專利名稱：殺菌/增強(qiáng)通透性蛋白質(zhì)產(chǎn)物的治療用途的制作方法
本申請系1994年3月11日提交的申請?zhí)枮?4191892.0發(fā)明名稱與本申請相同的申請的分案申請，而后者是申請日為1993年3月12日的美國專利申請08/030,644的部分繼續(xù)申請。
本發(fā)明涉及殺菌/增強(qiáng)通透性(BPI)蛋白質(zhì)產(chǎn)物的治療用途，它們用于治療與革蘭氏陰性細(xì)菌感染有關(guān)的病情及與革蘭氏陰性細(xì)菌感染不直接相聯(lián)系的病情，包括中和肝素的抗凝血特性，抑制血管形成，腫瘤及內(nèi)皮細(xì)胞增生和治療慢性發(fā)炎疾病狀態(tài)(如關(guān)節(jié)炎)。
肝素結(jié)合肝素是一組不均一的直鏈陰離子粘多糖，稱為葡糖氨基葡聚糖，具有抗凝血特性。在肝素中出現(xiàn)的主要糖類有(1)α-L-艾杜糖醛酸2-硫酸鹽，(2)2-脫氧-2-磺氨基-α-D-葡萄糖6-硫酸鹽，(3)β-D-葡萄糖醛酸，(4)2-乙酰氨基-2-脫氧-α-D-葡萄糖，和(5)α-L-艾杜糖醛酸，盡管可能存在其他的糖類。這些糖類通常按(2)＞(1)＞(4)＞(3)＞(5)的順序含量遞減，并以糖苷鍵連結(jié)，形成大小不同的多聚體。肝素具有強(qiáng)酸性，因為它含有共價相連的硫酸和羧酸基團(tuán)。肝素在肥大細(xì)胞顆粒中發(fā)現(xiàn)并經(jīng)脫顆粒而釋放。肝素的一種細(xì)胞相關(guān)性形式稱為硫酸乙酰肝素。硫酸乙酰肝素是一個廣義的術(shù)語，用于描述各種在哺乳動物細(xì)胞膜表面和胞外基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)幾乎隨機(jī)分布的硫酸化蛋白聚糖(HSPG′S)。HSPG含有可變百分比的五聚體肝素樣序列，其功能與可溶肝素相似。HSPG′s作為抗凝血酶HI(ATIII)和肝素結(jié)合生長因子(如成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)1-5，IL-8，GM-CSF和IL-3)的倉庫。Folkman etal.，InflammationBasic Principles and Clinical Correlates ZdEd.Chapter 40，PP821-839(1992)。事實上，用遺傳方法制備的HSPG′s缺乏性細(xì)胞需要外源性肝素用于生長。
在外科手術(shù)過程中(如心肺旁路，心臟導(dǎo)管插入和血液透析程序)，為阻止該過程中的血液凝固，通常以達(dá)到400U/Kg的劑量施用肝素。肝素在血液中的抗血凝效力是肝素與ATIII相互作用的結(jié)果。肝素/ATIII復(fù)合物是凝血級聯(lián)過程中的許多凝血因子的有效抑制劑。對激活的因子IXa，Xa，XIa、XIIIa和凝血酶的特異性抑制已被證實。肝素/ATIII復(fù)合物對因子Xa和凝血酶具有最高親和力，因子Xa和凝血酶是內(nèi)部和外部凝血途徑共有的，作為導(dǎo)致纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白的凝血級聯(lián)的最后兩步牽涉到這兩個途徑。
當(dāng)在手術(shù)過程中施用肝素以產(chǎn)生抗凝血效力時，手術(shù)后治療的一個重要方面是立即中和肝素的效力以便恢復(fù)正常的凝血功能。通常用魚精蛋白中和肝素。魚精蛋白是一種通常從鮭魚精子中分離出的低分子量的簡單蛋白質(zhì)。它們富含精氨酸殘基并具有強(qiáng)堿性。單獨用藥時，魚精蛋白(通常以魚精蛋白硫酸鹽的形式)具有抗凝血效力。當(dāng)在存在肝素的條件下用藥時，形成一種穩(wěn)定的復(fù)合物，并且兩種藥物的抗凝血活性喪失。魚精蛋白明顯的降低血壓和類過敏性效力限制了其臨床使用。
報道的其他具有肝素中和活性的化合物包括血小板因子4(PF4)和主要的堿性蛋白質(zhì)，見美國專利5,086,164。主要的堿性蛋白質(zhì)證實具有肝素中和活性，但也具有高毒性。血管形成血管形成與內(nèi)皮細(xì)胞增生密切相關(guān)并構(gòu)成新毛細(xì)血管的發(fā)育。因此，它是哺乳動物發(fā)育和生長的重要過程。在月經(jīng)過程中，血管形成生長因子(如成纖維細(xì)胞生長因子1-5)的釋放經(jīng)一種肝素依賴性受體結(jié)合機(jī)制誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的增生。見Yayon et al.，Cell，64841-848(1991)。這些肝素結(jié)合生長因子能由血管創(chuàng)傷(傷口愈合)，免疫刺激(自身免疫疾病)，發(fā)炎介質(zhì)(前列腺素)和從腫瘤細(xì)胞釋放。
血管形成還與一些希望抑制該新血管發(fā)育的病理狀態(tài)相關(guān)。作為一個例子，血管形成對各種腫瘤的生長，增生和轉(zhuǎn)移是關(guān)鍵的。其他與血管形成相關(guān)的病理狀態(tài)包括糖尿病的視網(wǎng)膜病，晶狀體后的纖維組織形成，新血管青光眼，牛皮癬，血管纖維瘤，免疫和非免疫性發(fā)炎(包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)、動脈粥樣硬化斑內(nèi)的毛細(xì)血管增生，血管瘤，子宮內(nèi)膜異位和卡波濟(jì)肉瘤。
Folkman等(出處同上)公開了皮膚牛皮癬損害受上皮增生，新血管形成，和發(fā)炎細(xì)胞浸潤的支配。然而，血管形成是牛皮癬的發(fā)病機(jī)理中的一步還是一種繼發(fā)性現(xiàn)象尚不清楚。
一些物質(zhì)已知具有血管形成抑制劑的功能，并已報道了抑制腫瘤血管形成，防止關(guān)節(jié)炎的發(fā)作以及抑制在膠原蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型中建立的關(guān)節(jié)炎，Peacock et al.J.Exp.Med.175，1135-1138(1992)。作為一個例子，魚精蛋白已知抑制腫瘤血管形成及隨后的腫瘤生長。根據(jù)Taylor et al.，Nature，297307-312(1982)，魚精蛋白的抗血管形成活性由其結(jié)合肝素的能力所引起。已知PF4也表現(xiàn)出抗血管形成活性。本發(fā)明感興趣的是美國專利5,112,946公開的具有抗血管形成活性但缺乏結(jié)合肝素能力的被修飾的PF4及其類似物。PF4已被證明至少具有兩種功能特征。盡管肝素結(jié)合已被最廣泛地研究，但PF4最初被描述為具有膠原酶抑制特性。膠原酶抑制劑是第一個發(fā)現(xiàn)的血管形成抑制劑。見Folkman 1973，(出處同上)。PF4肝素結(jié)合區(qū)中的突變對膠原酶抑制活性的影響檢查不到。令人感興趣的是，凝血酶敏感蛋白也是一種血管形成抑制劑并以絲氨酸/色氨酸區(qū)域代替堿性氨基酸區(qū)域與肝素結(jié)合。因此，沒有明顯的肝素結(jié)合或血管形成抑制的單個一致性序列。
公開的PCT專利申請WO 92/01003公開了葡糖氨基葡聚糖(肝素)衍生物的用途及其用于抑制腫瘤的侵襲力。公開的肝素衍生物被描述為基本上沒有抗凝血活性，并能阻止宿主中腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移瘤的形成。慢性炎癥慢性炎癥通常伴隨著血管形成。關(guān)節(jié)炎是一種慢性綜合癥，其特征為外周關(guān)節(jié)發(fā)炎并伴隨著滑膜增厚和免疫因子及細(xì)胞(如多形核白細(xì)胞(PMN)的流入。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中，炎癥是免疫驅(qū)動的，而在反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎中，炎癥與滑膜組織受化膿性細(xì)菌或其它感染物的感染相關(guān)。Folkman等(1973.出處同上)還提出許多種類的關(guān)節(jié)炎從一個關(guān)節(jié)的發(fā)炎浸潤占優(yōu)勢的時期到后期新血管血管翳侵入關(guān)節(jié)并開始破壞軟骨。但在關(guān)節(jié)炎中是否血管形成是疾病的起因而不是一種表面現(xiàn)象尚不清楚。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中，有證據(jù)表明血管形成是維持滑膜炎所必需的。盡管非類固醇抗炎藥物(NSAIDs)，皮質(zhì)類固醇和其它療法在減輕關(guān)節(jié)炎的治療方面提供了改進(jìn)，但在本領(lǐng)域仍需要對關(guān)節(jié)炎和其他發(fā)炎疾病的更有效的療法。
現(xiàn)在了解到炎癥和血管形成是可分開的但并不互相排斥的過程。已發(fā)現(xiàn)特異性血管形成蛋白刺激血管形成而不引起炎癥，另外血管抑制類固醇能抑制血管形成而不減輕急性炎癥。見Folkman，1973出處同上。令人感興趣的是，已鑒定內(nèi)毒素通過其對巨噬細(xì)胞細(xì)胞素和生長因子的刺激作為一種最有效的外源性血管形成刺激因子。殺菌/增強(qiáng)通透性蛋白質(zhì)殺菌/增強(qiáng)通透性蛋白質(zhì)(BPI)是一種從哺乳動物PMNs顆粒中分離出的蛋白質(zhì)，PMNs是抵抗微生物侵入所必需的血細(xì)胞。經(jīng)酸提取并結(jié)合離子交換色譜〔Elsbach，J.Biol.Chem.，25411000(1979)〕或E.Coli親和色譜〔Weiss.et al.，Blood，69652(1987)〕從多形核嗜中性的細(xì)胞中分離出了人BPI蛋白質(zhì)，此處稱為天然BPI，它對廣譜革蘭氏陰性細(xì)菌具有有效的殺菌活性。人BPI分子量大約為55,000道爾頓(55KD)。人BPI全蛋白的氨基酸序列以及編碼該蛋白質(zhì)的DNA已在Gray et al.，J.Bio.Chem.，2649505(1989)的

圖1中給出。此處引用以供參考。
BPI的殺菌效力對敏感性革蘭氏陰性種類表現(xiàn)出高度特異性，而對其他微生物和真核細(xì)胞無毒性。BPI殺死細(xì)菌的確切機(jī)理還不知道，但知道BPI必須首先附著到感受態(tài)革蘭氏陰性細(xì)菌的表面。這種BPI對細(xì)菌的最初的結(jié)合涉及堿性BPI蛋白質(zhì)與脂多糖(LPS)上帶負(fù)電荷的位點之間的靜電相互作用。LPS由于可刺激強(qiáng)烈的發(fā)炎反應(yīng)，已被稱為“內(nèi)毒素”。LPS經(jīng)宿主發(fā)炎細(xì)胞誘導(dǎo)介質(zhì)的釋放，可能最終導(dǎo)致不可逆的內(nèi)毒素攻擊。BPI與脂A結(jié)合，脂A是LPS中最具毒性的最具生物學(xué)活性的成份。
在感受態(tài)細(xì)菌中，認(rèn)為BPI的結(jié)合破壞了LPS的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致降解磷脂和肽葡聚糖的細(xì)菌酶激活，改變細(xì)胞外膜的通透性，啟動最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡的發(fā)生。Elsbach and Weiss，InflammationBasicPrincipkes a nd Clintcal Correlates.eds.Gallin etd.，Chapter 30，Review Press，Ltd.(1992)。認(rèn)為BPI分兩階段發(fā)揮作用。第一為亞致死階段，其特征為生長立即停滯，處膜穿透和水解磷脂和肽葡聚糖的細(xì)菌酶選擇性激活。在這一階段的細(xì)菌可經(jīng)在含血清白蛋白的培養(yǎng)基上涂布來挽救。第二階段的特征為生長抑制不能用血清白蛋白來逆轉(zhuǎn)，在細(xì)菌長期接觸BPI后出現(xiàn)，其特征為廣泛的生理學(xué)和結(jié)構(gòu)改變，包括細(xì)胞質(zhì)膜的穿透。
BPI也能中和其所結(jié)合的LPS之內(nèi)毒素的特性。由于其革蘭氏陰性殺菌特性和其中和LPS的能力，BPI能用于治療哺乳動物由革蘭氏陰性細(xì)菌所引起的疾病，如敗血癥或膿毒癥。
與人BPI全蛋白N-端部分相對應(yīng)的蛋白水解片段具有天然產(chǎn)生的55KD人全蛋白的脂A結(jié)合和抗菌活性。與N-端部分相反，分離的人BPI蛋白質(zhì)C-端區(qū)域僅表現(xiàn)出微弱的可檢測的抗菌活性。Ooi.et al.，J.Exp.Med.，174649(1991)。含有人BPI全蛋白和大約開始199個氨基酸殘基的BPI N-端片段稱為“rBPI23”，已用重組方法以23KD蛋白質(zhì)的形式生產(chǎn)出來。Gazzano--Santoro et al.，Infect.Immun.60.4754-4761(1992)。
