專利名稱：編碼單克隆抗-ctla-4抗體的溶瘤腺病毒載體的制作方法
編碼單克隆抗-CTLA-4抗體的溶瘤腺病毒載體發(fā)明領域
本發(fā)明涉及生命科學和醫(yī)學領域。具體地，本發(fā)明涉及癌癥療法。更具體地，本發(fā)明涉及溶瘤腺病毒載體以及包含所述載體的細胞和藥物組合物。本發(fā)明還涉及用于治療受試者的癌癥的所述載體以及用于治療受試者的癌癥的方法。此外，本發(fā)明涉及在細胞中產生單克隆抗-CTLA4抗體以及增強受試者的腫瘤特異性免疫應答和細胞凋亡的方法，以及溶瘤腺病毒載體用于在細胞中產生單克隆抗-CTLA4抗體和增強受試者的腫瘤特異性免疫應答和細胞凋亡的用途。
發(fā)明背景
癌癥可利用手術、激素療法、化學療法、放射療法和/或其它療法來治療，但在許多情況下，通常特征在于晚期的癌癥不能用現有療法來治愈。因此，需要新型癌細胞靶向方法，例如基因療法。
在過去20年中，基因轉移技術一直處于嚴密的審查中。癌癥基因療法的目的是，向腫瘤細胞引入治療性基因。引入靶細胞的此類治療性基因可以例如修正突變的基因，抑制活性癌基因或對細胞產生額外的性質。適當的外源性治療基因包括但不限于，免疫治療性、抗血管生成性、化學保護性(chemoprotective)和“自殺”基因，并且可通過利用修飾的病毒載體或非病毒法(包括電穿孔、基因槍和脂質或聚合物包衣)將其引入細胞。
最佳病毒載體的要求包括，發(fā)現特定靶細胞和在靶細胞中表達病毒基因組的高效能力。此外，最佳載體必須在靶組織或細胞中保持活性。在過去10年中，已開發(fā)了具有此類性質的病毒載體，例如，逆轉錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒(adeno-associated viral)載體已在生物醫(yī)學中得到廣泛研究。
為了進一步改善對腫瘤的穿透性和抗腫瘤作用的局部放大，已構建了選擇性溶瘤齊U，例如條件復制腺病毒。溶瘤腺病毒是用于治療癌癥的很有前景的工具，并且在臨床試驗中已顯示良好的安全性和一定的功效。腫瘤細胞因病毒在腫瘤細胞中的復制而被溶瘤腺病毒殺死，復制的晚期導致數以千計的病毒體(virion)釋放入周圍腫瘤組織，有效地進行腫瘤穿透和血管再感染。由于病毒基因組的工程改變(該改變阻止在非腫瘤細胞中的復制)，因此腫瘤細胞允許病毒復制，然而正常細胞則避免了病毒復制。
可通過在腺病毒El區(qū)域中產生部分缺失或通過使用組織或腫瘤特異性啟動子(TSP)來將復制局限于 腫瘤組織。此類啟動子的插入可增強載體在靶細胞中的作用，并且外源組織或腫瘤特異性啟動子的使用在重組腺病毒載體中是非常常見的。
大多數臨床試驗一直以來利用基于腺病毒5(Ad5)的早期腺病毒來進行。溶瘤腺病毒的抗腫瘤作用依賴于它們的基因遞送能力。不幸的是，大多數腫瘤低表達主要的Ad5受體，因此已向Ad5衣殼(capsid)中引入修飾。例如，使用血清型3型的結(knob)的衣殼修飾已在卵巢癌中顯示提高的感染性和良好效力(Kanerva A,等人，Clin CancerRes2002; 8:275-80; Kanerva A,等人，Mol Ther2002; 5:695-704; Kanerva A,等人，MolTher2003;8:449-58)。此外，由于Ad載體的纖突(fiber)和五鄰體(penton)底座是細胞進入機制的至關重要的介體，因此可通過此類衣殼蛋白的遺傳修飾來實現重組Ad載體的革巴向(Dmitriev 1.,等人 1998，Journal of Virology, 72, 9706-9713) 目前，在臨床中使用的大部分溶瘤病毒由于關鍵病毒基因的若干缺失而在復制方面被高度減弱。此類病毒已顯示優(yōu)良的安全記錄，但抗腫瘤功效仍然是有限的。
臨床和臨床前結果顯示，利用未被武裝的(unarmed)溶瘤病毒的治療的免疫刺激不足以導致持續(xù)的抗腫瘤治療性免疫應答。在這一點上，溶瘤病毒已被武裝(be armed)以更具免疫刺激性。此外，腫瘤內的病毒復制和免疫刺激蛋白的表達通過誘導細胞因子的產生和腫瘤抗原的釋放而增強免疫系統(tǒng)(Ries SJ,等人，Nat Med2000;6:1128-33)。
武裝溶瘤病毒組合了常規(guī)基因遞送的有利方面與能復制的試劑的效力。武裝病毒的一個目的是，誘導針對允許病毒復制的細胞的免疫應答。如上文中所提及的，單獨的病毒復制，盡管具有免疫原性，但通常不足以誘導有效的抗腫瘤免疫。為了增強治療性免疫的誘導，已用刺激蛋白例如細胞因子武裝病毒，以促進腫瘤抗原至抗原呈遞細胞例如樹突細胞的引入以及它們的刺激和/或成熟。免疫治療性基因至腫瘤細胞的引入以及此外其蛋白質的翻譯，導致免疫應答的激活和更高效的腫瘤細胞破壞。在這一點上，最相關的免疫細胞是天然殺傷細胞(NK)和細胞毒性CD8+T細胞。
已認識到癌癥免疫療法中的關鍵啟示是，由于腫瘤免疫逃逸機制，抗-腫瘤免疫應答的誘導不足以根除疾病。相反地，由于晚期腫瘤的免疫抑制性質，抑制性T細胞的下調也是需要的(Dranoff G., Nat Rev Cancer2004; 4:11-22 ; de Visser KE 等人，NatRev Cancer2006;6:24-37)。此類關鍵調控途徑之一涉及細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4 (CTLA-4,⑶152)，其針對B7/⑶28介導的刺激起作用。拮抗CTLA-4的抗體的臨床前抗腫瘤效力先前已顯示于幾個腫瘤模型中(Leach DR等人，Sciencel996; 271:1734-6; Kwon ED等人，Proc Natl Acad Sci USA1999; 96:15074-9)。
目前，兩個抗CTLA-4的完全人單克隆抗體(mAb)正處于臨床開發(fā)中=IgGl伊匹木單抗(以前稱為MDX-010)和IgG2曲美木單抗(先前稱為CP-675，206)。幾個已公布的研究證明了，伊匹木單抗和曲美木單抗在患有黑色素瘤和其它癌癥的患者中的生物學活性和臨床活性(Kirkwood JM 等人，Clin Cancer Res2010; 16:1042-8; Hodi FS 等人，N Engl JMed.2010;363;8:711-23;Rib as A 等人，0ncologist2007; 12:873-83)。盡管已在許多試驗中看到了抗-腫瘤活性，但也已報導了嚴重的、甚至致命的副作用。副作用與因全身性施用而導致的正常組織暴露相關，而效力通過腫瘤處免疫抑制的減小來測定。因此局部產生CTLA-4mAb的可能性是迫切需要的。
CTLA-4是激活誘導的Ig超家族的I型跨膜蛋白，其由T淋巴細胞表達為共價同二聚體，用作共刺激分子B7.1 (CD80)和B7.2 (CD86)的抑制性受體(Ribas A等A , 0ncologist2007; 12:873-83)。mAb對CTLA-4的阻斷導致淋巴細胞產生增加的白細胞介素-2(IL-2)和干擾素-Y (IFN-y);和增加的主要組織相容性復合物(MHC) I類分子的表達(Lee KM 等人，Sciencel998; 282:2263-6; Paradis TJ 等人，Cancer TmmunolImmunother2001;50:125-33)。
腫瘤用于逃避抗-腫瘤免疫的主要機制之一是，通過調節(jié)性T細胞(T-Reg)。在幾個迄今被用于下調T-Reg的方法中,抗_CTLA4mAb是唯--個其安全性和效力已在大型隨機化研究中得到證明的方法(Hodi FS等人，N Engl J Med.2010; 363; 8:711-23)。雖然該試驗代表了腫瘤免疫療法的突破，但在此之前報道了利用另一種抗_CTLA4mAb的陰性3期研究(Ribas A 等人 J Clin Oncol ASCO suppl.2008; 287)。此外，在所有抗 _CTLA4mAb試驗中，嚴重的免疫相關不利事件(irAE)已造成死亡，這導致了對所述方法的安全性的憂慮。因此，需要其它方法(例如基因療法平臺的應用)，因為其可增加局部濃度以獲得增強的效力，同時減小與全身性暴露相關的副作用。
已報導，局限于腫瘤的抗_CTLA4scFv的表達與全身性T-Reg耗盡法的組合具有協(xié)同作用(Tuve S，等人 Cancer Res2007;67:5929-39)。此外，當抗-CTLA_4scFv 抗體被腫瘤持續(xù)表達以及腹膜內(1.P.)施用抗-CD25抗體時，作者在鼠模型中未觀察到自身免疫反應(Tuve S，等人 Cancer Res2007;67:5929-39)。相反地，當將抗 _CTLA4mAb與T-Reg耗盡一起全身性施用時，觀察到自身免疫反應(Sutmuller RP等人，J ExpMed2001; 194:823-32; Takahashi T 等人 J Exp Med2000; 192:303-10)。協(xié)同作用的一個可能原因是，T-Reg的耗盡減少了調節(jié)性細胞的數目，同時抗-CTLA-4減少了抑制細胞的活性。此外，抗-CTLA4還可減小對抗原呈遞細胞的抑制。
腺病毒是中等大小的(90_100nm)無包膜二十面體病毒，其在蛋白質衣殼中具有約36000個堿基對的雙鏈線性DNA。病毒衣殼具有纖突結構，其參與病毒至靶細胞的附著。首先，纖突蛋白質的結(knob)結構域結合靶細胞的受體(例如，柯薩奇病毒腺病毒受體，CAR)，第二，病毒與整聯蛋白分子相互作用，第三，病毒被內吞入靶細胞。接著，病毒基因組被從內體(endosome)轉移進入細胞核,且祀細胞的復制機制也被用于病毒目的(Russellff.C., J General Virol2000;81:2573-2604)。
腺病毒基因組具有按相繼順序轉錄的早期(E1-E4)、中期(IX和IVa2)和晚期基因(L1-L5)。早期基因產物影響宿主細胞的防御機制、細胞周期和細胞代謝。中期和晚期基因編碼用于產生新病毒體的結構病毒蛋白質(Wu和Nemerow, Trends Microbiol2004; 12:162-168;Russell ff.C., J General Virol2000;81;2573-2604;Volpers C.和Kochanek S.JGene Med2004;6, suppl1:S164-71;KootstraN.A.和Verma 1.M.Annu Rev PharmacolToxicol2003;43:413-439)。
已在人中發(fā)現超過50種不同血清型的腺病毒。血清型被分類成6個亞組A-F，并且已知不同的血清型與不同的病況(即，呼吸性疾病、結膜炎和胃腸炎)相關。已知腺病毒血清型5型(Ad5)引起呼吸疾病，其是基因治療領域中最常研究的血清型。在第一種Ad5載體中,El和/或E3區(qū)域被缺失,從而使得能夠將外源DNA插入載體(Danthinne X, ImperialeMJ., Gene Therapy .2000; 7:1707-1714)。此外，其它區(qū)域的缺失以及另外的突變已給病毒載體提供了額外的性質。事實上，已提出腺病毒的各種修飾來實現有效抗腫瘤作用。
基因療法的更高效和精確的基因轉移以及增加的特異性和充足的腫瘤殺傷能力仍然是有必要的。治療性載體的安全記錄必須也是優(yōu)異的。本發(fā)明通過利用腺病毒的溶瘤和免疫治療性性質，以創(chuàng)新方式提供了具有上述性質的癌癥治療工具。
發(fā)明概述
本發(fā)明的目的是，提供用于實現腺病毒的上述性質的新型方法和工具，從而解決常規(guī)癌癥療法的問題。更具體地，本發(fā)明提供了用于基因療法的新型方法和工具。
本申請描述了重組病毒載體的構建、與載體相關的方法以及其在腫瘤細胞系、動物模型以及癌癥患者和正常供體的血細胞中的用途。
本發(fā)明涉及溶瘤腺病毒載體，所述載體包含:
I)腺病毒血清型5型(Ad5)核酸主鏈，其包含衣殼修飾，優(yōu)選具有腺病毒血清型3型(Ad3)的結的衣殼修飾(Ad5/3衣殼嵌合體)，
2)在El的Rb結合恒定區(qū)2中的24bp缺失(D24);和
3)替代E3區(qū)域中的缺失的腺病毒基因gpl9k/6.7K的編碼特異于CTLA-4的完全人單克隆抗體的核酸序列。
本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的腺病毒載體的細胞。
本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的腺病毒載體的藥物組合物。
本發(fā)明還涉及用于治療受試者的癌癥的本發(fā)明的腺病毒載體。
本發(fā)明還涉及治療受試者的癌癥的方法，其中所述方法包括給患有癌癥(特別地常規(guī)化學療法和/或放射療法難以治療的癌癥)的受試者施用本發(fā)明的載體或藥物組合物。
此外，本發(fā)明涉及在細胞中產生特異于CTLA-4的完全人單克隆抗體的方法，其中所述方法包括:
將包含本發(fā)明的溶瘤腺病毒載體的媒介物運送至細胞，和
在細胞中表達載體的特異于CTLA-4的完全人單克隆抗體。
此外，本發(fā)明涉及增強受試者的腫瘤特異性免疫應答的方法，其中所述方法包括:
將包含本發(fā)明的溶瘤腺病毒載體的媒介物運送至靶細胞或組織，
在細胞中表達載體的特異于CTLA-4的完全人單克隆抗體(抗_CTLA4mAb)，
通過病毒基因組的腫瘤特異性復制而增加抗_CTLA4mAb在腫瘤(但非正常組織)中產生的量。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的溶瘤腺病毒載體用于在細胞中產生特異于CTLA-4的完全人單克隆抗體的用途。
本發(fā)明還涉及用于在細胞中產生特異于CTLA-4的完全人單克隆抗體的本發(fā)明的溶瘤腺病毒載體。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的溶瘤腺病毒載體用于增強受試者的腫瘤特異性免疫應答的用途。
本發(fā)明還涉及用于增強受試者的特異性免疫應答的本發(fā)明的溶瘤腺病毒載體。
本發(fā)明提供了用于治療癌癥(其為現有治療方法難以治療或不能治愈的癌癥)的工具。此外，相較于許多其它治療，對于適合于本發(fā)明的治療的腫瘤類型的限制也很少。事實上，可利用提出的發(fā)明治療所有實體瘤。與先前的技術相比較，本發(fā)明可幫助破壞更大的腫瘤(按質量計)和更復雜的腫瘤?？赏ㄟ^瘤內、腔內、靜脈內途徑以及與此類途徑的組合提供治療。本發(fā)明方法可提供全身性效力，盡管進行局部注射。本發(fā)明方法還可根除被提及為腫瘤起始(“癌癥干細胞(cancer stem cell)”)的細胞(Eriksson M等人MolTher2007;15(12):2088-93)。
除了使得能夠將載體轉運至目的位置外，本發(fā)明的載體還確保了轉基因的表達和保持。本發(fā)明解決了與常規(guī)療法的治療抗性相關的問題。此外，本發(fā)明提供了用于選擇性治療的、對健康組織具有較低的毒性或損害的工具和方法。本發(fā)明的有利方面還包括，相較于其它療法，不同的和減小的副作用。重要地，本發(fā)明方法與許多其它形式的療法(包括化學療法、小分子抑制劑和放射療法)具有協(xié)同作用，從而可以以組合方案使用。
未武裝的腺病毒的針對允許復制的細胞的免疫反應的誘導通常未能強至足以導致治療性腫瘤免疫的發(fā)生。為了克服該弱點，本發(fā)明提供了具有特異于CTLA-4的完全人單克隆抗體的武裝的腺病毒，所述病毒通過活化T細胞毒性細胞和抗原呈遞細胞，以及通過下調調節(jié)性T細胞和其它抑制性細胞而增強抗腫瘤免疫?？?CTLA-4mAb還可直接誘導通常表達CTLA-4的腫瘤細胞的細胞凋亡。通過本發(fā)明的腺病毒，實現了幾種由CTLA-4阻斷性抗體(如上文中描述的)介導的抗腫瘤機制:
(A):抗-CTLA-4mAb可阻斷衍生自活化的T細胞表面上的CTLA-4分子的免疫抑制信號轉導(Chambers CA 等人,Annu Rev Tmmunol 2001 ; 19:565-94)。
(B):重要的抑制性T細胞亞組(調節(jié)性T細胞，T-Reg)組成型表達CTLA-4并且可結合樹突細胞上的B7分子，所述樹突細胞為至關重要的抗原呈遞細胞(Paust S等A , Proc Natl Acad Sci USA2004; 101:10398-403)。吲哚胺 2，3-雙加氧酶和其它抑制回路的隨后上調導致T細胞在微環(huán)境中的耐受，而非細胞毒性作用(Munn DH等人，J ClinInvest2004;114:280-90.
