專利名稱：基因表達(dá)幽門螺桿菌細(xì)胞毒素相關(guān)基因a蛋白抗原制備工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物基因工程和疾病診斷防治技術(shù)，屬于生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種基因工程表達(dá)幽門螺桿菌細(xì)胞毒素相關(guān)基因A(HelicobacterPylori-Cytotoxin associated gene A，簡(jiǎn)稱CagA)蛋白抗原的制備工藝，以及在消化道疾病的診斷預(yù)報(bào)和預(yù)防治療中的制備應(yīng)用。
幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，簡(jiǎn)稱HP)是一種造成人類胃及十二指腸疾患的重要致病性病原體。幽門螺桿菌的感染已是個(gè)世界問(wèn)題，據(jù)報(bào)道，在發(fā)達(dá)國(guó)家30歲以下人群感染率低于20％，60歲以上人群感染率超過(guò)50％，而在包括我國(guó)在內(nèi)的發(fā)展中國(guó)家，20歲以上人群感染率已達(dá)80％以上。
近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)建立了一些具有高靈敏度和特異性的幽門螺桿菌(HP)診斷方法，這些方法總的可分為兩大類一類是需要使用內(nèi)窺鏡的侵入法；另一類是不需要內(nèi)窺鏡的非侵入法?，F(xiàn)分述于下一.侵入性的診斷試驗(yàn)這類試驗(yàn)的特點(diǎn)是使用內(nèi)窺鏡，在取得胃活檢組織后進(jìn)行檢測(cè)，試驗(yàn)的方法主要有快速尿酶試驗(yàn)、組織學(xué)染色鑒別及細(xì)菌培養(yǎng)法。
1.快速尿酶試驗(yàn)快速尿酶試驗(yàn)是利用胃活檢組織中存在一定量的幽門螺桿菌，其菌膜上存在的尿酶使尿素產(chǎn)生氨氣，引起pH值的改變，通過(guò)顏色的變化來(lái)顯示結(jié)果。該試驗(yàn)具有簡(jiǎn)便快速的特點(diǎn)，它是檢測(cè)胃活檢組織幽門螺桿菌常用的方法，但對(duì)于近期使用過(guò)降低胃部細(xì)菌量或直接抑制酶活性的藥物的樣品應(yīng)避免使用，同時(shí)在成功地根治幽門螺桿菌感染后，由于尚未建立快速尿酶法的準(zhǔn)確性指標(biāo)，故也不應(yīng)使用該試驗(yàn)。
2.組織學(xué)染色一般胃鏡活檢組織經(jīng)過(guò)快速尿酶試驗(yàn)檢測(cè)為陰性時(shí)，為了對(duì)未治療病人進(jìn)行確診，可進(jìn)行病理組織學(xué)檢查，取2份以上胃竇活檢組織用蘇木精和伊紅染色，其它特殊染色還有Genta，Giemsa，Warthin-Starry等。在未治療病人胃活檢中存在慢性活動(dòng)性胃炎，是幽門螺桿菌感染的有力證據(jù)。從組織學(xué)上若不存在慢性粘膜(mucosal)炎癥，則可以排除幽門螺桿菌感染。但不同病理學(xué)家間的觀察會(huì)存在差異，它對(duì)于腸道化生及胃萎縮的樣品診斷具有一定困難。在成功地根治性治療后6周內(nèi)，慢性活動(dòng)性胃炎會(huì)緩慢恢復(fù)其組織形態(tài)，因此也不能作為繼續(xù)感染的標(biāo)志。
3.細(xì)菌培養(yǎng)一般胃活檢組織進(jìn)行幽門螺桿菌的細(xì)菌培養(yǎng)較少，因?yàn)樵摷?xì)菌需要復(fù)雜的營(yíng)養(yǎng)，且費(fèi)用昂貴。但對(duì)于病人在治療中產(chǎn)生抗藥性時(shí)，應(yīng)該進(jìn)行幽門螺桿菌培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)。
4.其它方法其它方法包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)及相差顯微鏡檢查等，前者可用作分型(I型幽門螺桿菌和II型幽門螺桿菌)及研究用，后者需暗視野，且操作者需一定訓(xùn)練，因此臨床上使用是有限的。
以上這些方法由于均需采用胃活檢組織，因此對(duì)醫(yī)院和臨床醫(yī)師、病理學(xué)家等均有一定的要求，同時(shí)采用內(nèi)窺鏡也會(huì)造成病人的痛苦及醫(yī)療費(fèi)的負(fù)擔(dān)，因此常在較嚴(yán)重的胃十二指腸疾患的病中采用。
二.非侵入性的診斷試驗(yàn)這類試驗(yàn)的主要特點(diǎn)是不需要使用內(nèi)窺鏡，從而可避免病人反復(fù)做胃鏡的痛苦及發(fā)生其它類型的感染，試驗(yàn)方法主要包括下述尿素呼吸試驗(yàn)和抗體檢測(cè)。