本申請感興趣的是在公開號為WO 92/035 35的PCT國際申請PCT/US 91/05758說明書中涉及的含有一種BPI蛋白質(zhì)和一種陰離子化合物的組合物，所說的組合物表現(xiàn)出(1)無殺菌活性，和(2)內(nèi)毒素中和活性。陰離子化合物優(yōu)選一種蛋白質(zhì)，如血清白蛋白，但也可以是一種蛋白多糖，如肝素。另外，Weiss et al.，J.Clin.Invest.5533-42(1975)公開了肝素硫酸鹽與LPS結(jié)合阻斷BPI增強(qiáng)通透性活性的表達(dá)。然而，沒有文獻(xiàn)公開用與BPI組合來進(jìn)行肝素中和。
本領(lǐng)域?qū)τ糜诟嗡刂泻停[瘤，血管形成和內(nèi)皮細(xì)胞增生的抑制以及慢性炎癥的治療的新產(chǎn)品和方法的需要仍然存在。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了中和肝素的抗凝血活性的方法，包括給受實驗者的體內(nèi)或體外含肝素的液體樣品中施用有效量的BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，給受實驗者施用一種BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物以抑制內(nèi)皮細(xì)胞增生，包括但不限于與血管形成相關(guān)的內(nèi)皮細(xì)胞增生。本發(fā)明提供抑制與各種臨床癥狀相聯(lián)系的血管形成的方法。本發(fā)明特別提供以抑制與惡性腫瘤增生，卡波濟(jì)肉瘤損害和相似疾病相聯(lián)系的血管形成來治療癌癥的方法。對施用BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物的治療敏感的腫瘤包括黑素瘤、肉瘤、和癌，包括但不限于乳房、結(jié)腸、肺、和前列腺癌。能施用BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物來抑制血管形成的其他癥狀包括眼視網(wǎng)膜病，晶狀體后纖維組織形成，牛皮癬，血管纖維瘤，子宮內(nèi)膜異位，血管瘤和相似癥狀。本發(fā)明還期望提供避孕方法，包括供給有效量的BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物以阻止受精卵的植入。
本發(fā)明還提供治療慢性發(fā)炎疾病癥狀(如并節(jié)炎、牛皮癬、發(fā)炎性的疾病，節(jié)段性回腸炎，潰瘍性結(jié)腸炎，戲斑狼瘡，自身免疫眼色素層炎，Lyme疾病，和氣喘病的方法，包括給感染發(fā)炎疾病癥狀的病人施用有效量的BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
本發(fā)明還提供制備用于中和肝素的抗凝血特性，抑制腫瘤和內(nèi)皮細(xì)胞增生，抑制血管形成和治療慢性發(fā)炎疾病癥狀的藥物之方法。
該藥物可制備成口服，注射或其他腸胃外方式的劑型并優(yōu)選包含本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的常用的藥物上可接受的載體和佐劑。藥物優(yōu)選以單位劑量的固體，半固體和液體形式的劑型如片劑、丸劑、粉末、液體溶液或懸液，以及可注射的和可浸入的溶液。預(yù)期的有效劑量范圍從大約100μg/kg到大約10mg/kg的體重。
此處所用的“BPI蛋白產(chǎn)物”包括天然的和重組產(chǎn)生的殺菌/增強(qiáng)通透性蛋白質(zhì)，天然的，重組的具生物學(xué)活性的殺菌/增強(qiáng)通透性蛋白質(zhì)的多肽片段，以及生物學(xué)活性多肽或類似物，包括殺菌/增強(qiáng)通透性蛋白質(zhì)或具生物學(xué)活性片段的雜種融合蛋白質(zhì)。
附圖的簡要描述圖1描繪了rBPI23和rBPI的肝素結(jié)合試驗圖；圖2顯示了肝素對rBPI23結(jié)合E.coli J5脂A與結(jié)合各種LPS和磷壁酸質(zhì)樣品相比較的影響；圖3顯示了rBPI23對凝血酶的ATIII/肝素抑制的影響；圖4顯示了rBPI23對因子Xa的ATIII/肝素抑制的影響；圖5顯示了rBPI23對人血漿中肝素介導(dǎo)的延長凝血酶時間的影響。
圖6顯示了rBPI23對部分凝血致活酶時間的影響；
圖7顯示了rBPI23和thaumatin對照蛋白質(zhì)對具輕度關(guān)節(jié)炎的膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎模型之關(guān)節(jié)炎程度的影響；圖8顯示了rBPI23和魚精蛋白對具嚴(yán)重關(guān)節(jié)炎的膠原蛋白誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎模型的關(guān)節(jié)炎程度之影響；圖9顯示了rBPI23對耶爾辛誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎模型的關(guān)節(jié)炎發(fā)病率的影響；圖10顯示了rBPI23對LAL的Borrelia burgdorferi LPS樣刺激的抑制試驗之影響；圖11顯示了在小鼠腫瘤轉(zhuǎn)移模型中以BPI或緩沖液處理后小鼠的存活率；圖12顯示了rBPI23對II型鼠毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生的影響；圖13圖示了BPI對上皮細(xì)胞的結(jié)合；圖14描繪的是合成的BPI肽肝素結(jié)合試驗圖；圖15描繪的是鱟屬變形細(xì)胞溶胞產(chǎn)物(LAL)對合成的BPI肽抑制試驗圖；圖16描繪的是合成的BPI肽放射狀擴(kuò)散殺菌試驗的圖；圖17描繪的是合成的BPI肽在肝素結(jié)合試驗中的影響；圖18a和18b顯示的是合成的BPI肽對凝血酶ATIII/肝素抑制的影響；圖19a和19b顯示的是合成的BPI肽在LAL抑制試驗中的影響；圖20a，20b，20c和20d顯示的是合成的BPI肽在放射狀擴(kuò)散的殺菌試驗中的影響；圖20e和20f描寫的是合成的BPI肽在E.coli培養(yǎng)試驗中的影響；圖21a和21b顯示的是rBPI23蛋白質(zhì)水解片段的HPLC吸收結(jié)果；圖22顯示的是rBPI23蛋白質(zhì)水解片段的LAL抑制試驗結(jié)果；圖23描繪的是rBPI23功能區(qū)。
本發(fā)明涉及用于治療各種與細(xì)菌感染不直接相關(guān)的治療癥狀之殺菌/增強(qiáng)通透性蛋白質(zhì)(BPI)蛋白產(chǎn)物的用法。
雖然此處所述的BPI蛋白質(zhì)可用作革蘭氏陰性細(xì)菌的有效細(xì)胞毒素和用于中和革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁相聯(lián)系的脂多糖的有害影響，但是已發(fā)現(xiàn)了BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物與革蘭氏陰性細(xì)菌感染不直接相關(guān)的各種治療效力。具體地說，本發(fā)明提供了治療與革蘭氏陰性感染不直接相關(guān)的癥狀之方法，包括中和肝素的抗凝血活性、抑制腫瘤和內(nèi)皮細(xì)胞增生(包括與血管形成相關(guān)的細(xì)胞增生)以及慢性發(fā)炎疾病癥狀(如關(guān)節(jié)炎)的治療。
根據(jù)本發(fā)明的方法用藥的包括BPI全蛋白生物活性片段的BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物可用本領(lǐng)域已知的任何方法生產(chǎn)和/或分離出來。此外引用共同擁有，共同未決的美國專利申請07/885.501及其部分繼續(xù)申請-申請日為1993年5月19日的美國專利申請08/072,063以供參考，它們公開了從遺傳轉(zhuǎn)化的哺乳動物宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)和分泌的重組BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物之新的純化方法，并公開了如何生產(chǎn)大量的適于配制成穩(wěn)定的，均質(zhì)的藥物制劑的重組BPI產(chǎn)物。
BPI的生物學(xué)活性片段包括含有與BPI全蛋白相同氨基酸順序的生物學(xué)活性分子，不同的是該分子缺失全蛋白的氨基末端氨基酸，內(nèi)部氨基酸和/或羧基末端氨基酸。該片段的非限制性例子包括此處所述和以前提到的天然的25KD片段和稱為rBPI23的重組23KD、人BPI全蛋白199個氨基酸殘基的氨基末端片段，見.Gaz-zano-Santoro et al.，Infect.Immun.604754-4761(1992)。在該文獻(xiàn)中，一個表達(dá)載體用作編碼重組表達(dá)產(chǎn)物(rBPI23)的DNA來源，rBPI23具有31個殘基的信號序列和成熟的人BPI前199個N-端氨基酸，同Gray等人(出處同上)的SEQ ID NOs1和2所列出的一樣，不同之處在于151位的纈氨酸由GTG編碼而不是GTC編碼，185位的殘基是谷氨酸(由GAG編碼)而不是賴氨酸(由AAG編碼)。此處稱為rBPI或rBPI50的重組全蛋白也已被生產(chǎn)出來，它具有來自Gray等(出處同上)SEQ ID NOs1和2所列出的序列，該序列已在對rBPI23的描述中提及。
其他BPI生物學(xué)活性片段的非限制性例子包括例如BPI全蛋白或?qū)⒃摰鞍踪|(zhì)以試劑(如溴化氰CNBr)進(jìn)行化學(xué)裂解或以試劑(如蛋白內(nèi)切酶Asp-N)進(jìn)行酶消化產(chǎn)生的rBPI23的片段。BPI蛋白質(zhì)片段還可以用含有BPI全蛋白內(nèi)、尤其是該蛋白一半的氨基末端內(nèi)大約5個到大約50個連續(xù)的氨基酸復(fù)制物的線型或環(huán)狀的合成肽的形式提供。提供的該肽可以為單體的形式，二聚體或多聚體(其中的肽復(fù)制一具有半胱氨酸殘基的BPI區(qū)域)的形式，以及“線型”二聚體或多聚體的形式，其中的一段BPI序列在肽中重復(fù)出現(xiàn)，具備或不具備為允許所選擇的構(gòu)象顯示的“間隔”氨基酸所分開。
BPI的生物學(xué)活性類似物包括但不限于重組雜種融合蛋白質(zhì)，它包含BPI全蛋白或其生物學(xué)活性片段，以及至少其他一種其它多肽的至少一部分。該蛋白質(zhì)在Theofan等共同擁有，共同未決的美國專利申請07/885.911及其部分繼續(xù)申請-申請日為1993年5月19日的美國專利申請08/064,693〔代理人備案號為27129/31429〕中進(jìn)行了描述，此處引用其全文以供參考，其中包括的雜種融合蛋白質(zhì)在其氨基末端包含-BPI蛋白質(zhì)或其生物活性片段，在其羧基末端包含一免疫球蛋白重鏈的至少一個恒定區(qū)或其等位變異體。
BPI生物活性類似物也包括但不限于BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物，其中的一個或多個氨基酸殘基被一不同的氨基酸或被非典型的氨基酸所取代。例如在申請日為1993年2月2日共同擁有，共同未決的美國專利申請08/013,801(Theofan等，“穩(wěn)定的殺菌/增強(qiáng)通透性蛋白質(zhì)產(chǎn)物和含有該產(chǎn)物的藥物組合物”)(此處引用以供參考)中公開了BPI和BPI片段的多肽類似物，其中132位或135位的半胱氨酸殘基被一不同的氨基酸所取代。一個命名為rBPI23△Cys的優(yōu)選的蛋白質(zhì)產(chǎn)物含有BPI全蛋白的前199個氨基酸殘基，但其中132位的半胱氨酸殘基被丙氨酸取代。
BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物的投藥優(yōu)選用含有BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物和藥物上可接受的稀釋劑，佐劑或載體的藥物組合物來實現(xiàn)。該BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物組合物可與已知的抗生素、表面活性劑、或其他化學(xué)治療試劑聯(lián)用或不聯(lián)用進(jìn)行投藥。一種優(yōu)選的含BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物的藥物組合物包含BPI濃度為1mg/ml的檸檬酸緩沖鹽水(0.02M檸檬酸，0.15M NaCl，pH5.0)，它含有0.1％(重量)的Poloxamer 188(Pluronic F-68，BASF Wyandotte，Parsippany，NJ)和0.002％(重量)的Polysorbate 80(Tween 80.ICI Americas Inc.，Wilming-ton DE)。該優(yōu)選的組合物在申請日為1993年2月2日的共同擁有，共同未決的美國專利申請08/012.360(McGregor et al.，“改進(jìn)的藥物組合物”)中進(jìn)行了描述，此處引用該說明書以供參考。
