專利名稱：流感病毒靜水壓滅活與納米技術(shù)處理工藝制備裂解疫苗的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物制品中流感病毒滅活疫苗與流感病毒裂解疫苗，特別是流感病毒靜水壓滅活與納米技術(shù)處理工藝制備疫苗的方法。
流感是一種甲、乙、丙三型流感病毒引起的急性呼吸道傳染病。本病發(fā)病急，傳播快，發(fā)病率高，具有一定的死亡率，在兒童和老弱患者中死亡率較高，給人類造成嚴(yán)重的社會和經(jīng)濟(jì)后果。而且流感病毒經(jīng)常不斷發(fā)生抗原變異，出現(xiàn)新的亞種，一般10-15年發(fā)生一次世界范圍內(nèi)的大流行；區(qū)域性流行春秋常在各地發(fā)生。至今人類尚無有效的治療方法，唯一的方法就是接種流感疫苗進(jìn)行預(yù)防，因此流感疫苗的研制具有十分重要的社會和經(jīng)濟(jì)效益。制備流感疫苗必須采用WHO推薦毒株結(jié)合各國實(shí)際情況用甲1、甲3和乙型三價流感病毒來制作滅活疫苗和裂解疫苗。滅活和裂解方法的選擇是疫苗制備上的關(guān)鍵技術(shù)?；瘜W(xué)試劑甲醛(福爾馬林)是應(yīng)用最早最廣泛的滅活劑，從1941年美國批準(zhǔn)甲醛滅活制備流感病毒滅活疫苗以來一直沿用至今。目前已確認(rèn)甲醛是一種致癌物質(zhì)。由于甲醛易使病毒粒子表面蛋白抗原受損，往往影響疫苗的免疫原性。同時甲醛又有一定的刺激性，有一定的副作用。人體接種疫苗局部和全身反應(yīng)都較強(qiáng)。為了解決甲醛滅活存在的問題，本世紀(jì)60年代，超速離心機(jī)和層析色譜技術(shù)的應(yīng)用，使流感病毒純化操作大大提高，制成了流感全病毒滅活疫苗。然而，兒童使用時仍可出現(xiàn)不良反應(yīng)。為了使不良反應(yīng)減少，接著又研制出多種裂解劑，如乙醚，3-N-丁基磷酸鹽(Tri-N-butylphosphate)，聚山梨酸酯80(Polysorbate80)，脫氧膽酸鈉(Sodium deoxy cholate)，三硝基甲苯X100(Triton X100)等，生產(chǎn)出了裂解疫苗。1980年英國首次批準(zhǔn)使用，而后擴(kuò)展到其它到國家。
在實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，流感病毒亞單位和表面抗原疫苗接種后雖然不良反應(yīng)有減少，但其免疫原性都不如純正化的全病毒粒疫苗，從而又開展了佐劑研究工作。利用佐劑來提高免疫效果的。用B30-MDP[6-0-(2-14烷基16烷酰“2-tetradcylhexdecanoyl”)-N-乙酰胞壁酰“N-acetylmuramoy”-L-丙氨?！癓-alanyl”-D-異谷氨酰胺“D-isoglutamine”和純化的流感病毒顆粒HA、NA抗原、膽因醇及去污劑(Octyl glucoside-辛基苷)相混，通過超聲波使之充分混合，溶解，然后經(jīng)過纖維素去除去污劑。這樣就能使流感毒粒HA和NA亞單位內(nèi)部和外表面相互附著成微脂粒的薄片狀結(jié)構(gòu)，其直徑約為100nm，類似于一個完整的流感病毒顆粒。這種疫苗，日本已開始在志愿者試用，抗體陽轉(zhuǎn)為理想，但仍有副反應(yīng)，如注射部位有疼痛和紅腫等。
目前，國際上流感病毒疫苗主要包括流感病毒滅活疫苗(純化的，三價的全屬毒粒滅活疫苗)；裂解疫苗；亞單位疫苗三種(見

圖1)，三種流感病毒疫苗的結(jié)構(gòu)所示。它們各有利弊，前者制備簡單，但有時會引起不良反應(yīng)；裂解的，可降低不良反應(yīng)，但制備過程中需加和去除裂解劑；而后者安全性好，可對兒童進(jìn)行免疫接種，但抗體應(yīng)答效果差，同時造價高。
