專利名稱：來自幽門螺桿菌的新型粘附素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及來自幽門螺桿菌的新型粘附素基因alpB和由其編碼的多肽?？蓪⒒?、多肽和針對(duì)該多肽的一種抗體用于診斷、預(yù)防和治療螺桿菌感染。
很久以來已知在人胃粘膜中螺旋細(xì)菌的存在(Bizzozero，1893)。然而直到由Marshall和Warren從一個(gè)胃潰瘍患者的胃粘膜中成功分離和培養(yǎng)了這種細(xì)菌(Marshall和Warren，1983；Marshall等，1984)才意識(shí)到這些是病原菌。首次分析表明所分離的微生物是有極高運(yùn)動(dòng)性而具有能夠在強(qiáng)酸性環(huán)境中(高達(dá)大約pH1.5)存活的不尋常能力的革蘭氏陰性螺旋細(xì)菌?；谏锘瘜W(xué)和形態(tài)學(xué)特征，最后將最初被稱為幽門彎曲菌的細(xì)菌歸類于新確定的屬“螺桿菌”(Goodwin等，1989)。
在幾年內(nèi)更加明確了幽門螺桿菌感染的重要性和這個(gè)發(fā)現(xiàn)的影響。由Taylor和Blaser的流行病學(xué)調(diào)查(1991)表明幽門螺桿菌感染在世界范圍內(nèi)發(fā)生，并且大約50％的人被這種細(xì)菌感染，在發(fā)展中國(guó)家感染率高于發(fā)達(dá)國(guó)家。另外觀察到隨著年齡的增長(zhǎng)慢性幽門螺桿菌感染的可能性明顯增加。因而幽門螺桿菌感染是人最常見的慢性細(xì)菌感染之一。
目前已知在人類中這種感染不可避免地引起細(xì)菌性胃炎(B型胃炎)的誘發(fā)。而且據(jù)推測(cè)幽門螺桿菌還在胃和十二指腸潰瘍以及一些類型胃癌(腺癌)的發(fā)展中發(fā)揮起因的作用(Lee等，1993；Solnick和Tompkins，1993)。甚至連更罕見并被認(rèn)為是免疫系統(tǒng)B細(xì)胞淋巴瘤前體的胃MALT(粘膜相關(guān)淋巴組織)淋巴瘤也可能是幽門螺桿菌感染的一個(gè)結(jié)果。對(duì)這些患者進(jìn)行成功清除(全部清除)幽門螺桿菌的抗菌治療引起胃潰瘍和低級(jí)MALT淋巴瘤的治愈(Sipponen和Hyvarinen，1993；Isaacson和Spencer，1993；Stolte和Eidt，1993)。
幽門螺桿菌長(zhǎng)期感染的一個(gè)后遺癥是萎縮性胃炎，一種被看作是癌前病變的胃上皮分泌粘液、酸或胃蛋白酶的細(xì)胞的退化。根據(jù)在1980年世界性發(fā)生率最高的癌癥類型的統(tǒng)計(jì)，胃癌是在第二位但具有下降的趨勢(shì)(Parkin等，1988)。兩項(xiàng)研究最近顯示在幽門螺桿菌感染和胃癌(腸型)的發(fā)生之間有一個(gè)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的相關(guān)性，它們都得出了所有發(fā)生的胃癌中大約60％可能是由于幽門螺桿菌感染的結(jié)論(Parsonnet等，1991；Nomura等，1991)。另外，Sipponen(1992)的研究表明在許多工業(yè)化國(guó)家被感染者20％以上在他們的一生中罹患胃或十二指腸潰瘍，而這個(gè)風(fēng)險(xiǎn)在具有正常胃粘膜的人中小得可忽略。這意味著這些常見的胃-十二指腸疾病必須被看作是感染性疾病，并恰當(dāng)?shù)刂委?Alper，1993)。清除已存在的慢性幽門螺桿菌感染的治療導(dǎo)致胃炎、胃或十二指腸潰瘍或MALT淋巴瘤的治愈。因此防止幽門螺桿菌感染的預(yù)防性治療(如免疫)和清除已存在的螺桿菌感染的治療可被用來治療這些常見的胃-十二指腸疾病。