用于部分或完全中和肝素的抗凝血活性及此處所述的其他效力的BPI和BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物的有效劑量可被本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)常用參數(shù)(包括受試驗者的大小，給受試驗者施用的肝素量及肝素施用后的時間)很容易檢測出來。
本發(fā)明的其他方面和優(yōu)勢將以下面列出的實施例來理解。實施例1論述了用BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物進(jìn)行肝素結(jié)合的定量之試驗系統(tǒng)；實施例2描述了肝素阻斷細(xì)菌LPS結(jié)合BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物的相對能力；實施例3和4分別提供了BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物抑制抗凝血酶III/肝素復(fù)合物對凝血酶或因子Xa的激活能力的試驗結(jié)果；實施例5涉及BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物對肝素介導(dǎo)的凝血酶時間延長的影響；實施例6涉及BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物對肝素介導(dǎo)的部分凝血致活酶時間延長的影響。實施例7-9涉及在膠原蛋白和細(xì)菌誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎動物模型系統(tǒng)中BPI蛋白產(chǎn)物的投藥倒證對慢性發(fā)炎性疾病癥狀的治療。實施例10-11說明了在小鼠惡性黑素瘤轉(zhuǎn)移模型系統(tǒng)中BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物的血管抑制效力試驗。實施例12論述了BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物對于內(nèi)皮細(xì)胞增生和可能涉及的結(jié)合機(jī)理的影響。實施例13涉及合成的BPI肽的制備。實施例14-16說明了實施例13合成的BPI肽的肝素結(jié)合，LPS結(jié)合和殺菌活性。實施例17涉及其他的合成BPI肽的制備。實施例18-21論述了實施例17肽的特征。實施例22揭示了BPI蛋白水解片段肽的制備。實施例23揭示了BPI蛋白水解片段的殺菌效力。實施例24揭示了BPI蛋白水解片段的肝素結(jié)合特征。實施例25揭示了BPI蛋白水解片段對LAL試驗的影響。
實施例1BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物與肝素的結(jié)合使用與膜結(jié)合的天然和重組BPI分子和放射標(biāo)記的肝素進(jìn)行肝素結(jié)合試驗。簡單地說，在孔底安置有Imobilon-P(Millipore，Bedford.M A)膜的96-孔微滴定板的孔中加入rBPI23和命名為rBPI或rBPI50的全蛋白質(zhì)。每孔加入5μg蛋白質(zhì)?？捉?jīng)干燥隨后以0.1％牛血清白蛋白(BSA)的磷酸鹽緩沖鹽水pH7.4(封閉緩沖液)封閉。3H-肝素(Dupont，NEN，Wiulmington，DE)在封閉緩沖液中稀釋并在含BPI的孔中4℃保溫1小時。吸出未結(jié)合的肝素，孔用封閉緩沖液洗三次，干燥并取出在液閃計數(shù)器中定量。圖1以圖形提供了典型的試驗結(jié)果。BSA在封閉緩沖液中確實對肝素具有較低的親合力和結(jié)合能力，這被認(rèn)為是在生理上不相關(guān)的，因此按常規(guī)從試驗總信號中減去背景。放射標(biāo)記的肝素結(jié)合被過量100倍的未標(biāo)記肝素完全抑制數(shù)據(jù)未顯示)。
以thaumatin對照蛋白(所帶電荷和大小與rBPI23相似)或以洗滌緩沖液(1％BSA)對照進(jìn)行相同試驗比較rBPI23，rBPI50和天然全蛋白(BPI)的肝素結(jié)合。在這些試驗中，觀察到天然和重組BPI全蛋白質(zhì)的肝素結(jié)合較少。rBPI和nBPI結(jié)合的減少程度可能是在蛋白制品中存在碳水化合物污染的結(jié)果。
另外，使用Grafit軟件(Erithicus softward Ltd.，staines，UK)的非線型功能最小化測定了rBPI23，rBPI，魚精蛋白硫酸鹽(SigmaChemical Co.)和thaumatin的以3H-肝素作配體的結(jié)合常數(shù)，結(jié)果如下表1所示
表1以3H-肝素作配體的結(jié)合常數(shù)肝素柱NaCl蛋白質(zhì)Kd能力 洗脫rBPI2379nM 2.63μg0.84MrBPI50173nM 1.30μg0.81M魚精蛋白 8.1nM 2.66μg1.33MThaumatin 無結(jié)合 0.15M實施例2BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物結(jié)合的肝素競爭試驗了肝素，可溶脂A，LPS和磷壁酸質(zhì)與固相E.Coli J5脂A競爭結(jié)合可溶rBPI23的能力。具體地說，用E.coli J5脂A以0.5μg/ml濃度的甲醇溶液(50μl體積)覆蓋Immulon 2(Dynatech，Chin-tilly，VA)微滴定孔。然后孔用含0.1％BSA的PBS 37℃封閉4小時。對照孔只用50μl的甲醇處理再按上述方法封閉。吸出被封閉的孔內(nèi)溶液并用PBS/0.05％Tween-20洗2次。各種濃度的推斷抑制劑以25μl體積的PBS溶液形式加入孔中，接著加入25μl含0.1％Tween-20的200,000cpm放射碘標(biāo)記的rBPI23PBS溶液。試驗溶液包括200μg/ml的明尾蘇達(dá)沙門氏菌(Salmonellaminnesota)R60之Ra LPS，200μg/ml來自E.coli 0113的光滑型LPS(RIBI Immunochem，Hamilton，MT，#R318)；400μg/ml來自糞鏈球菌(Streptococcs faecalis)的脂磷壁酸質(zhì)(Sigma，St.Louis，MO，#L-4015)400μg/ml來自金黃色葡萄球菌(staphylo-coccus Aureus)的脂磷壁酸質(zhì)(Sigma#L-2525)；和400μg/ml的肝素鈉USP注射液(Lypho-Med.Rosemont，IL，#9155-01)。輕輕搖動4℃過夜進(jìn)行結(jié)合，然后吸出孔內(nèi)溶液，用PBS/0.05％Tween-20洗滌3次并計數(shù)，結(jié)果在圖2中列出，表明rBPI23對肝素具有高親合力而且肝素也阻斷脂A對BPI的結(jié)合。
實施例3用BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物進(jìn)行肝素中和BPI對以ATIII/肝素復(fù)合物導(dǎo)致的凝血酶失活的影響使用產(chǎn)色試驗鑒定rBP23對ATIII/肝素復(fù)合物的凝血酶滅活之影響。具體地說，使用一種“ChromostrateTX”抗凝血酶試驗試劑盒(Organon Teknika Corp.Durham.NC)檢測在血漿中以ATII-I/肝素復(fù)合物進(jìn)行的純化凝血酶的抑制作用。
在96孔微滴定板中以每孔200μl的終體積一式三份進(jìn)行試驗。試驗組分的加入次序如下1)50μl終濃度為100，50，25，10和1μg/孔的樣品(rBPI23或用作對照蛋白的thaumatin)PBS溶液；2)50μl血漿的1∶100緩沖液；3)50μl1nkat/ml的凝血酶緩沖液；和4)50μl 1μmol/ml的生色底物水溶液。37℃下進(jìn)行反應(yīng)10分鐘，以50μl 0.1M的檸檬酸終止反應(yīng)，顏色反應(yīng)在微板閱讀器上定量。試驗結(jié)果如圖3所示，表明rBPI23在含肝素的人血漿中能以劑量依賴的方式有效地中和ATIII/肝素復(fù)合物。隨著血漿的滴定，凝血酶活性的總量增加。這由加入的血漿中的抑制性ATIII/肝素復(fù)合物的減少而引起。對照蛋白質(zhì)(thau-matin)無相同的中和效力，其在各種蛋白質(zhì)濃度下的試驗結(jié)果基本上與緩沖液對照一樣。
實施例4以BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物進(jìn)行肝素中和BPI對以ATIII/肝素復(fù)合物導(dǎo)致的因子Xa失活的影響使用產(chǎn)色試驗鑒定rBPI23對由ATIII/肝素復(fù)合物導(dǎo)致的因子Xa中和之影響。具體地說，使用一種Chromostrate肝素抗因子Xa試驗試劑盒(Organon Teknika Corp.)進(jìn)行試驗，試驗在因子Xa和ATHI的濃度固定的條件下進(jìn)行。肝素濃度以在PBS中按濃度為1，0.5，0.25，0.125，0.063，0.031，0.016，0.008，0.004，0.002和0單位/ml變化，以便產(chǎn)生肝素的標(biāo)準(zhǔn)曲線。本試驗以從合成底物中釋放的產(chǎn)色的化合物來測定功能性因子Xa活性。ATIII/肝素復(fù)合物中和因子Xa的活性，因此，在試驗樣品中釋放的發(fā)色團(tuán)量與肝素的抗因子Xa活性的量反相關(guān)。
在96孔微滴定板中以每孔200μl的終濃度一式三份進(jìn)行試驗。試驗組分加入微滴定孔的順序為1)50μl終濃度為100，50，25，10，和1μg/孔的樣品(rBPI23或作為對照蛋白的thaumatin)PBS溶液；2)50μl 0.14nKat.ml的因子Xa水溶液；3)25μl 0.5u/ml的ATIII水溶液；4)24μl 0.25u/ml的肝素緩沖液；5)50μl底物(3μmoles/ml)。37℃下進(jìn)行反應(yīng)10分鐘，以50μl 0.1M檸檬酸終止反應(yīng)，然后在一微板閱讀器上對顏色反應(yīng)進(jìn)行定量。試驗結(jié)果如圖4所示，表明了rBPI23能在因子Xa的ATIII/肝素抑制作用中有效地中和肝素。隨著肝素的濃度增高，中和肝素所需的rBPI23量也增加。對照蛋白thaumatin無相似的中和效力并在所有蛋白質(zhì)濃度下都與緩沖液對照基本等同。
實施例5以BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物進(jìn)行肝素中和BPI對肝素介導(dǎo)的凝血酶時間延長的影響我們檢查了BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物對肝素介導(dǎo)的凝血酶時間(即凝血酶和血漿混合物凝固所需時間)延長的影響。凝血酶時間由于由源性或外源性凝血酶形成抑制劑(如治療上施用的肝素)的存在而延長。中和肝素的抗凝血效力的試劑將減少試驗測定的凝血酶時間。人檸檬酸鹽血漿(200μl)與15μl稀釋劑(0.15M NaCl，0.1M Tris，pH7.4)或15μl含25μg/ml肝素(187單位/mg)的該稀釋劑一起37℃保溫1分鐘。加入15μl體積的各種濃度的rBPI23(從0.0到56μg/ml)，接著立即加入100μl的凝血酶試劑(Sigma ChemicalCo.，No.845-4)。用BBL Fibrometer(Becton Dickenson Micro-biology Systems.Co ckeysvine MD)測定凝血時間(凝血酶時間)。結(jié)果如圖5所示，表明rBPI23抑制肝素介導(dǎo)的凝血酶時間延長。當(dāng)不存在肝素時，即使rBPI23濃度高達(dá)56μl/ml，對該試驗也無影響。
實施例6以BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物進(jìn)行的肝素中和
