInsP3/AM對(duì)氯離子分泌的抑制達(dá)79％。當(dāng)用預(yù)期不會(huì)進(jìn)入細(xì)胞的PtdInsP3預(yù)處理細(xì)胞時(shí)，沒(méi)有觀察到對(duì)鈣介導(dǎo)的氯離子分泌的抑制作用。PtdInsP3的這些細(xì)胞滲透衍生物對(duì)卡巴膽堿刺激后的鈣水平?jīng)]有影響。用PtInsP3的這些衍生物觀察的水平降低與用EGF處理細(xì)胞觀察到的結(jié)果相當(dāng)。此外，將EGF加之與細(xì)胞滲透性PtdInsP3衍生物預(yù)保溫的單層中，沒(méi)有導(dǎo)致附加的鈣介導(dǎo)的氯離子分泌的抑制作用，這表明PtdInsP3和EGF通過(guò)相同的機(jī)理發(fā)揮作用。
將T84細(xì)胞與細(xì)胞滲透性Ins(1，4，5，6)P4衍生物預(yù)保溫以確定Ins(1，4，5，6)P4是否可逆轉(zhuǎn)PtdInsP3介導(dǎo)的氯離子分泌的減少。如圖7d所示，T84單層與膜滲透性Ins(1，4，5，6)P4衍生物預(yù)保溫部分逆轉(zhuǎn)了PtdInsP3介導(dǎo)的氯離子分泌的減少。
這些結(jié)果表明PtdInsP3可減少鈣介導(dǎo)的氯離子分泌。另外，Ins(1，4，5，6)P4逆轉(zhuǎn)了鈣介導(dǎo)的氯離子分泌中PtInsP3的減少。
實(shí)施例IX人鼻上皮中的氯離子運(yùn)輸本實(shí)施例提供了初級(jí)人鼻上皮細(xì)胞系統(tǒng)，該系統(tǒng)作為檢測(cè)化合物改變呼吸上皮中氯離子分泌的效力的模型。
活檢得到初級(jí)人鼻上皮。為了在單層中進(jìn)行生物電和鈣測(cè)量，將初級(jí)人鼻上皮細(xì)胞鋪在固定于O環(huán)的多孔Transwell Coll濾紙(孔直徑0.4μm，Costar)上，然后在接種5-7天后進(jìn)行研究，5-7天與最大跨上皮電勢(shì)差的發(fā)展一致。將細(xì)胞保持在用胰島素(10μg/ml)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(5μg/ml)、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)補(bǔ)充物(3.75μg/ml)、氫化可的松(5nM)、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)補(bǔ)充物(3.75μg/ml)、三碘甲腺原氨酸(30nM)和1mMCaCl2補(bǔ)充的無(wú)血清Ham′s F12培養(yǎng)基中。在鋪板5-7天后，用小型Ussing室固定人鼻上皮單層。
用Voltage-Clamp/Pulse Generator(Physiologic Instruments，SanDiego，Califomia)檢測(cè)跨上皮電勢(shì)差，用兩通道記錄儀積累生物電。將單層與無(wú)鈉Ringer接觸以計(jì)算跨上皮氯化物電阻，一種從其天然鈉吸收狀態(tài)至氯離子分泌狀態(tài)的變化的測(cè)量值。為了進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)鈣的測(cè)量，將單層用Fura-2負(fù)載并固定在與微熒光測(cè)量?jī)x相連的顯微鏡的載物臺(tái)上。從30-40個(gè)細(xì)胞的區(qū)域或從單個(gè)細(xì)胞收集熒光強(qiáng)度比。在每個(gè)制品中，細(xì)胞內(nèi)鈣水平的ΔIsc被歸一化。為了確保所述結(jié)果反映來(lái)自真正單層的響應(yīng)，將單層按常規(guī)固定并對(duì)橫截面片段進(jìn)行檢測(cè)。
初級(jí)人鼻上皮細(xì)胞對(duì)于用Ins(3，4，5，6)P4和PtdInsP3的拮抗劑處理，如在實(shí)施例III、IV、VII和VIII中描述的那些是有用的。在初級(jí)人鼻上皮細(xì)胞中對(duì)氯離子分泌增加有效的化合物是緩解囊性纖維性變癥狀如肺功能不全的良好候選物。
實(shí)施例X產(chǎn)生CFTR-T84細(xì)胞本實(shí)施例提供了制備CFTR-T84細(xì)胞的方法，該細(xì)胞用作囊性纖維性變模型。
為了篩選Ins(3，4，5，6)P4衍生物并最終確定CFTR是否可調(diào)節(jié)與Ins(3，4，5，6)P4介導(dǎo)的氯離子抑制作用有關(guān)之因素的表達(dá)，產(chǎn)生了CFTR-T84細(xì)胞。
用雙選擇法失活T84細(xì)胞中的CFTR基因，這種方法最初用于產(chǎn)生小鼠胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)中的基因剔除突變(Mansour等，Nature336348(1988))，該文獻(xiàn)引入本文作為參考。用pSSC-9載體(Chauhanand Gottesman，Gene120281(1992)，該文獻(xiàn)引入本文作為參考)產(chǎn)生致突變的CFTR基因靶向構(gòu)建體。該載體攜帶新霉素抗性基因，由胸苷激酶啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，兩側(cè)為hsv-tk基因。另外，pSSC-9在該基因的兩側(cè)攜帶了方便的克隆位點(diǎn)(可用于插入基因靶向片段)和兩個(gè)Sfil限制位點(diǎn)(用于切割線性形式的致突變彈夾(cassette))。通過(guò)G418抗性，對(duì)新霉素基因的表達(dá)進(jìn)行篩選，可篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆。用cyclovir對(duì)hsv-tk表達(dá)進(jìn)行篩選可擴(kuò)展經(jīng)同源重組將所述構(gòu)建體整合至靶位點(diǎn)的克隆(Mansour等，同上文，1988)。用8.5kb CFTR基因片段(TE2611E8.5，含外顯子21)作為CFTR基因序列源(Rommens等，Science2451059(1989)；和Rommens等，Am.J.Hum.Genet.45932(1989))，所述文獻(xiàn)均引入本文作為參考。或者，可用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)直接從T84細(xì)胞中克隆適宜的序列。已描述了用于擴(kuò)增CFTR基因片段的數(shù)個(gè)PCR引物(Zielinski等，Genomics10214(1991))，該文獻(xiàn)引入本文作為參考。應(yīng)擴(kuò)增至少2-4kb長(zhǎng)的片段以確保有足夠的同源序列進(jìn)行同源重組。PCR引物攜帶與pSSC-9克隆位點(diǎn)相容的限制位點(diǎn)。
用DNA轉(zhuǎn)染方法，例如磷酸鈣或電穿孔為基礎(chǔ)的方法(MolecularBioloy，A Laboratory Manual(分子生物學(xué)，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，第2版，Sambrook等編，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，Plainview，NY(1989)，該文獻(xiàn)引入本文作為參考)，將致突變構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到T84細(xì)胞中。用G418篩選穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染體，擴(kuò)增并用cyclovir進(jìn)行第二輪篩選。用不斷增加量的G418對(duì)抗性克隆進(jìn)行另一輪篩選，所述克隆可能通過(guò)載體的同源重組進(jìn)入CFTR基因座衍生的?？捎迷摲椒?是為了便于用ES細(xì)胞在小鼠中產(chǎn)生雙剔除突變體而開發(fā)的)在細(xì)胞系中篩選純合突變(Chen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA904528(1993)；和Mortenson，Hypertension22646(1993))，所述文獻(xiàn)均引入本文作為參考。用Southern印跡和PCR分析分析篩選出的克隆以確定neo彈夾被插入到CFTR基因中。
還可用“雙構(gòu)建體法”，其中用兩個(gè)不同的突變構(gòu)建體依次完成靶基因誘變(Mortenson，同上文，1993；Feldhaus等EMBOJ.122763(1993)；和Porter and Itzhaki，Eur.J.Biochem.218273(1993))，所述文獻(xiàn)均引入本文作為參考。這些構(gòu)建體攜帶了一個(gè)neo基因或gpt基因彈夾，可以連續(xù)轉(zhuǎn)染并用G418篩選neo基因和用霉酚酸加黃嘌呤篩選gpt基因。用T84細(xì)胞的雙剔除CFTR突變體評(píng)估Ins(3，4，5，6)P4和PtdInsP3拮抗劑的效力。
這些結(jié)果表明產(chǎn)生了T84細(xì)胞的CFTR-突變體，所述突變體可用作囊性纖維性變的模型。這些細(xì)胞提供了與囊性纖維性變患者上皮細(xì)胞相似的遺傳背景。Ins(3，4，5，6)P4和PtdInsP3的拮抗劑可有效提高CFTR-T84細(xì)胞中的氯離子分泌，對(duì)于增加囊性纖維性變患者中氯離子分泌是良好的候選物。
實(shí)施例XI制備細(xì)胞滲透性肌醇多磷酸酯衍生物本實(shí)施例描述了細(xì)胞滲透性肌醇多磷酸酯衍生物的合成。
以前描述過(guò)一些細(xì)胞滲透性肌醇多磷酸酯衍生物的合成反應(yīng)(Roemer等，同上文，1996，和Roemer等，同上文，1995)。
以下描述其它肌醇磷酸酯衍生物的合成反應(yīng)。圖9給出了細(xì)胞可滲透性PtdInsP3和二C16-Bt-PtdInsP3/AM的結(jié)構(gòu)。圖10給出了PtdInsP3/AM衍生物的合成路線。圖11給出了1，2-亞環(huán)己基Ins(3，4，5，6)P4//AM的合成路線。圖12給出了myo-肌醇-1，3，4-三磷酸酯和2，5，6-Bt3-Ins(1，3，4)P3/AM的結(jié)構(gòu)。只給出了D-構(gòu)型的化合物。圖13給出了細(xì)胞可滲透性肌醇多磷酸酯衍生物的合成路線。圖13中，使用了以下條件(i)Bt2O，DMAP，pyr.；(ii)TFA，CH3CN/H2O；(iii)aBu2SnO，甲苯，回流；b BnBr，CsF，DMF；(iv)Bt2O，DMAP，pyr.；(v)Pd/C(10％)，AcOH；(vi)a(BnO)2PNiPr2，四唑，CH3CN；b AcOOOH，-40℃；(vii)Pd/C(10％)，AcOH；(viii)AMBr，DIEA，CH3CN。
所有的化學(xué)試劑均是高純度的。如需要，可將溶劑在臨用前干燥和/或蒸餾。將乙腈在五氧化二磷存在下蒸餾并保存在3分子篩中，二甲基甲酰胺(DMF)與之相同。吡啶和甲苯保存在4分子篩中。乙基二異丙基胺(DIEA)用鈉絲干燥。鈀炭(10％)和三氟乙酸來(lái)自Acros Chemie。二芐基N，N-二異丙基亞磷酰胺(dibenzylN，N-diisopropylphosphoramidite)、過(guò)乙酸(32％v/w)、四唑、氫化鈉和乙酰氧甲基溴化物來(lái)自Aldrich，Milwaukee，Wisconsin。丁酸酐、DIEA和三(三苯基膦)-氯化銠(I)[tris(triphenylphosphin)-rhodium(I)-chloride]來(lái)自Merck。芐基溴、烯丙基溴、丁基碘、氟化銫和4-二甲氨基吡啶(DMAP)來(lái)自Fluka。離子交換樹脂Dowex50 WX 8，H+-型來(lái)自Serva，德國(guó)的Heidelberg。其它所有試劑均來(lái)自Riedel-de Haen。
高效液相色譜(HPLC)用LDC/Milton Roy Consta Metric III泵和LDC/Milton Roy UV Monitor D(254nm)或Knaur折光率檢測(cè)器進(jìn)行。分析柱是填充了RP 18材料(Merck，LiChrosorb10μm)的Merch Hibar不銹鋼管(250mm×4mm)。制備HPLC用Shimadzu LC8A泵和制備LDC UV III Monitor(254nm)或Knaur折光率檢測(cè)器以及填充了RP18材料(Merck，LiChrospher 100，10μm)的MerckPrepbar不銹鋼柱(25°mm×50mm)進(jìn)行。洗脫劑為甲醇-水混合物；組成以％甲醇(MeOH)給出。
1H-NMR和31P-NMR波譜在Brucker AM 360AM波譜儀上進(jìn)行。1H-NMR波譜中測(cè)得的化學(xué)位移是相對(duì)于四甲基硅烷的ppm，31P-NMR波譜中測(cè)得的化學(xué)位移是相對(duì)于85％H3PO4的ppm。J-值以Hz給出。質(zhì)譜用Finnigan Mat 8222質(zhì)譜儀通過(guò)快原子轟擊(FAB)解離測(cè)得。高分辨質(zhì)譜相對(duì)于質(zhì)量相差不超過(guò)10％的已知化合物測(cè)得。熔點(diǎn)(MP)(未校正)用Bchi B-540裝置測(cè)得。旋光度用Perkin-Elmer1231旋光計(jì)在10cm樣品池中、在鈉D-線下測(cè)定。鈀炭催化劑的超過(guò)濾在Sartorius過(guò)濾裝置SM 162 01上用再生纖維素濾紙(Sartorius，SM 116 04)Sartorius Edgewood，NewYork進(jìn)行。元素分析用Mikroanalytisches(Labor Beller，Gottingen，Germany)進(jìn)行。
D-1，4，5，6-四-O-芐基-myo-肌醇(ent-9)和D-3，4，5，6-四-O-芐基-myp-肌醇(9)按照以上描述進(jìn)行合成(Roemer等，文獻(xiàn)出處同上)?；衔飏ac-1，2-二-O-亞環(huán)己基-myo-肌醇通過(guò)Angyal和Tate的方法合成(Angyal和Tate，化學(xué)會(huì)志(J.CHe m.Soc.)19656949(1995))，該文獻(xiàn)引入本文作為參考。
磷酸化的一般方法。將選擇性保護(hù)的myo-肌醇衍生物和四唑在氬氣下溶于無(wú)水乙腈，然后加入二芐基N，N-二異丙基亞磷酰胺。室溫下攪拌給定的時(shí)間后，將反應(yīng)混合物冷卻至-40℃并加入過(guò)乙酸(32％v/w；1摩爾當(dāng)量/摩爾當(dāng)量亞磷酰胺)?；旌衔锷郎刂潦覝睾?，減壓蒸除溶劑并將殘余的油通過(guò)制備HPLC純化得到所需的肌醇四磷酸酯衍生物。
通過(guò)水解脫除芐基的一般方法。分別將完全保護(hù)的myo-肌醇四磷酸酯或四芐基-肌醇和鈀炭(10％；0.1mol鈀/mol芐基)一起在氫氣氛圍下、在自發(fā)產(chǎn)生氫氣的裝置中劇烈攪拌給定的時(shí)間。通過(guò)超過(guò)濾除去催化劑并將濾液冷凍干燥得到各自的產(chǎn)物。