(C):表達CTLA-4的T細胞(包括T-Reg)也可直接結合活化的T細胞，因為B7共刺激分子在活化的人T細胞表面上表達。CTLA-4阻斷性mAb干擾該抑制性信號轉導，導致腫瘤抗原特異性T細胞的局部擴增(Paust S等人，Proc Natl Acad SciUSA2004;101:10398-403)ο
(D): CTLA-4在許多腫瘤細胞表面上表達(Contardi E等人，Int JCancer2005; 117:538-50)，這推定地反映對細胞毒性T細胞和DC的B7的直接免疫抑制作用。有趣地，CTLA-4阻斷性mAb可通過觸發(fā)細胞凋亡而誘導對腫瘤細胞的直接殺傷(RibasA 等人，0ncologist2007; 12:873-83; Contardi E 等人，Int J Cancer2005; 117:538-50),并且在體內這可通過抗體依賴性細胞毒作用得到進一步增強(Jinushi M等人Proc NatlAcad Sci U S A2006;103:9190-5)。
(E):腫瘤表達的CTLA-4可在腫瘤浸潤性DC中觸發(fā)增加的吲哚胺2，3-雙加氧酶，并且CTLA-4特異性單克隆Ab也可阻斷 該作用(Ribas A等人,0ncologist2007;12:873-83)。
因此，5種不同的機制使得包含單克隆抗-CTLA-4的本發(fā)明的腺病毒成為高效的抗腫瘤方法，而無已導致安全問題的與全身性暴露相關的副作用(Hodi FS等人，N Engl JMed.2010; 363; 8:711-23; Sanderson K 等人，J Clin 0ncol2005; 23:741-50。除了這 5 個轉基因介導的機制外，病毒的溶瘤復制還將增添抗腫瘤效力。鑒于腺病毒本身介導高效的免疫刺激活性(Tuve S，等人Vaccine.2009;27 (31):4225-39)，因此，溶瘤作用增添了所述方法的總體免疫效用。在下面的實施例9(

圖1、11、12)中，我們描述了這一方面的其它改善:將CpG部分添加進入腺病毒基因組使得病毒甚至更具免疫刺激性。
與現有技術的腺病毒工具相比較，本發(fā)明提供了更簡單、更有效、廉價的、無毒性和/或更安全的癌癥治療工具。此外，無需輔助病毒或重組分子的共施用。
本發(fā)明提供了新一代的感染性增強的、高度有效的腺病毒，所述腺病毒保留了更早代的病毒的良好安全性，且導致更高的功效水平。重要地，本發(fā)明描述了這樣的溶瘤腺病毒，其提供了對于溶瘤病毒的功效是至關重要的免疫因子。
本發(fā)明的新型產物使得能夠進一步改善癌癥療法。
附圖概述
圖1顯示了單和雙靶向的和抗-CTLA4武裝的溶瘤腺病毒的構建。溶瘤腺病毒 Ad5/3- Δ 24aCTLA4 (單靶向的；其它的為雙靶向的)、Ad5/3_hTERT- Δ 24aCTLA4、Ad5/3-hTERT- Δ 24aCTLA4_CpG、Ad5/3_E2F- Δ 24aCTLA4 和 Ad5/3E2F_ Δ 24aCTLA4_CpG、復制缺陷型Ad5/3-aCTLA4以及未武裝的溶瘤Ad5/3_△ 24(陽性對照)和復制缺陷型Ad5/3-Lucl (陰性對照)的示意性說明。
圖2A-2F顯示病毒產生的抗-CTLA4單克隆抗體的表達和功能的評價。
圖2A:在非變性(上行)或變性條件(下行)下，通過Western印跡分析病毒感染的A549 (從左至右泳道I和2)或PC3-MM2 (泳道3和4)細胞的無血清上清液，以特異性檢測人Ig (重鏈和輕鏈)。泳道I和3:用Ad5/3-Λ 24aCTLA4感染的細胞；泳道2和4:用Ad5/3-aCTLA4感染的細胞。
圖2B:證明病毒產生的抗-CTLA4單克隆抗體的活性的功能測定。用離子霉素、佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(PMA)和重組人B7溫育Jurkat細胞，導致與被抗原呈遞細胞刺激但被抑制細胞抑制的T細胞相似的CD28和CTLA-4陽性細胞(晚期腫瘤中常見的情形)。來自經Ad5/3- Δ 24aCTLA4或Ad5/3_aCTLA4感染的細胞的上清液導致B7/CTLA-4介導的抑制作用的抑制。這可從增加的IL-2產量(T細胞活化的標志)觀察到。將重組抗-CTLA4單克隆抗體用作陽性對照。
圖2C:顯示重組CTLA-4 (rCTLA-4)對病毒產生的抗-CTLA4單克隆抗體的親和力的功能喪失測定(loss of function assay)。如先前一樣(但現在還添加rCTLA-4以結合B7，阻止CTLA-4激活)活化Jurkat細胞。當添加含有aCTLA4的上清液時，rCTLA-4被封閉，并且B7能夠結合CTLA-4以減少IL-2產量。條柱，3個單獨的實驗的平均值；條棒，SE，*，Ρ〈0.05 ;***，Ρ〈0.0Olo
圖2D:A549、SK0V3_ipl、PC3-MM2腫瘤細胞系和UT-SCC8低代次腫瘤外植體的CTLA4表達水平。在熒光輔助細胞分選中，所有腫瘤細胞系對于CTLA4都是陽性的。
圖2E和2F:顯示抗-CTLA4表達盒的大尺寸或抗-CTLA4蛋白的產生不影響Ad5/3_Δ 24aCTLA4的復制能力(replicativity)的腺病毒qPCR。簡而言之，用PBS、Ad5/3- Δ 24和Ad5/ 3_ Δ 24aCTLA4感染A549細胞，然后在不同的時間點通過qPCR測量來自上清液和來自細胞的病毒顆粒的數目。在病毒組之間未發(fā)現顯著差異。
圖3顯示抗-CTLA4武裝的腺病毒和對照載體的細胞殺傷效率。感染腫瘤細胞系(A)PC3-MM2、(B)SK0V3-1pl、(C)A549和(D)低代次腫瘤外植體UT-SCC8。在所有細胞系中，Ad5/3-A24aCTLA4具有與陽性對照病毒Ad5/3_A 24相似的溶瘤效力。此外，復制缺陷型Ad5/3-aCTLA4也具有抗腫瘤活性，因為腫瘤細胞表達CTLA4。條柱，一式三份測定的平均值；條棒，SE。**，P〈0.01 ;***，Ρ〈0.001。
圖4顯示，用表達抗-CTLA-4單克隆抗體的溶瘤腺病毒處理的、具有人前列腺癌異種移植物(PC3-MM2腫瘤)和人肺癌異種移植物(A549腫瘤)的免疫缺陷型小鼠的腫瘤生長抑制和細胞凋亡。在裸小鼠中建立PC3-MM2腫瘤(n=8/組)，其中人抗-CTLA-4不具有免疫學活性。因此，該模型僅測量抗-CTLA-4的溶瘤作用和促細胞凋亡作用。7天后，在第O、2和4天(箭頭)用I X IO8個病毒顆粒瘤內處理腫瘤(直徑5-8mm)。模擬小鼠僅用生長培養(yǎng)基進行注射。
圖4A:Ad5/3- Δ 24aCTLA4在該高度侵襲性模型中具有最佳抗腫瘤活性。相對于平均初始尺寸來表示腫瘤尺寸。點，平均值；條棒，SE ;**，P〈0.01 (第7天的學生氏t檢驗)。
圖4B:在第5天，通過免疫組織化學(褐色)對腫瘤冰凍切片的抗-CTLA4的表達(人IgG，上行)或細胞凋亡(活性胱天蛋白酶_3，下行)進行染色。在X40放大倍數下拍攝的圖像。
圖4C:在第7天，測量用Ad5/3-A 24aCTLA4或Ad5/3_aCTLA4處理的小鼠的腫瘤和血漿的人IgG水平。在Ad5/3-Λ 24aCTLA4處理的腫瘤中，相較于Ad5/3_aCTLA4處理的腫瘤，發(fā)現81倍的抗-CTLA4mAb (p〈0.05)。此外，在用Ad5/3_ Δ 24aCTLA4處理的腫瘤中，與相同動物的血漿相比，發(fā)現了 43.3倍的抗-CTLA4mAb (p〈0.05)。平均血漿濃度為392.6 μ g/g(SE312.0)，其低于報導的分別用伊匹木單抗(Seiyg/mL)和曲美木單抗(450 μ g/mL)處理的人中耐受的濃度(REFS) (ImL的血漿重約Ig)。在Ad5/3_A 24aCTLA4腫瘤中，mAb的濃度為16977 μ g/g，因此遠高于血漿中的濃度。條柱，一式三份測定的平均值；條棒，SE。
圖4D.在肺癌模型中相較于模擬物的Ad5/3_ Λ 24aCTLA4引起的顯著的抗腫瘤活性(P〈0.01)。未看見Ad5/3-A24aCTLA4與Ad5/3-A24之間的顯著差異。顯示組，直至按照動物管理條例必須殺死來自所述組的第一只小鼠。點，平均值；條棒，SE。
圖5顯示，由Ad5/3_ Δ 24aCTLA4介導的、癌癥患者的經刺激的外周血單核細胞(PBMC)中的增加的IL-2和IFN-Y產量。癌癥患者(患者1244、患者C261、患者M158或患者X258)的PBMC用離子霉素、PMA和重組人B7進行刺激(以模擬腫瘤誘導的免疫抑制)以及用來自病毒感染的PC3-MM2細胞的過濾的上清液進行處理。IL-2(A)和IFN-Y (B)是T細胞活化的標志，且通過FACS陣列進行測定。將重組抗-CTLA-4單克隆抗體用作陽性對照。條柱，三個單獨實驗的平均值；條棒，SE。*，Ρ〈0.05 ;**，Ρ〈0.01 ;***，Ρ〈0.001。
圖6顯示，用Ad5/3-A 24aCTLA4處理的健康供體的外周血單核細胞(PBMC)的IL-2和IFN- Y的產量。來自2個健康供體的PBMC用離子霉素、PMA和重組人B7進行刺激，以及用來自病毒感染的PC3-MM2細胞的過濾的上清液進行處理。利用FACS陣列測量生長培養(yǎng)基中的IL-2(A)或IFN-Y⑶水平。條柱，3個單獨實驗的平均值；條棒，SE。*，P〈0.05 ；_，Ρ〈0.001。
圖7顯示，針對圖2、5和6中顯示的實例進行的抗-CTLA-4功能性測定的示意圖。在體內，樹突細胞通過 主要組織相容性復合物(MHC)將抗原呈遞給T細胞表面上的T細胞受體(TCR)。對于免疫應答(而非耐受性)，還需要共刺激。這通過Β7.1或Β7.2 (DC上的)對T細胞上的⑶28的結合來介導。T細胞活化可通過IL-2和IFN- Y的產量來定量。
圖7Α:在完整免疫系統(tǒng)不存在的情況下，可通過用佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(PMA)和離子霉素溫育PBMC來體外刺激T細胞活化，從而導致不依賴于TCR和CD28信號轉導的活化。
圖7Β:在T細胞活化后，作為負反饋控制機制，CTLA-4的表達也被上調。
圖7C:CTLA_4對Β7的親和力為CD28對Β7的100倍，從而導致T細胞阻滯(Τ cellarrest)。
圖7D:抗-CTLA-4抗體對CTLA-4信號轉導的阻斷阻斷了抑制作用，從而導致T細胞的活化。
圖7E:當添加可溶性重組人CTLA-4時，抗-CTLA_4mAb被隔離，從而使得B7自由地結合CTLA-4，并進行T細胞阻滯。
圖7F:如果在抗_CTLA4mAb不存在的情況下將重組CTLA-4添加至生長培養(yǎng)基，那么其將隔離B7，從而使T細胞處于活化狀態(tài)。
圖8顯示癌癥患者的經刺激的外周血單核細胞(PBMC)中，由Ad5/3_ Λ 24aCTLA4產生的特異性抗_CTLA4mAb活性。癌癥患者(患者1244、患者C261、患者M158或患者X258)的PBMC用離子霉素、PMA、重組人B7和重組人CTLA-4進行刺激；以及用來自病毒感染的PC3-MM2細胞的過濾的上清液進行處理。通過FACS測定測量生長培養(yǎng)基的IL_2 (A)或IFN- Y (B)水平。條柱，3個單獨實驗的平均值；條棒，SE。*，Ρ〈0.05。
圖9顯示健康供體的經刺激的外周血單核細胞(PBMC)中，由Ad5/3_ Λ 24aCTLA4產生的特異性抗_CTLA4mAb活性。PBMC用離子霉素、PMA、重組人B7和重組人CTLA-4進行溫育以及用來自病毒感染的PC3-MM2細胞的過濾的上清液進行處理。通過FACS測定測量生長培養(yǎng)基的IL-2(A)或IFN-Y⑶水平。條柱，3個單獨實驗的平均值。
圖10顯示，相較于復制缺陷型病毒，能復制的平臺在增加抗_CTLA4mAb表達方面的效用。將PC3-MM2細胞以20000個細胞/孔接種，然后用各病毒以IOVP/細胞感染所述細胞。感染后24h、48h和72h，收集上清液，用ELISA分析人IgG的量。相較于復制缺陷型Ad5/3-aCTLA4，對于溶瘤病毒Ad5/3_ Δ 24aCTLA4觀察到3倍的增加。條柱，一式五份測定的平均值；條棒，SE。***，P〈0.001。
