專利名稱：貝母甲素在制備治療耐藥性細菌感染疾病的藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明是關于貝母甲素藥物新用途的發(fā)明，主要涉及貝母甲素的逆轉細菌多重抗生素耐藥作用的研究，包括貝母甲素在制備治療耐藥性細菌感染疾病的藥物中的應用。
細菌的多藥耐藥(Multiple Antibiotic Resistance,Mar)指因質粒和染色體介導的耐藥因素，細菌對多類抗菌藥物耐藥。目前細菌感染性疾病多為耐藥菌感染。而感染是白血病的主要并發(fā)癥和死因之一。由于患者抵抗力低下，易于感染，常死于難以控制的感染。因而有效控制感染尤其是耐藥菌感染成為治療白血病的一個重要方面。而在控制感染的過程中需要面對的一個問題就是細菌耐藥性。在以往細菌耐藥性的研究中，人們通常采用兩種方法。一是避開已知的細菌耐藥機制，不斷研究開發(fā)具有新的作用機制的抗生素，然而細菌耐藥總是在新的抗生素出現(xiàn)后隨之出現(xiàn)，研究新的抗生素的努力與細菌耐藥之間的斗爭成為一場沒有贏家的拉鋸戰(zhàn)。二是面對細菌耐藥，研究逆轉細菌耐藥的藥物。已經成功開發(fā)出了β-內酰胺酶抑制劑如克拉維酸(棒酸)、舒巴坦(青霉烷砜)與β-內酰胺類抗生素聯(lián)用，在臨床上獲得很好的效果。因為細菌耐藥往往是多種機制的綜合作用，而β-內酰胺酶抑制劑僅僅是針對其中一種，使其在應用上有一定局限性。開發(fā)針對其它耐藥機制，產生逆轉細菌耐藥性作用的藥物，對于豐富逆轉細菌耐藥研究手段，提高臨床抗感染治療的療效，具有重要意義。
本發(fā)明目的是研究一種具有逆轉細菌多重抗生素耐藥作用的藥物，該藥物可以在臨床上作為細菌耐藥逆轉劑使用。
浙貝母是常用中藥，味苦，性寒，歸心、肺經，具有清熱化痰、解毒散結之功效。臨床上常用以止咳化痰平喘，主要與其阿托品樣作用，緩解支氣管痙攣相關。浙貝母堿(Peimine)又稱貝母甲素，和貝母乙素是常用中藥浙貝母和川貝母的主要活性成分，屬異甾類生物堿。1g浙貝母粉劑含該有效成分不低于5mg。發(fā)明人經過實驗研究發(fā)現(xiàn)，貝母甲素具有逆轉細菌多重抗生素耐藥性作用，浙貝母生物堿體外與抗生素有協(xié)同抑菌作用，且對個別菌株MIC值較以往報道低。
貝母甲素作為一種藥物活性成分，可以按照常規(guī)的提取方法從貝母原藥材當中提取，并將其按照常規(guī)制劑方法制備成藥物制劑，例如，片劑、膠囊劑、顆粒劑、口服液體制劑等。
由于貝母甲素的逆轉細菌多重抗生素耐藥性作用，上述制備的藥物制劑可以和抗生素聯(lián)合使用，以增強抗生素的敏感性，用于治療耐藥性細菌感染性疾病。
發(fā)明人通過實驗研究發(fā)現(xiàn)，貝母甲素與β-內酰胺類抗生素(青霉素、優(yōu)立新)，氨基糖甙類(慶大霉素)，喹諾酮類藥物(環(huán)并沙星)聯(lián)合均能有效抑制銅綠假單胞菌的生長，僅與大環(huán)內酯類藥物(紅霉素)聯(lián)合抑菌無效。甲素與青霉素、優(yōu)立新聯(lián)合對銅綠假單胞菌、腸桿菌科、葡萄球菌普遍具協(xié)同抑菌作用。
與優(yōu)立新、青霉素的聯(lián)合對多數菌均顯示了抑制作用，在對腸桿菌科的抑菌試驗中，與優(yōu)立新聯(lián)合作用大于與青霉素的聯(lián)合。