引入乙酰氧甲基酯的一般方法。將充分干燥的肌醇四磷酸酯衍生物(游離酸)在氬氣氛下懸浮于無(wú)水乙腈中，然后加入無(wú)水DIEA(2.25mol DIEA/mol羥基)和乙酰氧甲基溴(1mol當(dāng)量/mol當(dāng)量DIEA)。將混合物于黑暗中室溫下攪拌4天，然后減壓蒸除所有揮發(fā)性組分并將粗品殘余物用特定的溶劑通過(guò)制備HPLC純化得到糖漿狀肌醇四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
D-3.4.5，6-四-O-芐基-1-O-丁基-myo-肌醇(10)將干燥的9和無(wú)水二丁基氧化錫(116mg，167μmol)在無(wú)水甲苯(100毫升)中、在裝有活化分子篩(3)的Soxhlet裝置中加熱回流18小時(shí)。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫并減壓蒸發(fā)至干。向殘余的油中加入CsF(140mg，926μmol)，然后將混合物置于高真空下2小時(shí)。將殘余的糖漿在氬氣下溶于無(wú)水DMF(10ml)并加入1-丁基碘(300μl，2.62mmol)。將溶液攪拌48小時(shí)后，HPLC分析(90％MeOH 1.5ml/分鐘；tR＝7.43分鐘)表明無(wú)進(jìn)一步的反應(yīng)。高真空蒸除過(guò)量的1-丁基碘和DMF。將粗產(chǎn)物通過(guò)制備HPLC進(jìn)行色譜分離(93％MeOH；40ml/分鐘；tR＝22.30分鐘)得到固體狀的化合物10(175mg，74％)。Mp75.4-75.9℃(甲醇)。[α]24D+8.4°(c＝0.98，CHCl3)。1H-NMR(CDCl3，360 MHZ)δ0.91(3H，t，J＝7.25Hz，CH3)，1.34-1.44(2H，m，CH2)，1.57-1.65(2H，m，CH2)，2.46(1H，s(br)，OH)，3.23(1H，dd，J＝9.31，2.33Hz，H-1)，3.43(1H，dd，J＝9.78，2.80Hz，H-3)，3.45(1H，dd，J＝9.78，9.31Hz，H4)，3.57(1H，dt，J＝6.99，6.52Hz，OCCHCH2CH3)，3.75(1H，dt，J＝6.99Hz，OCCH2CH2CH3)，3.91(1H，dd，J＝9.31，9.31Hz，H-5)，3.99(1H，dd，J＝9.78，9.31Hz，H-6)，4.27(1H，dd，J＝2.80，2.33Hz，H-2)，4.71-1.91(8H，m，CH2Ph)，7.25-7.39(20H，m，CH2Ph)MSm/z(+ve離子FAB)597[(M+H)+，1]，91[Bn-，100]。
D-1，4，5，6-四-O-芐基-3-O-丁基-myo-肌醇(ent-10)將二醇ent-9進(jìn)行類似的反應(yīng)和后處理得到化合物ent-10。[α]24D-8.7°(c＝1.01，CHCl3)。波譜數(shù)據(jù)與對(duì)映體10所得的數(shù)據(jù)一致。
D-3，4，5，6-四-O-芐基-1-O-丁基-2-O-丁酰-myo-肌醇(11)將10(187mg，298μmol)、丁酸酐(210μl，596μmol)和DMAP(38mg，30μmol)的無(wú)水吡啶(3ml)溶液室溫?cái)嚢?8小時(shí)。高真空蒸除溶劑得到油。與辛烷一起蒸發(fā)3次除去殘余的吡啶。將殘余物溶于叔丁基甲基醚(10ml)，用磷酸鹽緩沖液(10ml)洗滌一次、用碳酸氫鈉(10ml)洗滌一次、用硫酸氫鈉(10ml)洗滌一次、再次用磷酸鹽緩沖液(10ml)洗滌一次，然后用鹽水(10ml)洗滌。將有機(jī)層用硫酸鈉干燥并過(guò)濾。蒸除溶劑得到油狀純凈的11(194mg，98％)，[α]24D-10.4°(c-1.9，CHCl3)。1H-NMR(CHCl3，360MHZ)δ0.91(3H，t，J＝7.25Hz，CH3)，0.98(3H，t，J＝7.46Hz，CH3)，1.32-1.42(2H，m，CH2)，1.50-1.60(2H，m，CH2)，1.69(2H，tq，J＝7.46，7.46Hz，O(O)CCH2CH2CH3)，2.39(2H，t，J＝7.46Hz，O(O)CCH2，CH2CH3)，3.31(1H，dd，J＝9.66，2.63Hz，H-1)，3.44(1H，dt，J＝9.07，6.81Hz，OCH2CH2CH2CH3)，3.48(1H，dd，J＝9.66，3.07Hz，H3)，3.49(1H，dd，J＝9.66，9.22Hz，H-5)，3.67(1H，dt，J＝8.78，6.81Hz，OCH2CH2CH2CH3)，3.81(1H，dd，J＝9.66，9.66Hz，H-4)，3.86(1H，dd，J＝9.66，9.22Hz，H-6)，4.51-4.93(8H，m，CH2Ph)，5.83(1H，dd，J＝3.07，2.63Hz，H-2)，7.26-7.36(20H，m，CH2Ph)。MSm/z(+ve離子FAB)665[(M+H)+，21]，91[Bn+，100]。
D-1，4，5，6-四-O-芐基-3-O-丁基-2-O-丁酰-myo-肌醇(ent-11)將化合物ent-10按照以上描述進(jìn)行丁?；玫交衔飁nt-11。[α]24D+10.7°(c-2.05，CHCl3)。波譜數(shù)據(jù)與對(duì)映體11的數(shù)據(jù)一致。
D-1-O-丁基-2-O-丁酰-myo-肌醇(12)將化合物11(178mg，267μmol)按照一般方法中的描述用鈀炭(10％)在氫氣下氫化，冷凍干燥后得到固體狀的四醇12(81mg，99％)。[α]24D+26.5°(c＝2.0，MeOH)。1H-NMR([D6]DMSO，360MHZ)δ0.84(3H，t，J＝7.38Hz，CH3)，0.90(3H，t，J＝7.38Hz，CH3)，1.21-1.31(2H，m，CH2)，1.36-1.44(2H，m，CH2)，1.54(2H，tq，J＝7.38，700Hz，O(O)CCH2，CH2CH3)，2.24(2H，t，J＝7.00Hz，O(O)CCH2，CH2CH3)，2.97(1H，dd，J-8.94，8.55Hz，H-5)，3.10(1H，dd，J＝9.72，2.72Hz，H-1)，3.25-3.35(4H，m，H-3，H-4，H-6，OCH2，CH2CH2CH3)，3.50(1H，dt，J＝8.94，6.60Hz，OCH2CH2CH2CH3)，4.85(4H，s(br)，OH)，5.36(1H dd，J＝2.72，2.33Hz，H-2)。MSm/z(+ve離子FAB)307[(M+H)+，21]，71[Bt+，100]。MSm/z(-ve離子FAB)305[(M-H+)-，27]，87[B+O-，100]。分析()C計(jì)算值54.89；實(shí)測(cè)值54.45；H計(jì)算值8.55，實(shí)測(cè)值8.56。
D-3-O-丁基-2-O-丁基-2-O-丁酰-myo-肌醇(ent-12)將完全保護(hù)的化合物ent-11進(jìn)行類似的反應(yīng)和后處理得到四醇ent-12。[α]24D-26.6°(c＝0.76，MeOH)。波譜數(shù)據(jù)與對(duì)映體12的數(shù)據(jù)一致。
D-1-O-丁酰-myo-肌醇3，4，5，6-四(二芐基)磷酸酯(20)將四醇12(63mg，206μmol)和四唑(174mg，2.47mmol)的乙腈(2毫升)溶液用二芐基N，N-二異丙基亞磷酰胺(834μl，2.47mmol)處理18小時(shí)，用過(guò)乙酸氧化，然后按照以上描述進(jìn)行后處理。通過(guò)制備HPLC(93％MeOH；40ml/分鐘；tR＝26.45分鐘)純化得到油狀的化合物20(165mg，60％)。[α]24D-4.9°(c＝1.08，CHCl3)。1H-NMR(CDCl3，360 MHZ)δ0.77(3H，t，J＝7.27Hz，CH3)，0.93(3H，t，J＝7.27Hz，CH3)，1.12-1.21(2H，m，CH2)，1.31-1.46(2H，m，CH2)，1.62(2H，tq，J＝7.26，7.26Hz，O(O)CCH2CH2CH3)，2.24(2H，t，J＝7.26Hz，O(O)CCH2CH2CH3)，3.26(1，H，dt，J＝8.23，5.81Hz，OCH2CH2CH2CH3)，3.37(1H，dd，J＝9.20，2.90Hz，H-1)，3.44(1H，dt，J＝8.23，7.26Hz，OCH2CH2CH2CH3)，4.35(1H，ddd，J＝9.69，2.42Hz，H-3)，4.53(1H，ddd，J＝9.69，9.69Hz，H-5)，4.68(1H，ddd，J＝9.69，9.69，9.20Hz，H-6)，4.91(1H，ddd，J＝9.84，9.69，9.69Hz，H-4)，4.92-5.02(16H，m，CH2Ph)，5.91(1H dd，J＝2.90，2.42Hz，H-2)，7.11-7.30(40H，m，CH2Ph，31P NMR(CDCl3，1H去偶，145.8MHZ)δ-1.81(1P，s)，-1.18(1P，s)，-0.72(1P，s)，-0.66(1P，s)。MSm/z(+ve離子FAB)1347[(M+H)+，8]；91[Bn+，100]。
D-3-O-丁基-2-O-丁酰-myo-肌醇1，4，5，6-四(二芐基)磷酸酯(ent-20)將四醇ent-12按照關(guān)于化合物20的描述進(jìn)行亞磷?；?phosphitylated)和氧化得到完全保護(hù)的磷酸酯ent-20。[α]24D+4.8°(c＝2.09，CHCl3)。波譜數(shù)據(jù)與對(duì)映體20的數(shù)據(jù)一致。
D-1-O-丁基-2-O-丁酰-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸酯(21)將化合物20(160mg，118μmol)按照一般方法中的描述用鈀炭(10％)氫化，冷凍干燥后得到固體狀標(biāo)題化合物21(73mg，99％)。[α]24D＝4.1°(c＝1.04，H2O，pH1.6)。1H-NMR(D2O，360MHZ)δ0.81(3H，t，J＝7.30Hz，CH3)，0.91(3H，t，J-7.30Hz，CH3)，1.22-1.30(2H，m，CH2)，1.42-1.49(2H，m，CH2)，1.62(2H，tq，J＝7.30，7.30Hz，O(O)CCH2CH2CH3)，2.36，2.54(2H，m，O(O)CCH2CH2CH3)，3.56(1H，dt，J＝9.49，6.46Hz，OCH2CH2CH2CH3)，3.63(1H，dt，J＝9.36，6.74Hz，OCH2CH2CH2CH3)，3.70(1H，dd，J＝9.74，2.62Hz，H-1)，4.27(1H，ddd，J＝9.36，9.36，9.36Hz，H-5)，4.31(1H，ddd，J＝9.74，9.74，2.25Hz，H-3)，4.39(IH，ddd，J＝9.74，9.36，9.36Hz，H-6)，4.49(1H，ddd，J-9.74，9.36，9.00Hz，H-4)，5.75(1H，dd，J＝2.62，2.25Hz，H-2)，31P NMR(D2O，1H去偶，145.8MHZ)δ-0.10(2P，s)，0.50(1P，s)，0.80(1P，s)。MSm/z(+ve離子FAB)627[(M+H)+，4]，71[Bt+，100]。MSm/z(-ve離子FAB)625[(M-H)+100]。
D-3-O-丁基-2-O-丁酰-myo-肌醇1，4，5，6-四磷酸酯(ent-21)將完全保護(hù)的底物ent-20進(jìn)行類似的反應(yīng)，冷凍干燥后得到游離酸ent-21。[α]24D＝4.1°(c＝0.78，H2O，pH1.6)。波譜數(shù)據(jù)與對(duì)映體21的數(shù)據(jù)一致。
D-1-O-丁基-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸酯(5)將化合物21(17mg，27μmol)用1M氫氧化鉀(260μl)處理將pH值調(diào)至12.8。將溶液室溫?cái)嚢?天。將反應(yīng)混合物直接倒在離子交換柱(Dowex 50 WX 8，Ht)上進(jìn)行純化。冷凍干燥得到化合物5(14mg，94％)。-[α]24D＝+4.9°(c＝0.53，H2O，pH1.6)。1H-NMR(D2O，360MHZ)δ0.78(3H，t，J＝7.44Hz，CH3)，1.26(2H，tq，J＝7.44，7.44Hz，CH2)，1.43-1.52(2H，m，CH2)，3.42(1H，dd，J＝9.60，2.78Hz，H-1)，3.52(1H，dt，J＝9.71，6.74Hz，OCH2CH2CH2CH3)，3.59(1H，dt，J＝9.81，6.74Hz，OCH2CH2CH2CH3)，4.16(1H，ddd，J＝9.60，9.60，2.78Hz，H-3)，4.21(1H，ddd，J＝9.37，9.37，9.37Hz，H-5)，4.35(1H，dd，J＝2.78，2.78Hz，H-2)，4.39(1H，ddd，J＝9.60，9.60，9.37Hz，H-6)，4.60(1H，ddd，J-9.60，9.60，9.37Hz，H-4)，31P NMR(D2O，1H去偶，145.8MHZ)δ0.10(2P，s)，0.70(1P，s)，1.05(1P，s)。MSm/z(-ve離子FAB)555[(M-H+)100]。
D-3-O-丁基-myo-肌醇1，4，5，6-四磷酸酯(ent-5)將底物ent-21的丁酰基按照上述方法水解得到四磷酸酯ent-5。-[α]24D＝+4.6°(c＝0.35，H2O，pH1.6)。波譜數(shù)據(jù)與對(duì)映體5的數(shù)據(jù)一致。
D-1-O-丁基-2-O-丁酰-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯(1)將DIEA(131μl，768μmol)和乙酰氧甲基溴(77μl，768μmol)按照一般方法的描述加入到化合物21(30mg，47μmol)的乙腈(2毫升)懸浮液中。通過(guò)制備HPLC(73％MeOH；37.5ml/分鐘；tR＝19.30分鐘)純化得到糖漿狀的化合物1(31mg，55％)。-[α]24D+2.0°(c＝1.00，甲苯)。1H-NMR([D8]甲苯，360MHZ)δ0.85(3H，t，J-7.48Hz，CH3)，0.97(3H，t，J＝7.48Hz，CH3)，1.39(2H，tq，J＝7.48，7.28Hz，CH2)，1.51-1.67(4H，m，2xCH2)1.75-1.75(24H，8s，8x OAc)，2.08-2.13(2H，m，CH2)，3.07(1H，dd，J-9.45，2.76Hz，H-1)，3.46(1H，dt，J＝7.68，5.91Hz，OCH2CH2CH2CH3)，3.62(1H，dt，J＝7.74，7.68Hz，OCH2CH2CH2CH3)，4.62(1H，ddd，J＝9.84，9.84，2.76Hz，H-3)，4.67(1H，ddd，J＝9.84，9.84，9.45Hz，H-5)，4.80(1H，ddd，J＝9.45，9.45，9.16Hz，H-6)5.04(1H，ddd，J-9.84，9.84，9.45Hz，H-4)，5.63-5.96(16H，m，CH2OAc)，6.00(1H，dd，J＝2.76，2.76Hz，H-2)。31P NMR([D8]-甲苯，1H去偶，145.8MHZ)δ-5.14(1P，s)，-4.49(1P，s)，-4.06(1P，s)，-3.99(1P，s)。MSm/z(+ve離子FAB)1131[(M-CH2OAc+2H)+，58]，98.7[((M-3 CH2OAc-+4H)，100]，MSm/z(-ve離子FAB)1129[(M-CH2OAc+)-38]，241[OP(OCH2OAc)-2，100]。