圖11顯示包含toll樣受體9 (TLR-9)刺激性CpG分子的溶瘤腺病毒在肺癌的異種移植物小鼠模型中的作用。將A549細胞植入裸小鼠(5只小鼠/組，每小鼠2個腫瘤)，然后如下處理小鼠:鹽水(黑色三角形)、富含CpG的溶瘤腺病毒(Ad5-A24CpG，白色圓圈)、溶瘤腺病毒(Ad5-Λ 24，黑色正方形)、溶瘤腺病毒+重組CpG寡核苷酸(白色正方形)。富含CpG的病毒在介導抗腫瘤免疫中最有效，其甚至比與重組CpG分子組合提供的溶瘤腺病毒更有效。
圖12Α顯示，對在72小時從處理的小鼠(與圖11中的小鼠相同的小鼠)收獲的脾細胞進行的MTS細胞殺傷測定的結果。報告在指定的時間點仍然活著的Α549的百分比。圖12Β顯示，鼠抗-CTLA4不影響抗病毒免疫。
圖12Β顯示，干擾素Y ELISP0T測定的結果，其表明鼠抗-CTLA4不影響抗病毒免疫。用PBS、Ad5/3-A 24、Ad5/3-A 24和小鼠aCTLA4抗體或用單獨的小鼠aCTLA4抗體處理具有免疫能力的C57B1/6小鼠(n=5)。2周后，收集脾，在用UV-滅活的Ad5/3_ Λ 24或用功能性病毒刺激后，通過干擾素Y ELISP0T分析PBMC。SPU=斑點產生單位。
發(fā)明詳述
腺病毒載體
在Ad5中以及在其它腺病毒中，二十面體衣殼由三種主要蛋白質:六鄰體(II)、五鄰體基座(penton base) (III)和多節(jié)纖突(knobbed fiber) (IV)以及次要蛋白質:V1、VII1、IX、IIIa 和 IVa2 組成(Russell ff.C., J General Virol2000;81:2573-2604)。蛋白質VI1、小肽mu和末端蛋白質(TP)與DNA締合。蛋白質V通過蛋白質VI提供至衣殼的結構連接。病毒編碼的蛋白酶是加工一些結構蛋白質所需要的。
本發(fā)明的溶瘤腺病毒載體基于腺病毒血清型5型(Ad5)核酸主鏈，該核酸主鏈包含衣殼修飾例如腺病毒血清型3型(Ad3)的結(Ad5/3衣殼嵌合體)、El的Rb結合恒定區(qū)2中的24bp缺失(D24)和替代E3區(qū)域中缺失的gpl9k/6.7K的編碼特異于CTLA-4的完全人單克隆抗體(抗_CTLA4mAb或aCTLA4)的核酸序列。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，腺病毒載體基于人腺病毒。
Ad5基因組包含側翼連接有左和右末端反向重復(分別地LITR和RITR)的早期(E1-4)、中期(IX和IVa2)和晚期(L1-5)基因，其包含DNA復制所需的序列?；蚪M還包含包裝信號(Ψ)和主要晚期啟動子(MLP)。
早期基因ElA的轉錄啟動復制周期，隨后表達E1B、E2A、E2B、E3和E4。El蛋白以使細胞對病毒復制更易感的方式調節(jié)細胞代謝。例如，它們干擾NF- K B、p53和pRb-蛋白。ElA和ElB—起用于抑制細胞凋亡。E2(E2A和E2B)和E4基因產物介導DNA復制，E4產物也影響病毒RNA代謝并且阻止宿主蛋白質的合成。E3基因產物負責抵抗宿主免疫系統(tǒng)的防御，增強細胞裂解，并且釋放病毒后代(Russell ff.C., J General Virol2000;81:2573-2604)。
中期基因IX和IVa2編碼病毒衣殼的次要蛋白。晚期基因Ll_5(其導致病毒結構組分的產生、病毒顆粒在細胞核中的衣殼化和成熟)的表達受MLP影響(Russell W.C.，JGeneral Virol2000;81:2573-2604)。
與野生型腺病毒基因組相比較，本發(fā)明的腺病毒載體在El區(qū)中，特別地在ElA區(qū)域中缺乏來自CR2的24個堿基對，以及在E3區(qū)域中缺乏gpl9k和6.7K，并且在病毒的纖突中包含衣殼修飾。在一些實施方案中，與野生型腺病毒基因組相比較，本發(fā)明的腺病毒載體額外地在El區(qū)域中，特別地在ElA區(qū)域的上游包含hTERT啟動子或E2F啟動子，并且在E3區(qū)域中缺乏gpl9k和6.7K。在一些實施方案中，本發(fā)明還包括富含TLR-9結合CpG島的腺病毒主鏈，其已被置于E3區(qū)域中(圖1)。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，除了修正的/部分區(qū)域El和E3外，本發(fā)明的溶瘤腺病毒載體還包含選自E2、E4和晚期區(qū)域的一個或多個區(qū)域。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，溶瘤腺病毒載體包含下列區(qū)域:左ITR、部分El、pIX、pIVa2、E2、VAl、VA2、Ll、L2、L3、L4、部分E3、L5、E4和右ITR。所述區(qū)域可以以任何順序存在于載體中，但在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述區(qū)域按5’至3’的方向依次排列。開放閱讀框架(ORF)可以在相同的DNA鏈或或在不同的DNA鏈中。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，El區(qū)域包含病毒包裝信號。
如本文中所 用，表述“腺病毒血清型5型(Ad5)核酸主鏈”是指Ad5的基因組或部分基因組，其包含選自Ad5來源的部分El、pIX、pIVa2、E2、VA1、VA2、L1、L2、L3、L4、部分E3、L5和E4的一個或幾個區(qū)域。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的載體包含具有Ad3的一部分(例如，衣殼結構的一部分)的Ad5核酸主鏈。
如本文中所用，表述“部分”區(qū)域是指，與相應野生型區(qū)域相比，缺乏任何部分的區(qū)域。例如，“部分E3”可以指缺乏gpl9k/6.7K的E3區(qū)域。
如本文中所用，表述“VA1”和“VA2”是指病毒相關RNAl和2，其由腺病毒轉錄但不被翻譯。VAl和VA2在抵抗細胞防御機制中具有作用。
如本文中所用，表述“病毒包裝信號”是指病毒DNA的一部分,其由一系列富含AT的序列組成并且控制衣殼化過程。
El的24個堿基對的缺失(D24)影響CR2結構域，其負責結合Rb腫瘤抑制蛋白/細胞周期調節(jié)蛋白，從而允許誘導合成(S)期，即DNA合成或復制期。pRb和ElA的相互作用需要ElA蛋白保守區(qū)的 8個氨基酸 121 至 127 (Heise C.等人2000，Nature Med6, 1134-1139)，所述氨基酸在本發(fā)明中缺失。本發(fā)明的載體包含對應于根據Heise C.等人(2000，NatureMed6, 1134-1139)的載體的氨基酸122-129的核苷酸的缺失。已知具有D24的病毒具有降低的克服Gl-S檢查點的能力，并且僅在其中該相互作用不是必需的細胞中，例如在Rb-pl6途徑具有缺陷的腫瘤細胞中有效復制(Heise C.等人2000，Nature Med6, 1134-1139; FueyoJ 等人 2000，0ncogenel9, 2-12)。
E3區(qū)域不是病毒體外復制所必需的，但E3區(qū)域在宿主免疫應答的調控，即在抑制先天和特異性免疫應答中具有重要作用。E3中的gpl9k/6.7K缺失是指，來自腺病毒E3A區(qū)域的965個堿基對的缺失。在所得的腺病毒構建體中，gp 19k和6.7K基因都已缺失(KanervaA等人2005，Gene Therapyl2，87-94)。已知gpl9k基因產物結合主要組織相容性復合物I (MHCl)分子并且將其隔離(sequester)在內質網中，且防止細胞毒性T淋巴細胞識別感染的細胞。由于許多腫瘤缺乏MHC1，所以gpl9k的缺失增強了病毒的腫瘤選擇性(病毒比野生型病毒更快地從正常細胞清除但在腫瘤細胞中無差異)。6.7K的蛋白質在細胞表面上表達，它們參與下調誘導TNF相關細胞凋亡的配體(TRAIL)的受體2。
在本發(fā)明中，將編碼CTLA4mAb轉基因的cDNA置于缺失gpl9k/6.7k的E3區(qū)域中，處于E3啟動子之下。這將轉基因表達限制于允許病毒復制，且隨后激活E3啟動子的腫瘤細胞。E3啟動子可以是本領域已知的任何外源或內源性啟動子，優(yōu)選內源性啟動子。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，編碼抗CTLA4mAb的核酸序列處于病毒E3啟動子的控制之下。
gpl9k缺失在抗CTLA4mAb表達的背景中特別有用，因為其可增強保持該能力的此類腫瘤中的腫瘤表位的MHCl呈遞。在該背景中，抗CTLA4mAb對T細胞毒性細胞的刺激可產生最佳益處。
抗-CTLA4mAb經由各種機制(包括活化T細胞毒性細胞、下調調節(jié)性T細胞(T-Reg)和抑制表達CTLA-4的腫瘤細胞對細胞毒性T細胞和抗原呈遞細胞(例如樹突細胞)的直接免疫抑制)起作用，從而增強免疫應答。除了上文中詳細解釋的這5個轉基因介導的機制外，病毒的溶瘤復制將增添抗-腫瘤功效。
編碼CTLA4mAb的核苷酸序列可來自任何動物例如人、猿、大鼠、小鼠、倉鼠、狗或貓，但優(yōu)選在人的治療的背景中CTLA4mAb由完全人的序列編碼。編碼CTLA4mAb的核苷酸序列可進行修飾以增強 其作用，或不進行修飾，即野生型序列。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，編碼CTLA4mAb的核酸序列是未經修飾的。
外源性元件的插入可增強載體在靶細胞中的作用。外源組織或腫瘤特異性啟動子的使用在重組腺病毒載體中是常見的，它們也可用于本發(fā)明。在一些實施方案中，本發(fā)明的腺病毒包含hTERT或hTERT的變體或E2F以控制ElA區(qū)域，優(yōu)選置于ElA的上游。hTERT將載體導向表達端粒酶的細胞，而E2F將載體導向具有Rb/pl6途徑缺陷的細胞。此類缺陷導致游離E2F的高表達水平和E2F啟動子的高活性。然而，可利用任何其它適當的啟動子將病毒復制限制于靶細胞，所述啟動子包括但不限于CEA、SLP、Cox-2, Midkine, CXCR4、SCCA2和TTS。它們通常被添加來控制ElA區(qū)域，但除此之外或備選地，也可調節(jié)其它基因例如ElB或E4。還可將外源絕緣子(insulator)即針對非特異性增強子的阻斷元件、左ITR、天然ElA啟動子或染色質蛋白質包含在重組腺病毒載體中。可任選地使用任何額外的組分或修飾，但其在本發(fā)明的載體中不是必須的。
在本發(fā)明的其它實施方案中，本發(fā)明的腺病毒載體的特征在于，腺病毒主鏈中的結合TLR-9的富含CpG的DNA區(qū)域(圖1、11、12)。
本發(fā)明的溶瘤腺病毒載體包含衣殼修飾。大多數成人已被暴露于最廣泛使用的腺病毒血清型Ad5，因此免疫系統(tǒng)可快速產生針對它們的中和抗體(NAb)。事實上，抗-Ad5NAb的流行可達到50%。已顯示，可針對腺病毒衣殼的多個免疫原性蛋白質中的大多數誘導NAb，以及在另一方面，已顯示Ad5纖突的結的甚至小的變化可允許逃脫衣殼特異性NAb (Sarkioja M,等人 Gene Ther.2008; 15(12):921-9)。因此，結的修飾在接觸腺病毒的情況下對于在人中保持或增加基因遞送是非常重要的。
此外，已知Ad5通過纖突的結部分結合稱為CAR的受體，并且該結部分或纖突的修飾可促進至靶細胞的進入，并且在許多或大多數癌癥中引起增強的溶瘤作用(Ranki T.等人，Int J Cancer2007; 121:165-174)。事實上，衣殼修飾的腺病毒是用于改善基因至癌細胞的遞送的有利工具。
如本文中所用，“衣殼”是指病毒的蛋白質外殼，其包括六鄰體、纖突和五鄰體基座蛋白。本領域已知的任何衣殼修飾，即六鄰體、纖突和/或五鄰體基座蛋白的修飾(所述修飾促進病毒至腫瘤細胞的遞送)可用于本發(fā)明。修飾可以是遺傳和/或物理修飾，包括但不限于，用于整合配體(其識別特定細胞受體和/或阻斷天然受體結合)的修飾，用其它腺病毒的結替代腺病毒載體的纖突或結結構域(嵌合體)的修飾，以及向腺病毒添加特定分子(例如，成纖維細胞生長因子2，FGF2)的修飾。因此，衣殼修飾包括但不限于，小肽基序、肽、嵌合體或突變至纖突(例如，至結、尾或軸部分內)、六鄰體和/或五鄰體基座內的摻入。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，衣殼修飾是Ad5/3嵌合體，整聯蛋白結合(RGD)區(qū)域和/或硫酸肝素結合多聚賴氨酸修飾至纖突的插入。在本發(fā)明的具體實施方案中，衣殼修飾為Ad5/3嵌合體。