1.尿素呼吸試驗(yàn)(UBT)碳標(biāo)記尿素呼吸試驗(yàn)(UBT)不隸屬于免疫應(yīng)答，它是根據(jù)幽門螺桿菌尿酶水解口服的碳標(biāo)記尿素的原理設(shè)計(jì)的一種試驗(yàn)方法。當(dāng)一個(gè)感染幽門螺桿菌的病人咽下同位素標(biāo)記的尿素時(shí)，由于幽門螺桿菌表面的尿酶水解尿素釋放標(biāo)記CO2，并吸收到血液中，然后在呼氣中捕獲并測(cè)定之。13C是一種穩(wěn)定的無(wú)放射性同位素，14C是放射性同位素，二者都可用來(lái)標(biāo)記尿素。碳標(biāo)記尿素呼吸試驗(yàn)具有操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，但作為商品的碳標(biāo)記尿素呼吸試驗(yàn)試劑盒的預(yù)期費(fèi)用雖比內(nèi)窺鏡價(jià)格低些但遠(yuǎn)比抗體檢測(cè)試驗(yàn)貴，而且會(huì)造成大量的同位素污染，因此尚難以此法作為常規(guī)檢測(cè)未治療的病人。至于對(duì)病人的確診根治也須在治療后至少一個(gè)月后采用，對(duì)新近用抗生素、鉍劑或質(zhì)子泵抑制劑治療的病人可能會(huì)引起碳標(biāo)記尿素呼吸試驗(yàn)假陰性結(jié)果，先前有胃切除的病人碳標(biāo)記尿素呼吸試驗(yàn)靈敏度也會(huì)下降。
2.抗體檢測(cè)慢性幽門螺桿菌感染可引起病人產(chǎn)生局部或全身性的免疫應(yīng)答而導(dǎo)致IgG和IgA抗體的產(chǎn)生，而其抗體的水平又能較準(zhǔn)確地反映幽門螺桿菌感染的狀態(tài)，因此在病人血清中檢測(cè)幽門螺桿菌抗體是幽門螺桿菌感染的可信指標(biāo)。
目前國(guó)內(nèi)外已有多種幽門螺桿菌抗體檢測(cè)盒上市，其中多以用經(jīng)培養(yǎng)的幽門螺桿菌體抽提物作為抗原，采用如膠乳凝集試驗(yàn)、血球凝集試驗(yàn)、熒光免疫檢測(cè)試驗(yàn)和酶免疫檢測(cè)試驗(yàn)等免疫學(xué)方法檢測(cè)人血清中(或血漿、全血、唾液等)的幽門螺桿菌抗體。其中用得較多的是定性或定量酶免疫檢測(cè)(EIA)幽門螺桿菌抗體檢測(cè)盒，它的檢測(cè)能顯示人群中的幽門螺桿菌感染率，但由于幽門螺桿菌在包括我國(guó)在內(nèi)的發(fā)展中國(guó)家的高感染率，因此對(duì)幽門螺桿菌抗體的檢測(cè)在臨床上不常用作診斷工具，而多用于流行病學(xué)調(diào)查。
隨著醫(yī)學(xué)研究的發(fā)展，對(duì)于幽門螺桿菌是不是產(chǎn)細(xì)胞毒素，在臨床上分為兩種型別I型幽門螺桿菌為產(chǎn)細(xì)胞毒素；II型幽門螺桿菌為不產(chǎn)細(xì)胞毒素。其中約占50％～60％幽門螺桿菌為I型感染。I型幽門螺桿菌即VacA(+)和CagA(+)幽門螺桿菌(VacA空泡細(xì)胞毒素；CagA細(xì)胞毒素相關(guān)基因蛋白抗原)，它是造成胃、十二指腸潰瘍病的重要致病原。檢測(cè)產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌能為消化道疾病的防治工作提供確切的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，尤其是對(duì)含高滴度CagA抗體的患者進(jìn)行積極的根治性治療有著重要的指導(dǎo)意義。
產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌抗體檢測(cè)目前尚屬研究階段，文獻(xiàn)檢索顯示1.HP菌具有高度異源性，不同來(lái)源的CagA基因顯示大量核苷酸取代現(xiàn)象，根據(jù)已報(bào)道的美國(guó)和意大利的CagA核苷酸序列相比，其異源性達(dá)21％。(Infectionand Immunity 61(5)1799-1801 1993；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905791-57951993)2. 1993年10月報(bào)道采用重組128KDa CagA蛋白檢測(cè)CagA-IgG抗體的檢測(cè)試劑(Eur.J.Clin.Microbio.Infect.Dis 12(10)739-745 1993)，但至今尚未見(jiàn)到上市產(chǎn)品。
3.CagA蛋白(128KDa)的抗原性是由CagA近C末端的核苷酸編碼(Proc.Natl.Acad.Sei.USA 905791-5795 1993)，但至今也尚未見(jiàn)到上市產(chǎn)品。
目前在臨床上應(yīng)用的幽門螺桿菌抗體檢測(cè)盒(包括EIA試劑、膠乳試劑等)均采用培養(yǎng)的幽門螺桿菌菌體的抽提物制備而成，在我國(guó)臨床樣品的幽門螺桿菌抗體(HP-IgG)的檢測(cè)結(jié)果絕大多數(shù)均為陽(yáng)性，這樣造成了臨床醫(yī)師的無(wú)所適從，因此對(duì)于胃腸道患者的診斷治療仍主要依靠傳統(tǒng)胃鏡及活檢報(bào)告。HP-IgG的檢測(cè)尚不適合我國(guó)臨床診斷的需要。