流感全病毒滅活疫苗于1941年在美國首次被批準(zhǔn)使用。這種疫苗接種后，局部和全身反應(yīng)都很強(qiáng)。本世紀(jì)60年代，超速離心機(jī)和層析色譜技術(shù)的應(yīng)用，使毒粒純化操作大大提高，制成了全毒粒疫苗。然而，兒童使用時仍可出現(xiàn)不良反應(yīng)。以后又研制出裂解的純化疫苗，不良反應(yīng)大為減少，接著研制出多種化學(xué)裂解劑，如乙醚，3-M-丁基酸鹽(Tri-N-butylphosphate)，聚山梨酸酯80(Polysorbate80)，脫氧膽酸鈉(Sodium deoxy cholate)，三硝基甲苯X100(TritonX100)等，生產(chǎn)出了裂解疫苗，此種疫苗1986年在美國首次被批準(zhǔn)使用。
在實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，毒粒亞單位和表面抗原疫苗接種后雖然不良反應(yīng)有所減少，但其免疫原性都不如純化的全毒粒疫苗，從而就開始了佐劑研究工作。從根本上講裂解疫苗，亞單位疫苗的免疫原性目前還尚未完全解決。
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，應(yīng)用現(xiàn)代高壓物理學(xué)與生物學(xué)互相交叉滲透建立起來的一種理想方法，既流感病毒靜水壓滅活結(jié)合納米技術(shù)裂解病毒的方法制備流感病毒裂解疫苗，取代化學(xué)試劑和去污劑。它不僅使病毒能完全滅活，同時抗原的免疫原性又不受影響，而且還有明顯提高免疫活性，對流感病毒變異快，變種多非常適宜，工藝簡便，生產(chǎn)周期顯著縮短，總成本低，能滿足現(xiàn)代工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。
流感病毒靜水壓滅活與納米技術(shù)處理工藝制備裂解疫苗的方法，選取流感病毒毒種，即由甲1、甲3及乙型流感病毒接種8-110日齡雞胚，并于34℃孵化，48-72小時后放入4-8℃冷胚過濾，然后收獲尿囊液進(jìn)行無菌試驗(yàn)后用靜水壓技術(shù)滅活，低速離心提純及超濾濃縮，過柱層析，采用納米技術(shù)處理，使病毒粒懸液裂解至14nm顆粒，單價病毒懸液檢定，半成品配制與檢定，成品分裝與檢定，成品包裝即成流感病毒裂解疫苗。其工藝路線為種子液制備→接種雞胚→34-55℃溫箱培育48-72小時→4-8℃冷胚過夜→收獲尿囊液→無菌試驗(yàn)→靜水壓技術(shù)滅活→低速離心提純及超濾濃縮→過柱層析→納米技術(shù)裂解→單價病毒懸液檢定→半成品配制與檢定→成品分裝與檢定→成品包裝。
靜水壓技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一項(xiàng)高新物理技術(shù)，將該技術(shù)應(yīng)用于生物學(xué)領(lǐng)域，主要用于研究生物大分子在高壓下所發(fā)生的結(jié)構(gòu)與功能的變化，亦有用于滅活生物大分子病毒。我們將該技術(shù)首次應(yīng)用于流感病毒滅活疫苗目的在于徹底省去福爾馬林滅活劑，提高疫苗的安全性。而且極大在地簡化了生產(chǎn)工藝，縮短了生產(chǎn)周期。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，經(jīng)靜水壓技術(shù)滅活的流感病毒，在免疫原性方面亦有所提高。
常規(guī)的流感病毒裂解疫苗制備過程中，是用化學(xué)裂解劑將病毒蛋白裂解成亞單位，再經(jīng)純化制成亞單位疫苗的。這樣在制成的流感病毒裂解疫苗中或多或少地存在化學(xué)裂解劑，從而使疫苗的不安全性增加。而用納米技術(shù)處理流感病毒，不僅徹底消除了化學(xué)裂解劑的存在，而且還可以保證使裂解后的病毒亞單位大小均一，使疫苗的安全性增加，質(zhì)量全面提高，達(dá)到WHO的有關(guān)規(guī)定要求。