以前除了一些較高等靈長(zhǎng)類，人是幽門螺桿菌唯一已知的天然宿主。最近，家貓也能被幽門螺桿菌感染的發(fā)現(xiàn)在這些細(xì)菌在人體外傳播和可能的宿主問題上提出新的觀點(diǎn)。偶爾成功的取自感染者糞便的幽門螺桿菌培養(yǎng)和細(xì)菌在水中存活數(shù)月的能力支持糞-口傳播的假設(shè)。在家庭研究的基礎(chǔ)上直接口-口傳播也被看作是可能的。由于狹窄的生活條件和差的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)與感染率正相關(guān)，在家庭內(nèi)感染通常發(fā)生在童年。
經(jīng)口攝入后細(xì)菌首先到達(dá)極酸的胃腔(pH1-2)。在這里通過產(chǎn)生使存在的尿素分解從而局部中和胃中酸性pH值的尿素酶，使得細(xì)菌的存活成為可能。通過趨化性的定位和鞭毛依賴的運(yùn)動(dòng)，微生物然后遷移入實(shí)際上是它們天然棲息地的碳酸氫鹽緩沖的胃竇區(qū)粘膜層。在此由于酸屏障，它們處于一個(gè)只有一些競(jìng)爭(zhēng)性的細(xì)菌種類可以接近的獨(dú)特的生態(tài)學(xué)小生境中。為了達(dá)到上皮，這些微生物可能通過在胃腔(pH1-2)和上皮細(xì)胞表面(pH6-7)之間的pH梯度來定向。由于它們的螺旋形狀、它們?cè)谡骋褐械倪\(yùn)動(dòng)性、粘液修飾酶的產(chǎn)生以及最后它們生存的微需氧方式，這些細(xì)菌最適應(yīng)這個(gè)小生境中的生存條件。
它們通常生活在保護(hù)它們免受如酸、胃蛋白酶和用來清除它們的藥物如抗生素等外部影響的竇區(qū)深隱窩中。部分細(xì)菌(大約20％)與上皮細(xì)胞特別是產(chǎn)粘液細(xì)胞相關(guān)。在胃組織轉(zhuǎn)化即在十二指腸中酸誘導(dǎo)胃上皮形成的條件下，組織轉(zhuǎn)化區(qū)也在十二指腸中定位，這產(chǎn)生十二指腸潰瘍發(fā)生的前提條件。幽門螺桿菌隨著所分泌粘液的完全排泄可能被它們的粘附能力阻止，以便細(xì)菌能夠持續(xù)數(shù)年、數(shù)十年甚至終生(慢性感染)。
在了解對(duì)于潰瘍病幽門螺桿菌的存在和意義之前，用所謂的制酸劑或H2受體拮抗劑來治療這些病。這些是抑制胃壁細(xì)胞分泌酸的物質(zhì)。這些藥物的作用通常引起潰瘍的治愈，但由此并未清除這些潰瘍的原因之一即幽門螺桿菌感染，故在大部分情況下在短時(shí)間后便發(fā)生潰瘍的再現(xiàn)(復(fù)發(fā))。
另一常用的潰瘍療法是鉍治療。各種鉍鹽(CBS、BSS)對(duì)幽門螺桿菌有殺菌的作用。然而只在8-32％的病例中實(shí)現(xiàn)了這些細(xì)菌的全部清除。該療法明顯引起細(xì)菌暫時(shí)的抑制，但中止治療后在大多數(shù)情況下感染重新發(fā)作。長(zhǎng)期的高劑量治療引起該物質(zhì)在肝臟、腎臟和神經(jīng)系統(tǒng)的蓄積并具有很大的神經(jīng)學(xué)副作用(Malfertheiner，1994)。