幽門螺桿菌按臨床可分為產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌和不產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌兩類，它們?cè)谖负褪改c潰瘍疾病中所造成的后果不一樣感染了不產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌后，雖然能復(fù)蓋在部份胃粘膜上，并使人體產(chǎn)生相應(yīng)的免疫應(yīng)答反應(yīng)(HP-IgG為陽(yáng)性)，但不能侵人胃上皮細(xì)胞，一般可長(zhǎng)期(數(shù)十年乃至終身)無(wú)臨床癥狀。與此相反，感染了產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌后，由于細(xì)胞毒素的作用造成胃上皮細(xì)胞空泡、損傷、壞死和潰瘍，因此感染這類幽門螺桿菌與胃、十二指腸潰瘍及胃癌密切相關(guān)。國(guó)外研究結(jié)果顯示，90％以上的十二指腸潰瘍及75％胃潰瘍病人均感染了產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌，同時(shí)80％以上胃癌病人也與此相關(guān)，因此臨床上迫切需要檢測(cè)特異性的產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌試劑?，F(xiàn)研究結(jié)果進(jìn)一步表明，大約占50％～60％幽門螺桿菌能產(chǎn)生細(xì)胞毒素活性，其中細(xì)胞毒素的表達(dá)與暴露在幽門螺桿菌表面的細(xì)胞毒素相關(guān)基因A(Cytotoxin associatedgene A簡(jiǎn)稱CagA)密切相關(guān)，該基因表達(dá)的蛋白僅存在于產(chǎn)細(xì)胞毒素的幽門螺桿菌中，并具有良好的免疫原性。現(xiàn)已認(rèn)為，CagA蛋白抗體與胃潰瘍、十二指腸潰瘍及胃癌密切相關(guān)，。
本發(fā)明的目的是提供一種基因表達(dá)幽門螺桿菌細(xì)胞毒素相關(guān)基因A蛋白抗原的制備工藝，它采用基因工程表達(dá)幽門螺桿菌細(xì)胞毒素相關(guān)基因A(HP-CagA)蛋白抗原，能為臨床消化道疾患的診斷及預(yù)報(bào)提供依據(jù)，應(yīng)用于免疫學(xué)診斷方法中。
本發(fā)明的又一目的是提供一種基因表達(dá)幽門螺桿菌細(xì)胞毒素相關(guān)基因A蛋白抗原在消化道疾病的診斷預(yù)報(bào)和預(yù)防治療中的制備應(yīng)用，用于檢測(cè)幽門螺桿菌細(xì)胞毒素相關(guān)基因A(HP-CagA)蛋白抗原的抗原或抗體，以指導(dǎo)患者進(jìn)行根除性治療。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案如下一種基因表達(dá)幽門螺桿菌細(xì)胞毒素相關(guān)基因A蛋白抗原的制備工藝，在基因工程中質(zhì)粒的制備和純化、限制性內(nèi)切酶水解、酶切后DNA純化、DNA連結(jié)、連結(jié)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌受體菌、轉(zhuǎn)化子篩選，按一般常規(guī)操作或采用市售商品試劑及試劑盒進(jìn)行操作；
首先選用在細(xì)菌中產(chǎn)生融合蛋白和完全天然蛋白的質(zhì)粒載體；在確定質(zhì)粒載體后，使用與之相適應(yīng)的大腸桿菌受體菌，以獲得高表達(dá)率的基因工程菌；然后制備目的DNA以CagA陽(yáng)性菌染色體DNA為模板，用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增目的DNA片段；(1)DNA模板采用國(guó)際CagA陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)菌株，以及用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)菌株證實(shí)的國(guó)內(nèi)外CagA陽(yáng)性流行菌株的菌體染色體DNA作PCR擴(kuò)增模板；(2)引物選用

圖1所示的CagA基因核苷酸2229-3018bp序列及根據(jù)載體酶切點(diǎn)的序列設(shè)計(jì)引物，使插入目的DNA表達(dá)符合讀格；(3)擴(kuò)增反應(yīng)在0.5ml滅菌離心管內(nèi)混合，其中滅菌水 30μl10X擴(kuò)增緩沖液 10μl4種dNTP混合物，每種濃度1.25m mol/L16μl引物1(溶于5μl水)100p mol引物2(溶于5μl水)100p mol模板DNA1ug加水至終體積100μl其中10X擴(kuò)增緩沖液500m mol/LKCl100m mol/LTris.HCl(PH8.3室溫)15m mol/LMgCl20.1％明膠(4)擴(kuò)增參數(shù)上述混合液在94℃加熱5分鐘，加入2u