如本文中所用，衣殼的“Ad5/3嵌合體”是指，其中纖突的結部分來自Ad血清型3型并且纖突的其余部分來自Ad血清型5型的嵌合體。
本發(fā)明的載體還可包含其它修飾，例如ElB區(qū)域的修飾。
如本文中所用，“RGD”是指精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)基序，其在五鄰體基座上暴露并且與支持腺病毒內吞的細胞α-ν-β-整聯蛋白相互作用。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，衣殼修飾為RGD-4C修飾。“RGD-4C修飾”是指，異源整聯蛋白結合RGD-4C基序在纖突結結構域的HI環(huán)中的插入。4C是指4個半胱氨酸，其形成RGD-4C中的硫橋。編碼具有RGD-4C肽的纖突的重組Ad5纖突基因的構建詳細地描述于例如Dmitriev1.等人的論文(Journal of Virology 1998; 72:9706-9713)中。
如本文中所用，“硫酸乙酰肝素結合多聚賴氨酸修飾”是指7個賴氨酸的區(qū)段至纖突結C-末端的添加。
可通過使用載體，將表達盒用于在靶例如細胞中表達轉基因。如本文中所用，表述“表達盒”是指DNA載體或其部分，包含編碼cDNA或基因的核苷酸序列以及控制和/或調控所述cDNA或基因的表達的核苷酸序列?？蓪⑾嗨苹虿煌谋磉_盒插入一個載體或插入幾個不同的載體。本發(fā)明的Ad5載體可包含幾個或一個表達盒。然而，僅一個表達盒也是足夠的。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，溶瘤腺病毒載體包含至少一個表達盒。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，溶瘤腺病毒載體僅包含一個表達盒。
包含本發(fā)明的腺病毒載體的細胞可以是任何細胞，例如真核細胞、細菌細胞、動物細胞、人細胞、小鼠細胞等。細胞可以是體外、離體或體內細胞。例如，細胞可用于體外、離體或體內產生腺病毒載體，或細胞可以是靶，例如腫瘤細胞，其已被腺病毒載體感染。在于細胞中產生CTLA4mAb的方法中，包含本發(fā)明的載體的媒介物被運送至細胞內，CTLA4mAb基因進行表達，蛋白質被翻譯并且以旁分泌的方式進行分泌?！懊浇槲铩笨梢允侨魏尾《据d體、質?；蚱渌ぞ?，例如顆粒，其能夠將本發(fā)明的載體遞送至靶細胞。本領域已知的任何常規(guī)方法可用于將載體遞送至細胞?？赏ㄟ^本發(fā)明增加受試者的腫瘤特異性免疫應答。T細胞毒性細胞的活化、調節(jié)性T細胞(T-Reg)的下調和表達CTLA-4的腫瘤細胞對細胞毒性T細胞和樹突細胞的直接免疫抑制的抑制，因CTLA4mAb的表達而發(fā)生。為了跟蹤或研究本發(fā)明的效果，可測定免疫應答的各種參數。最常見的標志包括但不限于，血液或腫瘤中腫瘤或腺病毒特異性細胞毒性T細胞的改變?？稍谀[瘤處或淋巴組織中研究抗原呈遞細胞的招募和活化。此外，可研究調節(jié)性細胞亞組(例如調節(jié)性T細胞)的數目或活性。血清細胞因子特征譜可闡明Thl/Th2環(huán)境(其對于免疫對耐受性也是非常重要的)。可按照本領域已知的任何常規(guī)方法研究此類標志的水平，包括但不限于，利用抗體、探針、引物等的那些方法，例如ELISP0T測定、四聚體分析、五聚體分析、細胞內細胞因子染色、血液中的抗體的分析以及血液或腫瘤中的不同細胞類型的分析。癌癥已構建了在細胞中具有復制能力的本發(fā)明的重組Ad5/3載體，所述細胞在Rb途徑，特別地Rb_pl6途徑中具有缺陷。此類缺陷細胞包括動物和人的所有腫瘤細胞(SherrC.J.1996，Science274, 1672-1677)。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，載體能夠在Rb途徑具有缺陷的細胞中選擇性復制。如本文中所用，“Rb途徑中的缺陷”是指，所述途徑的任何基因或蛋白質的突變和/或表觀遺傳改變。由于存在這些缺陷，腫瘤細胞過表達E2F，從而ElACR2對Rb的結合(這通 常是釋放E2F以進行有效復制所必須的)不是必要的。本發(fā)明的一些溶瘤腺病毒載體另外地經構建在表達人端粒酶逆轉錄酶(hTERT)的細胞中具有復制能力，該酶是人端粒酶的催化亞結構域。這些包括超過85%的人腫瘤，其被發(fā)現上調hTERT基因及其啟動子的表達，然而大多數正常成人體細胞缺乏端粒酶或瞬時表達極低水平的該酶(Shay 和 Bacchetti 1997，Eur J Cancer33:787-791)。這樣的 Rb_pl6途徑缺陷/hTERT啟動子組合可靶向任何癌癥或腫瘤，包括惡性和良性腫瘤，以及原發(fā)性腫瘤和轉移灶可以是基因療法的靶。E2F轉錄因子調節(jié)多組參與與生長控制相關的關鍵細胞事件的基因的表達(Johnson 和 Schneider_Broussardl998，Role of E2F in cell cyclecontrol and cancer, Front Biosc1.1998Apr27;3:d447_8;Muller 和 Helin2000, The E2Ftranscription factors:key regulators of cell proliferation, Biochim BiophysActa.2000Febl4;1470(1):M1_12)。在非循環(huán)正常細胞中，E2F被隔離在pRb/E2F復合物中，從而E2F幾乎是不可自由獲得的。pRb途徑在幾乎所有人癌癥中被破壞，導致游離的E2F存在于大多數癌癥中，這證明了其在生理性生長控制中的關聯性?？赏ㄟ^突變幾種不同分子中的任一種來破壞該途徑。然而，共同特征是，E2F啟動子隨后被激活以增加E2F水平。E2F結合許多靶基因的啟動子，但對其功能重要的還是自體活化。因此，Pl6/Rb功能失調的細胞的特征在于高E2F水平，這通過E2F對其啟動子的結合被進一步放大(Hanahan和Weinberg2000，Cell7; 100(1):57-70; Johnson 等人 2002，Cancer Celll (4): 325-37)。然而，如果腺病毒ElA受E2F啟動子控制(如在例如US2008118470A1中)，那么除非同時使用消除ΕΙΑ/Rb的D24缺失，否則存在自我擴增的惡性循環(huán)的風險。具體地，甚至存在于正常細胞中的低水平E2F可結合E2F啟動子，從而導致ElA的表達，導致更多E2F從pRb/E2F復合物釋放，導致更多E2F啟動子激活和更多E1A。因此，在消除ElA對pRb的結合的D24缺失不存在的情況下，E2F啟動子導致也可在正常細胞中復制的溶瘤腺病毒，這可能具有安全影響。未甲基化的雙鏈DNA可刺激TLR9 (橋聯接先天性和適應性免疫應答的內體受體)。富含CpG的區(qū)域在腺病毒主鏈中的插入增強了腺病毒刺激抗原呈遞細胞中的TLR9的能力，從而增加了 T細胞刺激和成熟以及NK活化(Nayak S，Herzog Rff.GeneTher.20IOMar;17(3):295-304)。在本發(fā)明的具體實施方案中，癌癥是任何實體瘤。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，癌癥選自:鼻咽癌、滑膜癌(synovial cancer)、肝細胞癌、腎癌、結締組織的癌癥、黑素瘤、肺癌、腸癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、腦癌、喉癌、口癌、肝癌、骨癌、胰腺癌、絨毛膜癌、胃泌素瘤、嗜鉻細胞瘤、催乳素瘤、T細胞白血病/淋巴瘤、神經瘤、VHL病(von Hippel-Lindaudisease)、卓-艾綜合征(Zollinger-Ellison syndrome)、腎上腺癌、肛門癌、膽管癌、膀胱癌、輸尿管癌、少突膠質細胞瘤、神經母細胞瘤、腦膜瘤、脊髓瘤、骨軟骨瘤、軟骨肉瘤、尤文氏肉瘤(Ewing’s sarcoma)、原發(fā)部位不明癌癥(cancer of unknown primary site)、類癌(carcinoid)、胃腸道類癌、纖維肉瘤、乳腺癌、派杰氏病(Paget’s disease)、宮頸癌、食道癌、膽囊癌、頭部癌癥(head cancer)、眼癌、頸癌、腎癌、腎母細胞瘤(Wilms’tumor)、卡波西肉瘤(Kaposi’s sarcoma)、前列腺癌、睪丸癌、霍奇金氏病、非霍奇金淋巴瘤、皮膚癌、間皮瘤、多發(fā)性骨髓瘤、卵巢癌、內分泌胰腺癌、胰高血糖素瘤(glucagonoma)、胰腺癌、甲狀旁腺癌、陰莖癌、垂體癌(pituitary cancer)、軟組織肉瘤、視網膜母細胞瘤、小腸癌、胃癌、胸腺癌、甲狀腺癌、滋養(yǎng) 層癌癥、葡萄胎、子宮癌、子宮內膜癌、陰道癌、外陰癌、聽神經瘤、蕈樣肉芽腫病(mycosis fungoides)、胰島素瘤、類癌綜合征、生長抑素瘤(somatostatinoma)、牙銀癌(gum cancer)、心臟癌癥(heart cancer)、唇癌、腦膜癌(meninges cancer)、口腔癌、神經癌、腭癌(palate cancer)、腮腺癌、腹膜癌、咽癌、胸膜癌、涎腺癌、舌癌和扁桃體癌。藥物組合物本發(fā)明的藥物組合物包含至少一種類型的本發(fā)明的載體。此外，組合物可包含至少兩種、三種或四種不同的本發(fā)明的載體。除了本發(fā)明的載體以外，藥物組合物還可包含任何其它載體，例如其它腺病毒載體，例如US2010166799A1中描述的那些載體、其它治療有效試劑、任何其它試劑例如藥學上可接受的載體、緩沖劑、賦形劑、佐劑、抗菌藥(antiseptics)、填充劑、穩(wěn)定劑或增稠劑和/或通常在相應產物中發(fā)現的任何組分。藥物組合物可以為適合于施用的任何形式，例如固體、半固體或液體形式。制劑可選自但不限于，溶液、乳劑、懸浮液、片劑、丸劑和膠囊。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，溶瘤腺病毒載體或藥物組合物用作原位癌癥疫苗。如本文中所用，“原位癌癥疫苗”是指殺死腫瘤細胞并且還增加抗腫瘤細胞的免疫應答的癌癥疫苗。病毒復制對于可用于THl型細胞毒性T細胞應答的免疫系統(tǒng)是強危險信號，從而用作APC成熟和活化以及NK細胞的招募的強有力共刺激因子。腫瘤免疫學領域的至關重要的發(fā)現是，抗-腫瘤免疫應答的誘導不足以產生療效。相反，減小腫瘤介導的免疫抑制也是至關重要的。腫瘤細胞裂解還幫助呈遞腫瘤片段和表位至APC，且其它共刺激由炎癥產生。因此，不依賴于表位(即，非HLA限制性)的應答在各腫瘤的背景中產生，且原位發(fā)生。腫瘤特異性免疫應答在靶細胞中被激活，隨后允許抗腫瘤活性在整個受試者水平上例如在遠端轉移中發(fā)生。載體的有效劑量取決于許多因素，包括需要治療的受試者、腫瘤類型、腫瘤的位置和腫瘤的分期。劑量可例如從約IO8個病毒粒子(VP)變化至約IO14個VP，優(yōu)選從約5xl09個VP變化至約IO13個VP，更優(yōu)選從約8xl09個VP變化至約IO12個VP。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，人劑量在約5X101(l-5X10nVP的范圍內。藥物組合物可通過本領域已知的任何常規(guī)方法，例如通過利用下列方法之任一種來產生:分批、分批補料和灌注培養(yǎng)模式、柱層析純化、CsCl梯度純化和利用低剪切力細胞保留裝置的灌注模式。施用可將本發(fā)明的載體或藥物組合物施用給選自植物、動物和人類的任何真核生物受試者。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，受試者是人或動物。動物可選自寵物、家養(yǎng)動物和生產性動物(production animal)。任何常規(guī)方法可用于將載體或組合物給受試者施用。