由于已經(jīng)揭示了胃十二指腸潰瘍病是感染性疾病，所以治療的一個(gè)目標(biāo)是通過抗生素清除病原體。然而，各種抗生素(阿莫西林、硝基呋喃、furazolidin、紅霉素)的單一療法已被證明是不令人滿意的，因?yàn)樵谶@種情況下只在0-15％的病例中實(shí)現(xiàn)細(xì)菌的清除。目前通過能夠?qū)е赂哌_(dá)80％清除率的一種制酸劑(奧美拉唑)和一種抗生素(阿莫西林)的聯(lián)合達(dá)到最成功的治療。然而，由于必須推測(cè)細(xì)菌將迅速發(fā)展對(duì)抗生素的抗性，故抗生素治療來清除幽門螺桿菌作為一種長(zhǎng)期治療方法是沒有保證的。
因而需要一種新形式的療法來控制幽門螺桿菌感染，特別是特異性針對(duì)幽門螺桿菌毒力因子的疫苗。毒力因子指盡管有宿主機(jī)體的免疫反應(yīng)和非特異的防御反應(yīng)，但仍使病原菌能夠在宿主體內(nèi)定位于一個(gè)特異的生態(tài)學(xué)小生境并在其中復(fù)制的病原菌的特性。因而關(guān)于毒力因子的知識(shí)幫助較好地理解一種感染性疾病的原因和機(jī)制。以前檢測(cè)的幽門螺桿菌最重要的毒力因子是尿素酶、鞭毛、粘附素和細(xì)胞毒素的產(chǎn)生。
尿素酶，在細(xì)菌表面的一種酶，由構(gòu)成高達(dá)5％全部細(xì)菌蛋白的兩個(gè)亞單位(UreA，26kDa，UreB，66kDa)所組成。尿素酶將胃液中低濃度存在的尿素分解為氨和二氧化碳。根據(jù)目前的觀點(diǎn)，細(xì)菌被導(dǎo)致局部胃液中酸中和的氨包圍。細(xì)菌極高的運(yùn)動(dòng)性可以歸功于使細(xì)菌能夠在胃粘膜的粘液中運(yùn)動(dòng)并達(dá)到上皮細(xì)胞層的極性鞭毛的存在。將尿素酶基因簇(ureA-ureH)和形成鞭毛的基因(flaA，flaB)克隆到大腸桿菌中并測(cè)序，并且構(gòu)建了同基因突變體。
所有分離的幽門螺桿菌菌株中大約50-60％都產(chǎn)生一種87kDa蛋白質(zhì)，即所謂的空泡化細(xì)胞毒素，其在體外細(xì)胞培養(yǎng)中誘導(dǎo)胞漿空泡的形成。同時(shí)還克隆并在遺傳學(xué)上分析了編碼幽門螺桿菌細(xì)胞毒素的vacA基因。另外，推測(cè)產(chǎn)細(xì)胞毒素菌株比不產(chǎn)生這種毒素的菌株具有更高的致病能力。此外，在細(xì)胞毒素的產(chǎn)生和胃潰瘍的發(fā)展之間發(fā)現(xiàn)了一種正相關(guān)性。
體外對(duì)于幽門螺桿菌對(duì)上皮細(xì)胞系粘附的研究表明細(xì)菌可以結(jié)合不同組織的許多細(xì)胞系。相反，幽門螺桿菌在宿主生物中表現(xiàn)出一種非常明顯的物種和組織選擇性粘附。因此，發(fā)現(xiàn)該細(xì)菌只結(jié)合于屬于胃型上皮細(xì)胞的上皮細(xì)胞。由一種細(xì)菌粘附素和一種特異性細(xì)胞受體之間的一種特異性相互作用解釋了這種選擇性。
直至今日，已經(jīng)描述了幽門螺桿菌的幾種潛在的粘附素，而且克隆并測(cè)序了一個(gè)編碼一種所謂的N-乙酰神經(jīng)氨酸基乳糖結(jié)合血凝素的基因(hpaA)(Evans等，1993)。這是一種被猜測(cè)識(shí)別細(xì)胞表面一含有唾液酸的受體的蛋白。然而，這種粘附素對(duì)于幽門螺桿菌感染的意義是有爭(zhēng)議的。其他潛在的粘附素只通過其分子量或其受體結(jié)合特異性進(jìn)行了鑒定。這些包括一種似乎與銅綠假單胞菌的胞外酶S(一種具有ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶活性的粘附素)同源的63kDa蛋白質(zhì)。另外，據(jù)推測(cè)還有一個(gè)未鑒定出的介導(dǎo)一種對(duì)胃上皮細(xì)胞Lewisb血型抗原的特異性結(jié)合的粘附素(Falk等，1993；Boren等，1993)。