Taq聚合酶，用100μl液體石蠟復(fù)蓋反應(yīng)混合液上，然后按以下參數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增循環(huán)變性退火聚合首輪循環(huán) 94℃5分鐘50℃2分鐘 72℃3分鐘后續(xù)循環(huán) 94℃1分鐘50℃2分鐘72℃3分鐘末輪循環(huán) 94℃1分鐘50℃2分鐘72℃10分鐘循環(huán)25～30次；目的DNA與質(zhì)粒DNA重組(連結(jié))后轉(zhuǎn)化大腸桿菌；最后進(jìn)行CagA蛋白抗原的表達(dá)和純化重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后，經(jīng)小量培養(yǎng)篩選表達(dá)率高的重組轉(zhuǎn)化子作為基因工程菌，基因工程菌經(jīng)增菌及IPTG誘導(dǎo)后表達(dá)CagA蛋白抗原；基因表達(dá)的CagA為近C末端蛋白抗原，其分子量大小隨不同菌株而定，為27～38Kda；CagA蛋白抗原的純化需根據(jù)載體的情況使用融合蛋白抗體、相應(yīng)抗體。親和層析柱或HPLC進(jìn)行。
一種基因表達(dá)幽門螺桿菌細(xì)胞毒素相關(guān)基因A蛋白抗原在消化道疾病的診斷預(yù)報(bào)中的制備應(yīng)用，應(yīng)用于產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌免疫診斷試劑及試劑盒的制備，它包括檢測(cè)產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌抗原(CagA)及抗體(CagA IgG、CagAIgA、CagA IgM)的膠乳凝集檢測(cè)試劑及試劑盒、金標(biāo)記檢測(cè)試劑及試劑盒、血球凝集檢測(cè)試劑及試劑盒、螢光免疫檢測(cè)試劑及試劑盒、酶免疫檢測(cè)試劑及試劑盒、以及放射免疫檢測(cè)試劑及試劑盒。
一種基因表達(dá)幽門螺桿菌細(xì)胞毒素相關(guān)基因A蛋白抗原在消化道疾病的預(yù)防中的制備應(yīng)用，應(yīng)用于疫苗的制備，包括口服疫苗和注射疫苗的制備。
一種基因表達(dá)幽門螺桿菌細(xì)胞毒素相關(guān)基因A蛋白抗原在消化道疾病的預(yù)防及治療中的制備應(yīng)用，制備包括單克隆抗體及多克隆抗體的CagA蛋白抗體及CagA蛋白拮抗物，用作特異性藥物使之與胃、十二指腸產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌結(jié)合，或作為保健品預(yù)防產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌侵入胃、十二指腸組織。
本發(fā)明采用基因工程表達(dá)幽門螺桿菌細(xì)胞毒素相關(guān)基因A(HP-CagA)蛋白抗原，并應(yīng)用于診斷預(yù)報(bào)檢測(cè)試劑盒的制備、疫苗制備、藥品及保健品的制備中。本發(fā)明中的CagA蛋白抗原可應(yīng)用于免疫學(xué)診斷方法中各種診斷試劑及試劑盒的制備，包括檢測(cè)產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌抗原(CagA)及抗體(CagA IgG、CagAIgA、CagA IgM)的膠乳凝集檢測(cè)試劑及試劑盒、金標(biāo)記檢測(cè)試劑及試劑盒、血球凝集檢測(cè)試劑及試劑盒、螢光免疫檢測(cè)試劑及試劑盒、酶免疫檢測(cè)試劑及試劑盒、以及放射免疫檢測(cè)試劑及試劑盒等，用來(lái)檢測(cè)CagA抗體，能為臨床胃部疾患的診斷及預(yù)報(bào)提供依據(jù)，尤其對(duì)含高滴度CagA抗體的胃、十二指腸患者進(jìn)行積極的抗菌素根除性治療有著重要的指導(dǎo)意義，對(duì)45歲以下的CagA抗體檢測(cè)陰性的患者可免除胃鏡檢查的痛苦。本發(fā)明中的CagA蛋白也可用作制備預(yù)防消化道疾病的疫苗；同時(shí)，CagA抗體可應(yīng)用于特異性治療消化道疾病及預(yù)防消化道疾病的藥物和保健品。
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作進(jìn)一步描述。
圖1表示了CagA基因核苷酸序列。
圖2表示出HP-CagA蛋白表達(dá)及純化。
一種基因表達(dá)幽門螺桿菌細(xì)胞毒素相關(guān)基因A蛋白抗原的制備工藝，在基因工程中質(zhì)粒的制備和純化、限制性內(nèi)切酶水解、酶切后DNA純化、DNA連結(jié)、連結(jié)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌受體菌、轉(zhuǎn)化子篩選，按一般常規(guī)操作或采用市售商品試劑及試劑盒進(jìn)行操作。
1.質(zhì)粒載體的使用可選用在細(xì)菌中產(chǎn)生融合蛋白和完全天然蛋白的各種質(zhì)粒載體。