總之，浙貝母生物堿具有逆轉細菌耐藥性作用。其機制與抑制外排有關。作為新一類逆轉細菌耐藥研究方向之代表的逆轉劑，具有很好的臨床應用前景。
因此，本發(fā)明包括貝母甲素在制備治療耐藥性細菌感染疾病的藥物中的應用；貝母甲素在制備具有抗菌增效協(xié)同作用的抗耐藥性細菌感染疾病的藥物中的應用；貝母甲素在制備具有逆轉細菌多重抗生素耐藥性作用的藥物中的應用。
上述所說的抗生素包括β-內酰胺類抗生素，例如青霉素、優(yōu)立新，氨基糖甙類抗生素，例如慶大霉素，喹諾酮類抗生素，例如環(huán)并沙星。實驗例材 料一.受試菌株取自1998年12月1日至1999年1月15日東直門醫(yī)院門診及住院病人的血、尿、痰、咽拭子、膿性分泌物等標本中分離純化培養(yǎng)出的細菌。經東直門醫(yī)院檢驗科細菌室鑒定菌種，并經藥敏試驗證實為多重抗生素耐藥菌。共計48株，其中銅綠假單胞菌13株，其它非發(fā)酵菌5株，腸桿菌科菌15株，葡萄球菌屬菌15株。二.藥物與試劑1．貝母甲素(PM)化學對照品。購自中國藥品生物制品檢定所。批號750-8904。先加入生理鹽水，再以1NHcl滴定至完全溶解，用1NhclNaOH調PH值至4.0，然后以生理鹽水補足所需體積，配成濃度1000μg/ml，-4℃避光保存。
2．注射用青霉素鈉華北制藥股份有限公司生產。批號B9808015。溶于滅菌蒸餾水中，濃度為4mg/ml。
3．注射用乳糖酸紅霉素大連制藥廠生產。批號970201。溶于滅菌蒸餾水中，濃度為4mg/ml。
4．優(yōu)立新(氨芐青霉素/舒巴坦)輝瑞公司。批號70739363，750mg(含氨芐青霉素500mg，舒巴坦250mg)，溶于滅菌蒸餾水中，濃度為4mg/ml。
5．硫酸慶大霉素煙臺第二制藥廠生產。批號980608。溶于滅菌蒸餾水中，濃度為10mg/ml。
6．環(huán)丙沙星注射液(特美力)德國拜耳公司制造。中美天津史克制藥有限公司分裝。批號98020237。溶于滅菌蒸餾水中，濃度為1mg/ml。
7．營養(yǎng)肉湯上海市醫(yī)學化驗所試劑廠生產。批號970701。
8．柔紅霉素北京醫(yī)科大學實驗藥廠生產。批號96100912。溶于滅菌蒸餾水中，濃度為20μg/ml。-4℃避光保存。
三．主要儀器1．電熱保溫箱北京市醫(yī)療器械廠。編號20-0092．高速低溫離心機SANYO公司3．流式細胞儀Becton Dickinson公司，F(xiàn)ACS420型方 法1．細菌的培養(yǎng)取痰、尿、咽拭子等標本，以接種環(huán)經無菌操作接種于營養(yǎng)瓊脂，37℃孵育18-24小時，以紙片擴散法測定其對抗生素敏感性，確定其為多重抗生素耐藥菌，轉移種于營養(yǎng)肉湯(Muller-Hinton液體培養(yǎng)基)，37℃孵育18-24小時。2．貝母甲素協(xié)同抗生素抑菌試驗2.1最低抑菌濃度的測定(MIC)[4]取10支13×100mm滅菌有塞試管，排列于試管架上，第1管加培養(yǎng)基1.9ml。然后加入抗生素原液，第1管加0.1ml，混勻后吸出1.0ml至第2管，依次倍比稀釋，最后一管不加藥物作為對照。菌液經營養(yǎng)肉湯1∶3000稀釋后，于每管加入0.05ml，搖勻，37℃孵育18-24小時后取出。以試管澄清無混濁為抑菌，藥物最高稀釋度仍能抑制細菌生長者，該管所含藥物濃度即位試驗菌株的最低抑菌濃度。