D-3-O-丁基-2-O-丁酰-myo-肌醇1，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯(ent-1)將磷酸酯ent-21按照以上描述進(jìn)行烷基化得到八(乙酰氧甲基)酯ent-1。[α]24D+1.9°(c＝1.46，甲苯)。波譜數(shù)據(jù)與對(duì)映體1的數(shù)據(jù)一致。
D-1-O-烯丙基-3，4，5，6-四-O-芐基-myo-肌醇(13)將干燥的9(690mg，1.28mmol)和無(wú)水二丁基氧化錫(324mg，1.3mol)在無(wú)水甲苯(150毫升)中、在裝有活化分子篩(3)的Soxhlet裝置中加熱回流20小時(shí)。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫并減壓蒸發(fā)至干。向殘余的油中加入CsF(388mg，2.56mol)，然后將混合物置于高真空下2小時(shí)。將殘余的糖漿在氬氣下溶于無(wú)水DMF(10毫升)并加入1-烯丙基碘(329μl，3.58mmol)。將溶液攪拌20小時(shí)后，HPLC分析(95％MeOH；1.5ml/分鐘；tR＝3.20分鐘)表明無(wú)進(jìn)一步的反應(yīng)。高真空蒸除過(guò)量的1-烯丙基碘和DMF。將粗產(chǎn)物通過(guò)制備HPLC進(jìn)行色譜分離(90％MeOH；40ml/分鐘；tR＝26.15分鐘)得到固體狀的化合物13(448mg，60％)。Mp71-72℃(甲醇)。-[α]24D+4.6°(c＝0.98，CHCl3)。1H-NMR(CDCl3，360MHZ)δ3.30(1H，dd，J-973Hz，3.10Hz，H-1)，3.41(1H，dd，J＝9.73，2.65，H-3)，3.44(1H，dd，J＝9.51，9.51，H-5)，3.95(1H，dd，J-9.73，9.51Hz，H-6)，3.99(1H，dd，J＝9.73，2.51Hz，H-4)，4.18(1H，dd，J＝1.65，1.33Hz，OCH2CH2CH2)，4.19(1H，dd，J＝2.65，1.33Hz，OCH2CHCH2)，4.20(1H，dd，J-3.10，2.65Hz，H-2)，4.71-4.92(8H，m，CH2Ph)，5.19(1H，ddt，J＝11.50，1.33，1.33Hz，OCH2CHCH2)，5.29(1H，ddt，J-16.91，2.65，1.33Hz，OCH2CHCH2)，5.94(1H，dddd，J＝16.91，11.50，1.33，1.33Hz，OCH2CHCH2)，7.26-7.37(20H，m，CH2Ph)。MSm/z(+ve離子FAB)581[(M+H+)+，1]，91[Bn+，100]。MSm/z(ve離子FAB)580[(M-H)+6]489[(M-Bn+)-，100]。
D-3-O-烯丙基-1，4，5，6-四-O-芐基-myo-肌醇(ent-13)將二醇ent-9進(jìn)行類似的反應(yīng)和后處理得到化合物ent-13。-[α]24D+3.9°(c＝0.82，CHCl3)。波譜數(shù)據(jù)與對(duì)映體13數(shù)據(jù)一致。
D-1-O-烯丙基-3，4，5，6-四-O-芐基-2-O-丁基-myo-肌醇(14)室溫及黑暗中，將氫化鈉(46mg，1.92mmol)加入到攪拌中的13(445mg，767μmol)的無(wú)水DMF(5毫升)溶液中。將混合物攪拌5小時(shí)，然后加入1-丁基碘(306μl，2.68mmol)。將該懸浮液于80℃攪拌18小時(shí)，HPLC(95％MeOH；1.5ml/分鐘；tR＝7.35分鐘)證實(shí)有產(chǎn)物形成。減壓蒸除過(guò)量的1-丁基碘和DMF。將混合物溶于叔丁基甲基醚(40毫升)，然后依次用磷酸鹽緩沖液(20毫升)、連二亞硫酸鈉水溶液(20毫升)和鹽水(20毫升)各洗滌一次。將有機(jī)層用硫酸鈉干燥，過(guò)濾并蒸除醚得到油。將粗品油通過(guò)制備HPLC(93％MeOH；40ml/分鐘；tR＝37.10分鐘)純化得到油狀的標(biāo)題化合物14(458mg，94％)。-[α]24D+1.5°(c＝2.29，CHCl3)。1H NMR(CDCl3，360 MHZ)δ0.95(3H，t，J＝7.27Hz，CH3)，1.39-1.49(2H，m，CH2)，1.58-1.66(2H，m，CH2)，3.24(1H，dd，J＝9.69，2.42Hz，H-1)，3.36(1H，dd，J＝9.93，2.42，H-3)，3.46(1H，dd，J＝9.45，9.45，H-5)，3.78(2H，t，J＝6.54Hz，OCH2CH2CH2CH3)，3.89(1H，dd，J＝2.42，2.42Hz，H-2)，3.98(1H，dd，J-9.45，9.45Hz，H-6)，4.03(1H，dd，J-9.45，9.45Hz，H-4)，4.15(1H，dd，J-5.81，1.00Hz，OCH2CHCH2)，4.16(1H，dd，J-6.06，1.00Hz，OCH2CHCH2)，4.72，4.95(8H，m，CH2Ph)，5.19(1H，ddt，J-10.66，1.45，1.45Hz，OCH2CHCH2)，5.32(1H，ddt，J-16.95，1.45，1.45Hz，OCH2CHCH2)，5.95(1H，dddd，J-16.95，10.66，1.45，1.45Hz，OCH2CHCH2)，7.26-7.40(20H，m，CH2Ph)。MSm/z(+ve離子FAB)637[(M+H)+，1]，91[Bn+，100]。
D-3-O-烯丙基-1，4，5，6-四-O-芐基-2-O-丁基-myo-肌醇(ent-14)將化合物ent-13進(jìn)行類似的反應(yīng)和后處理得到化合物ent-14。[α]24D-1.6°(c＝1.87，CHCl3)。波譜數(shù)據(jù)與對(duì)映體14的數(shù)據(jù)一致。
D-3，4，5，6-四-O-芐基-2-O-丁基-myo-肌醇(15)在將14的50％乙醇(90ml)懸浮液在回流下加熱7h之前，向其中中加入三(三苯基膦)-氯化銠(I)(140mg，150μmol)和DIEA(25μl，140μmol)。在加入三氟乙酸(7ml)之前，將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，并且在HPLC(90％MeOH；1.5ml/min；tR＝4.03min)顯示無(wú)起始原料以后，將該溶液繼續(xù)攪拌24h。然后用2N NH4OH溶液中和。在減壓下蒸發(fā)除去乙醇得到糖漿。將該糖漿溶解于叔丁基甲基醚(40ml)中，順序用磷酸鹽緩沖液(20ml)和鹽水各洗滌一次。有機(jī)層在硫酸鈉上干燥，過(guò)濾，蒸除醚得到油。粗品油用制備HPLC(92％MeOH；40ml/min；tR-27.40min)純化得到固體狀15(275mg，74％)。-[α]24D+24.6°(c＝0.97，CHCl3)。1H NMR(CDCl3，360MHZ)δ0.92(3H，t，J-7.36Hz，CH3)，1.32-1.43(2H，m，CH2)，1.53-1.61(2H，m，CH2)，3.41(1H，dd，J＝9.96，2.60Hz，H-1)，3.45(1H，dd，J-9.25，2.60Hz，H-3)，3.46(1H，dd，J-9.31，9.31Hz，H-5)，3.61(1H，dt，J-9.09，6.49Hz，OCCH2CH2CH3)，3.74(1H，dd，J-9.52，9.31Hz，H-4)，3.86(1H，dd，J＝2.60，2.60Hz，H-2)，3.95(1H，dt，J-8.95，6.49Hz，OCCH2CH2CH3)，3.98(1H，dd，J-9.96，9.31，Hz，H-6)，4.79-4.94(8H，m，CH2Ph)，7.26-7.36(20H，m，CH2Ph)。MSm/z(ve離子FAB)597[(M+H)+，1]，91[Bn+，100]。MSm/z(-ve離子FAB)595[(M-H+)-，100]，[(M-Bn+)-，20]。C計(jì)算值76.48；實(shí)測(cè)值76.52；H計(jì)算值7.43，實(shí)測(cè)值7.40。
D-1，4，5，6-四-O-芐基-2-O-丁基-myo-肌醇(ent-15)將二醇ent-15進(jìn)行類似的反應(yīng)和后處理得到化合物ent-15。[α]24D+24.9°(c＝1.00，CHCl3)。波譜數(shù)據(jù)與對(duì)映體15的數(shù)據(jù)一致。
D-3，4，5，6-四-O-芐基-2-O-丁基-1-O-丁酰myo-肌醇(16)室溫下用丁酸酐(158μl，447μmol)和DMAP(38mg，29μmol)處理在無(wú)水吡啶(4ml)中的乙醇15(178mg，298μmol)并攪拌。當(dāng)HPLC分析(90％MeOH；1.5ml/分鐘；tR＝6.40分鐘)顯示無(wú)起始材料(18h)時(shí)，減壓蒸餾反應(yīng)混合物得到粗品油。為了除去殘余的吡啶，將該油溶解在辛烷中并蒸發(fā)三次。殘余物溶解在叔丁基甲基醚(20ml)中，并用磷酸鹽緩沖液(10ml)、碳酸氫鈉(10ml)、硫酸氫鈉(10ml)各洗滌一次，再用磷酸鹽緩沖液(10ml)洗滌一次，然后用鹽水(10ml)洗滌。將有機(jī)層在硫酸鈉上干燥，過(guò)濾。蒸除溶劑得到純的油狀16(176mg，89％)。-[α]24D-15.4°(c＝1.00，CHCl3)。1H NMR(CHCl3，360MHZ)；δ0.91(3H，t，J＝7.21Hz，CH3)，0.93(3H，t，J＝7.21Hz，CH3)，1.35-1.56(4H，m，2X CH2)，1.58-1.72(2H，m，CH2)，2.21-2.26(2H，m，CH2)，3.48(1H，dd，J-9.61，2.40Hz，H-3)，3.51(1H，dd，J-9.66，9.37，Hz，H-5)，3.52(2H，tq，J-8.97，6.25，Hz，O(O)CCH2CH2CH3)，3.76(2H，t，J-9.13，6.25，Hz，O(O)CCH2CH2CH3)，3.94(1H，dd，J-2.40，2.40Hz，H-2)，4.00(1H，dd，J＝9.61，9.61Hz，H-4)，4.02(1H，dd，J＝9.85，9.31Hz，H-6)，4.73(1H，dd，J＝9.85，2.40Hz，H-1)，4.65-4.93(8H，m，CH2Ph)，7.25-7.34(20H，m，CH2Ph)。MSm/z(+ve離子FAB)665[(M+H)+，1]，91[Bn+，100]。
D-1，4，5，6-四-O-芐基-3-O-丁基-2-O-丁酰myo-肌醇(ent-16)將化合物ent-15進(jìn)行上述對(duì)另外的對(duì)映體的丁?；玫交衔飁nt-16。-[α]24D+15.9°(c＝1.10，CHCl3)。波譜數(shù)據(jù)與對(duì)映體16的數(shù)據(jù)一致。
D-2-O-丁基-1-O-丁酰-myo-肌醇(17)按一般步驟用鈀炭(10％)在氫氣下對(duì)化合物16(170mg，255μmol)進(jìn)行氫化，冷凍干燥后得到固體狀的四醇17(75mg，97％)。[α]24D+41.9°(c＝1.10，MeOH)。1H NMR([D6]DMSO，360MHZ)；δ0.87(3H，t，J＝7.16Hz，CH3)，0.89(3H，t，J＝7.33Hz，CH3)，1.28-1.48(4H，m，2x CH2)，1.52-1.62(2H，m，CH2)，2.24-2.36(2H，m，CH2)，2.96(1H，dd，J＝9.21，9.21Hz，H-5)，3.26(1H，dd，J-9.55，2.39Hz，H-3)，3.35(1H，dd，J＝9.55，9.21Hz，H-4)，3.44(1H，dt，J＝9.43，6.39Hz，OCH2CH2CH2CH3)，3.52(1H，dd，J＝10.23，9.21Hz，H-6)，3.57(1H，dd，J＝2.39，2.39Hz，H-2)，4.47(2H，dt，J＝9.21，6.39Hz，OCCH2CH2CH3)，4.47(1H，dd，J＝10.23，2.39Hz，H-1)，4.71(2H，s(br)，OH)，4.82(1H，s(br)，OH)，4.86(1H，s(br)，OH)，MSm/z(+ve離子FAB)307[(M+H)+，100]，MSm/z(-ve離子FAB)305[(M+H)+，34]，87(Bto-，100)。C計(jì)算值54.89；實(shí)測(cè)值54.90；H計(jì)算值8.55，實(shí)測(cè)值8.51。
D-2-O-丁基-3-O-丁酰-myo-肌醇(ent-17)對(duì)全面進(jìn)行了保護(hù)的化合物ent-16進(jìn)行類似的反應(yīng)和后處理，得到四醇ent-17。-[α]24D-40.5°(c＝1.00，MeOH)。波譜數(shù)據(jù)與對(duì)映體17的數(shù)據(jù)一致。
D-2-O-丁基-1-O-丁酰-myo-肌醇3，4，5，6-四(二芐基)磷酸酯(22)將化合物17(55mg，178μmol)和四唑(152mg，2.15mmol)的乙腈(2毫升)溶液用二芐基N，N-二異丙基亞磷酰胺(726μl，2.15mmol)處理22小時(shí)，用過(guò)乙酸氧化，然后按照以上描述進(jìn)行后處理。通過(guò)制備HPLC(92％MeOH；40ml/分鐘；tR＝20.00分鐘)純化得到油狀的化合物22(192mg，80％)。[α]24D-3.4°(c＝1.02，CHCl3)。1H-NMR(CDCl3，360MHZ)δ0.79(3H，t，J＝7.30Hz，CH3)，0.86(3H，t，J＝7.30Hz，CH3)，1.23-1.38(2H，m，CH2)，1.41-1.57(4H，m，2x CH2)，2.01-2.17(2H，m，CH2)，3.45(1H，dt，J＝8.52，6.63Hz，OCH2CH2CH2CH3)，3.60(1H，dt，J＝8.52，7.74Hz，OCH2CH2CH2CH3)，4.13(1H，dd，J＝2.52，2.52Hz，H-2)，4.22(1H，ddd，J＝9.73，9.73，2.52Hz，H-3)，4.43(1H，ddd，J＝9.51，9.51Hz，H-5)，4.44(1H，ddd，J＝9.51，9.51，9.28Hz，H-6)，4.89(1H，ddd，J-9.73，9.73，9.51Hz，H-4)，4.91-5.08(17H，m，CH2Ph，H-1)，7.13-7.27(40H，m，CH2Ph)。31P NMR(CDCl3，1H去偶，145.8MHZ)δ-1.64(1P，s)，-1.42(1P，s)，-0.76(1P，s)，-0.53(1P，s)。MSm/z(+ve離子FAB)1347[(M+H)+，33]；71[Bt-，100]。MSm/z(-ve離子FAB)1255[(M-Bn+)-，16]；277[OPO(OBn)2-，100]。