使用產(chǎn)生融合蛋白的載體有表達(dá)lacZ融合基因的載體系統(tǒng)如PUR載體、PMR載體及PEX載體等。表達(dá)6XHis融合蛋白的載體系統(tǒng)有PQE系統(tǒng)等，還有其它融合蛋白的載體系統(tǒng)。
表達(dá)完全天然CagA蛋白抗原也可采用PKC載體等。
2.大腸桿菌受體菌的使用在確定質(zhì)粒載體后，可使用與之相適應(yīng)的大腸桿菌受體菌，如K12 71/18、JM103、XL1 Blue、JM109、TG1、M15[PREP4]或SG13009[PREP4]等以獲得高表達(dá)率的基因工程菌。
3.目的DNA的制備以CagA陽(yáng)性菌染色體DNA為模板，用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增目的DNA片段。
(1)DNA模板采用國(guó)際CagA陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)菌株，以及用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)菌株證實(shí)的國(guó)內(nèi)外CagA陽(yáng)性流行菌株的菌體染色體DNA作PCR擴(kuò)增模板。
(2)引物參見(jiàn)Tummum et al報(bào)道的CagA核苷酸序列(Infection and Immunity61(5)1799-1809 1993)(參見(jiàn)圖1)，選用圖中核苷酸2229-3018bp序列及根據(jù)載體酶切點(diǎn)的序列設(shè)計(jì)引物，使插入目的DNA表達(dá)符合讀格。圖2中條1為誘導(dǎo)前細(xì)胞電泳圖譜，條2為IPTG誘導(dǎo)后細(xì)胞電泳圖譜，條3為純化蛋白電泳圖譜，條4為標(biāo)準(zhǔn)分子量(MW＝29000)電泳圖譜。
(3)擴(kuò)增反應(yīng)在0.5ml滅菌離心管內(nèi)混合，其中滅菌水30μl10X擴(kuò)增緩沖液 10μl4種dNTP混合物，每種濃度1.25m mol/L16μl引物1(溶于5μl水)100p mol引物2(溶于5μl水)100p mol模板DNA1ug加水至終體積100μl其中10X擴(kuò)增緩沖液500m mol/LKCl100m mol/LTris.HCl(PH8.3室溫)15m mol/LMgCl20.1％明膠(4)擴(kuò)增參數(shù)上述混合液在94℃加熱5分鐘，加入2u Taq聚合酶，用100μl液體石蠟復(fù)蓋反應(yīng)混合液上，然后按以下參數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增循環(huán)變性退火聚合首輪循環(huán) 94℃5分鐘50℃2分鐘 72℃3分鐘后續(xù)循環(huán) 94℃1分鐘50℃2分鐘72℃3分鐘末輪循環(huán) 94℃1分鐘50℃2分鐘72℃10分鐘循環(huán)25～30次。
目的DNA與質(zhì)粒DNA重組(連結(jié))后轉(zhuǎn)化大腸桿菌。
4.CagA蛋白抗原的表達(dá)和純化重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后，經(jīng)小量培養(yǎng)篩選表達(dá)率高的重組轉(zhuǎn)化子作為基因工程菌?；蚬こ叹?jīng)增菌及IPTG誘導(dǎo)后表達(dá)CagA蛋白抗原。具體操作參見(jiàn)MolecularCloningA Laboratory Manual(Sambrook et al 1989)或Current Protocols inMolecular Biology(Ausubel et al 1995)。
基因表達(dá)的CagA為近C末端蛋白抗原，其分子量大小隨不同菌株而定，為27～38Kda。
CagA蛋白抗原的純化可根據(jù)載體的情況使用融合蛋白抗體、相應(yīng)抗體。親和層析柱或HPLC進(jìn)行，純化結(jié)果參見(jiàn)圖2。
本發(fā)明的基因工程表達(dá)CagA蛋白抗原1.本發(fā)明所采用的中國(guó)流行株為醫(yī)960818為經(jīng)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株NCTC11637(14)(HP-CagA(+))及NCTC 12908(01)(HP-CagA(-))核對(duì)過(guò)為HP-CagA(+)株。
2.分別采用HP-CagA(+)的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株NCTC 11637(14)和中國(guó)流行株醫(yī)960818染色體DNA為模板，自行設(shè)計(jì)產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌CagA基因片段引物，用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增其編碼CagA蛋白抗原近C端基因片段作為插入片段。