BPI對部分促凝血酶原激酶時間的影響在施用肝素的大鼠中檢測了rBPI23或魚精蛋白硫酸鹽對部分促凝血酶原激酶時間(PTT)的影響。由于內(nèi)源性或外源性凝血酶形成抑制劑(如治療上施用的肝素)的存在，PTT被延長。中和肝素的抗凝血效力的試劑將減少試驗測定的PTT值。按NIH標(biāo)準(zhǔn)的室內(nèi)由Sprague-Dawley大鼠經(jīng)動物尾靜脈的靜脈內(nèi)注射施用100U/kg肝素，接著施用5mg/kg rBPI23，5mg/kg魚精蛋白硫酸鹽或緩沖液。從預(yù)先麻醉的動物腹主動脈收集的血液樣品測定PTT。也測定了未處理動物的PTT。結(jié)果如圖6所示，表明rBPI23和魚精蛋白對處理過的動物的PTT立即產(chǎn)生影響。這些動物資料證實了實施例2-5所示的BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物的肝素中和效力。
從實施例1到實施例6收集的結(jié)果表明在直接結(jié)合試驗中rBPI23結(jié)合肝素并有效地中和凝血蛋白酶的肝素抑制作用。根據(jù)這些特征，設(shè)計BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物，一般以在功能上與魚精硫酸鹽所推薦的劑量相對應(yīng)的劑量用于肝素抗凝血效力的臨床中和，但它們不具有魚精蛋白嚴(yán)重的降血壓和類過敏性效力。
實施例7BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物對慢性發(fā)炎疾病膠原蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型的療效本發(fā)明的另一方面涉及BPI對治療和預(yù)防慢性發(fā)炎疾病癥狀的影響之用途，慢性炎癥包括類風(fēng)濕性和反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎，牛皮癬，發(fā)炎性腸疾病，節(jié)段性回腸炎，潰瘍性結(jié)腸炎，紅斑狼瘡，自身免疫眼色素層炎，Lyme疾病，和哮喘。提供了治療關(guān)節(jié)炎患者的例證方法，包括施用有效量的BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物以預(yù)防或治療關(guān)節(jié)炎。BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物可局部投藥，或經(jīng)注射(如關(guān)節(jié)內(nèi)，靜脈內(nèi)，肌肉內(nèi)或皮下注射)或經(jīng)腸胃外和非腸胃外方式用藥。
在膠原蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型中研究了施用BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物的效果。具體地說，小鼠關(guān)節(jié)炎的誘導(dǎo)按照Stuat et al.，J.Clin In-vest.，69673-683(1982)的方法在鼠尾基部進(jìn)行牛II型膠原蛋白的皮內(nèi)免疫。一般來說，小鼠在膠原蛋白免疫后的第21天開始形成關(guān)節(jié)炎綜合癥。然后以盲目的方式評價所治療的小鼠關(guān)節(jié)炎程度，在120天的期間內(nèi)，每隔21-25天，以一定劑量的rBPI23，thau-matin對照蛋白，或緩沖液經(jīng)尾靜脈注射治療小鼠。
具體地說，在第0天在尾巴基部經(jīng)皮內(nèi)注射施用牛II型膠原蛋白(Southern Biotechnolgy Associate InC.，Birmingham AL)(0.1mg/小鼠)，試驗在10只雄性小鼠的各組中進(jìn)行，每只小鼠重約20-25g。rBPI23溶于0.5M NaCl，20mM乙酸鈉，pH6.0中，用PBS緩沖液稀釋(1mg/ml)，以0.125mg/小鼠用藥。Thaumatin蛋白質(zhì)的PBS溶液(0.121mg/小鼠)或僅用PBS緩沖液(0.1ml)進(jìn)行投藥作為對照。
結(jié)果如圖7所示，表明rBPI23與PBS緩沖液和thaumatin蛋白質(zhì)對照相比，對減輕所治療的小鼠關(guān)節(jié)炎程度具有統(tǒng)計學(xué)上顯著的效力。
實施例8BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物與魚精蛋白硫酸鹽對慢性發(fā)炎疾病膠原蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型治療效果的比較使用thaumatin蛋白質(zhì)和緩沖液作為對照，用實施例7的膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎模型評價BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物的效果與魚精蛋白硫酸鹽的比較。具體地說，rBPI23溶于0.5M NaCl，20mM乙酸鈉pH6.0中，以PBS緩沖液稀釋(1mg/ml)并以0.125mg/小鼠用藥。其他試驗物質(zhì)按下面劑量用藥魚精蛋白硫酸鹽(Sigma Chemical Co)(0.13mg/小鼠)，thaumatin(0.121mg/小鼠)，PBS緩沖液(0.1ml)。每隔28天到32天，在其尾靜脈處通過靜脈注射對四組10只小鼠的每只中施用試驗或?qū)φ瘴镔|(zhì)。圖8揭示了在28-80天測定的各種治療和對照方案的關(guān)節(jié)炎程度的結(jié)果。圖8中的星號(*)代表rBPI23和緩沖液間統(tǒng)計學(xué)上P＜0.01的顯著差別，而加號(+)代表rBPI23和緩沖液間統(tǒng)計學(xué)上P＜0.05的顯著差別。這些結(jié)果表明在模型系統(tǒng)中對于所治療的小鼠rBPI23明顯減輕關(guān)節(jié)炎程度。
實施例9革蘭氏陰性誘導(dǎo)的反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎模型根據(jù)Yong.et al.，Microbial Pathogenelis，4305-310(1988)的方法在一種小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Yersinia enterocoliti-ca)反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎模型中研究了施用BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物治療反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎的效果。具體地說，預(yù)先通過尾靜脈用小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Yersinia enterocolirica)CWA 08Tz(即，缺失根據(jù)Yong etal.，出處同上的毒性質(zhì)粒)以計算的4×108個細(xì)菌的劑量進(jìn)行靜脈內(nèi)注射誘導(dǎo)DBA/2J雄性小鼠非膿毒性關(guān)節(jié)炎，再對這種小鼠施用BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物。3組15只小鼠的每只在尾靜脈處通過靜脈內(nèi)注射接受試驗或?qū)φ瘴镔|(zhì)。小鼠接受以劑量為大約5.0mg/kg，溶于20mM檸檬酸鈉，150mM氯化鈉，0.1％poloxamer 188，0.002％Polysorbate 80，pH 5.0的緩中液中的rBPI23；以劑量為大約5.0mg/kg，溶于20mM檸檬酸鈉，150mM氯化鈉，0.1％poloxamer188，0.002％polysorbate 80 pH 5.0的緩沖液中的thaumatin蛋白質(zhì)；或僅有緩沖液。結(jié)果如圖9所示，表明BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物與緩沖液或thaumatin對照蛋白相比明顯降低反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率。
Borrelia burgdorferi是引起Lyme疾病和相關(guān)的關(guān)節(jié)炎的病原體，在其細(xì)胞壁上具有一LPS類復(fù)合物，其細(xì)胞壁與E.coli不同但在結(jié)構(gòu)上有關(guān)。在鱟屬(LTmulas)變形細(xì)胞溶胞產(chǎn)物(LAL)抑制試驗中測定了施用BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物對Borreha burgdor feri LPS抑制作用的影響。具體地說，根據(jù)實施例15的方法進(jìn)行LAL試驗，施用2.5μg/ml的rBPI23和2ng/ml的E.coli 0113LPS測定rBPI23對Borrelia burgdorferi LPS的影響。結(jié)果如圖10所示，表明在LAL試驗中，rBPI23中和Borrelia burgdorferi LPS和E.coli 0113LPS的效力。
實施例10BPI在小鼠惡性黑素瘤模型中的效力根據(jù)本實施例，在小鼠惡性黑素瘤轉(zhuǎn)移模型中試驗了BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物，魚精蛋白，和thaumatin蛋白質(zhì)及緩沖液對照的效力。具體地說，在第0天經(jīng)尾靜脈的靜脈注射以105B16F10惡性黑素瘤細(xì)胞接種4組9只C57BL/6J小鼠。在第1，3，6，8，10，13，15，17和19天將rBPI23(0.13mg/小鼠)，魚精蛋白硫酸鹽(0.13mg/小鼠)，thaumatin(0.13mg/小鼠)或PBS緩沖液(0.1ml/小鼠)靜脈注射到小鼠尾靜脈中。在第20天經(jīng)折頸處死動物觀察肺組織。灌注每個肺的肺葉，從氣管往肺里注入3ml水使其膨脹。借助于解剖顯微鏡計數(shù)表面的腫瘤結(jié)，每組發(fā)現(xiàn)的腫瘤數(shù)用于分析統(tǒng)計學(xué)上顯著的差異。盡管數(shù)據(jù)在統(tǒng)計學(xué)上是不顯著的，但用BPI23處理過的動物具有最低腫瘤負(fù)荷，隨后是那些用魚精蛋白，thaumatin蛋白質(zhì)對照和緩沖液對照處理過的動物。統(tǒng)計學(xué)顯著性的缺乏(腫瘤數(shù)不是以反應(yīng)腫瘤的大小)表明需要更特異性的試驗方法學(xué)來鑒定腫瘤負(fù)荷。
實施例11BPI在小鼠惡性黑素瘤模型中的效力在實施例10的小鼠惡性黑素瘤轉(zhuǎn)移模型中再次試驗BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物，魚精蛋白，和thaumatin蛋白質(zhì)和緩沖液對照的效力。具體地說，在第0天用105B16.F10惡性黑素瘤細(xì)胞經(jīng)靜脈內(nèi)注射到尾靜脈中接種6組C57 BL/6J小鼠。在第1，2，5，7，9，12，14，16，和19天rBPI23(0.125mg/小鼠)，魚精蛋白硫酸鹽(0.125mg/小鼠)，thaumatin(0.125mg/小鼠)或PBS緩沖液(在下面表2中列出)經(jīng)靜脈內(nèi)注射到小鼠尾靜脈中。在第20天A-D組的所有動物以折頸處死觀察其肺組織。取出肺并放入燒杯內(nèi)的冷水中。然后灌注每個肺的肺葉，經(jīng)氣管注射3ml水到肺內(nèi)使其膨脹。然后分析表面腫瘤結(jié)中的黑色素含量。
表2組 對照/試驗項目 動物數(shù)A 緩沖液 10B 魚精蛋白10
CThaumatin 10DrBPT2310E緩沖液 5FrBPT235E和F組包含的分別以緩沖液或rBPT23處理的動物不處死，但每天觀察一次其死亡率。圖11顯示了這兩組動物的存活資料。盡管這10只動物在43天內(nèi)全部死亡，但PBI處理過的小鼠一般比未處理的小鼠存活時間明顯延長，這表明BPI具有抗血管形成效力并能減慢黑素瘤腫瘤的轉(zhuǎn)移。
除了上面部分，根據(jù)本發(fā)明的其他方面，BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物可在Miles et al.，VII International Conference on AID，F(xiàn)lorence It-aly，Paper 41(8)，1991的模型系統(tǒng)中用于抑制卡波濟(jì)肉瘤。