D-2-O-丁基-3-O-丁酰-myo-肌醇1，4，5，6-四(二芐基)磷酸酯(ent-22)將ent-12按照關(guān)于化合物22的描述進(jìn)行亞磷?；?phosphitylated)和氧化得到完全保護(hù)的磷酸酯ent-22。[α]24D+3.1°(c＝1.10，CHCl3)。波譜數(shù)據(jù)與對(duì)映體22的數(shù)據(jù)一致。
D-2-O-丁基-1-O-丁酰-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸酯(23)。按一般步驟用鈀炭(10％)在氫氣下對(duì)化合物22(190mg，141μmol)進(jìn)行氫化，冷凍干燥后得到固體狀的題述化合物23(87mg，99％)。-[α]24D9.9°(c＝1.10，H2O，pH1.6)。1H NMR(D2O，360MHZ)；δ0.75(3H，t，J-7.15Hz，CH3)，0.76(3H，t，J＝7.31Hz，CH3)，1.19-1.29(2H，m，CH2)，1.38-1.53(4H，m，2x CH2)，2.30(2H，t，J-7.47，O(O)CCH2CH2CH3)，3.58(1H，dt，J-9.64，6.44Hz，OCH2CH2CH2CH3)，3.67(1H，dt，J-9.64，6.36Hz，OCH2CH2CH2CH3)，4.01(1H，dd，J＝2.54，2.23Hz，H-2)，4.22(1H，ddd，J-9.22，9.22，8.90Hz，H-5)，4.23(1H，ddd，J＝9.54，9.54，2.54Hz，H-3)，4.43(1H，ddd，J＝9.90，9.22Hz，H-6)，4.48(1H，ddd，J-9.54，9.54，9.54Hz，H-4)，4.94(1H，dd，J＝9.90，2.23Hz，H-1)。31P NMR(D2O，1H去偶，145.8Hz)，δ-0.20(2P，s)，0.40(1P，s)，0.50(1P，s)。MSm/z(+ve離子FAB)627[(M+H)+，8]，71[Bt+，100]。MSm/z(-ye離子FAB)625[(M-H)+，35]，79[OP(O)2，100]。
D-2-O-丁基-3-O-丁酰-myo-肌醇1，4，5，6-四磷酸酯(ent-23)對(duì)全面進(jìn)行了保護(hù)的化合物ent-23進(jìn)行類似的反應(yīng)和后處理，凍干后得到游離酸ent-23。[α]24D-9.7°(c＝1.00，H2O，pH1.6)。波譜數(shù)據(jù)與對(duì)映體23的數(shù)據(jù)一致。
D-2-O-丁基-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸酯(6)。用1M KOH(453μl)處理化合物23(33mg，52μmol)，將其pH值調(diào)整到12.8。溶液在室溫下攪拌2天。將反應(yīng)混合物直接傾入離子交換柱(Dowex 50WX 8，H+)進(jìn)行純化。凍干給出化合物6(27mg，93％)。--[α]24D-1.1°(c＝0.89，H2O，pH1.6)。1H NMR(D2O，360MHZ)；δ0.77(3H，t，J-7.37Hz，CH3)，1.21-1.31(2H，m，CH2)，1.39-1.52(2H，m，CH2)，3.63(1H，dt，J＝9.30，6.18Hz，OCH2CH2CH2CH3)，3.67(1H，dd，J＝10.00，2.63Hz，H-1)，3.75(1H，dt，J-9.30，6.56Hz，OCH2CH2CH2CH3)，3.94(1H，dd，J-2.63，2.37Hz，H-2)，4.13(1H，ddd，J-9.21，9.21，9.21Hz，H-5)，4.17(1H，ddd，J-9.47，9.47，2.37Hz，H-3)，4.30(1H，ddd，J-9.47，9.47，9.21Hz，H-4)，4.43(1H，ddd，J-10.00，9.73，9.21Hz，H-6)。31P NMR(D2O，1H去偶，145.8MHZ)，δ-0.18(1P，s)，0.55(2P，s)，0.55(2P，s)，0.95(1P，s)。MSm/z(+ve離子FAB)557[(M+H+)-，100]。MSm/z(ve離子FAB)555[(M-H)-，100]。
D-2-O-丁基-myo-肌醇1，4，5，6-四磷酸酯(ent-6)通過(guò)上述類似的方法對(duì)底物ent-23的丁酰基進(jìn)行氫化，給出四磷酸酯ent-6。-[α]24D+1.6°(c＝0.60，H2O，pH1.6)。波譜數(shù)據(jù)與對(duì)映體6的數(shù)據(jù)一致。
D-2-O-丁基-1-O-丁酰-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯(2)將DIEA(182μl，1.06mmol)和乙酰氧甲基溴(107μl，1.06mmol)按照一般方法的描述加入到化合物23(37mg，59μmol)的乙腈(2毫升)懸浮液中。通過(guò)制備HPLC(72％MeOH；40ml/分鐘；tR＝21.12)純化得到糖漿狀的化合物2(33mg，46％)。[α]24D+1.1°(c＝1.07，甲苯)。1H-NMR([D8]甲苯，360 MHZ)δ0.93(3H，t，J＝7.28Hz，CH3)，0.97(3H，t，J-7.48Hz，CH3)，1.39-1.49(2H，m，CH2)，1.51-1.60(2H，m，CH2)，1.77-1.86(24H，8 s，8x OAc)，2.39(1H，dt，J-16.67，7.38Hz，CH2)，2.63(1H，dt，J＝16.67，7.68，CH3)，3.78(1，H，dt，J＝9.45，6.30Hz，OCH2CH2CH2CH3)，3.87(1H，dt，J＝9.06，6.30Hz，OCH2CH2CH2CH3)，4.40(1H，dd，J＝2.36，2.36Hz，H-2)，4.68(1H，ddd，J＝9.55，9.55，2.36Hz，H-3)，4.79(1H，ddd，J＝9.55，9.45，9.45Hz，H-5)，5.03(1H，ddd，J＝9.55，9.55，9.55Hz，H-4)，5.09(1H，ddd，J-10.04，9.55，9.55Hz，H-6)，5.21(1H，dd，J-10.04，2.36Hz，H-1)，5.58-5.93(16H，m.CH2OAc)。31P NMR([D8]-甲苯，1H去偶，145.8MHZ)δ-4.42(1P，s)，-3.98(1P，s)，-3.48(2P，s)。MSm/z(+ve離子FAB)1131[(M-CH2OAc++2H)，44]，987[(M-3CH2OAc++4H)+，100]，MSm/z(-ve離子FAB)1129[(M-CH2OAc+)18]，241[OP(OCH2OAc)2，100]。
D-2-O-丁基-3-O-丁酰-myo-肌醇1，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯(ent-2)將磷酸酯ent-23按照以上描述進(jìn)行烷基化得到八(乙酰氧甲基)酯ent-2。[α]24D1.9°(c＝0.60，甲苯)。波譜數(shù)據(jù)與對(duì)映體2的數(shù)據(jù)一致。
D-3，4，5，6-四-O-芐基-1，2-二-O-丁基-myo-肌醇(18)室溫及黑暗中，將氫化鈉(13mg，522μmol)加入到攪拌中的9(94mg，174μmol)的無(wú)水DMF(3毫升)溶液中。將混合物攪拌5小時(shí)，然后加入1-丁基碘(120μl，1.04mmol)。將該懸浮液于80℃攪拌36小時(shí)，HPLC(95％MeOH；1.5ml/分鐘；tR＝7.26)證實(shí)有產(chǎn)物形成。減壓蒸除過(guò)量的1-丁基碘和DMF。將混合物溶于叔丁基甲基醚(30毫升)，然后依次用磷酸鹽緩沖液(10毫升)、連二亞硫酸鈉水溶液(10毫升)和鹽水(10毫升)各洗滌一次。將有機(jī)層用硫酸鈉干燥，過(guò)濾并蒸除醚得到油。將粗品油通過(guò)制備HPLC(95％MeOH；40ml/分鐘；tR＝27.24分鐘)純化得到油狀的標(biāo)題化合物18(100mg，88％)。[α]24D+1.3°(c＝1.00，CHCl3)。1H NMR(CDCl3，360 MHZ)δ0.092(3H，t，J＝7.52Hz，CH3)，1.36-1.47(4H，m，2x CH2)，1.55-1.63(4H，m，2x CH2)，3.14(1H，dd，J-9.57，2.28Hz，H-3)，3.34(1H，dd，J-10.02，2.28，H-1)，3.43(1H，dd，J＝9.34，9.34，H-5)，3.52(1H，dt，J＝9.11Hz，6.60Hz，OCCH2CH2CH3)，3.60(1H，dt，J＝9.11，6.60Hz，OCCH2CH2CH3)，3.75(2H，t，J-6.60Hz，OCCH2CH2CH3)，3.89(1H，dd，J＝2.28，2.28Hz，H-2)，3.92(1H，dd，J-9.57，9.34Hz，H-4)，4.00(1H，dd，J＝10.02，9.34Hz，H-6)，4.71-4.93(8H，m，CH3Ph)，7.24-7.39(20H，m，CH2Ph)。MSm/z(+ve離子FAB)653[(M+H)+，1]，91[Bn+，100]。MSm/z653.383(M+H)+C42H53O6計(jì)算值653.384)。
D-1，4，5，6-四-O-芐基-2，3-二-O-丁基-myo-肌醇(ent-18)將化合物ent-9進(jìn)行類似的反應(yīng)和后處理得到化合物ent-18。[α]24D1.2°(c＝2.20，CHCl3)。波譜數(shù)據(jù)與對(duì)映體18的數(shù)據(jù)一致。
D-1，2-二-O-丁基-myo-肌醇(19)將化合物18(100mg，153μmol)按照一般方法中的描述用鈀炭(10％)在氫氣下氫化，冷凍干燥后得到固體狀的四醇19(40mg，92％)。(從乙醇中)[α]24D+18.7°(c＝0.80，MeOH)。1H-NMR([D6]DMSO，360MHZ)δ0.89(3H，t，J＝7.52Hz，CH3)，0.91(3H，t，J＝7.38Hz，CH3)，1.24-1.39(4H，m，CH2)，1.41 1.53(4H，m，CH2)，2.88(1H，dd，J＝9.55，2.63Hz，H-3)，2.93(1H，dd，J＝9.93，2.63Hz，H-1)，3.14(1H，dt，J＝9.51，6.42Hz，OCCH2CH2CH2CH3)，3.31(1H，dd，J＝9.52，9.52Hz，H-5)，3.39-3.67(6H，m，3x OCCH2CH2CH3，H-2，H-4，H-6)，4.43(1H，s，OH)，4.52(1H，S，OH)，4.59(2H，s(br)，OH)，MSm/z(+ve離子FAB)293[(M+H)+，100]。MSm/z(-ve離子FAB)291[(M-H+)，100]。
D-2，3-二-O-丁基-myo-肌醇(ent-19)將完全保護(hù)的化合物ent-18進(jìn)行類似的反應(yīng)和后處理得到四醇ent-19。[α]24D-18.9°(c＝1.36，MeOH)。波譜數(shù)據(jù)與對(duì)映體19的數(shù)據(jù)一致。
D-1，2-二-O-丁基-myo-肌醇3，4，5，6-四(二芐基)磷酸酯(24)將化合物19(40mg，137μmol)和四唑(115mg，1.64mmol)的乙腈(2ml)溶液用二芐基N，N-二異丙基亞磷酰胺(552μl，1.64mmol)處理18小時(shí)，用過(guò)乙酸氧化，然后按照以上描述進(jìn)行后處理。通過(guò)制備HPLC(93％MeOH；40ml/分鐘；tR＝26.05分鐘)純化得到油狀的化合物24(133mg，73％)。[α]24D-2.3°(c-1.00，CHCl3)。1H-NMR(CDCl3，360MHZ)δ0.79(3H，t，J＝7.31Hz，CH3)，0.86(3H，t，J＝7.31Hz，CH3)，1.13-1.38(4H，m，2x CH2)，1.41-1.56(4H，m，2x CH2)，3.24(1H，dd，J＝9.89，2.15Hz，H-1)，3.36(1H，dt，J＝8.31，7.41Hz，OCH2CH2CH2CH3)，3.41(1H，dt，J＝8.31，5.87Hz，OCH2CH2CH2CH3)，3.60(1H，dt，J＝8.88，6.55Hz，OCH2CH2CH2CH3)，3.71(1H，dt，J＝8.88，6.55Hz，OCH2CH2CH2CH3)，4.16(1H，ddd，J＝9.89，9.89，2.47Hz，H-3)，4.21(1H，dd，J＝2.47，2.15Hz，H-2)，4.48(1H，ddd，J＝9.67，9.67，9.67Hz，H-5)，4.79(1H，ddd，J＝9.89，9.67，9.67Hz，H-6)，4.95(1H，ddd，J＝9.89，9.67，9.67Hz，H-4)，4.96-5.09(16H，m，CH2Ph)，7.12-7.32(40H，m，CH2Ph)。31P NMR(CDCl3，1H去偶，145.8MHZ)δ-1.82(1P，s)，-1.59(1P，s)，-0.81(1P，s)，-0.68(1P，s)。MSm/z(+ve離子FAB)1333[(M+H)+，2]，91[Bn+，100]。MSm/z(-ve離子FAB)1241[(M-Bn-)-，8]，277[OPO(OBn)-2，100]。
D-2，3-二-O-丁基-myo-肌醇1，4，5，6-四(二芐基)磷酸酯(ent-24)將ent-19按照關(guān)于化合物24的描述進(jìn)行亞磷?；?phosphitylated)和氧化得到完全保護(hù)的磷酸酯ent-24。[α]24D+2.5°(c＝1.15，CHCl3)。波譜數(shù)據(jù)與對(duì)映體24的數(shù)據(jù)一致。
D-1，2-二-O-丁基-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸酯(7)將化合物24(134mg，100μmol)按照一般方法中的描述用鈀炭(10％)在氫氣下氫化，冷凍干燥后得到固體狀的標(biāo)題化合物7(52mg，87％)。(c＝1.10，H2O，pH1.6)。1H-NMR(D2O，360MHZ)δ0.70(3H，t，J＝7.37Hz，CH3)，0.71(3H，t，J＝7.37Hz，CH3)，1.13-1.24(4H，m，2xCH2)，1.32-1.46(4H，m，2x CH2)，3.39(1H，dd，J＝9.47，2.33Hz，H-1)，3.45(1H，dt，J＝8.59，8.16Hz，OCH2CH2CH2CH3)，3.51(1H，dt，J＝8.59，5.79Hz，OCH2CH2CH2CH3)，3.56(1H，dt，J＝9.47，6.31Hz，OCH2CH2CH2CH3)，3.65(1H，dt，J＝9.47，6.84Hz，OCH2CH2CH2CH3)，4.02-4.08(2H，m，H-2，H-3)，4.11(1H，ddd，J＝9.47，9.47，9.47Hz，H-5)，4.27(1H，ddd，J＝9.47，9.47，9.47Hz，H-4)，4.39(1H，ddd，J＝9.47，9.21，9.21Hz，H-6)。31P NMR(D2O，1H去偶，145.8MHZ)δ-0.69(1P，s)，-0.41(2P，s)，-0.12(1P，s)。MSm/z(+ve離子FAB)613[(M+H)+，15]，81[PO(OH)-2，100]。MSm/z(-ve離子FAB)611[(M-H+)-，90]79[OP(O)-2，100]。