3.采用表達(dá)載體[如PUR、PMR、PQE等表達(dá)載體]，按常規(guī)操作(見(jiàn)Molecular Cloninga Laboratory Manual(Sambrook et al 1989)或Current Protocolsin Molecular Biology(Ausubel et al 1995)將插入片段與載體多克隆酶切位點(diǎn)連結(jié)，使插入片段表達(dá)符合讀格，然后轉(zhuǎn)化至受體菌(如K12 71/18，JM103 XL1蘭、JM109、TG1、M15[pREP4]或SG 13009[pREP4]等大腸桿菌受體菌)中，并獲得表達(dá)率高的基因工程菌。
4.基因工程菌經(jīng)增菌及IPTG誘導(dǎo)表達(dá)CagA蛋白抗原經(jīng)相應(yīng)的親和層析柱純化后獲得純化CagA蛋白抗原。
本發(fā)明的基因表達(dá)幽門螺桿菌細(xì)胞毒素相關(guān)基因A蛋白抗原在消化道疾病的診斷預(yù)報(bào)中的制備應(yīng)用，應(yīng)用于產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌免疫診斷試劑及試劑盒的制備，它包括檢測(cè)產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌抗原(CagA)及抗體(CagA IgG、CagAIgA、CagA IgM)的膠乳凝集檢測(cè)試劑及試劑盒、金標(biāo)記檢測(cè)試劑及試劑盒、血球凝集檢測(cè)試劑及試劑盒、螢光免疫檢測(cè)試劑及試劑盒、酶免疫檢測(cè)試劑及試劑盒、以及放射免疫檢測(cè)試劑及試劑盒。
實(shí)施例產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌IgG抗體酶免疫檢測(cè)試劑盒的制備產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌IgG抗體酶免疫檢測(cè)試劑盒中，固相載體可包括聚苯乙烯板(孔)、聚苯乙烯珠、聚丙烯板(孔)等。酶可采用辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、尿酶等。底物可根據(jù)不同酶標(biāo)記物選用相應(yīng)的底物。以下用聚苯乙烯板為固相載體，以辣根過(guò)氧化物酶制備酶標(biāo)結(jié)合物，用3，3’、5，5’四甲基聯(lián)苯胺為底物制備試劑盒。
產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌IgG抗體酶免疫檢測(cè)試劑盒包括產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌抗原(CagA蛋白抗原)包被反應(yīng)板條一袋；抗人-IgG-HRP酶標(biāo)結(jié)合物一瓶；樣品稀釋液一瓶；產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌IgG抗體陰、陽(yáng)性對(duì)照血清各一管；底物A液一瓶；底物B液一瓶；終止液一瓶；20倍濃縮洗滌液一瓶。
產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌IgG抗體酶免疫檢測(cè)試劑盒是非侵入型臨床診斷檢測(cè)幽門螺桿菌IgG抗體并能達(dá)到幽門螺桿菌(HP)分型目的的唯一方法，能特異性地檢出引發(fā)胃、十二指腸潰瘍和胃癌的產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌感染，將為我國(guó)在產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌的流行病研究、潰瘍病的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)、潰瘍病治療療效考核及幽門螺桿菌疫苗的研制提供有效的工具。
實(shí)施例產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌IgG抗體金標(biāo)檢測(cè)試劑盒的制備產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌IgG抗體金標(biāo)檢測(cè)試劑盒中由于制備工藝的不同，可有滲濾金標(biāo)斑點(diǎn)法檢測(cè)試劑盒、免疫金標(biāo)層析試驗(yàn)檢測(cè)試紙條等。下面描述滲濾金標(biāo)斑點(diǎn)法檢測(cè)試劑盒的制備方法。
該試劑盒包括滲濾法檢測(cè)塑料小盒20個(gè)，抗人IgG-金標(biāo)記溶液一瓶及洗滌液一瓶。
1.滲濾法檢測(cè)塑料小盒的制備濾膜制備(1)點(diǎn)樣在孔徑為0.22～0.45μ的濾膜上(可采用硝酸纖維素膜、醋酸-硝酸纖維素膜、尼龍膜及預(yù)活化濾膜等)，點(diǎn)樣一定濃度CagA純化蛋白抗原1～2μl作樣品檢測(cè)，另在距此2mm處點(diǎn)樣人IgG 0.5μl作為陰性對(duì)照用，待干。
