專利名稱：一種獲取無(wú)毒有效蝎毒的生產(chǎn)工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種獲取無(wú)毒有效蝎毒的生產(chǎn)工藝，屬于生命科學(xué)，醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別是用于癲癇、帕金森病等神經(jīng)性疾病的防治。
東亞鉗蝎(Buthus martensii Karsch,BmK)具有鎮(zhèn)靜息風(fēng)的功能，對(duì)驚厥、抽搐有顯著療效。蝎毒(Scorpion venom,SV)是蝎尾節(jié)毒腺排放的毒液，是蝎子捕食御敵的武器。醫(yī)學(xué)研究證明，全蝎的功用在于蝎尾，即SV。SV具有多種治療作用，但嚴(yán)重的神經(jīng)毒作用使其開發(fā)和應(yīng)用受到極大的限制，因此尋找消除SV毒性而又保持其治療活性的方法是目前的當(dāng)務(wù)之急。用凝膠過(guò)濾及離子交換樹脂等手段進(jìn)行分離、純化，回收率僅為0.305％，因此從1988年至今未見用此技術(shù)路線進(jìn)行開發(fā)應(yīng)用的報(bào)道。有人用上述類似技術(shù)將SV分離、純化后擬用于腫瘤的治療一但由于其毒副作用仍然存在，至今未見開發(fā)成功。新藥的安全性是其開發(fā)應(yīng)用的最關(guān)鍵前提。
我們以往的工作證實(shí)，通過(guò)口服途徑給藥可大幅度降低SV的毒性。SV半數(shù)致死量(LD50)的測(cè)定結(jié)果表明，小鼠口服或經(jīng)腹腔注射途徑給藥，其LD50分別為5.48g/kg體重和6.80mg/kg。盡管經(jīng)口服途徑給藥的毒性作用已大大降低，但毒性成份仍在其中。
本發(fā)明的目的在于提供一種獲取無(wú)毒有效蝎毒的生產(chǎn)工藝，即是在口服前將SV的毒性降到盡可能低的程度。
本發(fā)明的目的是通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的以往(包括我們自己)SV工藝的每個(gè)環(huán)節(jié)都嚴(yán)格注意低溫，包括采集到的SV液，必須經(jīng)冷凍干燥后，避光4攝氏度保存。本發(fā)明用高溫(100攝氏度)處理SV1.0小時(shí)，其神經(jīng)毒作用開始明顯降低，2.5小時(shí)以上，可消除其毒性，但仍能保存抗癲癇作用的生物活性，而且，隨高溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，SV中具有抗癲癇作用的組份所占百分比增加。
本發(fā)明的生產(chǎn)工藝如下1、采集蝎毒(SV)；
2、加蒸餾水后，分離，取上清液；3、加熱上清液，加熱溫度為100攝氏度，加熱時(shí)間至少為2.5小時(shí)，加熱方式為煮沸，即將盛裝上清液的容器置于沸水中，武火煮沸，制得無(wú)毒SV水提液；4、將上述無(wú)毒SV水提液(原料藥)與藥物輔料制成片劑或膠囊。
本發(fā)明提供了一種獲取安全且具有新的醫(yī)療用途的蝎毒制劑的工藝(國(guó)內(nèi)外均未見報(bào)導(dǎo))，該藥對(duì)各種興奮性神經(jīng)毒引起的腦損傷均有治療作用，包括癲癇、帕金森病、腦血管病以及老年性癡呆等。


圖1為SV的毒性取決于加熱(100攝氏度)時(shí)間數(shù)據(jù)圖表。
圖2為SV的毒性取決于加熱的溫度和方式數(shù)據(jù)圖表。
圖3為SV及其有效組分對(duì)抗PTZ作用(發(fā)作例數(shù))數(shù)據(jù)圖表。
圖4為SV及其有效組分對(duì)抗PTZ作用(發(fā)作嚴(yán)重程度)數(shù)據(jù)圖表。
圖5為一次口服SV對(duì)PTZ模型的治療作用數(shù)據(jù)圖表。
圖6為一次口服SV對(duì)PTZ模型的治療作用(程度/時(shí)間關(guān)系)數(shù)據(jù)圖表。
圖7為癲癇大鼠SV處置3周后療效觀察數(shù)據(jù)圖表。
圖8、圖9為本發(fā)明組分分析及功能組分的確定示意圖。
圖10為KA誘導(dǎo)癲癇反復(fù)發(fā)作及SV的治療機(jī)制方框圖。
圖11為SV對(duì)再次閾下劑量KA誘發(fā)癲癇發(fā)作潛伏期的影響示意圖。
圖12為SV對(duì)再次閾下劑量KA誘發(fā)癲癇發(fā)作持續(xù)時(shí)間的影響示意圖。
圖13為SV對(duì)再次閾下劑量KA誘發(fā)癲癇發(fā)作嚴(yán)重程度的影響示意圖。