實施例12BPI對內(nèi)皮細(xì)胞增生的影響如Bauer，Microvascular Research 37148-161(1989)所述的鼠大腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(EC)在含Earle氏鹽，L-谷氨酰胺和2. 2g/l碳酸氫鈉(Gibco Grand sland，NY，#400-100EB)，加上10％加熱滅活的胎牛血清(Irvine Scientific，Irvine，CA)和1％青霉素/鏈霉素(Gibco，#600-5140AG)的199培養(yǎng)基中傳代。以胰酶-EPTA(Gibco#610-5300PG)消化3分鐘收獲匯合的細(xì)胞。經(jīng)加入10ml培養(yǎng)基到培養(yǎng)瓶中來終止胰酶消化。在標(biāo)準(zhǔn)平底96孔微滴定板中對新收獲的EC進(jìn)行增生試驗。試驗中每孔的終體積保持200μl/孔。每孔共加入含各種濃度的rBPT23，thaumatin對照蛋白或緩沖液對照的4×104EC。在5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時后，每孔加入10μl含1μCi〔甲基-3H〕胸苷的199培養(yǎng)基。脈沖24小時后，經(jīng)胰酶消化玻璃微纖維濾器過濾收集EC細(xì)胞，用一氣相固相成比例的β-計數(shù)器定量摻入的〔3H〕胸苷。
rBPT23對EC細(xì)胞增生的濃度依賴性抑制作用見圖12。當(dāng)孔中加入相同濃度的thaumatin或等體積的緩沖液時觀察不到效果。最先觀察到的增生抑制作用為12.4μg/ml rBPI23，效力最大時為50μg/ml。已知EC細(xì)胞的生長依賴于小牛血清中的FGF-2(bFGF)，而FGF-2需要細(xì)胞表面的乙酰肝素用于受體激活(Yayonet al.，Cell64841-848，1991)。在不打算受本發(fā)明的理論束縛的情況下，認(rèn)為rBPT23與EC細(xì)胞表面的乙酰肝素結(jié)合干擾了細(xì)胞被FGF-2激活。
從匯合的培養(yǎng)瓶中收獲傳代10次的細(xì)胞，用胰酶消化的細(xì)胞重懸于12.5nl培養(yǎng)基中進(jìn)行rBPT23對EC細(xì)胞的直接結(jié)合試驗。在標(biāo)準(zhǔn)24孔組織培養(yǎng)板的每孔中加入0.5ml懸液并培養(yǎng)過夜。用0.1％牛血清白蛋白的鈣鎂磷酸鹽緩沖液(Gibco)洗滌平板。洗滌后，每孔加入0.5ml的BSA/PBS。初步實驗表明每孔加入50ng/ml的125I-標(biāo)記的rBPT23，4℃培養(yǎng)3小時，以PBS洗滌3次，再用1M NaOH溶胞后，由溶胞產(chǎn)物的γ射線計數(shù)得到大約30,000比cpm。
50ng/ml的125I-標(biāo)記的“熱”rBPI23與EC細(xì)胞特異性的結(jié)合可經(jīng)加入20μg/ml肝素(Sigma Grade I)進(jìn)行競爭。往結(jié)合培養(yǎng)物中加入未標(biāo)記的(“冷”)rBPT23可觀察到相似的競爭。未標(biāo)記的rBPT23與肝素的混合物(同時加入或預(yù)先混合后加入)不能使結(jié)合減少到低于僅用肝素競爭(圖13)。這些資料表明rBPT23經(jīng)肝素樣分子與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合，并且該結(jié)合似乎干擾對肝素結(jié)合生長因子(FGF-2)的EC細(xì)胞增生。
實施例13BPI 15殘基合成肽的制備為了試驗BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物肽片段的生物學(xué)活性，制備了以BPI 23KD氨基末端片段為基礎(chǔ)的15個氨基酸殘基的合成肽，并評價其肝素結(jié)合活性，在鱟屬(Limulus)變形細(xì)胞溶胞產(chǎn)物抑制(LAL)試驗中的活性和殺菌活性。具體地說，以上述rBPT23序列為基礎(chǔ)，以副本的形式制備了47種合成肽，每種含15個氨基酸，并且相鄰肽有11個氨基酸重疊。
根據(jù)Maeji et al.，mmunol、Methods，13423-33(1990)和Gammon et al.，J.Exp.Med.，173609-617(1991)的方法，在Coselco Mimotopes Pty Ltd的許可下使用Cambridge ResearchBiochemicals Lid的固相技術(shù)同時合成肽。簡單地說，特rBPT23(1-199)序列分成47個不同的15殘基肽，每到第15個氨基酸便出現(xiàn)下一個肽，這47個肽沿rBPT23的線型序列延伸。該肽的合成在技術(shù)上允許在96-孔板上安置的分開的栓上對多個肽以小批量同時進(jìn)行合成。因此，94個單獨的栓用于該合成，剩余的栓(B，B)不加活化的FMOC氨基酸與其他栓進(jìn)行相同的步驟。使用含水堿性緩沖液(碳酸鈉，pH 8.3)從固相栓支持物上進(jìn)行15殘基肽的最終裂解。在這些產(chǎn)生裂解肽(在每個肽羧基末端具有環(huán)(賴氨酰脯氨酰)部分)的條件下，與栓的單一連接經(jīng)歷了一個定量的環(huán)縮二氨酸的環(huán)化過程。氨基末端不乙?；?，以便使自由氨基具有產(chǎn)生陰離子結(jié)合反應(yīng)的潛力。從每孔中回收的15殘基肽平均大約各為15μg。
實施例14BPI 15殘基合成肽的肝素結(jié)合根據(jù)實施例1所述的方法將上述合成的BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物肽用于肝素結(jié)合試驗。結(jié)果如圖14所示，表明存在3個分開的功能區(qū)具有肝素結(jié)合活性；第一個大約從氨基酸21延伸到55，第二個大約從氨基酸65延伸到107；第3個從氨基酸137延伸到171。來自空白對照栓上的物質(zhì)無肝素結(jié)合效力。
實施例15BPI 15殘基合成肽對LCL試驗的影響合成的BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物肽用于進(jìn)行鱟屬(Limulus)變形細(xì)胞溶胞產(chǎn)物(LAL)抑制試驗以鑒定LPS結(jié)合特征。具體地說，合成的BPI肽在Eppendorf管中與固定濃度的E.Coli 0113 LPS(4ng/ml終濃度)混合37℃保溫3小時并不時搖動。也試驗了含0.05μg/ml的加入量對照。保溫后，每管加入360μl D-PBS以得到200pg/ml的LPS濃度用于LAL試驗。然后樣品以每孔50μl體積轉(zhuǎn)移到Im-mulon II帶(Dynatech，Chantilly，VA)上。
每孔加入50μl鱟屬(Limulus)變形細(xì)胞溶胞產(chǎn)物(定量產(chǎn)色LAL試劑盒，Whitaker Bioproduct，Inc.，Walkersville，MD)，室溫培養(yǎng)25分鐘。然后每孔加入100μl體積的產(chǎn)色底物并混勻。室溫培養(yǎng)20到30分鐘后，加入100μl乙酸終止反應(yīng)。然后在多板閱讀器(Vmax，Molecular Dynamics，Menlo Park，CA)上測量405nm下的光密度，圖15所示的是在LPS抑制百分?jǐn)?shù)方面的結(jié)果。圖15的資料表明至少3個主要區(qū)域具有明顯的LAL抑制作用第1個從氨基酸17延伸到55；第2個大約從氨基酸73延伸到99，第3個大約從氨基酸137延伸到163。其他個別肽也表現(xiàn)出LAL抑制作用。作為對照，來自空白對照栓上的物質(zhì)用LAL試驗測量不表現(xiàn)出LPS中和效力。
實施例16BPI 15殘基合成肽的殺菌效力在一放射擴(kuò)散試驗中試驗了合成的BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物肽對粗糙型突變E.Coli J5細(xì)菌的殺菌效力。具體地說，E.coli J5的過夜培養(yǎng)物用新鮮的胰蛋白酶大豆培養(yǎng)基按1∶50稀釋，37℃培養(yǎng)3小時達(dá)到對數(shù)期。然后在Sorvall RT6000B中以3000rpm離心5分鐘沉淀細(xì)菌，加入5ml 10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.4)，制品再次離心。棄去上清液，加入5ml新鮮緩沖液重懸細(xì)菌，經(jīng)在590nm下測量吸光率測定其濃度。1.25×109CFU/ml的懸液吸光率等于1.00。細(xì)菌在100ml熔化的鋪底瓊脂糖(大約45℃)中稀釋成4×106CFU/ml并以用于該用途的15ml聚丙烯管反復(fù)倒轉(zhuǎn)混合。
管內(nèi)的全部內(nèi)容物倒入完全水平的方形培養(yǎng)皿中，經(jīng)敲擊培養(yǎng)皿各側(cè)面使分布均勻。瓊脂糖不超過30秒變硬，并且有相同的厚度約為1nm。然后用一無菌的與真空裝置相連的3mm打孔器在變硬的瓊脂糖上打一系孔的孔。打孔器用100％乙醇滅菌并空氣干燥。
10μl合成的BPI肽小心吸移到每孔中，作為對照，在一單獨的孔中加入pH 8.3的緩沖液，作為陽性對照，也加入5μg/ml和1μg/ml濃度的rBPT23。另外，試驗來自空白栓B和B的產(chǎn)物作為對照。平板37℃培養(yǎng)3小時，然后往水平培養(yǎng)皿中加入10ml的熔化覆蓋瓊脂糖(大約45℃)，使其變硬并37℃培養(yǎng)過夜。與菌苔相反，在那些具有殺菌活性的孔中以菌苔為背景看到一清晰的環(huán)帶。為了提高這些環(huán)帶的可見性，往瓊脂上注入稀的考馬斯溶液(0.002％考馬斯亮蘭，27％甲醇，15％甲醛(37％貯液)和水)染色24小時。用Mitutoyo測微尺測量細(xì)菌環(huán)帶。
試驗結(jié)果如圖16所示，其中所示唯一具有殺菌活性的合成BPI肽是與氨基酸85-99相對應(yīng)的片段。陽性rBPT23對照也具有殺菌效力，而緩沖液和空白栓對照無殺菌效力。
實施例17BPI肽片段的制備根據(jù)實施例13到16重疊肽的試驗結(jié)果，按照Merrifield.J.Am Chem.Soc.852149(1963)和Merrifield et al.，Anal，Chem381905-1914(1966)的方法，使用Applied Biosystems.Inc.Model 432合成儀，經(jīng)固相肽合成制備BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物肽片段。制備的9種BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物肽命名的BPI-2到BPI-10，它們具有如下表3所列出的rBPT231-199氨基酸殘基中的部分氨基酸序列。例如BPI-7，BPI-9和BPI-10肽代表部分或甚至多次重復(fù)的序列。具體地說，BPI-7含有20個殘基，由氨基酸殘基90-99在單一線型鏈上重復(fù)兩次組成。BPI-10含有30個殘基，由氨基酸殘基90-99在單一線型鏈上重復(fù)3次組成。BPI-9含有16個殘基，在單一線型鏈上含有氨基酸殘基94-99，隨后是殘基90-99。
表3蛋白質(zhì)產(chǎn)物肽
實施例18用BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物肽進(jìn)行肝素結(jié)合在本實施例中，根據(jù)實施例1所示的方法對BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物肽BPI-2、BPI-3、BPI-4、BPI-6、BPI-7，BPI-8以及BPI cys進(jìn)行肝素結(jié)合試驗。結(jié)果如圖17所示，表明BPI-7和BPI-8具有極高的肝素結(jié)合能力，而BPI-2和BPI-3具有中等偏高的肝素結(jié)合能力，BPI-4和BPI-6具有很小或無肝素結(jié)合能力。
實施例19用BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物肽進(jìn)行肝素中和在本實施例中，根據(jù)實施例3的方法，對BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物肽BPI-2，BPI-3，BPI-4，BPI-5，BPI-6，BPI-7和BPI-8以及rBPI23進(jìn)行試驗以測定它們對ATIII/肝素復(fù)合物引起的凝血酶失活的影響。施用范圍為1.0μg/ml到100μg/ml的各種濃度的BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物以測定其影響。BPI蛋白質(zhì)肽BPI-7，BPI-3和BPI-5分別具有最顯著的肝素中和效力，如圖18a和18b所示，其中所描繪的樣品濃度分別為重量或摩爾濃度。