(2)封膜將濾膜浸入含5％去脂奶粉的PBS液中封閉1小時(shí)取出待干。
(3)包裝將濾膜裝入滲濾檢測(cè)用塑料小盒中，濾膜下鋪有吸水紙墊。
2.抗人-IgG金標(biāo)記溶液的制備(1)在潔凈的硅烷化后的三角燒瓶中，加入雙蒸水1000ml，煮沸，然后加入1％檸檬酸三鈉10ml，煮沸。
(2)加入2％氯金酸5ml，搖勻，繼續(xù)煮沸20分鐘，顏色改變顯示膠體金形成，當(dāng)紅-紫紅色時(shí)膠體金顆粒大小在20-40nm，冷卻至室溫。
(3)加1％PEG 20,000 2ml以穩(wěn)定金溶膠，用0.1M K2CO3校正pH值至中性。
(4)在上述金溶膠中加入適量已透析去鹽的抗人IgG，混勻，放置10分鐘。
(5)用0.1M K2CO3校正pH值至中性，置室溫5分鐘。
(6)加入1％BSA封閉金溶膠。
(7)離心，13,500rpm離心1小時(shí)，棄上清液，收集金溶膠標(biāo)記物。
(8)加入含0.2％PEG 20,000-1％BSA溶液100ml。
(9)校正抗人IgG-金溶膠濃度使之檢測(cè)HP-CagA符合質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。
(10)分裝抗人IgG-金溶膠。
3.洗滌液(1)配制0.1M Tris-HCl(pH8)-100mM NaCl-2％PEG4000-1％吐溫20-0.1％NaN3。
(2)分裝小瓶。
本發(fā)明的基因表達(dá)幽門螺桿菌細(xì)胞毒素相關(guān)基因A蛋白抗原在消化道疾病的預(yù)防中的制備應(yīng)用，應(yīng)用于疫苗的制備，包括口服疫苗和注射疫苗的制備。
實(shí)施例疫苗的制備本發(fā)明所制備的CagA蛋白抗原經(jīng)高度純化后可以用作疫苗免疫原，用來(lái)預(yù)防胃及十二指腸潰瘍或幽門螺桿菌感染的其它并發(fā)癥(如慢性胃炎、萎縮性胃炎、胃癌等)。
免疫劑量的決定可先按標(biāo)準(zhǔn)程序給予動(dòng)物不同量的抗原并測(cè)定其抗體反應(yīng)情況。
疫苗中的成份還應(yīng)包括適當(dāng)?shù)淖魟?br> 給予疫苗的途徑可通過(guò)口服，也可通過(guò)注射。
由于疫苗為主動(dòng)免疫過(guò)程，它對(duì)疾病的預(yù)防和治療都起作用，因此本發(fā)明對(duì)預(yù)防和治療幽門螺桿菌的感染及其引起的胃、十二指腸潰瘍等疾患是有效的方法。
本發(fā)明的基因表達(dá)幽門螺桿菌細(xì)胞毒素相關(guān)基因A蛋白抗原在消化道疾病的預(yù)防及治療中的制備應(yīng)用，制備包括單克隆抗體及多克隆抗體的CagA蛋白抗體及CagA蛋白拮抗物，用作特異性藥物使之與胃、十二指腸產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌結(jié)合，或作為保健品預(yù)防產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌侵入胃、十二指腸組織。
實(shí)施例制備CagA蛋白抗體及CagA蛋白拮抗物CagA抗體或CagA蛋白拮抗物能與產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌特異性結(jié)合，使產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌與宿主胃、十二指腸化生細(xì)胞的受體結(jié)合受到競(jìng)爭(zhēng)性抑制，從而起到被動(dòng)免疫的作用。
本發(fā)明所制備的CagA蛋白通過(guò)免疫動(dòng)物制備的多克隆抗體或單克隆抗體，通過(guò)口服途徑使感染產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌病人達(dá)到治療目的，對(duì)未感染幽門螺桿菌健康人起到保健預(yù)防作用。
權(quán)利要求
1.一種基因表達(dá)幽門螺桿菌細(xì)胞毒素相關(guān)基因A蛋白抗原的制備工藝，在基因工程中質(zhì)粒的制備和純化、限制性內(nèi)切酶水解、酶切后DNA純化、DNA連結(jié)、連結(jié)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌受體菌、轉(zhuǎn)化子篩選，按一般常規(guī)操作或采用市售商品試劑及試劑盒進(jìn)行操作；其特征在于，首先選用在細(xì)菌中產(chǎn)生融合蛋白和完全天然蛋白的質(zhì)粒載體；在確定質(zhì)粒載體后，使用與之相適應(yīng)的大腸桿菌受體菌，以獲得高表達(dá)率的基因工程菌；然后制備目的DNA以CagA陽(yáng)性菌染色體DNA為模板，用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增目的DNA片段；(1)DNA模板采用國(guó)際CagA陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)菌株，以及用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)菌株證實(shí)的國(guó)內(nèi)外CagA陽(yáng)性流行菌株的菌體染色體DNA作PCR擴(kuò)增模板；(2)引物選用CagA基因核苷酸2229-3018bp序列及根據(jù)載體酶切點(diǎn)的序列設(shè)計(jì)引物，使插入目的DNA表達(dá)符合讀格；(3)擴(kuò)增反應(yīng)在0.5ml滅菌離心管內(nèi)混合，其中滅菌水30μl10X擴(kuò)增緩沖液 