施用途徑取決于組合物的制劑或形式、疾病、腫瘤位置、患者、共病和其它因素。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，通過瘤內、肌內、動脈內、靜脈內、胸膜內、血管內、腔內或腹膜內注射或口服施用來進行施用。本發(fā)明的溶瘤腺病毒載體的僅一次施用可具有療效。然而，在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，在治療期間，數次施用溶瘤腺病毒載體或藥物組合物?？稍谇?周、4周、每月或在治療過程中施用溶瘤腺病毒載體或藥物組合物例如I至10次。在本發(fā)明的一個實施方案中，在前2周，隨后在第4周，隨后每月，施用3至7次。在本發(fā)明的具體實施方案中，在前2周，隨后在第4周，隨后每月，施用4次。治療期的長度可發(fā)生變化，例如可持續(xù)2至12個月或更長時間。此外，可優(yōu)選將本發(fā)明的溶瘤腺病毒載體的施用與其它溶瘤腺病毒載體例如US2010166799A1中描述的載體的施用組合。施用可以是同時的或相繼的。為了避免受試者中的中和抗體，可在治療之間改變本發(fā)明的載體。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，與早期治療的載體相比較，將具有不同的衣殼纖突結的溶瘤腺病毒載體給受試者施用。如本文中所用，“衣殼的纖突結”是指纖突蛋白的結部分(圖la)。或者，可將病毒的完整衣殼轉變成不同血清型的衣殼。 本發(fā)明的基因療法單獨是有效的，但腺病毒基因療法與任何其它療法例如常規(guī)療法的組合可比單獨的任一種療法更有效。例如，組合療法的每一種試劑可在腫瘤組織中獨立地工作，腺病毒載體可使細胞對化學療法或放射療法敏感和/或化學治療劑可升高病毒復制的水平或影響靶細胞的受體狀態(tài)?；蛘撸M合可以以對于治療的效力是有益的方式調節(jié)受試者的免疫系統(tǒng)。例如，化學療法可用于下調抑制細胞例如調節(jié)性T細胞?；蛘撸稍谌芰霾《警煼ㄖ笫褂没瘜W療法，以增強免疫應答(通過殺死腫瘤細胞和隨后釋放表位和/或病毒)?；瘜W療法還可使腫瘤細胞對溶瘤病毒敏感，并且反之亦然。可同時或相繼地施用聯合治療的試劑。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，患者同時接受環(huán)磷酰胺以增強治療的免疫效應。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述方法或用途還包括給受試者施用同步放射療法(concurrent radiotherapy)。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，所述方法或用途還包括給受試者施用同步化學療法。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，所述方法或用途還包括給受試者施用其它溶瘤腺病毒或疫苗病毒。載體的施用可是同時的或相繼的。如本文中所用，“同步”是指在本發(fā)明基因療法之前、之后或同時施用的療法。同步療法的時間段可從數分鐘變化至數周。優(yōu)選，同步療法持續(xù)數小時。在一個實施方案中，以節(jié)律方式將環(huán)磷酰胺通過靜脈團注和口服進行施用。適用于聯合治療的試劑包括但不限于，所有反式視黃酸、阿扎胞苷、硫唑嘌呤、博來霉素、卡鉬、卡培他濱、順鉬、苯丁酸氮芥、環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、柔紅霉素、多西他賽、去氧氟尿苷、多柔比星(Doxorubicin)、表柔比星(Epirubicin)、愛波喜龍、依托泊苷、氟尿喃唆、吉西他濱、羥基脲、伊達比星、伊馬替尼、氮芥、巰嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、奧沙利鉬、紫杉醇、培美曲塞、替莫唑胺、替尼泊苷、硫鳥嘌呤、戊柔比星、長春堿、長春新堿、長春地辛和長春瑞濱。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述方法或用途還包括給受試者施用維拉帕米或另一種鈣通道阻斷劑。“鈣通道阻斷劑”是指一種藥物和天然物質，其破壞鈣通道的傳導，其可選自維拉帕米、二氫批唳、戈洛帕米、地爾硫卓、咪拉地爾、節(jié)普地爾、氟司必林和芬地林。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述方法或用途還包括給受試者施用自噬誘導劑。自噬是指牽涉通過溶酶體機制降解細胞自己的組分的催化過程?！白允烧T導劑”是指能夠誘導自噬的試劑，其可選自但不限于，mTOR抑制劑、PI3K抑制劑、鋰、他莫昔芬、氯喹、巴弗洛霉素、坦西莫司、西羅莫司和替莫唑胺。在本發(fā)明的具體實施方案中，所述方法還包括給受試者施用替莫唑胺。替莫唑胺可以是口服或靜脈內替莫唑胺。可將自噬誘導劑與免疫調節(jié)劑組合。在一個實施方案中，將編碼抗_CTLA4mAb的溶瘤腺病毒與替莫唑胺和環(huán)磷酰胺組 口 ο在本發(fā)明的一個實施方案中，所述方法或用途還包括施用化學療法或抗-CD20療法或用于阻斷中和抗體的其它方法?！翱?CD20療法”是指能夠殺死CD20陽性細胞的試劑，其可選自利妥昔單抗和其它抗-CD20單克隆抗體?！坝糜谧钄嘀泻涂贵w的方法”是指能夠抑制通常因感染而產生的抗-病毒抗體產生的試劑，其可選自不同的化學治療劑、免疫調節(jié)物質、皮質激素和其它藥物。此類物質可選自但不限于，環(huán)磷酰胺、環(huán)孢素、硫唑嘌呤、甲潑尼龍、依托泊苷、CD40L、FK506(他克莫司)、IL-12、IFN-Y、白細胞介素10、抗-CD8、抗-CD4抗體、骨髓脫離(mye 1ab I at ion)和口服腺病毒蛋白質。還可將本申請中描述的方法與能夠克服中和抗體的分子組合。此類試劑包括脂質體、脂質復合物和聚乙二醇，可將所述試劑與病毒混合?；蛘?，可利用由腺病毒衣殼蛋白組成的免疫血衆(zhòng)取出法柱(immunopheresis column)除去中和抗體。本發(fā)明的溶瘤腺病毒載體誘導病毒體介導的腫瘤細胞的溶瘤作用并且激活抗腫瘤細胞的人免疫應答。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述方法或用途還包括，施用能夠進一步下調受試者的調節(jié)性T細胞的物質?！澳軌蛳抡{調節(jié)性T細胞的物質”是指減少鑒定為T抑制細胞或調節(jié)性T細胞的細胞的量。此類細胞已被鑒定為特征在于下列免疫表型標志的一個或多個:CD4+、CD25+、FoxP3+、CD127-和GITR+。減少T抑制細胞或調節(jié)性T細胞的此類試劑可選自抗-CD25抗體或化學治療劑。此類物質可用于減少調節(jié)性T細胞的數目，aCTLA4主要地有效地抑制它們的活性。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述方法或用途還包括給受試者施用環(huán)磷酰胺。環(huán)磷酰胺是常見化學治療劑，其也已被用于一些自身免疫性障礙。在本發(fā)明中，環(huán)磷酰胺可用于增強病毒復制以及aCTLA4誘導的NK或細胞毒性T細胞的刺激(以增強抗腫瘤免疫應答)。其可以以靜脈內團注劑量(bolus dose)或口服低劑量節(jié)律施用或它們的組合的方式使用。在本發(fā)明中，為了確保CTLA-4阻斷性mAb不殺死活化的細胞毒性T細胞(其對于治療是有用的)，選擇人IgG2亞型。IgG2誘導最小的補體激活和Ab依賴性細胞介導的細胞毒性(Bruggemann M.等人J Exp Medl987; 166:1351-1361)并且還在人使用的背景中降低細胞因子釋放綜合征的可能性(Ribas A等人，0ncologist2007; 12:873-83)。本發(fā)明的任何方法或用途可以是體內、離體或體外方法或用途。在本發(fā)明中，用特異于CTLA-4的完全人單克隆抗體武裝溶瘤腺病毒。在該方法中，腫瘤細胞因病毒復制和因抗-CTLA4mAb抗-腫瘤免疫激活和直接的促細胞凋亡腫瘤細胞殺傷而被殺死。額外的益處可由歸因于病毒復制的腫瘤抗原釋放產生，其可通過潛在地允許更加特異性的抗腫瘤靶的免疫應答來提高抗-CTLA-4mAb療法的效力(Hodi FS等人，NEngl J Med2010; 363; 8:711-23;Mokyr MB 等人，Cancer Resl998; 58:5301-4; Wolchok JDand Saenger Y.，0ncologist2008; 13Suppl4:2-9)。此外，治療的副作用是非重疊的，這可能有利于增加效率而不增加毒性。已顯示，溶瘤腺病毒可在癌細胞系中高效地表達作為轉基因的功能性抗_CTLA4mAb (圖2)。此外，已發(fā)現，可以將溶瘤腺病毒復制與抗_CTLA4mAb組合并且獲得增強的細胞殺傷(圖3-4)。這一直以來都被關注，因為mAb對CTLA-4的阻斷導致增加的IFN-Y和主要組織相容性復合物(MHC)I類分子的產量，這潛在地可抑制病毒復制(McCart JA 等人，Gene Ther2000; 7:1217-23; Nakamura H 等人，CancerRes2001;61:5447-52)。病毒溶瘤作用與抗_CTLA4mAb表達一起導致比任一單獨的治療更高的體內抗腫瘤活性(圖4)。已報導，用表達粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GMCSF)的溶瘤病毒與低劑量的節(jié)律性環(huán)磷酰胺(以減少T-Reg)的組合治療癌癥患者(Cerullo V等人，Cancer Res; 2010; 70:4297-309; Koski A 等人，Mol Ther.2010Jul27.[Epub ahead ofprint].PMID: 20664527)。此外，來自分泌GM-CSF的腫瘤細胞免疫療法的小鼠抗-CTLA-4的細胞介導的遞送激活有效的抗-腫瘤應答并且延長總體存活，并且減少全身性自身免疫的表現(Simmons AD 等人，Cancer Tmmunol Immunother2008; 57:1263-70)。因此，可在多模式方法(multimodal approach)中，利用癌癥常規(guī)療法例如放射化療法、疫苗例如GM-CSF和/或利用例如環(huán)磷酰胺進行的T-Reg的減少進一步提高本方法的效力。本申請首次顯示，可從溶瘤腺病毒產生全長mAb。此外，這也是由具有復制能力的腫瘤靶向性平臺表達的第一個完全人抗_CTLA4mAb。在已進行的小鼠實驗中未看見副作用。來自癌癥患者PBMC的數據提供了 Ad5/3-Δ24aCTLA4作為溶瘤病毒載體用于治療晚期癌癥患者的臨床應用的根據。 由于pl6-Rb途徑在許多(如果不是全部的話)實體瘤中具有缺陷(Sherr CJ.，Sciencel996; 274:1672-724)，因此，本發(fā)明的 Ad5/3_ Δ 24aCTLA4 和其它Δ 24缺陷型病毒適合用于治療大多數類型的可用療法難以治療的癌癥。除了Δ 24外還包含hTERT或E2F啟動子的本發(fā)明的此類實施方案實際上將本發(fā)明的效用擴大至所有癌癥。此外，添加所述啟動子可允許更大的治療劑量，減少的副作用和增強的全身性效用。重要地，將CpG部分添加進入病毒基因組可增強抗腫瘤免疫應答。本發(fā)明通過下列實施例來舉例說明，所述實施例無意以任何方式進行限定。