靜水壓是流體靜壓力的簡稱。將固體、液體和氣體均視為連續(xù)介質(zhì)。在外力作用下，各部分介質(zhì)通過它們之間的分界面互施大小相等、方向相反的作用力，稱作用在單位界面上的力為應(yīng)力?？梢园褢?yīng)分解成兩個分量一個垂直于作用面，稱為正應(yīng)力；常用σ表示另一個在作用面內(nèi)，稱切應(yīng)力，常用T表示。可以證明，介質(zhì)內(nèi)任一點(diǎn)的應(yīng)力狀態(tài)可以用對稱的應(yīng)力張量來表示，應(yīng)力張量共有9個分量，表示為σxTxyTxzTxyσyTyzTzxTzyσz]]>其中，σx、σy、σz分別是介質(zhì)的其余部分對介質(zhì)內(nèi)的體積元在x、y、z方向的正應(yīng)力；Tij(I、j=x、y、z)是6個切應(yīng)力，前一個足標(biāo)代一切應(yīng)力的方向，后一個足標(biāo)代表切應(yīng)力作用面的外法線方向。
定義壓力為P=-(σx+σy+σz)/3，即壓力的大小等于所考察點(diǎn)上的3個正應(yīng)力的平均值，負(fù)號表示壓力的作用方向與過該點(diǎn)的作用面的外法線方向相反。特殊地，如果流體處于靜止?fàn)顟B(tài)，或者雖然處于運(yùn)動狀態(tài)，但是流體是無粘性的，其6個切應(yīng)力分量都等于零，只有3個正應(yīng)力不為零?？梢宰C明σx=σy=σz=-P，即靜止流體或無粘流體的壓力等于任一方向正應(yīng)力的負(fù)值，稱這樣的壓力為流體靜壓力。概括的說，靜水壓狀態(tài)的特點(diǎn)是切應(yīng)力為零，正應(yīng)力各向同性。在高壓科學(xué)技術(shù)研究中，一般稱接近靜水壓的狀態(tài)為準(zhǔn)靜水壓，稱遠(yuǎn)離靜水壓力的狀態(tài)為非靜水壓。在壓強(qiáng)的實(shí)驗(yàn)測量中，實(shí)際測量的是某一有限面積上的正壓力。當(dāng)該面積處于流體當(dāng)中時，由于平衡態(tài)下滿足靜水壓條件，壓力分布是均勻的，于是用單位面積上的力可以把壓強(qiáng)確定到相當(dāng)高的精度。高精度靜水壓的獲得，與所選用的傳壓介質(zhì)的剪切強(qiáng)度有關(guān)。
所謂的傳壓介質(zhì)是指傳遞壓力的媒介物質(zhì)。流體傳壓介質(zhì)的基本功能是把施于其上的軸向壓力轉(zhuǎn)變成作用到試樣上的均勻壓力，即轉(zhuǎn)變成靜水壓力。此外考慮到使用時的可靠、方便與安全，還要求傳壓介質(zhì)具有下列物性；化學(xué)惰性，滲透率及壓縮率低，容易操作，容易密封，價格低廉。根據(jù)不同的使用要求和壓力范圍，可選用不同的氣體、液體或固體作為傳壓介質(zhì)。一般地說，轉(zhuǎn)變成靜水壓的能力方面，氣體最佳，液體次之，固體最差，即使選用剪切強(qiáng)度很低的軟固體也只能獲得準(zhǔn)靜水壓。常用的液體介質(zhì)有甘油、變壓器油、煤油、汽油、石油醚、戊浣與異戊烷的混合液以及水等。
常溫常壓靜水壓機(jī)由超高壓容器、超高壓力源及配套的管路附件系統(tǒng)組成。它使受壓制品得到各向均勻的起高壓力作用(見圖2)。
超高壓腔體積一定，通過不斷增加腔體內(nèi)油密度來改變腔體內(nèi)壓力，達(dá)到升壓的目的。加壓在常溫下進(jìn)行。升、降壓過程在幾秒或幾十秒內(nèi)完成，因此在操作過程中，可將整個系統(tǒng)視為絕熱狀態(tài)，與外界無熱交換，即Dq=Tds≈0。由于在升、降壓過程中系統(tǒng)對外分別做負(fù)功和正功，因而系統(tǒng)內(nèi)部有微小的溫度起伏，但并不影響病毒的存活。所以病毒的滅活完全是由壓力所致，而不是溫度造成的。
流感三價全病毒混合懸液靜水壓滅活操作方法1)根據(jù)流感病毒疫苗生產(chǎn)規(guī)模大小，引進(jìn)或加工制造適于生產(chǎn)規(guī)模產(chǎn)量的靜水壓機(jī)，進(jìn)口自動化程度高，自己加工制作的一般手工操作，中、小型靜水壓機(jī)日本有定型產(chǎn)品出售；大規(guī)模生產(chǎn)的靜水壓機(jī)瑞典生產(chǎn)；我國上海大龍機(jī)械廠能加工制造；2)選定好靜水壓機(jī)，安放于符合藥品GMP生產(chǎn)流程要求的4-8℃無菌室內(nèi)，按通電源，調(diào)節(jié)電壓、檢測、調(diào)試至符合生產(chǎn)要求的各項(xiàng)參數(shù)指標(biāo)；3)流感三價全病毒濃縮懸液，經(jīng)檢定合格后，裝于500ml軟塑料采血袋或軟塑料輸液袋內(nèi)密封好，置于4-8℃冰箱保存?zhèn)溆茫乐箖鋈?