甲素最低抑菌濃度的測定(MIC)方法同此。2.2協(xié)同抑菌試驗參照抗生素協(xié)同抑菌實驗方法。取抗生素1/2MIC濃度及貝母甲素1/4MIC濃度進行協(xié)同抑菌試驗。甲素最低抑菌濃度未測出者取50μg/ml。操作方法為取4支13×100mm滅菌有塞試管，將抗生素與甲素適當稀釋后，第1管中加入1/2MIC濃度抗生素及甲素，第2管中加入1/2MIC濃度抗生素，第3管加入甲素，第4管只加營養(yǎng)肉湯，各管終體積2ml。然后各管加入經1∶3000稀釋的菌液0.1ml，37℃孵育18-24小時后取出。2.3計算方法以試管澄清無混濁為抑菌，記為(-)，出現(xiàn)混濁表明細菌生長，記為(+)。計算各組的抑菌率。
抑菌率=抑菌管數/細菌總管數×100％2.4統(tǒng)計方法經x2檢驗，比較各組抑菌率。3．細菌內柔紅霉素濃度的測定利用柔紅霉素自發(fā)熒光的特性，用流式細胞儀分析甲素對細菌內柔紅霉素蓄積水平的影響。所測銅綠假單胞菌、大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌均為臨床分離耐藥菌。3.1分組所測三個菌株均設單純細菌組、細菌加甲素組、細菌加DNR組、細菌加甲素和DNR組。3.2試驗操作細菌接種于營養(yǎng)肉湯2ml，需加甲素者加入甲素100μg/ml，37℃孵育18-24小時后取出。加入DNR10μg/ml，再37℃孵育15分鐘后去處。經離心機1500轉/分離心5分鐘后，棄去上清液，加入生理鹽水1ml，低溫下保存，經流式細胞儀檢測其熒光強度。結果1．所測菌株對甲素的MIC值，除個別菌株外均不低于200μg/ml。對銅綠假單胞菌一株MIC為100μg/ml，二株為MIC60μg/ml；對一株臭鼻克雷伯氏菌MIC為60μg/ml；對腐生葡萄球菌一株為MIC75μg/ml，對三株金葡菌為MIC60μg/ml。
2．甲素與抗生素協(xié)同抑菌結果。
2.1甲素與抗生素聯(lián)合對銅綠假單胞菌的抑制作用，見表1。表1、對銅綠假單胞菌的協(xié)同抑制作用
與各組單純抗生素組比較，*0.01＜p＜0.025，**0.005＜p＜0.01貝母甲素與各抗生素聯(lián)合抑菌結果分別與各抗生素1/2MIC濃度抑菌結果比較，有顯著性差異表明貝母甲素與該抗生素有協(xié)同抑菌作用。表2、表3、表4同此。青代表青霉素，紅代表紅霉素，優(yōu)代表優(yōu)立新，慶代表慶大霉素，環(huán)代表環(huán)丙沙星，下同。2.2甲素與抗生素聯(lián)合對腸桿菌科菌的抑制作用，見表2。表2．對腸桿菌科菌的協(xié)同抑制作用
與各組單純抗生素組比較，*p＜0.0052.3甲素與抗生素聯(lián)合對葡萄球菌的抑制作用，見表3。表3．對葡萄球菌的協(xié)同抑制作用
與各組單純抗生素組比較，*0.01＜p＜0.0252.4甲素與抗生素聯(lián)合對其他非發(fā)酵菌的抑制作用，見表4。表4．對其他非發(fā)酵菌的協(xié)同抑制作用