10μ14種dNTP混合物，每種濃度1.25mmol/L16μl引物1(溶于5μl水)100pmol引物2(溶于5μl水)100pmol模板DNA1ug加水至終體積100μl其中10X擴(kuò)增緩沖液500m mol/LKCl100m mol/LTris.HCl(PH8.3室溫)15m mol/LMgCl20.1％明膠(4)擴(kuò)增參數(shù)上述混合液在94℃加熱5分鐘，加入2u Taq聚合酶，用100μl液體石蠟復(fù)蓋反應(yīng)混合液上，然后按以下參數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增循環(huán)變性退火聚合首輪循環(huán) 94℃5分鐘50℃2分鐘 72℃3分鐘后續(xù)循環(huán) 94℃1分鐘50℃2分鐘72℃3分鐘末輪循環(huán) 94℃1分鐘50℃2分鐘72℃10分鐘循環(huán)25～30次；目的DNA與質(zhì)粒DNA重組(連結(jié))后轉(zhuǎn)化大腸桿菌；最后進(jìn)行CagA蛋白抗原的表達(dá)和純化重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后，經(jīng)小量培養(yǎng)篩選表達(dá)率高的重組轉(zhuǎn)化子作為基因工程菌，基因工程菌經(jīng)增菌及IPTG誘導(dǎo)后表達(dá)CagA蛋白抗原；基因表達(dá)的CagA為近C末端蛋白抗原，其分子量大小隨不同菌株而定，為27～38KdaCagA蛋白抗原的純化需根據(jù)載體的情況使用融合蛋白抗體、相應(yīng)抗體。親和層析柱或HPLC進(jìn)行。
2.一種基因表達(dá)幽門螺桿菌細(xì)胞毒素相關(guān)基因A蛋白抗原在消化道疾病的診斷預(yù)報(bào)中的制備應(yīng)用，其特征在于，應(yīng)用于產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌免疫診斷試劑及試劑盒的制備，它包括檢測(cè)產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌抗原(CagA)及抗體(CagAIgG、CagA IgA、CagA IgM)的膠乳凝集檢測(cè)試劑及試劑盒、金標(biāo)記檢測(cè)試劑及試劑盒、血球凝集檢測(cè)試劑及試劑盒、螢光免疫檢測(cè)試劑及試劑盒、酶免疫檢測(cè)試劑及試劑盒、以及放射免疫檢測(cè)試劑及試劑盒。
3.一種基因表達(dá)幽門螺桿菌細(xì)胞毒素相關(guān)基因A蛋白抗原在消化道疾病的預(yù)防中的制備應(yīng)用，其特征在于，應(yīng)用于疫苗的制備，包括口服疫苗和注射疫苗的制備。
4.一種基因表達(dá)幽門螺桿菌細(xì)胞毒素相關(guān)基因A蛋白抗原在消化道疾病的預(yù)防及治療中的制備應(yīng)用，其特征在于，制備包括單克隆抗體及多克隆抗體的CagA蛋白抗體及CagA蛋白拮抗物，用作特異性藥物使之與胃、十二指腸產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌結(jié)合，或作為保健品預(yù)防產(chǎn)細(xì)胞毒素幽門螺桿菌侵入胃、十二指腸組織。
全文摘要
本發(fā)明首先選用在細(xì)菌中產(chǎn)生融合蛋白和完全天然蛋白的質(zhì)粒載體;在確定質(zhì)粒載體后,使用與之相適應(yīng)的大腸桿菌受體菌,以獲得高表達(dá)率的基因工程菌;然后制備目的DNA;目的DNA與質(zhì)粒DNA重組(連結(jié))后轉(zhuǎn)化大腸桿菌;最后進(jìn)行CagA蛋白抗原的表達(dá)和純化。基因表達(dá)的CagA為近C末端蛋白抗原,其分子量大小隨不同菌株而定,為27～38Kda。本發(fā)明應(yīng)用于消化道疾病的診斷預(yù)報(bào)和預(yù)防治療的制備中,能為臨床消化道疾患的診斷及預(yù)報(bào)提供依據(jù)。
文檔編號(hào)C12N15/10GK1255545SQ9812205
公開(kāi)日2000年6月7日 申請(qǐng)日期1998年11月30日 優(yōu)先權(quán)日1998年11月30日
發(fā)明者郭春祥, 李建林, 郭錫瓊 申請(qǐng)人:上海晶瑩生物技術(shù)有限公司