，也可以加工制式的軟塑料袋專供裝流感病毒懸液，根據(jù)規(guī)模而定250-5000ml不等規(guī)格；4)將靜水壓機(jī)密封高壓腔打開，置放好裝有流感三價全病毒懸液采血袋或塑料袋，選用好傳壓介質(zhì)、密閉高壓腔，接通電源，調(diào)節(jié)電壓，選定200-300Mpa，靜水壓20-40分鐘；5)流感三價全病毒懸液經(jīng)靜水壓處理后及時存放于4-8℃冰箱。
流感病毒靜水壓滅活，系由甲1(H1N1)型Al/Beijing/262/295、甲3(H3N2)型A3/SYSNWY/5/97和乙型B/HARBIN/7/94三株流感病毒分別接種雞胚，培養(yǎng)48-72小時后收獲尿囊液，分別對流感病毒靜水壓滅活進(jìn)行固定受壓時間、改變壓力及固定壓力、改變受壓時間的實(shí)驗(yàn)。將經(jīng)靜水壓力處理后的樣品分別進(jìn)行TCID50測定，結(jié)果表明經(jīng)250Mpa壓力處理的病毒其毒力也明顯下降。
取被250Mpa滅活的病毒樣品，電鏡觀察顯示在形態(tài)上與正常病毒粒子相比有明顯變化，病毒粒子有凸起形成。取同樣的兩份病毒樣品分別提取其總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后，對CHBA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，分析其帶譜的變化，再結(jié)合HA基因的特片段擴(kuò)增，結(jié)果二者無明顯差異，HA基因的特異擴(kuò)增呈陽性。這說明一定的靜水壓力雖然可使流感病毒滅活，但并沒有使HA基因片段斷裂。這是因壓力對病毒表面結(jié)構(gòu)蛋白產(chǎn)生影響，從而使其滅活。取流感靜水壓滅活疫苗注射家兔，經(jīng)基礎(chǔ)免疫、二次免疫及三次免疫之后采血，離心取上清，獲得實(shí)驗(yàn)用待檢血清，進(jìn)行血清中和試驗(yàn)。同時用相同處理的病毒用甲醛滅活作為對照。結(jié)果表明，經(jīng)靜水壓力滅活的病毒所引起的中和抗體效價遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于用甲醛滅活的病毒所引起的中和抗體效價5-10％。
納米技術(shù)裂解流感病毒理論依據(jù)設(shè)置選型、工作原理、操作方法及效果檢定1、納米科學(xué)概念納米科學(xué)，是人們研究納米尺度——即100納米至0.1范圍之內(nèi)的物質(zhì)所具有的特異現(xiàn)象和特異功能的科學(xué)，而納米技術(shù)則是指此基礎(chǔ)之上制造新材料、研究新工藝的方法和手段。納米科學(xué)技術(shù)不是某一學(xué)科的延伸，也不是某一工藝產(chǎn)物，而是基礎(chǔ)理論學(xué)科與當(dāng)代高新技術(shù)的結(jié)晶。它以物理、化學(xué)的微觀研究理論為基礎(chǔ)，以當(dāng)代精密儀器和先進(jìn)的分析技術(shù)為手段，是一個內(nèi)容廣闊的多學(xué)科群。
納米技術(shù)不僅是指它能制造超細(xì)粉末或納米液體技術(shù)，它還泛指在掃描隧道顯微鏡下，直接觀察和操縱單個原子和分子，按人們意愿組成需要的超微型器件。
納米又稱毫微米，符號為nm或mu，是1微米的千分之一。如果以我們?nèi)粘Ｉ钪谐Ｓ玫膯挝弧懊住?m)(1m=3市尺)作為主單位的話，納米在長度單位中換算所處的位置如表1所示。
可見，1納米等于10-9米(十億分之一米)，是人類肉眼不能分辨出來的很小的長度單位。一般人類頭發(fā)絲的直徑在70微米左右，即為70000納米。