D-2，3-二-O-丁基-myo-肌醇1，4，5，6-四磷酸酯(ent-7)將完全保護(hù)的底物ent-24進(jìn)行類似的反應(yīng)得到游離酸ent-7。(c＝1.00，H2O，pH1.6)。波譜數(shù)據(jù)與對(duì)映體7的數(shù)據(jù)一致。
D-1，2-二-O-丁基-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯(3)將DIEA(187μl，1.00mmol)和乙酰氧甲基溴(111μl，1.00mmol)按照一般方法的描述加入到化合物7(34mg，55μmol)的乙腈(2ml)懸浮液中。通過(guò)制備HPLC(73％MeOH；40ml/分鐘；tR＝20.40)純化得到糖漿狀的化合物3(42mg，65％)。[α]24D-2.3°(c＝1.03，甲苯)。1H-NMR([D8]甲苯，360MHZ)δ0.92(3H，t，J＝7.28Hz，CH3)，0.99(3H，t，J＝7.48Hz，CH3)，1.33-1.47(4H，m，2x CH2)，1.48-1.54(2H，m，CH2)，1.61-1.69(2H，m，CH2)，1.77-1.87(24H，8s，8xOAc)，3.11(1H，dd，J＝9.84，2.36Hz，H-1)，3.46(1H，dt，J＝8.79，7.28Hz，OCH2CH2CH2CH3)，3.56(IH，dt，J＝8.79，7.28Hz，OCH2CH2CH2CH3)，3.84(1H，t，J＝6.50Hz，2x OCH2CH2CH2CH3)，4.34(1H，dd，J＝2.36，2.36Hz，H-2)，4.49(1H，ddd，J＝9.45，9.45，2.36Hz，H-3)，4.68(1H，ddd，J＝9.65，9.65，9.65Hz，H-5)，4.90(1H，ddd，J＝9.65，9.45，9.45Hz，H-4)，5.06(1H，ddd，J＝9.84，9.65，9.65Hz，H-6)，5.68-5.96(16H，m.CH2OAc)。31P NMR([D8]-甲苯，1H去偶，145.8MHZ)δ-5.12(1P，s)，-3.98(1P，s)，-3.69(1P，s)，-3.42(1P，s)。MSm/z(+ve離子FAB)1189[(M+H)+，3]，1045[(M-2xCH2OAc++3H)+，100]，MSm/z(-ve離子FAB)1116[(M-CH2OAc+)-，30]，241[OP(OCH2OAc)-2，100]。
D-2，3-二-O-丁基-myo-肌醇1，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯(ent-3)將磷酸酯ent-7按照以上描述進(jìn)行烷基化得到八(乙酰氧甲基)酯ent-3。[α]24D+2.5°(c＝1.10，甲苯)。波譜數(shù)據(jù)與對(duì)映體3的數(shù)據(jù)一致。
rac-1，2-二-O-環(huán)亞己基-myo-肌醇3，4，5，6-四(二芐基)磷酸酯(rac-26)將rac-25(130mg，500μmol)和四唑(350mg，5.00mmol)的乙腈(6ml)溶液用二芐基N，N-二異丙基亞磷酰胺(1.68ml，5.00mmol)處理26小時(shí)，用過(guò)乙酸氧化，然后按照以上描述進(jìn)行后處理。通過(guò)制備HPLC(93％MeOH；40ml/分鐘；tR＝22.35分鐘)純化得到油狀的化合物rac-26(306mg，47％)。1H-NMR(CDCl3，360MHZ)δ1.20-1.80(10H，m，CH2(環(huán)己基))，4.26(1H，dd，J＝6.01，6.01Hz，H-1)，4.66(1H，dd，J＝6.01，3.43Hz，H-2)，4.76-4.81(2H，m，H-3，H-5)4.92-5.17(18H，m，CH2Ph，H-4，H-6)，7.20-7.40(40H，m，CH2Ph)。31P NMR(CDCl3，1H去偶，145.8MHZ)δ-1.69(1P，s)，-1.59(1P，s)，-1.52(1P，s)，-1.00(1P，s)。MSm/z(-ve離子FAB)1209[(M-Bn+)-，1]，277[OPO(OBn)-2，100]。
rac-1，2-二-O-環(huán)亞己基-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸酯(rac-8)。在將無(wú)水的乙基-二異丙基胺(95μl，560μmol)加入之前，將乙基-二異丙基氨基鹽rac-26(91mg，70μmol)溶解在乙醇(4ml)中，接著是鈀炭(10％)(84mg，840μmol)。在氫氣的氣氛下將該溶液在室溫下攪拌6天，濾出催化劑，凍干濾液得到標(biāo)題化合物rac-8(108mg，96％)。1H NMR，(D2O，360MHZ)δ1.30-1.90(10H，m，CH2(環(huán)己基))，(1H，ddd，J＝9.08，9.08，8.23Hz，H-5)，4.18-4.26(2H，m，H-1，H-3)，4.32-4.40(2H，m，H-4，H-6)，4.55(1H，dd，J＝1.26，3.69Hz，H-2)。31P-NMR(D2O，1H去偶，145.8MHZ)δ-0.24(1P，s)，0.10(1P，s)，0.85(1P，s)，0.90(1P，s)。
rac-1，2-二-O-環(huán)亞己基-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯(rac-4)將DIEA(205μl，1.20mmol)和乙酰氧甲基溴(120μl，1.20mmol)按照一般方法的描述加入到化合物rac-8(108mg，66μmol)的乙腈(2ml)懸浮液中。通過(guò)制備HPLC(68％MeOH；40ml/分鐘；tR＝19.35)純化得到糖漿狀的化合物rac-4(50mg，65％)。1H-NMR([D8]甲苯，360MHZ)δ1.20-1.75(10H，m，CH2(環(huán)己基))，1.811.92(24H，8s，8x OAc)，4.28(1H，dd，J＝5.51，5.51Hz，H-1)，4.77(1H，dd，J＝5.51，3.54Hz，H-2)，4.91-4.99(2H，m，H-5，H-6)，5.07(1H，ddd，J＝8.66，8.27，3.54Hz，H3)，5.17(1H，ddd，J＝9.05，8.66，7.08Hz，H-4)，5.65-5.94(16H，m，CH2OAc)。31P NMR([D8]-甲苯，1H去偶，145.8MHZ)δ-4.56(1P，s)，-4.07(1 P，s)，-3.67(1P，s)，-3.55(1P，s)。MSm/z(-ve離子FAB)1083[(M-CH2OAc+)-35]，241[OP(OCH2OAc)-2，100]。
rac-3，4，5，6-四-O-芐基-2-脫氧-2-碘代-1-O-(4-甲氧基芐基)-myo-肌醇(rac-56)。無(wú)水的rac-55(rac-3，4，5，6-四-O-芐基-1-O-(4-甲氧基芐基)-myo-肌醇)(1.32g，2mmol)，三苯基膦(2.15g，8.2mmol)，咪唑(549mg，8.2mmol)，和碘(1.52g，6mmol)在無(wú)水甲苯(100ml)的回流下攪拌41小時(shí)。反應(yīng)混合物冷卻至室溫，加入飽和的碳酸氫鈉水溶液(100ml)，混合物攪拌10分鐘。加入部分的碘。當(dāng)甲苯相保持碘著色時(shí)，再攪拌15分鐘。過(guò)量的碘通過(guò)加入連二亞硫酸鈉的水溶液除去。在一個(gè)分液漏斗中分離有機(jī)相和水相，并用鹽水洗滌有機(jī)相(兩次)。甲苯相用硫酸鈉干燥并過(guò)濾。蒸發(fā)混合物并結(jié)晶，得到純的rac-56(1.01g，73％)。Mp.131.5-132.4℃(從甲醇)。1H NMR(CDCl3，360MHZ)δ3.49(1H，dd，J＝9.27，9.27Hz)，3.50(1H，dd，J＝9.27，9.27Hz)，3.80(3H，s，OMe)，(1H，dd，J＝9.78，9.31Hz，H-4)，4.06(1H，dd，J＝11.08，11.08Hz)，4.82-4.92(10H，m，4x CH2Ph和PMB的CH2，6.87(2H，d，PMBArH)，7.23-7.37(22H，m，4x CH2Ph和PMB ArH)。MSm/z(+ve離子FAB)924[(M+NBA+H)+，1]，121[PMB+，100]。
rac-3，4，5，6-四-O-芐基-2-脫氧-1-O-(4-甲氧基芐基)-myo-肌醇(rac-57)。無(wú)水的rac-56溶解在甲苯(150ml)中，并且加入AIBN(63mg，355μmol)和n-Bu3SnH(1.63ml，6.3mmol)。該溶液在氬氣氣氛下加熱2小時(shí)。反應(yīng)混合物被冷卻并用磷酸鹽緩沖液(30ml)和鹽水(30ml)各洗滌一次。有機(jī)層用硫酸鈉干燥并過(guò)濾。蒸發(fā)混合物并結(jié)晶之，得到57(692mg，76％)。Mp.76.2-76.8℃(從甲醇)。1H-NMR(CDCl3，360MHZ)δ1.64(1H，ddd，J＝12.73，12.73，12.73Hz，H-2(ax))，2.39(1H，ddd，J＝12.73，4.39，4.39Hz，H-2(eq))，3.39-3.46(2H，m，H-1，H-3)，3.46(1H，dd，J＝9.22，8.87Hz，H-5)，3.55(1H，dd，J＝9.22，9.22Hz，H-4)，3.56(1H，dd，J＝9.22，9.22Hz，H-6)，3.81(3H，s，OMe)，4.60-4.94(10H，m，4x CH2Ph和PMB的CH2)，6.86(2H，d，PMB ArH)，7.24-7.33(22H，m，4x CH2Ph和PMB ArH)。MSm/z(-ve離子FAB)643[(M-H+)-，1]，523[M-PMB+)-，100]。
rac-3，4，5，6-四-O-芐基-2-脫氧-myo-肌醇(58)。將DDQ(367mg，1.62mmol)加入含有少量水(5％)的rac-57(600mg，931μmol)的CH2Cl2(10ml)溶液中。在室溫下攪拌該懸浮液28分鐘之后，HPLC分析(90％MeOH；1.5ml/min；tR＝4.27min)顯示反應(yīng)完成。反應(yīng)混合物在減壓下蒸發(fā)，并用制備HPLC(90％MeOH；40ml/min；20.00min)純化，得到固體狀的rac-58(232mg，48％)。Mp.126.7℃(從甲醇)。1H-NMR(CDCl3，360MHZ)δ1.64(1H，ddd，J＝12.73，12.73，12.73，12.73Hz，H-2(ax))，2.39(1H，ddd，J＝12.73，4.39，4.39Hz，H-2(eq))，3.39-3.46(2H，m，H-1，H-3)，3.46(1H，dd，J＝9.22，8.87Hz，H-5)，3.55(1H，dd，J＝9.22，9.22Hz，H-4)，3.56(1H，dd，J＝9.22，9.22Hz，H-6)，3.81(3H，s，OMe)，4.60-4.94(10H，m，4xCH2Ph和PMB的CH2)，6.86(2H，d，PMB ArH)，7.24-7.33(22H，m，4x CH2Ph和PMB ArH)。MSm/z(+ve離子FAB)525[(M+H)+，1]，91[Bn+)-，100]。
rac-3，4，5，6-四-O-芐基-1-O-丁酰-2-脫氧-myo-肌醇(rac-59)。將rac-58(186mg，355mmol)，丁酸酐(70μl，426μmol)和DMAP(12mg，10μmol)的吡啶(5ml)溶液在室溫下攪拌18小時(shí)。高真空下蒸除溶劑得到油狀物。殘留的吡啶通過(guò)用辛烷蒸三次除去。殘留物溶解在叔丁基甲基醚(30ml)中，依次用磷酸鹽緩沖液(20ml)、碳酸氫鈉(20ml)、硫酸氫鈉(20ml)各洗滌一次，再用磷酸鹽緩沖液(20ml)洗滌一次，然后用鹽水(20ml)洗滌一次。有機(jī)層用硫酸鈉干燥并過(guò)濾。蒸發(fā)溶劑得到固體狀的醇rac-59(196mg，94％)。Mp.110.1-110.3℃(從甲醇)。1H-NMR(CHCl3，360 MHZ)δ0.91(3H，t，J＝7.25Hz，CH3)，0.98(3H，t，J＝7.46Hz，CH3)，1.32-1.42(2H，m，CH2)，1.50-1.60(2H，m，CH2)，1.69(2H，tq，J＝7.46，7.46Hz，O(O)CCH2CH2CH3)，2.39(2H，t，J＝7.46Hz，O(O)CCH2CH2CH3)，3.31(1H，dd，J＝9.66，2.63Hz，H-1)，3.44(1H，dt，J＝9.07，6.81Hz，OCH2CH2CH2CH3)，3.48(1H，dd，J＝9.66，3.07Hz，H-3)，3.49(1H，dd，J＝9.66，9.22Hz，H-5)，3.67(1H，dt，J＝8.78，6.81Hz，OCH2CH2CH2CH3)，3.81(1H，dd，J＝9.66，9.66Hz，H-4)，3.86(1H，dd，J＝9.66，9.22Hz，H-6)，4.51-4.93(8H，m，CH2Ph)，5.83(1H，dd，J＝3.07，2.63Hz，H-2)，7.26-7.36(20H，m，CH2Ph)。MSm/z(+ve離子FAB)595[(M+H)+，21]，91[Bn+，100]。
rac-1-O-丁酰-2-脫氧-myo-肌醇(rac-60)將化合物rac-59(177mg，297μmol)按照一般方法中的描述用鈀炭(10％)在氫氣下氫化，冷凍干燥后得到固體狀的四醇rac-60(68mg，98％)。Mp.174.9-175.9℃(從乙醇)。1H-NMR([D6]DMSO，360 MHZ)δ0.84(3H，t，J＝7.38Hz，CH3)，0.90(3H，t，J＝7.38Hz，CH3)，1.21-1.31(2H，m，CH2)，1.36-1.44(2H，m，CH2)，1.54(2H，tq，J＝7.38，7.00Hz，O(O)CCH2CH2CH3)，2.24(2H，t，J＝7.00Hz，O(O)CCH2CH2CH3)，2.97(1H，dd，J＝8.94，8.55Hz，H-5)，3.10(1H，dd，J＝9.72，2.72Hz，H-1)，3.25-3.35(4H，m，H-3，H-4，H-6，OCH2CH2CH2CH3)，3.50(1H，dt，J＝8.94，6.60Hz，OCH2CH2CH2CH3)，4.85(4H，s(br)，OH)，5.36(1H，dd，J＝2.72，2.33Hz，H-2)。MSm/z(+ve離子FAB)235[(M+H)+，100]。MSm/z(-ve離子FAB)233[(M-H+)-，27]，87[BtO-，100]。