幽門螺桿菌感染導(dǎo)致胃粘膜的一種慢性炎癥反應(yīng)(胃炎)。另外誘導(dǎo)了一種對(duì)幽門螺桿菌抗原的特異性系統(tǒng)免疫反應(yīng)。然而還未完全弄清胃中分泌性抗體(sIgA)的形成。作為炎癥的結(jié)果，各種免疫細(xì)胞存在于胃粘膜或粘膜下，如多形核白細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞(Blaser，1992)。另外，幽門螺桿菌在體外激活中性粒細(xì)胞以及單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞(Mai等，1991)。特異性抗體和補(bǔ)體的實(shí)驗(yàn)表明了在體外通過中性粒細(xì)胞對(duì)幽門螺桿菌的快速滅活。然而，在體內(nèi)情況下，這些機(jī)制并未引起病原菌的滅活。幽門螺桿菌雖然激活前面提到的防御機(jī)制，但其如何在宿主內(nèi)長(zhǎng)期存活還不清楚。
在自然條件下宿主不能對(duì)付幽門螺桿菌感染。因而更驚人的是尿素酶，幽門螺桿菌的一種重要毒力因子(見上)，作為一種疫苗具有巨大的潛力(美國(guó)專利申請(qǐng)USSN 07/970,996基于尿素酶的抗幽門螺桿菌感染疫苗)。
在貓螺桿菌/小鼠模型(貓螺桿菌是一種天然定位于貓的胃中并也能感染小鼠的螺桿菌)中能夠表明幽門螺桿菌尿素酶或重組尿素酶B亞單位(rUreB)的經(jīng)口免疫可以保護(hù)小鼠免受貓螺桿菌感染(預(yù)防性疫苗)并還可以清除已存在的感染(治療性疫苗)(Michetti等，1994；Corthesy-Theulaz等，《胃腸病學(xué)》(Gastroenterol)，出版中)。經(jīng)口免疫中的一個(gè)決定性因素是佐劑的使用，如白喉毒素，其似乎對(duì)于從產(chǎn)生系統(tǒng)性抗體到產(chǎn)生分泌性抗體的免疫反應(yīng)的轉(zhuǎn)換中是重要的。
本發(fā)明的目的是提供來自幽門螺桿菌的新的分泌性基因以及由其編碼的作為疫苗潛在的候選者的多肽。
在德國(guó)專利申請(qǐng)195 21 312.2中描述了一個(gè)用于從幽門螺桿菌中鑒定分泌性基因的方法，其中在轉(zhuǎn)座子的協(xié)助下建立了一個(gè)幽門螺桿菌的突變基因庫(kù)，并分析了這個(gè)突變體庫(kù)在粘附行為上的缺陷，如對(duì)人胃上皮細(xì)胞。以這種方式鑒定一個(gè)被稱為alpA的粘附素基因以及一個(gè)由該基因編碼的多肽。
在克隆位于alpA下游的側(cè)翼區(qū)時(shí)，鑒定了一個(gè)來自幽門螺桿菌被稱為alpB的具有在序列號(hào)1中所示核苷酸序列的新的粘附素基因和一個(gè)由該基因編碼的具有在序列號(hào)1和2中所示氨基酸序列的多肽。
因此本發(fā)明的一個(gè)主要內(nèi)容是一種DNA分子，其包括(a)在序列號(hào)1中所示的核苷酸序列(b)在遺傳密碼簡(jiǎn)并性范圍內(nèi)與(a)的序列相應(yīng)的核苷酸序列或(c)在嚴(yán)格條件下與(a)或/和(b)的序列雜交的核苷酸序列。