組成自然界的最基本的單位是原子，它們的大小必須用埃這個單位來量度。而由原子構(gòu)成的分子，則大小不等。一般有機(jī)小分子在幾個納米至幾十納米之間，與生命有關(guān)的生物分子則大得多。
2、納米技術(shù)裂解流感病毒的理論依據(jù)1)流感病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)眾所周知，甲、乙型流感病毒是有囊膜病毒，呈現(xiàn)多型性，常為球型，直徑為80-120nm。主要包括HA和NA以及M2三種蛋白。核衣殼呈現(xiàn)螺旋對稱，直徑9-15nm。RNA為單股負(fù)鏈。甲、乙型流感病毒的結(jié)構(gòu)示意圖(見圖3)。
2)流感病毒主要多肽成分及其抗原性質(zhì)(見表2)根據(jù)流感病毒各抗原成分的性質(zhì)及分子量大小可以看出，其主要保護(hù)性抗原可分為HA和NA，裂解的大小分別為70kDa，其病毒顆粒裂解直徑在14nm以下。所以，我們選用14nm級對撞機(jī)對流感病毒進(jìn)行技術(shù)處理，既保持其病毒的免疫原性，又能充分裂解病毒顆粒。用這種方法裂解的流感亞單位疫苗只含有濃縮和純化的流感病毒外殼抗原即血凝毒和種經(jīng)氨酸酶；而不含有病毒核酸及其他外來蛋白質(zhì)。這就是我們用納米技術(shù)處理流感病毒，制作亞單位疫苗的理論論據(jù)。
3、納米對撞機(jī)的選型及工作原理目前尚無國產(chǎn)納米對撞機(jī)問世，從日本進(jìn)口的納米對撞機(jī)主要有兩個型號LEH-2和PEH-1，(見表3)。我們選用LEH-2型納米對撞機(jī)進(jìn)行了中等規(guī)模的流感病毒亞單位疫苗生產(chǎn)，基本可以滿足實(shí)際需要。如果進(jìn)行較大規(guī)模的生產(chǎn)，可采用PEH-1型機(jī)。
納米對撞機(jī)的基本工作原理是對撞機(jī)中的單晶金剛石開了兩個“X”通道，反應(yīng)物和介質(zhì)在2000個大氣壓驅(qū)動通過這兩個“X”通道，在通道的交叉處瞬間被粉碎、分散和乳化。粉碎的粒度只有幾個納米，粒度小，粒度分布窄，而且粒度大小是可調(diào)控的。這與一般情況和一般能量下的反應(yīng)顯然不同，肯定會發(fā)生質(zhì)的變化。
本發(fā)明創(chuàng)造是利用高新物理技術(shù)和生物技術(shù)處理流感病毒的方法。取代化學(xué)試劑和去污劑制成亞單位疫苗的一次革命。
三十年前，生物學(xué)遇到了可見光儀器的局限問題。一般的光學(xué)顯微鏡由分辨率不夠不能對病毒進(jìn)行觀測。電子顯微鏡雖然有很高的放大倍數(shù)，但是不能用于對活細(xì)胞的研究。而許多基本的生物學(xué)問題，必須在活的機(jī)體中去研究。
納米技術(shù)的發(fā)展使上述問題有了解決的辦法。在這個用?；蚣{米作單位的范圍中，病毒就好比是大象了。而原子就象是棋盤上的棋子，可以一個一個搬動。
納米技術(shù)在生物學(xué)中的應(yīng)用既可能在掃描隧道顯微鏡下，直接觀察和操縱單個原子或分子，又可以粉碎生物材料，制造納米粉末或液體。我們應(yīng)用納米技術(shù)處理流感全病毒(80-120nm)，裂解為14nm左右大小的顆粒，取代化學(xué)試劑和去污劑制成亞單位疫苗。實(shí)踐證明是完全可以的。它不僅手段先進(jìn)科學(xué)，方法簡便快速，而且非常安全。表面抗原生物活性指標(biāo)好。流感全病毒經(jīng)納米級裂解超微化后，顆粒小，表面積大。產(chǎn)物易純化，收產(chǎn)率高，一般可使抗原的免疫原性提高15-20％，影響安全的因素少，不殘留任何化學(xué)物質(zhì)，具有物殊的生物物理性能。
4、納米技術(shù)裂解流感病毒操作方法納米技術(shù)裂解流感病毒的方法單價全病毒懸液經(jīng)檢定合格后，置4-8℃冰箱中保存?zhèn)溆?，防止凍融；將選定好的納米對撞機(jī)放置于4-8℃無菌室中，接通電源，調(diào)節(jié)電壓，選定14nm極超微粒子通道，用無菌超純水沖洗容器和管道，對裂解后的流感毒超微粒子再層進(jìn)行檢定，最后合格成品包裝為流感裂解疫苗。