圖14為SV對(duì)再次閾下劑量KA誘發(fā)癲癇發(fā)作次數(shù)的影響示意圖。
下面結(jié)合實(shí)施例及附圖詳細(xì)描述本發(fā)明實(shí)施例用電刺激法從東亞鉗蝎(Bmk)蝎尾采集蝎毒(SV)，加等量蒸餾水后，4000×g離心5分鐘，取上清。將不同濃度的SV按同等容積分裝并置入同樣規(guī)格的耐熱離心管中。將上述各管放置在沸水中，然后在武火煮沸的沸水中分別放置0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5和4小時(shí)。結(jié)束后再次400×g離心5分鐘，取上清。對(duì)經(jīng)上述方法處理后的SV-進(jìn)行毒力測(cè)定，并與不同加熱溫度(40攝氏度、60攝氏度、80攝氏度)和100攝氏度烤箱烘烤4小時(shí)、8小時(shí)的處理組進(jìn)行對(duì)照。結(jié)果表明，SV的毒性取決于加熱的溫度及其時(shí)間和方式(見圖1和圖2)。然后，將上述無(wú)毒SV水提液(原料藥)與輔料β環(huán)虎精可壓性淀粉制成斯威片(或膠囊)。
如圖1所示，SV的毒性取決于加熱(100攝氏度)時(shí)間，動(dòng)物為昆明種小鼠。
(1)本實(shí)驗(yàn)中SV的劑量為0.3mg/20gBW/0.4ml，給藥途徑為腹腔注射(是依據(jù)上述LD50測(cè)定中引起100％死亡的最小劑量，即15.4m-g/kg,i.p)。結(jié)果表明，100攝氏度2.5小時(shí)、3小時(shí)、3.5小時(shí)和4小時(shí)均可使SV的毒力明顯降低。
(2)增加引起致死的劑量(倍比增加劑量，一直增加到上述劑量的320-倍)100攝氏度處理2.5小時(shí)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3只小鼠全部存活。
(3)抗癲癇活性見(本發(fā)明的醫(yī)藥用途部分)如圖2所示，SV的毒力取決于加熱的溫度和方式。
上述毒力測(cè)定結(jié)果表明，SV生產(chǎn)工藝過(guò)程中，無(wú)需低溫冷凍干燥。SV經(jīng)100攝氏度煮沸處理1小時(shí)毒力開始降低，2.5小時(shí)其毒力開始降到最低。因?yàn)?1)用未經(jīng)處理的可引起100％死亡的SV劑量，經(jīng)上述處理后用于動(dòng)物(15.4mg/kg,BW,i.p)不引起動(dòng)物死亡。
(2)用比未經(jīng)處理的引起100％死亡劑量高320倍的SV仍不引起死亡。
本發(fā)明組分分析及功能組分的確定(1)組分分析及確定功能組分經(jīng)FPLC(AKTATMexplore)快速純化工藝開拓系統(tǒng)，結(jié)合30％SDS不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據(jù)同時(shí)分離的蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)遷移率，顯示該藥為多組分多肽(圖8、圖9)。
(2)主要有效組分分析采用戊唑小鼠小發(fā)作模型，確定SV的抗癲癇的主要有效組分是FPLC分離的第一峰。
本發(fā)明的醫(yī)藥用途用現(xiàn)代藥理學(xué)研究方法，即采用多種世界公認(rèn)的癲癇動(dòng)物模型，證實(shí)SV鎮(zhèn)靜息風(fēng)作用的行為特點(diǎn)及其腦機(jī)理。
(1)戊四唑癲癇模型A、戊四唑(PTZ)最小發(fā)作閾及SV的對(duì)抗作用。
a、最小發(fā)作閾測(cè)定設(shè)定不同戊四唑劑量組，以給藥后30min內(nèi)陳攣性發(fā)作(震搖至雙前肢陣攣性發(fā)作)3ses以上為終指標(biāo)，求得最小發(fā)作閾劑量為52mg/kgB.W s.c。
b、SV對(duì)抗作用，如圖3和圖4所示。
B、SV對(duì)PTZ大鼠模型的治療作用，如圖5和圖6所示，圖6中*與對(duì)照組比較P＜0.01。
(2)抗馬桑內(nèi)酯小鼠癲癇大發(fā)作作用及ED50應(yīng)用馬桑內(nèi)脂(3.76mg/kg)腹腔注射誘發(fā)小鼠癲癇大發(fā)作。觀察不同劑量SV口服對(duì)發(fā)作的治療作用，并計(jì)算ED50。