除了在序列號(hào)1中所示的核苷酸序列和一個(gè)在遺傳密碼簡(jiǎn)并性范圍內(nèi)與該序列相應(yīng)的核苷酸序列外，本發(fā)明還包括一個(gè)在嚴(yán)格條件下與這些序列中的某一個(gè)雜交的DNA序列。根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)“雜交”是按照由Sambrook等的描述(《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Molecular Cloning.ALaboratoryManual)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(1989)，1.011到1.014)使用的。根據(jù)本發(fā)明，在嚴(yán)格條件下的雜交意味著在用1×SSC和0.1％SDS在55℃優(yōu)選在62℃特別優(yōu)選68℃下洗滌1小時(shí)，特別是在0.2×SSC和0.1％ SDS在45℃優(yōu)選62℃特別優(yōu)選68℃下洗滌1小時(shí)后仍可以觀察到一個(gè)陽(yáng)性雜交信號(hào)。本發(fā)明包括在這種洗滌條件下與在序列號(hào)1中所示核苷酸序列或在遺傳密碼簡(jiǎn)并性范圍內(nèi)相應(yīng)的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
根據(jù)本發(fā)明的DNA分子優(yōu)選編碼一個(gè)具有粘附于人的細(xì)胞特別是人胃上皮細(xì)胞之能力的多肽。另外，根據(jù)本發(fā)明的DNA分子與在序列號(hào)1中所示的核苷酸序列在核苷酸水平上具有至少70％，特別優(yōu)選至少80％的同源性。另外，優(yōu)選DNA分子具有至少15個(gè)優(yōu)選至少20個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。
在序列號(hào)1中所示的粘附素基因alpB的DNA序列編碼一518個(gè)氨基酸的多肽。這個(gè)被稱為AlpB的多肽的氨基酸序列示于序列號(hào)1和2中。AlpB氨基酸序列的N-末端區(qū)的分析表明該多肽具有一經(jīng)典的原核信號(hào)序列。AlpB和于德國(guó)專利申請(qǐng)195 21 312.2中所述的氨基酸序列示于序列號(hào)3和4中的多肽AlpA之間在氨基酸水平上的比較表明在兩種多肽中全部氨基酸序列的46％是相同的。C-末端部分(氨基酸341-518)甚至表現(xiàn)出66％的相似性。
通過在alpB基因上的兩個(gè)不同位點(diǎn)上插入轉(zhuǎn)座子TnMax9而產(chǎn)生的alpB基因缺陷突變體并不與胃上皮細(xì)胞的組織部分結(jié)合。因?yàn)樵谶@些alpB突變體中檢測(cè)到了AlpA的穩(wěn)定表達(dá)，故alpB突變體粘附的喪失一定是alpB基因的缺陷造成的。
在AlpA和AlpB之間有一個(gè)功能性的連接，因而認(rèn)為AlpA和AlpB之間可能共同形成一個(gè)復(fù)合物。這種復(fù)合物可表現(xiàn)為一種可有效地作為功能性粘附素的異源二聚體或/和多聚體。AlpA或AlpB的任一個(gè)亞單位的丟失可以導(dǎo)致粘附素復(fù)合物功能的喪失，從而導(dǎo)致細(xì)菌的粘附缺陷。
因而，本發(fā)明的另一主要內(nèi)容是含有被融合在一起的alpB基因和alpA基因序列區(qū)的一種DNA分子。特別是一種其中將上述在(a)、(b)和(c)下所定義的序列與(d)在序列號(hào)3中所示的核苷酸序列(e)在遺傳密碼簡(jiǎn)并性范圍內(nèi)與(d)的序列相應(yīng)的核苷酸序列或(f)在嚴(yán)格條件下與(d)或/和(e)的序列雜交的核苷酸序列相融合的DNA分子。