5、納米技術(shù)裂解流感疫苗效果檢定1)納米技術(shù)裂解流感端正毒的電鏡結(jié)果。(見圖4)2)納米技術(shù)裂解(物理方法)裂解流感病毒疫苗各項(xiàng)質(zhì)控指標(biāo)檢測的結(jié)果。(見表4)由表2可看出化學(xué)方法裂解需要清除化學(xué)裂解劑，工藝復(fù)雜，影響安全因素多、疫苗免疫原性低；而納米技術(shù)處理表面抗原活性指標(biāo)高，而且技術(shù)先進(jìn)，方法簡便快捷，適于工業(yè)化生產(chǎn)，宜于普有推廣。
下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明創(chuàng)造。
實(shí)施例11)按國家規(guī)定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和工藝生產(chǎn)出的合格流感三價全病毒懸液250ml；2)將流感三價病毒粒懸液裝入采血袋密封，用微型靜水壓機(jī)處理，壓力250MPa，時間30分鐘，經(jīng)靜水壓機(jī)處理后，再放入4-8℃冰箱內(nèi)；3)將用靜水壓滅的流感三價病毒粒懸液，放入調(diào)試好的納米對撞機(jī)，對流感病毒進(jìn)行納米技術(shù)處理，調(diào)節(jié)電壓、壓力、流量，使病毒懸液裂解至14nm大小顆粒，以15分鐘處理30ml，經(jīng)納米機(jī)處理后，再放入4-8℃冰箱內(nèi)。
實(shí)施例21)按國家規(guī)定流感病毒疫苗生產(chǎn)方法進(jìn)行，三價病毒粒懸液約1000毫升；2)選定中小型靜水壓機(jī)，超高壓腔體積一次能處理1000ml，放入靜水壓機(jī)進(jìn)行技術(shù)處理，加壓力均選定為250MPa，時間30分鐘，經(jīng)靜水壓機(jī)處理后，再放入4-8℃冰箱內(nèi)；3)選下中小型納米對撞機(jī)，30分鐘能處理1000毫升產(chǎn)樣品，裂解病毒懸液顆粒均為14nm。
實(shí)施例31)流感病毒裂解疫苗規(guī)?；a(chǎn)，生產(chǎn)環(huán)境條件必須符合GMP要求，疫苗全程工藝及質(zhì)量指標(biāo)必須按流感疫苗WHO規(guī)定要求進(jìn)行，人員技術(shù)，設(shè)備、工藝環(huán)境必須配套；2)靜水壓機(jī)需中型一流設(shè)備，每次能技術(shù)處理流感三價病毒粒懸液5000ml，安置于生產(chǎn)流感病毒疫苗最佳工藝環(huán)節(jié)；3)納米對撞機(jī)也需用中型一流設(shè)備，每小時能處理流感三價病毒草粒懸液15000ml以上，安置于生產(chǎn)流感病毒疫苗最佳工藝環(huán)節(jié)，一般固定不動，納米對撞機(jī)每次處理流感三價病毒粒懸液技術(shù)參數(shù)不宜有變動，以確保量的穩(wěn)定性。
流感病毒裂解疫苗系由甲1、甲3及乙型流感病毒接種雞胚，收獲尿囊液，靜水壓滅活獲得的病毒懸液，經(jīng)離心濃縮層析純化，用納米技術(shù)處理，經(jīng)磷酸鹽緩沖液稀釋而成。確保0.5ml(每人分一支)含有血凝素甲1、甲3及乙型都在15μg以上。經(jīng)三價流感病毒裂解疫苗免疫小白鼠后，血清中和試驗(yàn)證明疫苗免疫后血清對甲1、甲3及乙型流感病毒的中和指數(shù)分別達(dá)到1.6×105，2.5×105,1.6×105以上，以確保疫苗免疫效果。
流感病毒裂解疫苗再經(jīng)皮下接種小白鼠，腹腔接種豚鼠，觀察7天。全部小白鼠及豚鼠體重增加，健康存活，無任何異常表現(xiàn)。證明疫苗安全性及毒性試驗(yàn)合格。并經(jīng)過敏原性檢定證明不存在有過敏原。
通過靜水壓結(jié)合納米技術(shù)處理流感病毒粒懸液，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室、中試，產(chǎn)業(yè)化等不同規(guī)模生產(chǎn)，證實(shí)既能有效滅活裂解流感病毒，又能提高免疫原性，還能縮短工藝時間，又簡便價廉，符合現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