rac-1-O-丁酰-2-脫氧-myo-肌醇3，4，5，6-四(二芐基)磷酸酯(rac-61)將rac-60(44mg，190μmol)和四唑(160mg，2.28mmol)的乙腈(2ml)溶液用二芐基N，N-二異丙基亞磷酰胺(767μl，2.28mmol)處理36小時(shí)，用過(guò)乙酸氧化，然后按照以上描述進(jìn)行后處理。通過(guò)制備HPLC(92％MeOH；40ml/分鐘；tR＝21.55分鐘)純化得到油狀的化合物rac-61(172mg，71％)。1H-NMR(CDCl3，360MHZ)δ0.79(3H，t，J＝7.57Hz，CH3)，1.45(2H，tqu，J＝7.57，7.57Hzβ-CH2)，1.46(1H，ddd，J＝12.92，11.14，11.14Hz，H-2(ax))，2.08(2H，t，J＝7.57Hz，α-CH2)，2.58(1H，ddd，J＝12.92，4.90，4.90Hz，H-2(eq))，4.28-4.37(1H，m，H-3)，4.44(1H，dd，J＝9.24，9.24，9.24Hz，H-5)，4.53(1H，ddd，J＝9.24，9.02，9.02Hz，H-4)，4.56(1H，ddd，J＝9.24，9.24，9.24Hz，H-6)，4.83-5.08(17H，m，8x CH2Ph，H-1)，7.12-7.32(40H，m，8x CH2Ph)。31P NMR(CDCl3，1H去偶，145.8MHZ)δ-1.67(1P，s)，-1.33(1P，s)，-0.85(1P，s)，-0.64(1P，s)。MSm/z(+ve離子FAB)1275[(M+H)+，4]91[Bn+，100]。MSm/z(-ve離子FAB)1183[(M-Bn+)-，16]，277[OPO(OBn)-，100]。
rac-1-O-丁酰-2-脫氧-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸酯(rac-62)將化合物rac-61(165mg，130μmol)按照一般方法中的描述用鈀炭(10％)在氫氣下氫化，冷凍干燥后得到固體狀的四醇rac-62(65mg，90％)。1H-NMR(D2O，360MHZ)δ0.67(3H，t，J＝7.41Hz，CH3)，1.33-1.43(2H，m，β-CH2)，1.62(1H，ddd，J＝11.72，11.71，11.38Hz，H-2(ax))，2.17(2H，m，α-CH2)，2.25(1H，ddd，J＝11.38，2.24，2.24Hz，H-2(eq))，4.07-4.23(4H，m，H-3，H-4，H-5，H-6)，4.85(1H，m，H-1)。31P NMR(D2O，1H去偶，145.8MHZ)δ-0.39(2P，s)，-0.13(1P，s)，0.41(1P，s)。MSm/z(+ve離子FAB)555[(M+H)+，100]，485[M-Bt++2H+]，40]。MSm/z(-ve離子FAB)553[(M-H+)-，100]。
rac-1-O-丁酰-2-脫氧-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯(rac-51)將DIEA(201μl，1.19mmol)和乙酰氧甲基溴(119μl，1.19mmol)按照一般方法的描述加入到化合物rac-62(37mg，66μmol)的乙腈(2ml)懸浮液中。通過(guò)制備HPLC(69％MeOH；40ml/min；tR＝12.10)純化得到糖漿狀的化合物rac-51(31mg，50％)。1H-NMR([D8]甲苯，360MHZ)δ0.96(3H，t，J＝7.48Hz，CH3)，1.54(1H，ddd，J＝12.70，12.70，12.31Hz，H-2(ax))，1.63-1.74(2H，m，β-CH2)，1.81-1.87(24H，8s，8x OAc)，2.30(1H，dt，J＝16.28，7.68Hz，α-CH2)，2.52(1H，dt，J＝16.28，7.88Hz，α-CH2)，2.64(1H，ddd，J＝12.31，5.31，5.31Hz，H-2(eq))，4.40-4.59(4H，m，H-3，H-4，H-5，H-6)，5.03(1H，ddd，J＝12.20，9.53，5.31Hz，H-1)，5.65-5.95(16H，m，8x CH2OAc)。31P NMR([D8]-甲苯，1H去偶，145.8 MHZ)δ-4.68(1P，s)，-4.32(1P，s)，-3.77(1P，s)，-3.65(1P，s)。MSm/z(+ve離子FAB)1131[(M+H)+，12]，987[(M-2CH2OAc++3H)+，100]，MSm/z(-ve離子FAB)1059[(M-Bt+)-，16]，241[OP(OCH2OAc)2，100]。
rac-2-脫氧-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸酯(rac-53)。用1M KOH(260μl)處理化合物62，將其pH值調(diào)整到12.8。溶液在室溫下攪拌2天。將反應(yīng)混合物直接傾入離子交換柱(Dowex 50 WX 8，H+)進(jìn)行純化。凍干給出化合物rac-53。1H NMR(D2O，360 MHZ)；δ1.55(1H，ddd，J＝12.09，12.09，12.09Hz，H-2(ax))，2.24(1H，ddd，J＝12.09，4.31，4.31Hz，H-2(eq))，4.79(1H，ddd，J＝12.09，8.77，4.31Hz，H-1)，5.14(1H，ddd，J＝9.25，9.25，8.83Hz，H-5)，5.18-5.73(3H，m，H-3，H-4，H-6)。31P NMR(D2O，1H去偶，145.8MHZ)，δ-0.08(1P，s)，0.28(1P，s)，0.34(1P，s)，0.90(1P，s)。MSm/z(+ve離子FAB)485[(M+H)-，100]。MSm/z(-ve離子FAB)483[(M-H+)-，100]。
rac-1-O-芐基-6-O-丁酰-2，3，4，5-二-O-環(huán)亞己基-myo-肌醇(100)將rac-1-O-芐基-2，3-4，5-二-環(huán)亞己基-myo-肌醇(200mg，465μmol)、丁酸酐(144μl，571μmol)和DMAP(6mg，50μmol)的無(wú)水吡啶(3ml)溶液在室溫?cái)嚢?6小時(shí)。高真空蒸除溶劑得到油。與辛烷一起蒸發(fā)3次除去殘余的吡啶。將殘余物溶于叔丁基甲基醚(40毫升)，用磷酸鹽緩沖液(20毫升)洗滌一次、用碳酸氫鈉(20毫升)洗滌一次、用硫酸氫鈉(20毫升)洗滌一次、再次用磷酸鹽緩沖液(20毫升)洗滌一次，然后用鹽水(20毫升)洗滌。將有機(jī)層用硫酸鈉干燥并過(guò)濾。蒸除溶劑得到油狀純凈的rac-100(186mg，80％)。1H-NMR(CHCl3，360MHZ)δ0.94(3H，t，J＝7.40Hz，CH3)，1.39-1.79(12H，m，CH2(環(huán)己基)，CH2(β-CH2))，2.23-2.37(2H，m，α-CH2)，3.60(1H，dd，J＝2.85，2.08Hz，H-1)，3.63(1H，dd，J＝10.86，8.09Hz，H-5)，4.31(1H，dd，J＝7.17，2.85Hz，H-2)，4.34(1H，dd，J＝10.86，8.56Hz，H-4)，4.38(1H，dd，J＝8.56，7.17Hz，H-3)，4.78(2H，AB，J＝10.01Hz，CH2-Ph)，5.24(1H，dd，J＝8.09，2.08Hz，H-6)，7.24-7.39(5H，m，CH2Ph)。MSm/z(+ve離子FAB)501[(M+H)+，2]，91[Bn+，100]。
rac-1-O-芐基-6-O-丁酰-myo-肌醇(101)將rac-100(186mg，372μmol)在CH3CN/H2O(100∶1，8ml)的溶液與三氟乙酸(4ml)在室溫?cái)嚢?小時(shí)。高真空蒸除溶劑得到標(biāo)題化合物rac-101(125mg，98％)。1H-NMR(CHCl3，360MHZ)δ0.86(3H，t，J＝7.35Hz，CH3)，1.44-1.56(2H，m，β-CH2)，2.13-2.31(2H，m，α-CH2)，3.12(1H，dd，J＝9.13，9.13Hz，H-5)，3.15(1H，dd，J＝9.58，2.45Hz，H-3)，3.32(1H，dd，J＝10.05，2.45Hz，H-1)，3.44(1H，dd，J＝9.36，9.36Hz，H-4)，4.01(1H，dd，J＝2.45，2.45Hz，H-2)，4.44(2H，AB，J＝9.93Hz，CH2-Ph)，5.12(1H，dd，J＝10.05，9.13Hz，H-6)，7.24-7.34(5H，m，CH2Ph)。MSm/z(+ve離子FAB)341[(M+H)+，10]91[Bn+，100]。MSm/z(-ve離子FAB)339[(M-H+)-，14]，87[BtO-，100]。
rac-1-O-芐基-6-O-丁酰-myo-肌醇2，3，4，5-四(二芐基)磷酸酯(rac-102)將化合物rac-101(145mg，426μmol)和四唑(358mg，5.11mmol)的乙腈(3ml)溶液用二芐基N，N-二異丙基亞磷酰胺(1.72ml，5.11mmol)處理22小時(shí)，用過(guò)乙酸氧化，然后按照以上描述進(jìn)行后處理。通過(guò)制備HPLC(94％MeOH；40ml/min；tR＝22.40min)純化得到油狀的化合物rac-102(297mg，50％)。1H-NMR(CDCl3，360 MHZ)δ0.78(3H，t，J＝7.38Hz，CH3)，1.21-1.52(2H，m，β-CH2)，2.06-2.20(2H，m，α-CH2)，3.41(1H，ddd，J＝10.01，2.03，2.03Hz，H-3)，4.28-4.34(2H，m，H-1，H-5)，4.49(1H，ddd，J＝9.41，9.41，9.41Hz，H-4)，4.78-5.18(18H，m，CH2Ph)，5.50(1H，ddd，J＝9.15，2.03，2.03Hz，H-2)，5.64(1H，dd，J＝10.14，10.14Hz，H-6)，7.07-7.32(45H，m，CH2Ph)。31P NMR(CDCl3，1H去偶，145.8MHZ)δ-1.94(1P，s)，-1.03(1P，s)，-0.79(1P，s)，-0.32(1P，s)。MSm/z(+ve離子FAB)1381[(M+H)+，1]，71[Bt+，100]。MSm/z(-ve離子FAB)1279[(M-Bn+)-，16]，277[OPO(OBn)-2，100]。
rac-6-O-丁酰-myo-肌醇2，3，4，5-四磷酸酯(rac-103)將化合物rac-102(290mg，210μmol)按照一般方法中的描述用鈀炭(10％)在氫氣下氫化，冷凍后得到固體狀的標(biāo)題化合物rac-103(119mg，99％)。1H NMR(D2O，360MHZ)δ0.87(3H，t，J＝7.38Hz，CH3)，1.51-1.61(2H，m，β-CH2)，2.39(2H，d，J＝7.52Hz，α-CH2)，2.96(1H，ddd，J＝9.36，7.45，2.03Hz，H-1)，3.88(1H，ddd，J＝9.51，2.03，2.03Hz，H-3)，4.29(1H，ddd，J＝9.94，9.51，9.51Hz，H-5)，4.30(1H，dddd，J＝9.36，9.36，2.03，2.03Hz，H-2)，4.52(1H，ddd，J＝9.51，9.51，9.51Hz，H-4)，5.22(1H，dd，J＝9.94，9.94Hz，H-6)。31P NMR(D2O，1H去偶，145.8MHZ)δ0.19(2P，s)，0.42(1P，s)，0.89(1P，s)。MSm/z(+ve離子FAB)571[(M+H)+，10]，71[Bt+，100]。MSm/z(-ve離子FAB)569[(M-H+)-，35]，79[OP(O)-2，100]。
rac-1-O-[1，2-二棕櫚酰基-sn-甘油(glycerole)]-6-O-丁酰-myo-肌醇3，4，5-三磷酸六(乙酰氧甲基)酯(rac-104)將DIEA(190μl，1.12mmol)和乙酰氧甲基溴(126μl，1.26mmol)加入到化合物rac-103(40mg，70μmol)的無(wú)水乙腈(1.5ml)懸浮液中。在黑暗及室溫下攪拌該混合物3h，加入1，2-二棕櫚?；?sn-甘油(20mg，35μmol)，并將溶液于黑暗中在4℃下攪拌4天。降壓下蒸除溶劑并將殘留物用甲苯萃取，得到糖漿狀的標(biāo)題化合物rac-104。
rac-1-O-[1，2-二辛?；?sn-甘油(glycerole)]-6-O-丁酰-myo-肌醇3，4，5-三磷酸六(乙酰氧甲基)酯(rac-105)將DIEA(136μl，800μmol)和乙酰氧甲基溴(90μl，900μmol)加入到化合物rac-103(28mg，50μmol)的無(wú)水乙腈(1.5ml)懸浮液中。在黑暗及室溫下攪拌該混合物3h，加入1，2-二棕櫚?；?sn-甘油(23mg，70μmol)，并將溶液于黑暗中在4℃下攪拌4天。降壓下蒸除溶劑并將殘留物用甲苯萃取，得到糖漿狀的標(biāo)題化合物rac-105。材料——所有的化學(xué)試劑均是高純度的。如需要，可將溶劑在臨用前干燥和/或蒸餾。將乙腈在五氧化二磷存在下蒸餾并保存在3分子篩中，二甲基甲酰胺(DMF)與之相同。吡啶和甲苯保存在4分子篩中。乙基二異丙基胺(DIEA)用鈉絲干燥。鈀炭(10％)和三氟乙酸來(lái)自Acros Chemie。二芐基N，N-二異丙基亞磷酰胺(dibenzyl N，N-diisopropylphosphoramidite)、過(guò)乙酸(32％v/w)、四唑和乙酰氧甲基溴化物來(lái)自Aldrich。丁酸酐、DIEA來(lái)自Merck。芐基溴、氟化銫和4-二甲氨基吡啶(DMAP)來(lái)自Fluka。其它所有試劑均來(lái)自Riedel-de Haen。rac-3，4-二-O-芐基-1，2-環(huán)亞己基-myo-肌醇(1)按照以前所描述的從myo-肌醇按三步合成(Angyal et al.，J.Chem.Soc.4116(1961)；Jiang and Baker，Carbohydr.Chem.5615(1986))，這兩篇文獻(xiàn)都引入本文作為參考。所有的混合物都是外消旋的。
3，4-二-O-芐基-5，6-二-O-丁酰-1，2-環(huán)亞己基-myo-肌醇(152)將151(130mg，295μmol)、丁酸酐(193μl，1.18mmol)和DMAP(40mg，33μmol)的無(wú)水吡啶(2ml)溶液室溫?cái)嚢?天。高真空蒸除溶劑得到油。與辛烷一起蒸發(fā)3次除去殘余的吡啶。將殘余物溶于叔丁基甲基醚(10ml)，用磷酸鹽緩沖液(10ml)洗滌一次、用碳酸氫鈉(10ml)洗滌一次、用硫酸氫鈉(10ml)洗滌一次、再次用磷酸鹽緩沖液(10ml)洗滌一次，然后用鹽水(10ml)洗滌。將有機(jī)層用硫酸鈉干燥并過(guò)濾。蒸除溶劑得到油狀純凈的152(171mg，98％)。1H-NMR(CHCl3，360MHZ)δ0.87(3H，t，J＝7.30Hz，CH3)，0.91(3H，t，J＝7.30Hz，CH3)，1.26-1.87(14H，m，CH2(環(huán)己基)，2x β-CH2(Bt))，2.12-2.17(2H，m，α-CH2)，2.22-2.31(2H，m，α-CH2)，3.76(1H，dd，J＝9.29，4.05Hz，H-3)，3.97(1H，dd，J＝9.29，8.85Hz，H-4)，4.01(1H，dd，J＝7.74，5.09Hz，H-1)，4.27(1H，dd，J＝5.09，4.05Hz，H-2)，4.65-4.99(4H，m，2x CH2Ph)，4.96(1H，dd，J＝10.51，8.85Hz，H-5)，5.29(1H，dd，J＝10.51，7.74Hz，H-6)，7.26-7.38(10H，m，CH2Ph)。MSm/z(+ve離子FAB)581[(M+H)+，1]，91[Bn+，100]。MSm/z581.311(M+H)+(C34H45O8的計(jì)算值581.311)。