實施例20BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物肽對LAL試驗的影響在本實施例中，根據(jù)實施例15的方法，對BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物肽BPI-2，BPI-3，BPI-4，BPI-6，BPI-7和BPI-8以及rBPI23進(jìn)行LAL試驗以測定其LPS結(jié)合和抑制特性。結(jié)果表明BPI-7和BPI-3具有顯著的LPS抑制特性，BPI-2和BPI-8具有中等程度的LPS抑制特性，BPI-4和BPI-6無顯著的LPS抑制活性，如圖19a和19b所示，其中所描述繪的樣品濃度分別為重量或摩爾濃度。
實施例21BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物肽的殺菌試驗在本實施例中，根據(jù)實施例16的方法，試驗了BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物肽BPI-2，BPI-3，BPI-4，BPI-5，BPI-6，BPI-7，BPI-8，BPI-9和BPI-10以及rBPI23在放射擴(kuò)散試驗中對突變型E.coliJ5(粗糙型)和E.coli0111B4(光滑型)細(xì)菌的殺菌效力。結(jié)果在圖20a至20d中描繪出，顯示出BPI-2，BPI-3，BPI-5，BPI-7，BPI-8，BPI-9和BPI-10各自具有或大或小程度的殺菌活性，而BPI-4和BPI-6不表現(xiàn)出殺菌活性。每個殺菌肽傾向于對粗糙型比對光滑型E.coli菌株更有效。
本實施例的另一方面，進(jìn)行培養(yǎng)抗菌試驗以測定某些BPI肽的殺菌活性。具體地說，從瓊脂平板的單個菌落中挑選E.coli J5(粗糙型)和E.coli 0111B4(光滑型)細(xì)菌，并用于接種到加有一系列10倍稀釋的BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物肽的培養(yǎng)平板上。平板培養(yǎng)過夜并在ELISA板面讀器上讀數(shù)以測定存活的菌落形成單位。該試驗的結(jié)果在圖20e(E.coli J5)和20f(E.coli 0111B4)中描繪出，顯示了BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物肽BPI-3，BPI-7，BPI-9和BPI-10具有顯著的抗菌活性。
這些殺菌試驗以及肝素結(jié)合和LAL試驗的結(jié)果表明存在具有一種或多種殺菌、肝素結(jié)合和LPS中和效力的小型合成的BPI肽，并且在23KD氨基末端片段中至少存在3個明顯分離的功能區(qū)。一個功能區(qū)位于氨基酸殘基17和45之間，第二個功能區(qū)在3個試驗的活性鑒定中活性最強(qiáng)，位于氨基酸71和99之間。一個特異性的肽86-99在所有3個試驗中均證實具有活力。第三個功能區(qū)由殘基142-169組成。
實施例22BPI蛋白水解片段肽的制備在本實施例中，對rBPI23運用化學(xué)裂解和酶消化過程，根據(jù)Gazzano-Santoro et al(出處同上)的程序生產(chǎn)，以形成各種大小的重組蛋白質(zhì)的蛋白水解片段。
rBPI23在用溴化氰(CNBr)或蛋白內(nèi)切酶ASP-N進(jìn)行蛋白水解前先被還原和烷基化。蛋白質(zhì)以冷(4℃)丙酮沉淀法(1∶1V/V)脫鹽過夜，并經(jīng)離心(5000×g)10分鐘沉淀。rBPI23沉淀用冷丙酮洗滌2次并在氮氣流下干燥。然后rBPI23在8M尿素/0.1M Tris，pH8.1中重新配成1mg/ml的溶液，經(jīng)加入3.4mM二硫蘇糖醇(Calbiochem，San Diego.CA)37℃處理90分鐘來還原。經(jīng)加入碘乙酰胺(Sigma Chemical Co.，St，louis，MO)至終濃度為5.3微摩爾在室溫黑暗中處理30分鐘進(jìn)行烷基化。還原和烷基化的蛋白質(zhì)按上面所述進(jìn)行丙酮沉淀，離心和洗滌，沉淀再熔解以備CNBr或Asp-N消化。
在加入CNBr前，洗過的沉淀溶于70％的三氟乙酸(TFA)(蛋白質(zhì)測序級，Sigma)中使最終蛋白質(zhì)濃度為5mg/ml。加入溶于70％TFA中的溴化氰(Baker Analyzed Reagent，VWR Scienti-fuc，San Francisco.(A)使最終CNBr與蛋白質(zhì)之比(W/W)為2∶1。這樣CNBr大約比蛋白質(zhì)中甲硫氨酸殘基摩爾數(shù)過量75倍。用氮凈化反應(yīng)，并在室溫、黑暗中進(jìn)行24小時。經(jīng)加入9體積的蒸餾水終止反應(yīng)，隨后冷凍(-70℃)并凍干。
還原和烷基化的rBPI23以510mg/ml溶于8M尿素/0.1MTris，pH 8.1中。加入等體積0.1M Tris，pH8.1，使最終狀態(tài)為2.5mg/ml蛋白質(zhì)存在于5M尿素/0.1M Tris，pH8.1中。來自莓實假單胞菌(Pseudomonas fragi)的蛋白質(zhì)內(nèi)切酶Asp-N(Boehrinyer-Mannheim，Indianapolis，IN)按酶∶底物比為1∶1000(W/W)加入，37℃消化6小時。經(jīng)加入TFA至終濃度為0.1％來終止反應(yīng)，然后樣品以反相HPLC分餾。
在Zorbax蛋白質(zhì)加C3柱(4.6×250mm，300A孔徑，MAC-MOD Analytical InC.Chadsford，PA)上純化CNBr和Asp-N片段混合物。在2小時內(nèi)以1.0ml/分的流速用梯度從5％乙腈的0.1％TFA溶液到80％乙腈的0.1％TFA溶液進(jìn)行洗脫。用Beekman System Gold HPLC在220mm下監(jiān)測片段的洗脫。使柱的加熱室維持在35℃并手工收集餾分，-70℃冷凍并在Speed Vac濃縮器中干燥。用前片段再溶于20mM乙酸鈉，pH 4.0/0.5M NaCl中。
由Francis Bitsch博士和John Kim先生在兒童醫(yī)院-澳克蘭研究所，Cedric Shackleton博士實驗室中使用VG Bio-Q質(zhì)譜儀進(jìn)行電噴射電離質(zhì)譜測量。經(jīng)過數(shù)據(jù)的數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)移得到分子質(zhì)量。
盡管rBPI23DNA序列編碼成熟蛋白質(zhì)的1-199氨基酸殘基，但以電噴射電離質(zhì)譜測量(ESI-MS)鑒定出大部分該蛋白質(zhì)，它是在Leu-193和Val 195截斷而產(chǎn)生的。經(jīng)過分離被測序并以ESI-MS分析過的C端胰蛋白酶水解肽，證實了這些C端截短物。在56，70，100，111，170，和196位有6個甲硫氨酸殘基，預(yù)計用溴化氰進(jìn)行化學(xué)裂解產(chǎn)生6個主要肽片段。CNBr裂解實驗的結(jié)果在表4中進(jìn)行了小結(jié)。用反相(C3)HPLC(圖21A)分離出這些片段并用Ed-man降解法測定了其N-端序列。以C3HPLC柱未能解析出兩個最大的片段(C1和C5)，而且進(jìn)一步用離子交換色譜解析它們的嘗試也已失敗，假設(shè)的原因為它們的長度和等電點相似。用ESI-MS鑒定了混合物中C1，C5片段的一致性?？紤]到在CNBr的裂解反應(yīng)中C端甲硫氨酸轉(zhuǎn)化為高絲氨酸引起30a.m.u的喪失，預(yù)計G的質(zhì)量為6269(表4)。觀察到的質(zhì)量為6251.51±0.34，它與高絲氨酸內(nèi)酯中間體中喪失了一個水分子(18a.m.u)是一致的，由于C1片段C一端氨基酸的疏水性，該中間體可能比高絲氨酸的形成更有利。C5片段預(yù)計的質(zhì)量為6487，觀察到的質(zhì)量是6385.84±0.39(表1)。對于C5片段，由于C端氨基酸是親水的，所以高絲氨酸內(nèi)酯中間體的水解可能更有利。從N端測序和質(zhì)譜數(shù)據(jù)來看，C5組分代表了C1/C5混合物中大約10-25％的物質(zhì)。
用蛋白質(zhì)內(nèi)切酶對包含在CNBr C1/C5混合物內(nèi)的區(qū)域進(jìn)行蛋白水解的裂解以提供更多的片段。在rBPI23序列內(nèi)有6個天冬氨酸殘基，位于15，36，39，57，105和116位。以C3HPLC(圖21B)分離的6個主要Asp-N片段被測序并以EsI-Ms(表4)測定了其質(zhì)量。用酶∶底物為1∶1000(W/W)進(jìn)行短期消化以消除潛在的非特異性斷裂，尤其是在谷氨酸位點。由于分離到一個Asp殘基(氨基酸15和35)未被裂解的片段(1-38)，它證明了消化一旦完成就不再繼續(xù)。Asp-N片段的質(zhì)譜與預(yù)測的各個片段的質(zhì)量一致。不象CNBr裂解，其中的C端片段很難分辯，Asp-N片段從氨基酸116到G末端能很好地從所有其他Asp-N片段中分辯出。
表4rBPI23裂解片段分析的小結(jié)
實施例23BPI蛋白水解片段的殺菌效力篩選根據(jù)實施例22形成的BPI蛋白水解片段在基本上根據(jù)實施例16程序的放射擴(kuò)散試驗中對粗糙型突變E.coli J5細(xì)菌的殺菌效力。當(dāng)試驗量高達(dá)25pmol/孔時，由CNBr或Asp-N消化產(chǎn)生的rEPT23片段證實無殺菌活性。在本試驗中用每孔含量小到0.75pmol的rBPT23仍檢測到可測量的殺菌活性。還原的并烷基化的rBPT23(高達(dá)100pmol/孔)也不能殺菌，而烷基化的rBPT23保持與rBPT23相等的殺菌活性。
實施例24用BPI蛋白水解片段進(jìn)行肝素結(jié)合根據(jù)實施例22形成的rBPT23和BPI蛋白水解片段基本上按照實施例1的程序用于肝素結(jié)合試驗。
CNBr的片段的肝素結(jié)合在含飽和濃度的3H-肝素(20μg/ml)的每孔中使用100微微摩爾的各片段進(jìn)行測量。結(jié)果如表5所示(兩份孔的平均值加上或減去兩值之差)，表明含有氨基酸71-100(C3)和1-56及112-170(C1，5)的CNBr片段結(jié)合肝素的程度相似。CNBr片段171-193也結(jié)合比對照蛋白質(zhì)(thaumatin，一種與rBPT23分子量和電荷相似的蛋白質(zhì))更多的肝素。
Asp-N片段也證實在rBPT23中有多個肝素結(jié)合區(qū)。見表5，57-104 Asp-N片段結(jié)合最高量的肝素，隨后是1-38和116-193片段。這些資料與CNBr片段資料一起表明在rBPT23中至少有3個分離的肝素結(jié)合區(qū)，其中結(jié)合能力最高的是在殘基71-100內(nèi)。
表5rBPI23片段的肝素結(jié)合
實施例25BPI蛋白水解片段對LAL試驗的影響根據(jù)實施例22形成的BPI蛋白水解片段用于基本上根據(jù)實施例15的LAL抑制試驗，結(jié)果如圖22所示，其中實心三角代表rBPT23；空心圈代表Asp-N片段A3；實心圈代表Asp-N片段A2，空心方框代表Asp-N片段A3；實心方框代表Asp-N片段A1A2；空心三角代表Asp-N片段A6b；小空心三角代表CNBr片段C3；小實心方框代表CNBr片段C1/C5。
含有氨基酸片段1-56和112-170的CNBr消化片段以IC50為大約100nM抑制LPS誘導(dǎo)的LAL反應(yīng)。在相同試驗中，該IC50大約比rBPT23的IC50(9nm)高10倍。其他CNBr消化片段無抑制活性。
對Asp-N消化產(chǎn)生的片段觀察到的結(jié)果略有不同，其中發(fā)現(xiàn)3個片段在LAL試驗中具有抑制力。與氨基酸116-193相應(yīng)的片段表現(xiàn)出與完整rBPT23相似的LAL抑制活性，在15nM下能完全抑制LPS誘導(dǎo)的LAL反應(yīng)。與氨基酸57-104和1-38相應(yīng)的片段也抑制LAL試驗，但所需量高10倍。這些結(jié)果與CNBr消化結(jié)果一起表明在rBPT23分子中至少3個區(qū)域具有中和LAL反應(yīng)中LPS激活的能力，其中具有最高效力的區(qū)域看來存在于116-193氨基酸片段內(nèi)。
在實施例22的蛋白水解片段的有關(guān)試驗中，涉及使用能封閉rBPT23殺菌和LAL抑制特性的兔多克隆抗-rBPT23抗體和兩種不同的無封閉性的小鼠抗rBPT23單克隆抗體的ELISA試驗。發(fā)現(xiàn)多克隆抗體能與116-193和57-104 Asp-N片段以及1-56和112-170 CNBr片段發(fā)生免疫反應(yīng)，而鼠單克隆抗體僅與代表rBPT23殘基1-4的Asp-N片段發(fā)生反應(yīng)。