實施例動物所有動物實驗方案都通過赫爾辛基大學的實驗動物委員會和南芬蘭的省政府評審和批準。4至5周齡的NMRI裸小鼠獲自Taconic (Ejby, Denmark),并且在研究之前隔離檢疫至少I周。小鼠的健康狀態(tài)被頻繁監(jiān)測，只要疼痛或痛苦的任何征兆明顯，就將它們殺死。細胞培養(yǎng)將人頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC)低代次腫瘤細胞培養(yǎng)物UT-SCC8 (聲門上喉)(27)培養(yǎng)在補充有 10%FCS (PromoCell GmbH, Heidelberg,德國)、1%非必需氨基酸(Gibco, Invitrogen, Carlsbad, California)、2mmol/L 谷氨酸胺、100 單位 ZmT,青霉素和 100 單位 ZmT,鏈霉素(全部來自Sigma，St.Louis，MO)的達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)中。使用低代次的，通常第15-30代的UT-SCC細胞。人轉化胚腎細胞系293、人肺癌細胞系A549、人卵巢癌細胞系SK0V3_ipl和人前列腺癌細胞系PC-3麗2 ;以及Jurkat (克隆E6-1)人白血病T細胞淋巴母細胞獲自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，Manassas，VA，USA)。在推薦的條件下維持所有細胞系。人樣品

在知情況同意的情況下，獲得健康個體和患有常規(guī)療法難以治療的晚期轉移腫瘤的患者的外周血單核細胞(PBMC)。統(tǒng)計分析使用雙尾學生t檢驗(two tailed Student’s t-test),且小于0.05的p值被認為是顯著的。實施例1.腺病毒的構建產生具有編碼IgG2型抗_CTLA4mAb的cDNA序列的嵌合腺病毒(圖1)。將抗-CTLA4mAb的編碼序列引入腺病毒E3A的6.7K/gpl9K缺失處，以產生具有復制能力的腺病毒 Ad5/3- Δ 24aCTLA4 (SEQ ID.NO:1), Ad5/3_hTERT- Δ 24aCTLA4 (SEQ ID.NO: 2),Ad5/3-hTERT-Λ24aCTLA4-CpG (SEQ ID.NO: 3)、Ad5/3_E2F-Λ24aCTLA4(SEQ ID.NO:4)和Ad5/3-E2F-Λ 24aCTLA4-CpG (SEQ ID.NO: 5)，或引入由CMV啟動子驅動的缺失的El處，以產生復制缺陷型腺病毒Ad5/3-aCTLA4 (SEQ ID.N0:6)。使用標準腺病毒制備技術(Kanerva A,等人，Mol Ther2002; 5:695-704 ；Bauerschmitz GJ 等人，Mol Ther2006;14:164-74 ；KanervaA 和 Hemminki A., Int JCancer2004; 110:475-80 ；Volk AL,等人，Cancer Biol Ther2003; 2:511-5)產生和擴增溶瘤腺病毒。簡而言之，首先構建具有轉基因和其它部分(啟動子、CpG、poly-A)的El或E3穿梭載體，然后將其與拯救質粒(rescue plasmid)在特征在于人重組酶的細菌細胞中進行重組。圖1中描述了病毒的主要特征,包括對照病毒Ad5Lucl (Kanerva A等人，Clin CancerRes2002;8:275-80)和 Ad5/3_Λ 24(Kanerva A 等人，Mol Ther2003;8:449-58)的特征。為了產生 Ad5/3-A 24aCTLA4，產生質粒 pTHSN_aCTLA4。pTHSN_aCTLA4 在腺病毒基因組的缺失了 6.7K/gpl9K的E3區(qū)域中包含IgG2型抗_CTLA4mAb的重鏈和輕鏈。利用鏈之間的內部核糖體進入位點(IRES)實現重鏈和輕鏈的等摩爾性(equimolarity)。通過在大腸桿菌(Escherichia coli)BJ5183細胞(Qbiogene Inc., Irvine, CA, USA)中進行Fsp1-線性化的 pTHSN_aCTLA4 與 Srf1-線性化的 pAdEasy-1.5/3- Δ 24 (Kanerva A 等人，ClinCancer Res2002; 8:275-80)(在ElA中包含血清型3型的結和24bp缺失的拯救質粒)之間的同源重組來產生 pAdEasy-1.5/3-Λ 24_aCTLA4。通過 PacI 降解釋放 Ad5/3_ Λ 24aCTLA4的基因組，隨后將其轉染至A549細胞。將病毒在A549細胞上繁殖，在氯化銫梯度上純化。在260nm測定病毒顆粒濃度，并在293細胞上進行標準TCID50 (平均組織培養(yǎng)感染劑量)分析以測定感染性顆粒滴度。為了產生Ad5/3-hTERT-A 24aCTLA4、Ad5/3-hTERT-A 24aCTLA4-CpG、Ad5/3-E2F- Δ 24aCTLA4 和 Ad5/3_E2F- Δ 24aCTLA4_CpG，首先將抗-CTLA 擴增產物亞克隆入 pTHSN 或 pTHSN-CpG，隨后將其與 PAd5/3-hTERT_ElA 或 pAd5/3-E2F_ElA 重組(Bauerschmitz GJ,等人，Cancer Res2008;68:5533-9 ；Hakkarainen T,等人Clin CancerRes.2009; 15(17):5396-403)。用PacI線性化所得的質粒，將其轉染進入A549細胞以進行擴增和拯救。將病毒在A549細胞上繁殖，在氯化銫梯度上進行純化。在260nm測定病毒顆粒濃度，并在293細胞上進行標準TCID50 (平均組織培養(yǎng)感染劑量)分析以測定感染性顆粒的滴度。利用PCR和多個限制性消化來確認所有階段的克隆。對穿梭質粒pTHSN_aCTLA4進行測序。利用PCR確認野生型El的不存在。通過測序和PCR在最終的病毒中檢查El區(qū)域、轉基因和纖突。在A549細胞上進行病毒產生的所有階段(包括轉染)以避免野生型重組的風險，如先前所描述的(Kanerva A 等人 2003，MolTher8, 449-58; Bauerschmitz GJ 等2006,MolTherl4, 164-74)。aCTLA4處于E3啟動子之下(具體地處于內源病毒E3A基因表達控制元件之下)，這導致與復制相關的轉基因表達，這始于感染后約8小時。除6.7K/gpl9K的缺失外，E3是完整 的。為了構建非復制型El缺失的對照病毒Ad5/3_aCTLA4，將抗_CTLA4mAbcDNA 的兩條鏈連接進入 pShuttle-CMV。在 pAdEasy-1.5/3 質粒(Krasnykh VN,等人，J Virol 1996 ;70:6839-46)(其具有完整的腺病毒基因組)與Pme1-線性化的pShuttle-CMV-aCTLA4之間進行同源重組，以構建pAdEasy-1.5/3_aCTLA4。利用PacI釋放Ad5/3-aCTLA4的基因組，將其轉染進入293細胞。將病毒在293細胞上繁殖，在氯化銫梯度上進行純化。在260nm測定病毒顆粒濃度，在293細胞上進行標準噬斑測定，以測定感染性顆粒。實施例2.所構建的腺病毒的體外表達和功能性將Western印跡分析用于確認,所構建的腺病毒表達抗_CTLA4mAb。以10病毒顆粒(VP) / 細胞，用構建的 Ad5/3- Δ 24aCTLA4 或 Ad5/3_aCTLA4 感染 A549 或 PC3-MM2 腫瘤細胞。48小時后，用0.02 μ m過濾器(Anotop, Whatman, England)過濾病毒感染的細胞的上清液，在還原或非變性條件下，將15 μ L用于7.5%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，隨后轉移至硝酸纖維素膜上。用山羊抗_人IgG (重鏈和輕鏈)(AbD serotec, MorphoSys, Germany)溫育膜，洗滌膜，隨后用偶聯至辣根過氧化物酶的二抗(Dako，Denmark)進行溫育。利用增強型化學發(fā)光(GE Healthcare, Amersham, UK)進行信號檢測。在Western印跡中，在感染后48小時的上清液中，Ad5/3_ Δ 24aCTLA4和Ad5/3-aCTLA4表達預期的約150kDa的抗_CTLA4mAb (在非變性條件下)以及約50kDa的重鏈和約25kDa的輕鏈(在變性條件下)(圖2A)。為了比較溶瘤病毒Ad5/3_ Λ 24aCTLA4或復制缺陷型Ad5/3_aCTLA4的抗-CTLA4mAb表達，將PC3-MM2細胞以20000個細胞/孔接種，并用各自病毒以IOVP/細胞進行感染。感染后24小時、48小時和72小時，收集上清液，通過ELISA分析其中的人IgG的量(圖10)。為了確認 Ad5/3- Δ 24aCTLA4 和 Ad5/3_aCTLA4 表達功能性抗 _CTLA4mAb，如先前所述(Lee KM等人，Sciencel998; 282:2263-68)，檢查經刺激的Jurkat細胞的增加的IL-2產量。Jurkat 細胞(克隆 6.1)用 0.3 μ g/ml 的離子霉素(Sigma-AldrichC0.)、0.03 μ g/ml的佛波醇豆蘧酸酯乙酸酯(PMA) (Sigma-Aldrich C0.)和I μ g/ml的重組人B7Fc嵌合體(R&D systems)進行刺激，以及用0.02 μ m過濾的(Anotop, Whatman, England)病毒感染的PC3-MM2細胞的上清液進行處理。刺激Jurkat細胞48小時后，按照制造商的說明書，利用BD Cytometric Bead Array Human Soluble Protein FlexSet (Becton Dickinson 分析生長培養(yǎng)基中的白細胞介素-2 (IL-2)水平。使用10個病毒顆粒(VP)/細胞，且48小時后，收集上清液。小鼠抗-人CTLA-4(=CD152)mAb(BD Pharmingen ，Europe)用作陽性對照。將FCAP Array v.1.0.2 (Soft Flow)軟件用于分析。圖7顯示功能性測定的示意圖?？?CTLA4mAb結合細胞表面CTLA-4，從而阻斷與重組B7 (rB7)的免疫抑制相互作用。該分析顯示，與各自的同基因對照Ad5/3-A24或Ad5/3Lucl-感染的細胞相比，在用Ad5/3- Δ 24aCTLA4和Ad5/3_aCTLA4感染的細胞的上清液中發(fā)現抗_CTLA4mAb活性(圖2B)。重組抗-CTLA4mAb用作陽性對照，其比從Jurkat細胞收集的上清液效力更強。為了進一步確認病毒表達的抗_CTLA4mAb阻斷經由CTLA-4的信號轉導的能力，進行功能喪失測定。在功能喪失測定中，如上所述活化Jurkat細胞，但將0.1 μ g/ml的重組人CTLA-4/Fc 嵌合體(R&D Systems) (rCTLA-4)添加至離子霉素、PMA 和重組 B7。rCTLA-4 在生長培養(yǎng)基中結合抗_CTLA4mAb，從而釋放細胞表面上的CTLA-4，以與rB7相互作用并抑制T細胞活化(這可觀察為IL-2產量的減少)。與各自的同基因未武裝的對照Ad5/3- △ 24或Ad5/3Lucl相比，對于用Ad5/3-Λ 24aCTLA4和Ad5/3_aCTLA4感染的細胞的上清液觀察到抗-CTLA4mAb的功能的喪失(圖2C)。此外，對于Ad5/3_ Λ 24aCTLA4感染的腫瘤細胞的上清液，觀察到最高的功能喪失，甚至高于陽性對照。綜上所述，該數據表明，Ad5/3- Δ 24aCTLA4對癌細胞的感染導致抗人CTLA-4的功能性完全人mAb的高表達，這導致T細胞活性的減少，如通過IL-2測量的。 當考慮腺病毒El和E3區(qū)域中的缺失(B卩，分別地，El的Rb結合恒定區(qū)2中的24bp缺失(D24)和E3中的6.7K/gpl9K缺失)時，抗-CTLA4表達盒的插入等同于正好在提出的與腺病毒包裝和功能性相容的105%閾值之下的基因組大小的獲得(Kennedy&Parks，MolTher2009; 17:1664-6)。為了研究基因組大小的增加或抗-CTLA4的表達是否影響病毒復制，用Ad5/3- Λ 24aCTLA4、Ad5/3_ Λ 24或PBS感染A549細胞，在不同的時間點通過qPCR測量上清液中和細胞中的病毒基因組(正向引物，5’101^1'1'1'0^了60^440:1'-3’，SEQ IDNO: 7 ;反向引物，5’-TCCTCCGGTGATAATGACAAGA-3’，SEQ ID NO: 8 ;和探針 5’FAM-TGATCGATCCACCCAGTGA-3，MGBNFQ, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10，SEQ ID NO:11) (Cerullo 等人，2010 ;Cancer Res; 70:4297-309)。