3，4-二-O-芐基-5，6-二-O-丁酰-myo-肌醇(153)-將152(166mg，286μmol)在5ml CH3CN/H2O(100∶1)的溶液與三氟乙酸(2ml)在室溫?cái)嚢?小時(shí)。減壓蒸發(fā)該反應(yīng)混合物，產(chǎn)物用叔丁基甲基醚萃取。有機(jī)層用鹽水洗，用硫酸鈉干燥，過(guò)濾并蒸發(fā)得到油狀的153(140mg，99％)。1H-NMR(CHCl3，360MHZ)δ0.88(3H，t，J＝7.40Hz，CH3)，0.92(3H，t，J＝7.40Hz，CH3)，1.50-1.66(4H，m，2xβ-CH2)，2.11-2.13(2H，m，α-CH2)，2.21-2.36(2H，m，α-CH2)，3.05(2H，s(br)，2x OH)，3.54(1H，dd，J＝9.48，2.77Hz，H-3)，3.58(1H，dd，J＝9.86，2.77Hz，H-1)，3.95(1H，dd，J＝9.71，9.48Hz，H-4)，4.17(1H，dd，J＝2.77，2.77Hz，H-2)，4.62-4.87(4H，m，2x CH2Ph)，5.01(1H，dd，J＝9.71，9.71Hz，H-5)，5.29(1H，dd，J＝9.86，9.71Hz，H-6)，7.23-7.34(10H，m，CH2Ph)。MSm/z(+ve離子FAB)523[(M+Na)+，22]，91[Bn+，100]。MSm/z(-ve離子FAB)499[(M+H+)-，2]，87[Bt-，100]。MSm/z 539.207(M+K)+(C28H36O8K的計(jì)算值539.205)。
1，3，4-三-O-芐基-5，6-二-O-丁酰-myo-肌醇(154)-將153(143mg，286μmol)和無(wú)水二丁基氧化錫(71mg，300μmol)在無(wú)水甲苯(100ml)中、在裝有活化分子篩(3)的Soxhlet裝置中加熱回流4小時(shí)。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫并減壓蒸發(fā)至干。向殘余的油中加入CsF(92mg，572μmol)，然后將混合物置于高真空下2小時(shí)。將殘余的糖漿在氬氣下溶于無(wú)水DMF(5ml)并加入芐基溴(270μl，2.28mmol)。將溶液攪拌18小時(shí)后，HPLC(Merck Hibar鋼管(250mm×4mm)，填充RP18材料(Merck，Lichrosorb；10μm))分析(95％MeOH；1.5ml/min；tR＝3.20min)表明無(wú)進(jìn)一步的反應(yīng)。高真空蒸除過(guò)量的芐基溴和DMF。將粗產(chǎn)物通過(guò)制備HPLC(MerckPrepbar鋼管(250mm×50mm)，填充RP18材料(Merck，LiChrospher；10μm))進(jìn)行色譜分離(88％MeOH；40ml/min；tR＝17.20min)得到固體狀的化合物154(448mg，75％)。1H-NMR(CHCl3，360MHZ)δ0.87(3H，t，J＝7.46Hz，CH3)，0.90(3H，t，J＝7.25Hz，CH3)，1.48-1.68(4H，m，2x β-CH2)，2.09-2.22(4H，m，2xα-CH2)，2.52(1H，s(br)，OH)，3.40(1H，dd，J＝9.99，2.63Hz，H-1)，3.44(1H，dd，J＝9.66，2.63Hz，H-3)，4.03(1H，dd，J＝9.88，9.66Hz，H-4)，4.19(1H，dd，J＝2.63，2.63Hz，H-2)，4.51-4.88(6H，m，3xCH2Ph)，5.04(1H，dd，J＝10.09，9.88Hz，H-5)，5.48(1H，dd，J＝10.09，9.99Hz，H-6)，7.23-7.34(15H，m，CH2Ph)。MSm/z(+ve離子FAB)613[(M+Na)+，6]，91[Bn+，100]。MSm/z613.277(M+Na)+(C35H42O8Na的計(jì)算值613.278)。
1，3，4-三-O-芐基-2，5，6-三-O-丁酰-myo-肌醇(155)-將154(98mg，166μmol)、丁酸酐(68μl，415μmol)和DMAP(5mg，4μmol)的無(wú)水吡啶(2ml)溶液室溫?cái)嚢?小時(shí)。按與對(duì)化合物2所進(jìn)行的類似的后處理得到油狀純凈的155(106mg，99％)。1H-NMR(CHCl3，360MHZ)δ0.87(3H，t，J＝7.47Hz，CH3)，0.89(3H，t，J＝7.96Hz，CH3)，0.96(3H，t，J＝7.47Hz，CH3)，1.23-1.41(2H，m，CH2)，1.51-1.60(2H，m，CH2)，1.65-1.73(2H，m，CH2)，2.13(2H，t，J＝7.47Hz，α-CH2)，2.20(2H，t，J＝7.47Hz，α-CH2)，2.43(2H，t，J＝7.47Hz，α-CH2)，3.46(1H，dd，J＝10.03，2.77Hz，H-1)，3.53(1H，dd，J＝9.82，2.99Hz，H-3)，3.86(1H，dd，J＝9.82，9.82Hz，H-4)，4.40-4.83(6H，m，3x CH2Ph)，5.06(1H，dd，J＝10.03，9.82Hz，H-5)，5.37(1H，dd，J＝10.03，10.03Hz，H-6)，5.86(1H，dd，J＝2.99，2.77Hz，H-2)，7.19-7.34(15H，m，CH2Ph)。MSm/z(+ve離子FAB)661[(M+H)+，1]，91[Bn+，100]。MSm/z661.338(M+H)+(C29H49O9的計(jì)算值661.334)。
2，5，6-三-O-丁酰-myo-肌醇(156)-在將鈀炭(10％)(80mg，795μmol)加入之前，將155(105mg，159μmol)溶解于乙酸中。在氫氣的氣氛下將該溶液在室溫下攪拌6h，超濾除去催化劑，濾液凍干得到標(biāo)題化合物156(53mg，86％)。Mp113.4-114.4℃(從MeOH)。1H-NMR([D]6-DMSO)δ0.94(3H，t，J＝7.53Hz，CH3)，0.95(3H，t，J＝7.53Hz，CH3)，0.99(3H，t，J＝7.53Hz，CH3)，1.59-1.76(6H，m，3x β-CH2)，2.25-2.36(4H，m，2x α-CH2)，2.43(2H，t，J＝7.32Hz，α-CH2)，3.72(1H，dd，J＝9.77，2.84Hz，H-3)，3.85(1H，dd，J＝10.17，2.84Hz，H-1)，3.85(1H，dd，J＝9.77，9.77Hz，H-4)，5.02(1H，dd，J＝9.77，9.77Hz，H-5)，5.25(1H，dd，J＝10.17，9.77Hz，H-6)，5.53(1H，dd，J＝2.84，2.84Hz，H-2)。MSm/z(+ve離子FAB)391[(M+H)+，5]，71[Bt+，100]。MSm/z(-ve離子FAB)389[(M-H+)-，11]，87[BtO-，100]。分析計(jì)算值C18H30O9C，55.37；H，7.74。實(shí)測(cè)值C，55.43；H，7.84。
2，5，6-三-O-丁酰-myo-肌醇1，3，4-三(二芐基)磷酸酯(157)-將三醇156(48mg，123μmol)和四唑(104mg，1.48mmol)的乙腈(2ml)溶液用二芐基N，N-二異丙基亞磷酰胺(500μl，1.48mmol)處理18小時(shí)，冷卻到-40℃，強(qiáng)烈攪拌下用過(guò)乙酸(32％v/w，340μl，1.48mmol)氧化(Yu and Fraiser-Reid，Tetrahedron Lett.29979(1988))，將其引入本文作為參考。使該混合物升溫到室溫。減壓下除去溶劑，用制備HPLC(92％MeOH；40ml/min；tR＝17.50min)純化殘留物得到化合物157(104mg，72％)。1H-NMR(CHCl3，360 MHz)δ0.76(3H，t，J＝7.32Hz，CH3)，0.78(3H，t，J＝7.32Hz，CH3)，0.93(3H，t，J＝7.32Hz，CH3)，1.32-1.50(4H，m，2x β-CH2)，1.57-1.67(2H，m，β-CH2)，2.04(2H，t，J＝7.57Hz，α-CH2)，2.13(2H，t，J＝7.57Hz，α-CH2)，2.35(2H，t，J＝7.57Hz，α-CH2)，4.38(1H，ddd，J＝9.28，9.28，2.69Hz，H-3)，4.47(1H，ddd，J＝9.99，9.99，2.69Hz，H-1)，4.82-5.04(13H，m，3x CH2Ph，H-4)，5.14(1H，dd，J＝9.77，9.77Hz，H-5)，5.45(1H，dd，J＝9.99，9.77Hz，H-6)，6.04(1H，dd，J＝2.69，2.69Hz，H-2)，7.20-7.34(30H，m，CH2Ph)。31P-NMR(CHCl3，1H去偶，145.8MHZ)δ-1.25(1P，s)，-1.18(1P，s)，-1.15(1P，s)。MSm/z(+ve離子FAB)1171[(M+H)+，4]，91[Bn+，100]。MSm/z(-ve離子FAB)1079[(M-Bn+)-，45]，277[OPO(OBn)2-，100]。
2，5，6-三-O-丁酰-myo-肌醇1，3，4-三磷酸酯(158)-將游離酸157(100mg，85μmol)按如上所述氫化，凍干后得到標(biāo)題化合物158(47mg，88％)。1H-NMR(D2O，360MHz)δ0.83(3H，t，J＝7.40Hz，CH3)，0.84(3H，t，J＝7.40Hz，CH3)，0.92(3H，t，J＝7.40Hz，CH3)，1.46-1.56(4H，m，2x β-CH2)，1.61-1.71(2H，m，β-CH2)，2.32(2H，t，J＝7.22Hz，α-CH2)，2.34(2H，t，J＝7.22Hz，α-CH2)，2.47(2H，t，J＝7.22Hz，α-CH2)，4.44-4.55(2H，m，H-1，H-3)，4.61(1H，ddd，J＝9.57，9.39，9.39Hz，H-4)，5.26(1H，dd，J＝9.57，9.57Hz，H-5)，5.35(1H，dd，J＝9.75，9.75Hz，H-6)，5.77(1H，s(br)，H-2)。31P NMR(D2O，1H去偶，145.8MHZ)δ-0.94(1P，s)，-0.09(1P，s)，-0.06(1P，s)。MSm/z(+ve離子FAB)669[(M+K)+，20]，71[Bt+，100]。MSm/z(-ve離子FAB)629[(M-H+)-，30]，97[OP(OH)2-，100]。
2，5，6-三-O-丁酰-myo-肌醇1，3，4-三磷酸六酯(乙酰氧甲基)酯(159)-將DIEA(209μl，1.23mmol)和乙酰氧甲基溴(123μl，1.23mmol)加入到化合物158(39mg，61μmol)的無(wú)水乙腈(2ml)懸浮液中。黑暗中將該混合物在室溫下攪拌4天之后，減壓下蒸除所有的揮發(fā)性組分，通過(guò)制備HPLC(73％MeOH；40ml/min；tR＝20.25)純化殘留物得到糖漿狀的化合物159(44mg，67％)。1H-NMR([D]8甲苯，360 MHz)δ0.83(3H，t，J＝7.28Hz，CH3)，0.92(3H，t，J＝7.28Hz，CH3)，0.97(3H，t，J＝7.48Hz，CH3)，1.50-1.60(2H，m，β-CH2)，1.67-1.76(4H，m，2x β-CH2)，1.79-1.96(18H，6x s，6xOAc)，2.08-2.13(2H，m，α-CH2)，2.33-2.47(2H，m，α-CH2)，2.52-2.61(2H，m，α-CH2)，5.05(1H，ddd，J＝9.64，9.64，2.17Hz，H-3)，5.09(1H，ddd，J＝9.64，9.06，9.06Hz，H-4)，5.11(1H，ddd，J＝9.84，9.84，2.17Hz，H-1)，5.50-5.83(14H，m，6x CH2OAc，H-5，H-6)，6.21(1H，dd，J＝2.17，2.17Hz，H-2)。31P-NMR(D2O，1H去偶，145.8MHZ)δ-4.17(1P，s)，-4.05(1P，s)，-3.97(1P，s)。MSm/z(+ve離子FAB)[(M+K)+，20]，71[Bt+，100]。MSm/z(-ve離子FAB)[(M-H+)-，30]，97[，100]。
雖然本發(fā)明是參考以上所提供的實(shí)施例進(jìn)行描述的，但應(yīng)當(dāng)理解在不偏離本發(fā)明精神的情況下本發(fā)明還可以作出各種改動(dòng)。因此，本發(fā)明僅應(yīng)收到權(quán)利要求書的限制。
權(quán)利要求
1.肌醇多磷酸酯的細(xì)胞滲透性激動(dòng)劑，含有肌醇多磷酸酯衍生物或其模擬物。
2.權(quán)利要求1的細(xì)胞滲透性激動(dòng)劑，其中所述肌醇多磷酸酯是myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸酯。
3.權(quán)利要求2的細(xì)胞滲透性激動(dòng)劑，其中所述細(xì)胞滲透性激動(dòng)劑是myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸酯。
4.權(quán)利要求3的衍生物，其中所述衍生物是D，L-1-O-丁酰-2-O-脫氧-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
5.權(quán)利要求2的細(xì)胞滲透性激動(dòng)劑，其中所述細(xì)胞滲透性激動(dòng)劑是myo-肌醇1，3，4-三磷酸酯。
6.權(quán)利要求5的衍生物，其中所述衍生物是D，L-2，5，6-三-O-?；?myo-肌醇1，3，4-三磷酸六(乙酰氧甲基)酯。
7.權(quán)利要求6的衍生物，其中所述衍生物是D，L-2，5，6-三-O-丁酰-myo-肌醇1，3，4-三磷酸六(乙酰氧甲基)酯。
8.權(quán)利要求1的細(xì)胞滲透性激動(dòng)劑，其中所述肌醇多磷酸酯是磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸酯。
9.權(quán)利要求8的細(xì)胞滲透性激動(dòng)劑，其中所述細(xì)胞滲透性激動(dòng)劑是磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸酯的衍生物。