<p>用三輥磨機制備組分(b)的顏料在Ebecryl284中的分散液(10％重量)。通過加入TRPGDA單體，將此分散液進一步稀釋至5％重量。
將5％重量的CromophtalViolet GT分散液的一份加到一份上述含光引發(fā)劑混合物的油墨配制物中，以制備含0.0354％重量顏料的CromophtalViolet GT貯備液。
將5％重量的MonastralViolet Red NRT-201-D分散液的一份加到一份上述含光引發(fā)劑混合物的油墨配制物中，以制備含0.144％重量顏料的CromophtalViolet GT貯備液。
MonastralViolet Red NRT-201-D是喹吖啶酮類有機顏料，而CromophtalViolet GT是咔唑二噁嗪類有機顏料。Monastral和Cromophtal是Ciba Specialty Chemicals Corp.的注冊商標。
將若干份顏料貯備液加到若干份含光引發(fā)劑混合物的油墨配制物中，以制備列于表1和表2中的配制物。表1和表2中的重量百分是檢驗的總配制物的百分數。
表1
與優(yōu)立新、青霉素的聯(lián)合對多數菌均顯示了抑制作用，在對腸桿菌科的抑菌試驗中，與優(yōu)立新聯(lián)合作用大于與青霉素的聯(lián)合。
綜上所述，貝母甲素具有如下作用1、貝母甲素具有逆轉細菌多重抗生素耐藥性的作用。
2、貝母甲素與抗生素聯(lián)合，對銅綠假單胞菌有普遍抑制作用，且與各抗生素聯(lián)合的效果相似。
3、貝母甲素與青霉素、優(yōu)立新聯(lián)合，對多數菌有抑制作用。與優(yōu)立新協(xié)同對腸桿科菌抑制作用優(yōu)于與青霉素協(xié)同。
4、貝母甲素逆轉細菌耐藥性的作用與提高細菌內藥物濃度有關。
5、貝母甲素是首次發(fā)現(xiàn)的具有逆轉細菌多藥耐藥作用的瑟文類生物堿。從結構和機制而言屬新一類細菌耐藥逆轉劑，對于探討逆轉細菌耐藥機制和開發(fā)新逆轉劑具有進一步研究價值。
權利要求
1.貝母甲素在制備治療耐藥性細菌感染疾病的藥物中的應用。
2.貝母甲素在制備具有抗菌增效協(xié)同作用的抗耐藥性細菌感染疾病的藥物中的應用。
3.貝母甲素在制備具有逆轉細菌多重抗生素耐藥性作用的藥物中的應用。
4.權利要求3所說的抗生素包括β-內酰胺類抗生素。
5.權利要求4所說的抗生素是青霉素或優(yōu)立新。
6.權利要求3所說的抗生素包括氨基糖甙類抗生素。
7.權利要求6所說的抗生素是慶大霉素。
8.權利要求3所說的抗生素包括喹諾酮類抗生素。
9.權利要求8所說的抗生素是環(huán)并沙星。
全文摘要
本發(fā)明是關于貝母甲素的新藥物用途發(fā)明,包括貝母甲素在制備治療耐藥性細菌感染疾病的藥物中的應用;貝母甲素在制備具有抗菌增效協(xié)同作用的抗耐藥性細菌感染疾病的藥物中的應用;貝母甲素在制備具有逆轉細菌多重抗生素耐藥性作用的藥物中的應用。
文檔編號A61K31/58GK1304726SQ0013217
公開日2001年7月25日 申請日期2000年12月15日 優(yōu)先權日2000年12月15日
發(fā)明者胡凱文, 王嵩, 王成祥, 陳信義, 孫穎立, 李仝 申請人:北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院