ED50=1g-1[Xm-i(∑p-0.5)]=1g-1(2.3010-0.0969×1.2)=153.0030(mg/kg)已知LD50=5480mg/kg治療指數(shù)=LD50/ED50=35.82(3)根治癲癇反復(fù)發(fā)作藥理學(xué)研究(特殊功效)癲癇癥(Epilpsy)其病因復(fù)雜，臨床表現(xiàn)多樣，但反復(fù)出現(xiàn)癲癇發(fā)作(簡(jiǎn)稱反復(fù)發(fā)作)是其共同的最顯著的臨床特征，這是癲癇頑固難治的主要原因，也是病人最大的痛苦所在。
目前全世界有5千萬(wàn)癲癇病人，我國(guó)癲癇患病率為3.3‰-5.8‰，半數(shù)以上在10歲以內(nèi)起病，有20％-30％癲癇病人發(fā)展為難治癲癇(即長(zhǎng)期甚至終身服藥仍不能控制反復(fù)出現(xiàn)的癲癇發(fā)作)，而且有37％癲癇病人伴有精神障礙。癲癇及其并發(fā)癥依然嚴(yán)重困擾著患者、家庭與社會(huì)。以往國(guó)內(nèi)外大量工作集中在關(guān)于癲癇發(fā)作機(jī)理研究，這是由于缺乏具有長(zhǎng)期反復(fù)發(fā)作特征的動(dòng)物模型。本研究除采用上述急性癲癇發(fā)作模型外，進(jìn)一步采用一個(gè)理想的具有反復(fù)發(fā)作特征的動(dòng)物模型，即顳葉癲癇紅藻氨酸(KA)模型，篩選并證實(shí)SV早期用藥(急性癲癇發(fā)作后，反復(fù)發(fā)作形成前)可防止反復(fù)發(fā)作的形成，晚期用藥(反復(fù)發(fā)作形成后)，對(duì)已形成的反復(fù)發(fā)作有明顯的治療作用，并且能夠改變腦內(nèi)已出現(xiàn)的神經(jīng)病理、神經(jīng)生化等變化，如圖10所示。
第一部分實(shí)驗(yàn)SV早期用藥療效觀察如圖7所示，圖7中*與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組比較P＜0.05。
結(jié)果還顯示，與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組比較，SV治療后，癲癇發(fā)作嚴(yán)重程度明顯降低(ρ＜0.01)；發(fā)作潛伏期明顯延長(zhǎng)(＜0.05)。
第二部分實(shí)驗(yàn)SV晚期服用療效觀察如圖10-14所示。
對(duì)已形成的癲癇發(fā)作的敏感性有明顯的治療作用(兩次實(shí)驗(yàn)共用90只SD大鼠)。結(jié)果證實(shí)，實(shí)驗(yàn)給藥組動(dòng)物當(dāng)再次受到癲癇刺激(閾下劑量KA)誘發(fā)癲癇發(fā)作時(shí)，其發(fā)作潛伏期明顯延長(zhǎng)(P＜0.05)；發(fā)作持續(xù)時(shí)間明顯縮短(P＜0.01)；發(fā)作嚴(yán)重程度明顯降低(P＜0.01)；發(fā)作次數(shù)明顯減少(P＜0.01)。
權(quán)利要求
1.一種獲取無(wú)毒有效蝎毒的生產(chǎn)工藝，其特征在于①、采集蝎毒(SV)；②、加蒸餾水后，分離，取上清液；③、加熱上清液，加熱溫度為100攝氏度，加熱時(shí)間至少為2.5-小時(shí)，加熱方式為煮沸，即將盛裝上清液的容器置于沸水中，武火煮沸，制得無(wú)毒SV水提液；④、將上述無(wú)毒SV水提液(原料藥)與藥物輔料制成片劑或膠囊。
2.治療各種興奮性神經(jīng)毒引起的腦損傷病的藥，含無(wú)毒有效蝎毒和制藥可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明及一種獲取無(wú)毒有效蝎毒的生產(chǎn)工藝;①、采集蝎毒(SV);②、加蒸餾水后,分離,取上清液;③、加熱上清液,加熱溫度為100攝氏度,加熱時(shí)間至少為2.5小時(shí),加熱方式為煮沸,即將盛裝上清液的容器置于沸水中,武火煮沸,制得無(wú)毒SV水提液;④、將上述無(wú)毒SV水提液與藥物輔料制成片劑或膠囊。本發(fā)明提供了一種獲取安全且具有新的醫(yī)療用途的蝎毒制劑的工藝,該藥對(duì)各種興奮性神經(jīng)毒引起的腦損傷均有治療作用,包括癲癇、帕金森病、腦血管病以及老年性癡呆等。
文檔編號(hào)A61P25/28GK1324621SQ0110616
公開日2001年12月5日 申請(qǐng)日期2001年2月19日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月19日
發(fā)明者張萬(wàn)琴, 趙杰, 劉輝, 姜春玲, 高慧明, 吳雪飛, 李冬冬, 辛毅, 黃敏 申請(qǐng)人:大連高新園區(qū)全國(guó)高技術(shù)產(chǎn)業(yè)化微生態(tài)中試基地, 大連醫(yī)科大學(xué)