總之，該結(jié)果表明rBPT23含有3個有助于該分子全部生物學(xué)活性的功能區(qū)。第一個功能區(qū)在氨基酸17-45序列中并被36位殘基的Asp-N裂解破壞。這一功能區(qū)在對LPS誘導(dǎo)的LAL活性及肝素結(jié)合試驗的抑制作用中均具有中等程度的活性。第二個活性功能區(qū)在氨基酸65-99區(qū)域中，它對LPS誘導(dǎo)的LAL活性的抑制作用被70位殘基的CNBr裂解消除。這一功能區(qū)也表現(xiàn)出最高肝素結(jié)合能力并含有殺菌肽85-99。第3個活性功能區(qū)在氨基酸142-169之間，在LPS誘導(dǎo)的LAL刺激試驗中具有抑制活性并在3個功能區(qū)中表現(xiàn)出最低的肝素結(jié)合能力。
其他殺菌蛋白質(zhì)，如Cecropins和magainins，其特征為含有為其活性所必需的一連續(xù)的親水脂的α-螺旋區(qū)。在LPS結(jié)合/殺菌分子的陽離子/疏水部位和肝素結(jié)合蛋白的同感序列間觀察到高度結(jié)構(gòu)相似性。在結(jié)合肝素的合成rBPT23肽與那些抑制LPS誘導(dǎo)的LAL反應(yīng)的分子間存在極好的相關(guān)性(r＝0.75，p＝0.0001，n＝47)(圖14至16)。這些資料表明LPS和肝素對于與其相互作用的蛋白質(zhì)而言可能呈現(xiàn)相似的電荷排列。因此，其他與LPS以高親合力結(jié)合的蛋白質(zhì)，也可能與肝素緊密結(jié)合。
根據(jù)本發(fā)明提供的優(yōu)選實施例，以本發(fā)明的方法產(chǎn)生各種修飾型和變異體對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是可預(yù)料到的。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，設(shè)計了治療革蘭氏陰性細(xì)菌感染及其后遺癥的方法，包括施用具有革蘭氏陰性殺菌活性的BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物肽。因此，在本發(fā)明范圍上出現(xiàn)的唯一限制是所附權(quán)利要求中的內(nèi)容。
~EV~0360138.030903.6.SEQLIST.TXTCPCH0360138D序列表<110>XOMA CORPORATION<120>殺菌/增強(qiáng)通透性蛋白質(zhì)產(chǎn)物的治療應(yīng)用<130>31580<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1813<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(31)..(1491)<223><220><221>mat_peptide<222>(124)..(1491)<223><220><221>misc_feature<223>rBPI<400>1caggccttga ggttttggca gctctggagg atg aga gag aac atg gcc agg ggc54Met Arg Glu Asn Met Ala Arg Gly-30 -25cct tgc aac gcg ccg aga tgg gtg tcc ctg atg gtg ctc gtc gcc ata 102Pro Cys Asn Ala Pro Arg Trp Val Ser Leu Met Val Leu Val Ala Ile-20 -15 -10ggc acc gcc gtg aca gcg gcc gtc aac cct ggc gtc gtg gtc agg atc 150Gly Thr Ala Val Thr Ala Ala Val Asn Pro Gly Val Val Val Arg Ile-5 -1 1 5tcc cag aag ggc ctg gac tac gcc agc cag cag ggg acg gcc gct ctg 198
~EV~0360138.030903.6.SEQLIST.TXTSer Gln Lys Gly Leu Asp Tyr Ala Ser Gln Gln Gly Thr Ala Ala Leu10 15 20 25cag aag gag ctg aag agg atc aag att cct gac tac tca gac agc ttt 246Gln Lys Glu Leu Lys Arg Ile Lys Ile Pro Asp Tyr Ser Asp Ser Phe30 35 40aag atc aag cat ctt ggg aag ggg cat tat agc ttc tac agc atg gac 294Lys Ile Lys His Leu Gly Lys Gly His Tyr Ser Phe Tyr Ser Met Asp45 50 55atc cgt gaa ttc cag ctt ccc agt tcc cag ata agc atg gtg ccc aat 342Ile Arg Glu Phe Gln Leu Pro Ser Ser Gln Ile Ser Met Val Pro Asn60 65 70gtg ggc ctt aag ttc tcc atc agc aac gcc aat atc aag atc agc ggg 390Val Gly Leu Lys Phe Ser Ile Ser Asn Ala Asn Ile Lys Ile Ser Gly75 80 85aaa tgg aag gca caa aag aga ttc tta aaa atg agc ggc aat ttt gac 438Lys Trp Lys Ala Gln Lys Arg Phe Leu Lys Met Ser Gly Asn Phe Asp90 95 100 105ctg agc ata gaa ggc atg tcc att tcg gct gat ctg aag ctg ggc agt 486Leu Ser Ile Glu Gly Met Ser Ile Ser Ala Asp Leu Lys Leu Gly Ser110 115 120aac ccc acg tca ggc aag ccc acc atc acc tgc tcc agc tgc agc agc 534Asn Pro Thr Ser Gly Lys Pro Thr Ile Thr Cys Ser Ser Cys Ser Ser125 130 135cac atc aac agt gtc cac gtg cac atc tca aag agc aaa gtc ggg tgg 582His Ile Asn Ser Val His Val His Ile Ser Lys Ser Lys Val Gly Trp140 145 150ctg atc caa ctc ttc cac aaa aaa att gag tct gcg ctt cga aac aag 630Leu Ile Gln Leu Phe His Lys Lys Ile Glu Ser Ala Leu Arg Asn Lys155 160 165atg aac agc cag gtc tgc gag aaa gtg acc aat tct gta tcc tcc aag 678Met Asn Ser Gln Val Cys Glu Lys Val Thr Asn Ser Val Ser Ser Lys170 175 180 185ctg caa cct tat ttc cag act ctg cca gta atg acc aaa ata gat tct 726Leu Gln Pro Tyr Phe Gln Thr Leu Pro Val Met Thr Lys Ile Asp Ser190 195 200gtg gct gga atc aac tat ggt ctg gtg gca cct cca gca acc acg gct 774Val Ala Gly Ile Asn Tyr Gly Leu Val Ala Pro Pro Ala Thr Thr Ala
~EV~0360138.030903.6.SEQLIST.TXT205 210 215gag acc ctg gat gta cag atg aag ggg gag ttt tac agt gag aac cac 822Glu Thr Leu Asp Val Gln Met Lys Gly Glu Phe Tyr Ser Glu Asn His220 225 230cac aat cca cct ccc ttt gct cca cca gtg atg gag ttt ccc gct gcc 870His Asn Pro Pro Pro Phe Ala Pro Pro Val Met Glu Phe Pro Ala Ala235 240 245cat gac cgc atg gta tac ctg ggc ctc tca gac tac ttc ttc aac aca 918His Asp Arg Met Val Tyr Leu Gly Leu Ser Asp Tyr Phe Phe Asn Thr250 255 260 265gcc ggg ctt gta tac caa gag gct ggg gtc ttg aag atg acc ctt aga 966Ala Gly Leu Val Tyr Gln Glu Ala Gly Val Leu Lys Met Thr Leu Arg270 275 280gat gac atg att cca aag gag tcc aaa ttt cga ctg aca acc aag ttc 1014Asp Asp Met Ile Pro Lys Glu Ser Lys Phe Arg Leu Thr Thr Lys Phe285 290 295ttt gga acc ttc cta cct gag gtg gcc aag aag ttt ccc aac atg aag 1062Phe Gly Thr Phe Leu Pro Glu Val Ala Lys Lys Phe Pro Asn Met Lys300 305 310ata cag atc cat gtc tca gcc tcc acc ccg cca cac ctg tct gtg cag 1110Ile Gln Ile His Val Ser Ala Ser Thr Pro Pro His Leu Ser Val Gln315 320 325ccc acc ggc ctt acc ttc tac cct gcc gtg gat gtc cag gcc ttt gcc 1158Pro Thr Gly Leu Thr Phe Tyr Pro Ala Val Asp Val Gln Ala Phe Ala330 335 340 345gtc ctc ccc aac tcc tcc ctg gct tcc ctc ttc ctg att ggc atg cac 1206Val Leu Pro Asn Ser Ser Leu Ala Ser Leu Phe Leu Ile Gly Met His350 355 360aca act ggt tcc atg gag gtc agc gcc gag tcc aac agg ctt gtt gga 1254Thr Thr Gly Ser Met Glu Val Ser Ala Glu Ser Asn Arg Leu Val Gly365 370 375gag ctc aag ctg gat agg ctg ctc ctg gaa ctg aag cac tca aat att 1302Glu Leu Lys Leu Asp Arg Leu Leu Leu Glu Leu Lys His Ser Asn Ile380 385 390ggc ccc ttc ccg gtt gaa ttg ctg cag gat atc atg aac tac att gta 1350Gly Pro Phe Pro Val Glu Leu Leu Gln Asp Ile Met Asn Tyr Ile Val395 400 405