在病毒組之間未看到顯著差異,這表明完全的復制能力。實施例3.腫瘤細胞系和低代次腫瘤外植體的CTLA-4表達由于已報導，幾乎90%的腫瘤細胞系表達CTLA-4且抗-CTLA_4mAb可能具有直接的抗腫瘤活性(13)，因此，研究在腫瘤細胞系，包括使用的HNSCC低代次腫瘤外植體中，情況是否也如此。在低代次腫瘤細胞培養(yǎng)物UT-SCC8或腫瘤細胞系A549、SK0V3_ipl和PC3-MM2中進行間接免疫熒光術，以分析表面CTLA-4。簡而言之，在4°C下用小鼠抗人CTLA-4mAb(BDPharmingen , Europe)作為一抗溫育細胞沉淀30分鐘，然后在4 下用Alexa FlllOr 488驢抗-小鼠IgG(Invitrogen)作為二抗再溫育30分鐘。在LSR流式細胞儀(BDPharmingen , Europe)上測量突光強度。計數至少40000個細胞/樣品。使用ClontechDiscovery Labware immunocytometry 系統(tǒng)(BD Pharmingen , Europe)和 FlowJo7.6.I 軟件進行分析。A549、SK0V3-1pl 和 PC3-MM2 腫瘤細胞系分別呈現 99.5%,96.6%和 96.6% 的 CTLA-4表達，而UT-SCC8低代次腫瘤外植體呈現90.3%的CTLA-4表達(圖2D)。實施例4.構建的腺病毒的體外和體內溶瘤效力的評價評價Ad5/3_ Δ 24aCTLA4對不同腫瘤細胞系和對HNSCC低代次腫瘤細胞培養(yǎng)物的溶瘤效力(或細胞殺傷)。以1.5 X IO4或1.0 X IO4個細胞/孔將HNSCC低代次腫瘤細胞培養(yǎng)物或腫瘤細胞系PC3-MM2、SK0V3-1 pl或A549接種在96孔板上。第二天，將病毒以不同的濃度(1、10、100、1000VP/細胞)稀釋在具有2%FCS的DMEM中，在37°C下感染細胞I小時，洗滌細胞，在DMEM中的5%FCS中進行溫育。按照制造商的方案(Cell Titer96Aqueous One Solution CellProliferation Assay Promega)測定細胞活力(cell viability)。結果不于圖 3 中。在所有細胞系中，Ad5/3_A24aCTLA4具有與陽性對照病毒Ad5/3-A24相似的溶瘤效力。此外，復制缺陷型Ad5/3-aCTLA4也具有抗腫瘤活性，因為腫瘤細胞表達CTLA4。Ad5/3- Δ 24aCTLA4 的溶瘤作用對 PC3_MM2、SK0V3_ipl、A549 和 UT-SCC8 分別導致97.6%, 78.2%,69.1% 和 57.3% 的細胞殺傷(圖 3)。Ad5/3_ Δ 24aCTLA4 及其在 E3 中不具有轉基因的對應物(Ad5/3-A24)在任何分析的腫瘤細胞系中在細胞毒性上未顯示顯著的差
巳升。對于非復制的Ad5/3_aCTLA4，對于低病毒劑量未觀察到細胞毒性(圖3)。然而，在最高Ad5/3-aCTLA4劑量上觀察到細胞毒性，對于PC3-MM2、SK0V3_ipl、A549和UT-SCC8的最大細胞殺傷率分別為96.2%,74.3%,49.1%和56.15%(圖3)。該結果與先前證實的抗-CTLA-4與癌細胞表面上表達的CTLA的直接結合誘導細胞死亡一致(Contardi E等人，Int J Cancer2005;117:538-50)。實施例5.Ad5/3- Δ 24aCTLA4的抗腫瘤活性的評價通過用表達抗-CTLA-4單克隆抗體的溶瘤腺病毒處理小鼠，在具有人前列腺癌異種移植物的免疫缺陷型裸小鼠中評價腺病毒的腫瘤生長抑制作用和細胞凋亡。
通過將5xl06個PC3-MM2細胞注射入5_6周齡雌性NMRI/裸小鼠(Taconic, Ejby, Denmark)的脅腹來建立人前列腺外植體異種移植物。7天后，使用50 μ L體積，用IxlO8VP注射腫瘤(η=8/組，直徑5-8mm)三次(第0、2和4天)，每隔一日一次，對照腫瘤僅用DMEM進行注射。公式(長度X寬度2x0.5)用于計算腫瘤體積。第5天，通過免疫組織化學分析對腫瘤冰凍切片的抗_CTLA4(人IgG)的表達或細胞凋亡(活性胱天蛋白酶-3)進行染色。制備包埋在Tissue TekOCT (Sakura, Torrance, CA, USA)中的冷凍腫瘤的4-5 μ m冰凍切片，將其在-20 V下在丙酮中固定10分鐘。使用以1:200稀釋的山羊抗-人IgG (重鏈和輕鏈)(AbDserotec, MorphoSys)和抗活性胱天蛋白酶_3的兔單克隆抗體作為一抗,在室溫下進行I小時(BD Pharmingen Tm, AB559565)。此外，按照制造商的說明書，使用LSAB2System_HRP試劑盒(K0673, DakoCytomation, Carpinteria, CA, USA)溫育切片。使用 3，3’ - 二氨基聯苯胺(DAB, Sigma, St Louis, MO, USA)顯現結合的抗體。最后，利用蘇木精對切片進行復染，然后在乙醇中脫水，于二甲苯中透明化，用加拿大樹膠封片。使用配備有Olympus DP50彩色照相機的Leica DM LB顯微鏡在40x放大倍數下捕捉代表性圖像。第7天，測量用Ad5/3_ Λ 24aCTLA4或Ad5/3_aCTLA4處理的小鼠的腫瘤和血漿中的人IgG水平(圖4C)。在Ad5/3- Δ 24aCTLA4處理的腫瘤中，與Ad5/3_aCTLA4處理的腫瘤相比，發(fā)現81倍的抗-CTLA4mAb (p〈0.05)。此外，與相同動物的血漿相比，在用Ad5/3- Δ 24aCTLA4處理的腫瘤中發(fā)現了 43.3倍的抗_CTLA4mAb (ρ〈(λ 05)。平均血漿濃度為392.6μ8/^(3Ε312.0)，其低于報導的分別用伊匹木單抗(561 μ g/mL)和曲美木單抗(450yg/mL)處理的人中耐受的濃度(Weber JS,等人 J Clin 0ncol2008; 26:5950-6 ；Ribas A,等人 J Clin 0ncol2005;23:8968-77 ；Tarhini AA, Iqbal F, Oncol TargetsTher2010;3:15-25) (ImL 的血漿重約 lg)。在 Ad5/3_A 24aCTLA4 腫瘤中，mAb 的濃度為16977 μ g/g，因此，遠高于血漿中的濃度。人抗-CTLA_4mAb不結合小鼠CTLA-4，并且異種移植物實驗需要T細胞缺陷型裸小鼠。因此，該模型僅測定溶瘤和促細胞凋亡作用。然而，在該侵襲性皮下前列腺癌異種移植物模型中，Ad5/3-A 24aCTLA4相較于模擬物顯示顯著的抗腫瘤作用(p〈0.01 ;圖4A)。與模擬物相比較，其它處理的組未顯示顯著的作用。在Ad5/3-A24aCTLA4與Ad5/3-A24之間未觀察到統(tǒng)計學差異(P=0.43)，從而確認了抗-CTLA4mAb表達不降低病毒的抗腫瘤效力的體外數據。鑒于CTLA-4阻斷性Ab可通過觸發(fā)細胞凋亡來誘導腫瘤細胞的直接殺傷，因此，評價抗腫瘤效力是否與人抗_CTLA4mAb產生以及隨后增加的細胞凋亡相關。在Ad5/3- Δ 24aCTLA4和Ad5/3_aCTLA4處理的腫瘤中觀察到人mAb染色，但對于Ad5/3_ Δ 24或Ad5/3-Lucl未觀察到所述染色(圖4B)。人mAb的表達似乎與增加的細胞凋亡相關(圖4B)。因此，Ad5/3- Δ 24aCTLA4處理的腫瘤表達抗-CTLA_4mAb，從而導致增強的細胞凋亡。為了進一步評價Ad5/3_A24aCTLA4的溶瘤和促細胞凋亡作用，使用人肺癌異種移植物模型。該模型不考慮轉基因的免疫調節(jié)功能。通過將5xl06個A549細胞注射進入5-6周齡雌性NMRI裸小鼠的脅腹來建立人肺癌腫瘤。用Ad5/3- Δ 24aCTLA4、重組抗-CTLA4蛋白、非復制對照病毒Ad5/31ucl或溶瘤Ad5/3- Δ 24處理腫瘤,如上文中針對PC3-MM2腫瘤所描述的，測量所述腫瘤。當腫瘤達到15mm的平均直徑時，殺死小鼠。在Ad5/3- Δ 24aCTLA4與Ad5/3-A 24之間未觀察到統(tǒng)計學差異，這表明本發(fā)明的病毒的復制依賴性溶瘤效力與親代病毒相似(圖4D)。實施例6.表達抗_CTLA4mAb的溶瘤腺病毒對癌癥患者的T細胞的免疫調節(jié)為了將臨床前發(fā)現擴展至人，研究患有化學療法難以治療的晚期實體瘤的患者的PBMC。用0.3 μ g/ml的離子霉素(Sigma-Aldrich C0.)、0.03 μ g/ml的佛波醇豆蘧酸酯乙酸酯(PMA) (Sigma-Aldrich C0.)和 I μ g/ml 的重組人 B7Fc 嵌合體(R&D systems)刺激癌癥患者(chondroideal黑色素瘤患者1244、結腸癌患者C261、間皮瘤患者M158或宮頸癌患者X258)的PBMC，以模擬腫瘤誘導的免疫抑制。在刺激后，用0.02μπι過濾的(Anotop, Whatman, England)經 Ad5/3_ Δ 24aCTLA4、Ad5/3_ Δ 24、Ad5/3_aCTLA4 或Ad5/3-Lucl感染的PC3-MM2細胞的上清液處理PBMC。在功能喪失測定中，將0.1 μ g/ml的重組人CTLA_4/Fc嵌合體(R&DSystems)添加至離子霉素、PMA和重組B71BMC刺激后24小時，按照制造商的說明書，利用BD CytometricBead Array Human Soluble Protein Flex Set (Becton Dickinson)分析生長培養(yǎng)基中的白細胞介素-2 (IL-2)或干擾素I (IFNi)水平。使用10個病毒顆粒(VP)/細胞,48小時后，收集上清液。小鼠抗-人CTLA-4(=CD152)mAb(BD Pharmingen , Europe)用作陽性對照。將 FCAP Array v.1.0.2 (Soft Flow)軟件用于分析。在所有4個患者的樣品中，來自表達抗_CTLA4mAb的溶瘤腺病毒的上清液能夠增強T細胞活性，如通過IL-2和干擾素Y測量的(圖5)。實驗原理示于圖7中。有趣地，雖然對于Jurkat細胞(其為永生化T細胞系)，重組mAb更有效，但對于患者樣品，病毒上清液通常效力更強。在功能喪失測定(原理示于圖7E-F中)中獲得類似的數據(圖8)。實施例7.抗_CTLA4mAb對來自健康個體的PBMC的作用還使用健康個體的PBMC進行實施例6中描述的實驗。與癌癥患者相反，來自Ad5/3-A24aCTLA4感染的細胞的上清液不增加IL-2或干擾素、的產量。在功能喪失測定中也未看到顯著的變化。然而，由于陽性對照重組mAb在兩種情況中都是有效的(圖6中增加的IL-2和干擾素Y以及圖8中減少的IL-2和干擾素Y ;在圖6的供體I和供體2中，分別地，增加的IL-2，p〈0.05和p=0.206，增加的INF- y , p<0.05和p=0.120 ;在圖8的供體I和供體2中，分別地，減少的IL-2，p〈0.001和ρ〈0.05 ;以及減少的INF- y , ρ<0.001和ρ〈0.05 ;與僅用rB7、rCTLA4、離子霉素和PMA處理的細胞相比較)，因此，推定這是劑量作用。這得到下述的支持:在功能喪失測定中對于Ad5/3-A24aCTLA4看到非顯著趨勢(圖8)，和來自Ad5/3-aCTLA4感染的細胞的上清液產生具有顯著作用的幾種情況(圖6和8)。然而，抗-CTLA-4mAb的作用在癌癥患者中更明顯，這可能是因為它們具有更高程度的正在進行的免疫抑制過程(歸因于存在的晚期腫瘤)。實施例8:能夠復制的平臺在增加抗_CTLA4mAb表達中的效用分析能夠復制的平臺與復制缺陷型病毒相比，在增加抗_CTLA4mAb表達中的效用。將PC3-MM2細胞以20000個細胞/孔接種，且分別用Ad5/3_ Δ 24aCTLA4和Ad5/3_aCTLA4以10VP/細胞進行感染。感染后24小時、48小時和72小時，收集上清液，通過ELISA分析其中的人IgG的量。相較于復制缺陷型Ad5/3-aCTLA4，對于溶瘤病毒Ad5/3-A 24aCTLA4觀察到3倍的增加。Ad5/3-aCTLA4(圖10)。 溶瘤平臺的一個效用是，獲得高水平的轉基因表達。