10.權(quán)利要求9的衍生物，其中所述衍生物是二-棕櫚酰-D，L-O-酰基-磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸七(乙酰氧甲基)酯。
11.權(quán)利要求10的衍生物，其中所述衍生物是sn-二-O-棕櫚酰-D，L-6-O-丁酰-磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸七(乙酰氧甲基)酯。
12.權(quán)利要求9的衍生物，其中所述衍生物是sn-二-O-辛酰-D，L-6-O-丁酰-磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸七(乙酰氧甲基)酯。
13.用于減少細(xì)胞的氯離子分泌的方法，該方法包括將所述細(xì)胞與權(quán)利要求1的細(xì)胞滲透性激動(dòng)劑接觸。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述肌醇多磷酸酯是myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸酯。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述細(xì)胞滲透性激動(dòng)劑是myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸酯的衍生物。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述衍生物是1，2-二-O-?；?myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述衍生物是1，2-二-O-丁酰-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
18.權(quán)利要求16的方法，其中所述衍生物是1，2-二-O-丁酰-scyllo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
19.權(quán)利要求15的方法，其中所述衍生物是D，L-1-O-丁酰-2-O-脫氧-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
20.權(quán)利要求14的方法，其中所述細(xì)胞滲透性激動(dòng)劑是myo-肌醇1，3，4-三磷酸酯。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述衍生物是D，L-2，5，6-三-O-?；?myo-肌醇1，3，4-三磷酸六(乙酰氧甲基)酯。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述所述衍生物是D，L-2，5，6-三-O-丁酰-myo-肌醇1，3，4-三磷酸六(乙酰氧甲基)酯。
23.權(quán)利要求13的方法，其中所述肌醇多磷酸酯是磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸酯。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述細(xì)胞滲透性激動(dòng)劑是磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸酯的衍生物。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述衍生物是二-棕櫚酰-D，L-O-酰基-磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸七(乙酰氧甲基)酯。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述衍生物是sn-二-O-棕櫚酰-D，L-6-O-丁酰-磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸七(乙酰氧甲基)酯。
27.權(quán)利要求24的方法，其中所述衍生物是sn-二-O-辛酰-D，L-6-O-丁酰-磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸七(乙酰氧甲基)酯。
28.減少個(gè)體中氯離子分泌的方法，該方法包括給所述個(gè)體施用權(quán)利要求1的細(xì)胞滲透性激動(dòng)劑。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述肌醇多磷酸酯是myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸酯。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述細(xì)胞滲透性激動(dòng)劑是myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸酯的衍生物。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述衍生物是1，2-二-O-?；?myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述衍生物是1，2-二-O-丁酰-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
33.權(quán)利要求31的方法，其中所述衍生物是1，2-二-O-丁酰-scyllo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
34.權(quán)利要求30的方法，其中所述衍生物是D，L-1-O-丁酰-2-O-脫氧-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
35.權(quán)利要求29的方法，其中所述細(xì)胞滲透性激動(dòng)劑是myo-肌醇1，3，4-三磷酸酯的衍生物。
36.權(quán)利要求35的方法，其中所述衍生物是D，L-2，5，6-三-O-?；?myo-肌醇1，3，4-三磷酸六(乙酰氧甲基)酯。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所述所述衍生物是D，L-2，5，6-三-O-丁酰-myo-肌醇1，3，4-三磷酸六(乙酰氧甲基)酯。
38.權(quán)利要求28的方法，其中所述肌醇多磷酸酯是磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸酯。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述細(xì)胞滲透性激動(dòng)劑是磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸酯的衍生物。
40.權(quán)利要求39的方法，其中所述衍生物是二-棕櫚酰-D，L-O-酰基-磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸七(乙酰氧甲基)酯。
41.權(quán)利要求40的方法，其中所述衍生物是sn-二-O-棕櫚酰-D，L-6-O-丁酰-磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸七(乙酰氧甲基)酯。
42.權(quán)利要求39的方法，其中所述衍生物是sn-二-O-辛酰-D，L-6-O-丁酰-磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸七(乙酰氧甲基)酯。
43.緩解個(gè)體中與分泌性腹瀉有關(guān)的體征或癥狀的方法，該方法包括給所述個(gè)體施用權(quán)利要求1的細(xì)胞滲透性激動(dòng)劑。
44.權(quán)利要求43的方法，其中所述肌醇多磷酸酯是myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸酯。
45.權(quán)利要求44的方法，其中所述細(xì)胞滲透性激動(dòng)劑是myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸酯的衍生物。
46.權(quán)利要求45的方法，其中所述衍生物是1，2-二-O-?；?myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
47.權(quán)利要求46的方法，其中所述衍生物是1，2-二-O-丁酰-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
48.權(quán)利要求46的方法，其中所述衍生物是1，2-二-O-丁酰scyllo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
49.權(quán)利要求45的方法，其中所述衍生物是D，L-1-O-丁酰-2-O-脫氧-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
50.權(quán)利要求44的方法，其中所述激動(dòng)劑是myo-肌醇1，3，4-三磷酸酯的衍生物。
51.權(quán)利要求50的方法，其中所述衍生物是D，L-2，5，6-三-O-?；?myo-肌醇1，3，4-三磷酸六(乙酰氧甲基)酯。
52.權(quán)利要求51的方法，其中所述所述衍生物是D，L-2，5，6-三-O-丁酰-myo-肌醇1，3，4-三磷酸六(乙酰氧甲基)酯。
53.權(quán)利要求43的方法，其中所述肌醇多磷酸酯是磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸酯。
54.權(quán)利要求53的方法，其中所述細(xì)胞滲透性激動(dòng)劑是磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸酯的衍生物。
55.權(quán)利要求54的方法，其中所述衍生物是二-棕櫚酰-D，L-O-?；?磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸七(乙酰氧甲基)酯。
56.權(quán)利要求55的方法，其中所述衍生物是sn-二-O-棕櫚酰-D，L-6-O-丁酰-磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸七(乙酰氧甲基)酯。
57.權(quán)利要求54的方法，其中所述衍生物是sn-二-O-辛酰-D，L-6-O-丁酰-磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸七(乙酰氧甲基)酯。
58.緩解個(gè)體中與腦腫脹有關(guān)的體征或癥狀的方法，該方法包括給所述個(gè)體施用權(quán)利要求1的細(xì)胞滲透性激動(dòng)劑。
59.權(quán)利要求58的方法，其中所述肌醇多磷酸酯是myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸酯。
60.權(quán)利要求59的方法，其中所述細(xì)胞滲透性激動(dòng)劑是myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸酯的衍生物。
61.權(quán)利要求60的方法，其中所述衍生物是1，2-二-O-酰基-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
62.權(quán)利要求61的方法，其中所述衍生物是1，2-二-O-丁酰-myo-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
63.權(quán)利要求61的方法，其中所述衍生物是1，2-二-O-丁酰-scyll-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
64.權(quán)利要求60的方法，其中所述衍生物是D，L-1-O-丁酰-2-O-脫氧-肌醇3，4，5，6-四磷酸八(乙酰氧甲基)酯。
65.權(quán)利要求59的方法，其中所述細(xì)胞滲透性激動(dòng)劑是myo-肌醇1，3，4-三磷酸酯的衍生物。
66.權(quán)利要求65的方法，其中所述衍生物是D，L-2，5，6-三-O-?；?myo-肌醇1，3，4-三磷酸六(乙酰氧甲基)酯。
67.權(quán)利要求66的方法，其中所述所述衍生物是D，L-2，5，6-三-O-丁酰-myo-肌醇1，3，4-三磷酸六(乙酰氧甲基)酯。
68.權(quán)利要求58的方法，其中所述肌醇多磷酸酯是磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸酯。
69.權(quán)利要求68的方法，其中所述激動(dòng)劑是磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸酯的衍生物。
70.權(quán)利要求69的方法，其中所述衍生物是二-棕櫚酰-D，L-O-?；?磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸七(乙酰氧甲基)酯。
71.權(quán)利要求70的方法，其中所述衍生物是sn-二-O-棕櫚酰-D，L-6-O-丁酰-磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸七(乙酰氧甲基)酯。
72.權(quán)利要求69的方法，其中所述衍生物是sn-二-O-辛酰-D，L-6-O-丁酰-磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸七(乙酰氧甲基)酯。
全文摘要
本發(fā)明提供了作為肌醇多磷酸酯的細(xì)胞滲透性激動(dòng)劑的組合物。另外，本發(fā)明還提供了通過(guò)將細(xì)胞與肌醇多磷酸酯的細(xì)胞滲透性激動(dòng)劑接觸來(lái)減小氯離子分泌的方法。本發(fā)明還提供了通過(guò)給個(gè)體施用肌醇多磷酸酯的細(xì)胞滲透性激動(dòng)劑來(lái)減少氯離子分泌的方法。此外，本發(fā)明還提供了通過(guò)給所述個(gè)體施用肌醇多磷酸酯的細(xì)胞滲透性激動(dòng)劑緩解個(gè)體中與分泌性腹瀉有關(guān)的體征或癥狀的方法。
文檔編號(hào)A61P11/00GK1478783SQ03149578
公開日2004年3月3日 申請(qǐng)日期1997年9月19日 優(yōu)先權(quán)日1996年9月20日
發(fā)明者亞歷克西斯·特賴諾爾－卡普蘭, 卡斯滕·舒爾茨, 斯特凡·勒默爾, 克里斯托夫·施塔德勒, 馬爾科·魯?shù)婪? 勒默爾, 舒爾茨, 魯?shù)婪? 亞歷克西斯 特賴諾爾-卡普蘭, 托夫 施塔德勒 申請(qǐng)人:加利福尼亞大學(xué)董事會(huì), 伊諾勒吉有限公司