表1
表2
表3 表權(quán)利要求
1.流感病毒靜水壓滅活與納米技術(shù)處理工藝制備裂解疫苗的方法，選取流感病毒毒種，即由甲1、甲3及乙型流感病毒接種8-110日齡雞胚，并于34℃孵化，48-72小時后放入4-8℃冷胚過濾，然后收獲尿囊液進(jìn)行無菌試驗(yàn)后用靜水壓技術(shù)滅活，低速離心提純及超濾濃縮，過柱層析，采用納米技術(shù)處理，使病毒粒懸液裂解至14nm顆粒，單價病毒懸液檢定，半成品配制與檢定，成品分裝與檢定，成品包裝即成流感病毒裂解疫苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的流感病毒靜水壓滅活與納米技術(shù)處理工藝制備裂解疫苗的方法，選用規(guī)定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和工藝生產(chǎn)的合格流感三價全病毒懸液250ml；將流感三價病毒粒懸液裝入采血袋密封，微型靜水壓機(jī)處理，壓力250MPa，時間30分鐘，再放入4-8℃冰箱內(nèi)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的流感病毒靜水壓滅活與納米技術(shù)處理工藝制備裂解疫苗的方法，按規(guī)定流感病毒滅活疫苗生產(chǎn)方法進(jìn)行，三價病毒粒懸液約1000ml；選定中小型靜水壓機(jī)，超高壓腔體積一次能處理1000ml，放入靜水壓機(jī)進(jìn)行技術(shù)處理，壓力均選定為250MPa，時間30分鐘；其他方法同上。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的流感病毒靜水壓滅活與納米技術(shù)處理工藝制備裂解疫苗的方法，按規(guī)定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和工藝生產(chǎn)出的合格流感三價靜水壓滅活全病毒粒懸液取30ml，放入微型納米對撞機(jī)內(nèi)，進(jìn)行納米技術(shù)處理，使流感懸液裂解到14nm大小顆粒，以15分鐘處理30ml，放入4-8℃冰箱內(nèi)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的流感病毒靜水壓滅活與納米技術(shù)處理工藝制備裂解疫苗的方法，按規(guī)定的流感病毒滅活疫苗生產(chǎn)方法進(jìn)行收集單價病毒粒懸液約1000ml，選定小型納米對撞機(jī)，30分鐘能處理1000ml裂解病毒懸液顆粒均為14nm。
全文摘要
采用靜水壓和納米技術(shù)相結(jié)合工藝制備流感病毒裂解疫苗的方法，就是選取流感病毒工作毒種，即由甲1、甲3及乙型流感病毒接種8－110日齡雞胚，并于34℃孵化，48－72小時后放入4－8℃冷胚過濾,然后收獲尿囊液進(jìn)行病毒試驗(yàn),后用靜水壓技術(shù)滅活,低速離心提純及超濾濃縮,過柱層析,采用納米技術(shù)處理,使病毒粒懸液裂解至14nm顆粒,單價病毒懸液檢定,半成品配制與檢定,成品分裝與檢定,成品包裝即成流感病毒裂解疫苗。本項(xiàng)工藝制備方法采用了當(dāng)代兩次高新技術(shù),取代甲醛滅活病毒和化學(xué)試劑裂解病毒,新工藝使疫苗免疫原性好,安全無化學(xué)污染,工藝快速、簡便,可以滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需要,宜于普及推廣。
文檔編號A61P31/12GK1324660SQ0110614
公開日2001年12月5日 申請日期2001年2月13日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月13日
發(fā)明者茍仕金, 茍鴻鷹, 王成余 申請人:遼寧天成生物制藥研究所