在早期基因表達后，病毒基因組擴增并且產生高達10000拷貝的病毒DNA。這導致多得多的可產生轉基因的拷貝(圖10)。實施例9:具有增加的免疫應答的溶瘤腺病毒載體為了進一步增強免疫應答，使用肺癌的異種移植物小鼠模型研究特征在于在病毒主鏈中存在toll樣受體9(TLR-9)刺激性CpG分子的溶瘤腺病毒(圖1)。將A549細胞植入NMRI裸小鼠(5只小鼠/組，每小鼠兩個腫瘤)，然后用IxlO8VP的富含CpG的溶瘤腺病毒Ad5- Δ 24CpG、包含Λ 24缺失的溶瘤腺病毒、溶瘤腺病毒+含CpG重組寡核苷酸(0DN2395, InvivoGen, USA)進行處理。如早前所述，以2天的間隔測量腫瘤生長，進行12天。富含CpG的病毒Ad5-A24CpG在介導抗腫瘤免疫中最有效(圖11)。用經UV滅活的病毒刺激從相同小鼠收獲的脾細胞，將所述細胞以1:1和10:1的比率與A549細胞共培養(yǎng)。在第72小時進行MTS細胞殺傷測定。給出了在指定的時間點上仍然活著的A549細胞的百分比。圖12A顯示的數據證明，CpG修飾的病毒能夠刺激抗原呈遞細胞，這導致增強的抗腫瘤免疫應答。該應答是如此之強，以至于甚至在缺乏T細胞的裸小鼠中也可看見。因此，在具有免疫能力的動物和人中可預期甚至更好的數據。在用aCTLA-4同時下調抑制信號的情況下，TLR-9刺激(其誘導抗腫瘤免疫)的效用可能是最顯著的。由病毒產生的抗-CTLA4的表達可增強抗病毒免疫，從而抵消病毒療法。為此，評價小鼠抗-CTLA4與腺病毒一起對具有免疫能力的小鼠脾細胞的作用。用PBS、單獨的Ad5/3- Λ 24、組合的Ad5/3- Λ 24與小鼠aCTLA4抗體或用單獨的小鼠aCTLA4抗體處理具有免疫能力的C57B1/6小鼠(n=5)3次(圖12B)。兩周后，收集脾，通過干擾素Y ELISPOT (ELISP0T.，用于人 IFN- y，3420-2APT-10, MABTECH AB, Sweden)分析脾細胞。利用UV滅活的Ad5/3嵌合病毒或Ad5肽混合物進行刺激。在組之間未觀察到顯著的差異，這表明小鼠抗-CTLA4抗體不影響由病毒引起的免疫。實施例10.特征在于單克隆抗CTLA-4抗體的溶瘤腺病毒載體在人癌癥患者中的安全性和效力 1.患者在Finnish Medicines Association (FIMEA)批準的 Advanced Therapy AccessProgram (ATAP)中招募了患有晚期和難治性實體瘤的患者。在患有標準療法難以治療的晚期實體瘤的患者中選擇患者。選擇標準是常規(guī)療法難以治療的實體瘤、WHO表現評分為3或更低，以及無主要器官功能缺陷。淘汰標準是器官移植、HIV、嚴重心血管病、代謝病或肺病或阻礙溶瘤病毒治療的其它癥狀、發(fā)現或疾病。獲得書面知情同意，并遵循 Good Clinical Practice 和 Declaration of Helsinki,施用治療。適當時，瘤內、靜脈內或腹膜內提供治療。I1.利用編碼aCTLA_4MAb的腺病毒載體的治療溶瘤腺病毒根據臨床等級而產生，并開始患者的治療。通過瘤內注射提供治療。治療的總數是每3周3次?；诒景l(fā)明人的關于其它溶瘤病毒的先前數據選擇病毒劑量。然而，可根據情況使用不同的施用方案。例如，對于系列治療的第一輪，患者瘤內或腹膜內接受劑量的一部分，例如劑量的4/5或2/5,且靜脈內施用剩余劑量。在適當的條件下在施用時將病毒稀釋在無菌鹽水溶液中。在病毒施用后，在醫(yī)院監(jiān)測所有患者過夜，隨后在接下來的4周作為門診病人進行監(jiān)測。在每一次就診時進行體格評價和醫(yī)療史記錄，跟蹤臨床相關實驗室值。按照Common Terminology for Adverse Events ν3.0 (CTCAE)記錄治療的副作用，并且對其進行評分。由于許多癌癥患者具有因疾病而產生的癥狀，因此，如果它們不惡化，則不對預先存在的癥狀進行評分。然而，如果癥狀變得更嚴重，例如治療前的等級I在治療后變成等級2，則將其評分為等級2。利用造影劑增強的計算機斷層攝影術(CT)掃描評價腫瘤尺寸。獲得最大腫瘤直徑。將實體瘤的應答評價標準(RECIST1.1)用于總體疾病，包括注射的和非注射的損傷。這些標準是:部分應答PR(腫瘤直徑之和的大于30%的減小)、穩(wěn)定的疾病SD (無減小/增加)、進行性疾病PD (大于20%的增加)。未滿足PR的明顯的腫瘤減小被評分為最小應答(minor responses, MR)。當在基線上升高時,還評價血清腫瘤標志，并且使用相同的百分比。分析患者血清樣品的免疫學和病毒學參數，包括隨時間過去血液中的病毒拷貝數、抗病毒中和抗體的誘導、抗病毒和抗腫瘤T細胞的變化、其它免疫細胞類型和抗腫瘤抗體的變化。另外，按照 Common Terminology for Adverse Events ν3.0 (CTCAE)對不良事件評級，測量中和抗體滴度，并按照計算機斷層攝影術(CT)的RECIST標準(Therasse P等人2000，J Natl Cancer Inst92，205-16)或正電子發(fā)射斷層成像計算機斷層攝影術(PET-CT)的 PERCIST 標準(Wahl 等人 2009J Nucl Med50Suppll: 122S-50S)評價效力。所有患者在治療前已具有進行性腫 瘤，并且處于疾病的不同分期。
權利要求
1.一種溶瘤腺病毒載體,其包含 1)包含衣殼修飾的腺病毒血清型5型(Ad5)核酸主鏈， 2)El的Rb結合恒定區(qū)2中的24bp缺失(D24);和 3)替代E3區(qū)域中的缺失的腺病毒基因gpl9k/6.7K的、編碼特異于CTLA-4的完全人單克隆抗體(aCTLA MAb)的核酸序列。
2.權利要求1的溶瘤腺病毒載體，其還包含選自E2、E4和晚期區(qū)域的一個或多個區(qū)域。
3.權利要求1或2的溶瘤腺病毒載體，其包含下列區(qū)域:左ITR、部分El、pIX、pIVa2、E2、VA1、VA2、L1、L2、L3、L4、部分 E3、L5、E4 和右 ITR。
4.權利要求3的溶瘤腺病毒載體，其中所述區(qū)域按5’至3’的方向依次排列。
5.前述權利要求的任一項的溶瘤腺病毒載體，其中野生型區(qū)域位于El區(qū)域的上游。
6.前述權利要求的任一項的溶瘤腺病毒載體，其中所述El區(qū)域包含病毒包裝信號。
7.前述權利要求的任一項的溶瘤腺病毒載體，其中編碼aCTLAMAb的核酸序列處于病毒E3啟動子的控制之下。
8.前述權利要求的任一項的溶瘤腺病毒載體，其在El區(qū)域上游還包含編碼腫瘤特異性人端粒酶逆轉錄酶(hTERT)啟動子或E2F啟動子的核酸序列。
9.前述權利要求的任一項的溶瘤腺病毒載體，其在病毒主鏈中還包含CpG位點。
10.權利要求的溶瘤腺病毒載體，其中所述CpG位點在E3區(qū)域中。
11.前述權利要求的任一項的溶瘤腺病毒載體，其中E4區(qū)域是野生型的。
12.前述權利要求的任一項的溶瘤腺病毒載體，其中所述衣殼修飾是Ad5/3嵌合體、整聯蛋白結合(RGD)區(qū)域和/或硫酸肝素結合多聚賴氨酸修飾至纖突的插入。
13.權利要求12的溶瘤腺病毒載體,其中所述衣殼修飾是Ad5/3嵌合體。
14.權利要求12的溶瘤腺病毒載體，其中所述衣殼修飾是RGD-4C修飾。
15.前述權利要求的任一項的溶瘤腺病毒載體，其包含至少一個表達盒。
16.前述權利要求的任一項的溶瘤腺病毒載體，其僅包含一個表達盒。
17.前述權利要求的任一項的溶瘤腺病毒載體，其中所述載體能夠在Rb/pl6-途徑具有缺陷的細胞中選擇性復制。
18.前述權利要求的任一項的溶瘤腺病毒載體，其中所述載體能夠在表達端粒酶的細胞中選擇性復制。
19.一種細胞,其 包含權利要求1-18的任一項的腺病毒載體。
20.一種藥物組合物，其包含權利要求1-18任一項的腺病毒載體。
21.前述權利要求的任一項的溶瘤腺病毒載體或藥物組合物，其用作原位癌癥疫苗。
22.權利要求1-18的任一項的腺病毒載體,其用于治療受試者的癌癥。
23.一種治療受試者的癌癥的方法，其中所述方法包括，給受試者施用權利要求1-18或20的任一項的載體或藥物組合物。
24.權利要求21-23的腺病毒載體或方法，其中所述癌癥選自:鼻咽癌、滑膜癌、肝細胞癌、腎癌、結締組織的癌癥、黑素瘤、肺癌、腸癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、喉癌、口癌、肝癌、骨癌、胰腺癌、絨毛膜癌、胃泌素瘤、嗜鉻細胞瘤、催乳素瘤、T細胞白血病/淋巴瘤、神經瘤、VHL病、卓-艾綜合征、腎上腺癌、肛門癌、膽管癌、膀胱癌、輸尿管癌、少突膠質細胞瘤、神經母細胞瘤、腦膜瘤、脊髓瘤、骨軟骨瘤、軟骨肉瘤、尤文氏肉瘤、原發(fā)部位不明癌癥、類癌、胃腸道類癌、纖維肉瘤、乳腺癌、派杰氏病、宮頸癌、食道癌、膽囊癌、頭部癌癥、眼癌、頸癌、腎癌、腎母細胞瘤、卡波西肉瘤、前列腺癌、睪丸癌、霍奇金氏病、非霍奇金淋巴瘤、皮膚癌、間皮瘤、多發(fā)性骨髓瘤、卵巢癌、內分泌胰腺癌、胰高血糖素瘤、胰腺癌、甲狀旁腺癌、陰莖癌、垂體癌、軟組織肉瘤、視網膜母細胞瘤、小腸癌、胃癌、胸腺癌、甲狀腺癌、滋養(yǎng)層癌癥、葡萄胎、子宮癌、子宮內膜癌、陰道癌、外陰癌、聽神經瘤、蕈樣肉芽腫病、胰島素瘤、類癌綜合征、生長抑素瘤、牙齦癌、心臟癌癥、唇癌、腦膜癌、口腔癌、神經癌、腭癌、腮腺癌、腹膜癌、咽癌、胸膜癌、涎腺癌、舌癌、扁桃體癌。
25.權利要求21-24的腺病毒載體或方法，其中所述受試者是人或動物。
26.權利要求21-25的任一項的腺病毒載體或方法，其中通過瘤內、肌內、動脈內、靜脈內、胸膜內、血管內、腔內或腹膜注射或口服施用來進行施用。
27.權利要求21-26的任一項的腺病毒載體或方法，其中在治療期間施用所述溶瘤腺病毒載體或藥物組合物數次。
28.權利要求21-27的任一項的腺病毒載體或方法，其中將與早期治療的載體相比，具有不同的衣殼纖維結的溶瘤腺病毒載體施用給受試者。
29.權利要求21-28的任一項的腺病毒載體或方法,其中所述方法還包括,給受試者施用同步放射療法或同步化學療法或其它同步癌癥療法。
30.權利要求21-29的任一項的腺病毒載體或方法，其中所述方法還包括，在受試者中給受試者施用輔助劑，其選自維拉帕米或另一種鈣通道阻斷劑；自噬誘導劑；替莫唑胺；能夠下調調節(jié)性T細胞的物質；環(huán)磷酰胺及其任何組合。
31.權利要求21-29的任一項的腺病毒載體或方法，其中所述方法還包括，施用化學療法或抗-CD20療法或用于阻斷中和抗體的其它方法。
32.—種在細胞中產生特異于CTLA-4的完全人單克隆抗體的方法，其中所述方法包括: a)將包含權利要求1-18任一項的溶瘤腺病毒載體的媒介物運送至細胞，和 b)在細胞中表達所述載體的 特異于CTLA-4的完全人單克隆抗體。
33.一種增強受試者的腫瘤特異性免疫應答的方法，其中所述方法包括: a)將包含權利要求1-15任一項的溶瘤腺病毒載體的媒介物運送至靶細胞或組織， b)在細胞中表達所述載體的特異于CTLA-4的完全人單克隆抗體，和 c)通過使用溶瘤平臺，增加表達的抗_CTLA4mAb的量， d)通過使用溶瘤平臺，增加抗_CTLA4mAb的腫瘤對血漿比。
34.權利要求1-18任一項的溶瘤腺病毒載體的用途，其用于在細胞中產生抗-CTLA4mAb。
35.權利要求1-18的任一項的溶瘤腺病毒載體，其用于產生抗CTLA4的完全人單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及生命科學和醫(yī)學領域。具體地，本發(fā)明涉及癌癥療法。更具體地，本發(fā)明涉及溶瘤腺病毒載體以及包含所述載體的細胞和藥物組合物。本發(fā)明還涉及用于治療受試者的癌癥的所述載體以及用于治療受試者的癌癥的方法。此外，本發(fā)明涉及在細胞中產生單克隆抗-CTLA4抗體以及增強受試者的腫瘤特異性免疫應答和細胞凋亡的方法，以及溶瘤腺病毒載體用于在細胞中產生單克隆抗-CTLA4抗體和在受試者中增強腫瘤特異性免疫應答和細胞凋亡的用途。
文檔編號C07K16/28GK103221544SQ201180053319
公開日2013年7月24日 申請日期2011年9月23日 優(yōu)先權日2010年9月24日
發(fā)明者J·迪亞斯, V·切魯洛, A·海明基, S·佩索寧 申請人:昂克斯治療有限公司