~EV~0360138.030903.6.SEQEIST.TXTccc att ctt gtg ctg ccc agg gtt aac gag aaa cta cag aaa ggc ttc1398Pro Ile Leu Val Leu Pro Arg Val Asn Glu Lys Leu Gln Lys Gly Phe410 415 420 425cct ctc ccg acg ccg gcc aga gtc cag ctc tac aac gta gtg ctt cag1446Pro Leu Pro Thr Pro Ala Arg Val Gln Leu Tyr Asn Val Val Leu Gln430 435 440cct cac cag aac ttc ctg ctg ttc ggt gca gac gtt gtc tat aaa1491Pro His Gln Asn Phe Leu Leu Phe Gly Ala Asp Val Val Tyr Lys445 450 455tgaaggcacc aggggtgccg ggggctgtca gccgcacctg ttcctgatgg gctgtggggc 1551accggctgcc tttccccagg gaatcctctc cagatcttaa ccaagagccc cttgcaaact 1611tcttcgactc agattcagaa atgatctaaa cacgaggaaa cattattcat tggaaaagtg 1671catggtgtgt attttaggga ttatgagctt ctttcaaggg ctaaggctgc agagatattt 1731cctccaggaa tcgtgtttca attgtaacca agaaatttcc atttgtgctt catgaaaaaa 1791aacttctggt ttttttcatg tg 1813<210>2<211>487<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<220><221>misc_feature<223>rBPI<400>2Met Arg Glu Asn Met Ala Arg Gly Pro Cys Asn Ala Pro Arg Trp Val-30 -25 -20Ser Leu Met Val Leu Val Ala Ile Gly Thr Ala Val Thr Ala Ala Val-15 -10 -5 -1 1Asn Pro Gly Val Val Val Arg Ile Ser Gln Lys Gly Leu Asp Tyr Ala5 10 15
~EV~0360138.030903.6.SEQLIST.TXTSer Gln Gln Gly Thr Ala Ala Leu Gln Lys Glu Leu Lys Arg Ile Lys20 25 30Ile Pro Asp Tyr Ser Asp Ser Phe Lys Ile Lys His Leu Gly Lys Gly35 40 45His Tyr Ser Phe Tyr Ser Met Asp Ile Arg Glu Phe Gln Leu Pro Ser50 55 60 65Ser Gln Ile Ser Met Val Pro Asn Val Gly Leu Lys Phe Ser Ile Ser70 75 80Asn Ala Asn Ile Lys Ile Ser Gly Lys Trp Lys Ala Gln Lys Arg Phe85 90 95Leu Lys Met Ser Gly Asn Phe Asp Leu Ser Ile Glu Gly Met Ser Ile100 105 110Ser Ala Asp Leu Lys Leu Gly Ser Asn Pro Thr Ser Gly Lys Pro Thr115 120 125Ile Thr Cys Ser Ser Cys Ser Ser His Ile Asn Ser Val His Val His130 135 140 145Ile Ser Lys Ser Lys Val Gly Trp Leu Ile Gln Leu Phe His Lys Lys150 155 160Ile Glu Ser Ala Leu Arg Asn Lys Met Asn Ser Gln Val Cys Glu Lys165 170 175Val Thr Asn Ser Val Ser Ser Lys Leu Gln Pro Tyr Phe Gln Thr Leu180 185 190Pro Val Met Thr Lys Ile Asp Ser Val Ala Gly Ile Asn Tyr Gly Leu195 200 205Val Ala Pro Pro Ala Thr Thr Ala Glu Thr Leu Asp Val Gln Met Lys
~EV~0360138.030903.6.SEQLIST.TXT210 215 220 225Gly Glu Phe Tyr Ser Glu Asn His His Asn Pro Pro Pro Phe Ala Pro230 235 240Pro Val Met Glu Phe Pro Ala Ala His Asp Arg Met Val Tyr Leu Gly245 250 255Leu Ser Asp Tyr Phe Phe Asn Thr Ala Gly Leu Val Tyr Gln Glu Ala260 265 270Gly Val Leu Lys Met Thr Leu Arg Asp Asp Met Ile Pro Lys Glu Ser275 280 285Lys Phe Arg Leu Thr Thr Lys Phe Phe Gly Thr Phe Leu Pro Glu Val290 295 300 305Ala Lys Lys Phe Pro Asn Met Lys Ile Gln Ile His Val Ser Ala Ser310 315 320Thr Pro Pro His Leu Ser Val Gln Pro Thr Gly Leu Thr Phe Tyr Pro325 330 335Ala Val Asp Val Gln Ala Phe Ala Val Leu Pro Asn Ser Ser Leu Ala340 345 350Ser Leu Phe Leu Ile Gly Met His Thr Thr Gly Ser Met Glu Val Ser355 360 365Ala Glu Ser Asn Arg Leu Val Gly Glu Leu Lys Leu Asp Arg Leu Leu370 375 380 385Leu Glu Leu Lys His Ser Asn Ile Gly Pro Phe Pro Val Glu Leu Leu390 395 400Gln Asp Ile Met Asn Tyr Ile Val Pro Ile Leu Val Leu Pro Arg Val405 410 415
~EV~0360138.030903.6.SEQLIST.TXTAsn Glu Lys Leu Gln Lys Gly Phe Pro Leu Pro Thr Pro Ala Arg Val420 425 430Gln Leu Tyr Asn Val Val Leu Gln Pro His Gln Asn Phe Leu Leu Phe435 440 445Gly Ala Asp Val Val Tyr Lys450 4551權(quán)利要求
1.一種BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物，用作肝素結(jié)合藥物。
2.一種用于肝素結(jié)合的BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物，用于中和肝素的抗凝血效力。
3.一種用于肝素結(jié)合的BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物，用于抑制血管形成。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的產(chǎn)物，其中抑制的血管形成與視網(wǎng)膜病有關(guān)。
5.一種用于肝素結(jié)合的BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物，用于抑制內(nèi)皮細(xì)胞增生。
6.根據(jù)權(quán)利要求3的產(chǎn)物，其中的內(nèi)皮細(xì)胞增生與子宮內(nèi)膜異位相聯(lián)系。
7.一種用于肝素結(jié)合的BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物，用作一種避孕藥。
8.一種用于肝素結(jié)合的BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物，用于抑制惡性腫瘤細(xì)胞增生。
9.一種根據(jù)權(quán)利要求8的產(chǎn)物，其中的惡性腫瘤是卡波濟(jì)肉瘤。
10.一種用于肝素結(jié)合的BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物，用于治療慢性發(fā)炎疾病癥狀。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的產(chǎn)物，其中的慢性發(fā)炎疾病是關(guān)節(jié)炎。
12.一種根據(jù)權(quán)利要求11的產(chǎn)物，其中的關(guān)節(jié)炎發(fā)炎疾病是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
13.一種根據(jù)權(quán)利要求11的產(chǎn)物，其中的關(guān)節(jié)炎發(fā)炎疾病是反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎。
14.一種根據(jù)權(quán)利要求1，2，3，5，7，8和10中任意一項的產(chǎn)物，它是一種23-25KD的殺菌/增強(qiáng)通透性蛋白質(zhì)氨基末端片段。
15.一種中和肝素的抗凝血效力的方法，包括給受試驗者施用有效量的肝素結(jié)合BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
16.一種抑制血管形成的方法，包括給受試驗者施用一定量的對抑制血管形成有效的BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所抑制的血管形成與視網(wǎng)膜病有關(guān)。
18.一種抑制內(nèi)皮細(xì)胞增生的方法，包括給受試驗者施用一定量的對抑制增生有效的BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
19.一種治療子宮內(nèi)膜異位的方法，包括在給子宮內(nèi)膜施用一定量的對抑制內(nèi)皮細(xì)胞增生有效的BPI。
20.一種避孕方法，包括給受試驗者的子宮內(nèi)壁施用一定量的，對阻止與受精卵植入相聯(lián)系的內(nèi)皮細(xì)胞增生有效的BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
21.一種抑制惡性腫瘤細(xì)胞增生的方法，包括給受試驗者施用一定量的對抑制增生有效的BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
22.一種權(quán)利要求21的方法，其中的惡性腫瘤是卡波濟(jì)肉瘤。
23.一種治療慢性發(fā)炎疾病癥狀的方法，包括給受試驗者施用一定量的對減輕炎癥有效的BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
24.權(quán)利要求23的方法，其中的慢性發(fā)炎疾病是關(guān)節(jié)炎。
25.權(quán)利要求24的方法，其中的關(guān)節(jié)炎發(fā)炎疾病癥狀是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
26.權(quán)利要求24的方法，其中治療的關(guān)節(jié)炎發(fā)炎疾病癥狀是反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎。
27.權(quán)利要求15，16，18，19，20，21和23的方法，其中的BPI蛋白質(zhì)產(chǎn)物是23-25KD的殺菌/增強(qiáng)通透性蛋白質(zhì)氨基末端片段。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于癥狀治療的治療學(xué)方法，包括施用殺菌/增強(qiáng)通透性(BPI)蛋白質(zhì)產(chǎn)物來中和肝素的抗凝血活性，抑制血管形成、腫瘤和內(nèi)皮細(xì)胞增生，治療慢性發(fā)炎性疾病。
文檔編號A61P7/04GK1478543SQ0310431
公開日2004年3月3日 申請日期1994年3月11日 優(yōu)先權(quán)日1993年3月12日
發(fā)明者R·G·李特爾, R G 李特爾, H·伽扎奴-杉圖茹, 杉圖茹, J·B·佩仁特, 佩仁特 申請人:愛克索馬技術(shù)有限公司