這樣一種融合的DNA分子的一個(gè)優(yōu)選的例子含有分別來自粘附素基因alpB(序列號(hào)1)和alpA(序列號(hào)3)一個(gè)或幾個(gè)部分。這些部分的長(zhǎng)度優(yōu)選至少18個(gè)核苷酸，特別優(yōu)選至少30個(gè)核苷酸而最優(yōu)選至少60個(gè)核苷酸。
本發(fā)明的另一個(gè)主要內(nèi)容是一種含有至少一個(gè)拷貝本發(fā)明的DNA分子的載體。這種載體可以是在其中優(yōu)選將本發(fā)明的DNA序列定位于一個(gè)表達(dá)信號(hào)(啟動(dòng)子、操縱子、增強(qiáng)子等)控制下的任何原核或真核載體。原核載體的實(shí)例是如噬菌體(例如λ噬菌體)的染色體載體和如質(zhì)粒的染色體外載體，其中特別優(yōu)選環(huán)形質(zhì)粒載體。例如由Sambrook等，同前，1到4章描述了適宜的原核載體。
在另一方面，根據(jù)本發(fā)明的載體還可以是一種如酵母載體或適于高等細(xì)胞的真核載體(例如質(zhì)粒載體、病毒載體、植物載體)。例如由Sambrook等，同上，16章描述了這些載體。
而本發(fā)明的另一主要內(nèi)容是一種由本發(fā)明的載體所轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞為原核細(xì)胞，優(yōu)選革蘭氏陰性原核細(xì)胞，特別優(yōu)選大腸桿菌細(xì)胞。然而，在另一方面，本發(fā)明的細(xì)胞也可以為一種如真菌細(xì)胞(如酵母)、動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞的真核細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的DNA分子所編碼的多肽。這種多肽優(yōu)選能夠粘附于人細(xì)胞并含有(a)在序列號(hào)2中所示的氨基酸序列或(b)一種同根據(jù)(a)的序列有免疫學(xué)交叉反應(yīng)的氨基酸序列。
根據(jù)本發(fā)明的多肽優(yōu)選同在序列號(hào)2中所示的氨基酸序列具有至少80％最優(yōu)選至少90％的同源性。
根據(jù)本發(fā)明的多肽優(yōu)選是通過用本發(fā)明的DNA分子或載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并在進(jìn)行多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)所轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，然后從細(xì)胞或/和培養(yǎng)上清中分離多肽來制備的。在這個(gè)過程中，根據(jù)本發(fā)明的多肽可以以融合多肽也可以以非融合多肽形式獲得。
而本發(fā)明的另一主要內(nèi)容是各自含有來自多肽AlpB(序列號(hào)2)和AlpA(序列號(hào)4)的一個(gè)或幾個(gè)片段的融合多肽。這些片段的長(zhǎng)度至少為6個(gè)，優(yōu)選至少10個(gè)，最優(yōu)選至少20個(gè)氨基酸。
由于AlpB蛋白可與DE195 21 312.2中所公布的AlpA蛋白形成一個(gè)有功能活性的復(fù)合物，本發(fā)明還涉及含有至少兩個(gè)多肽元件的多肽復(fù)合物，其中第一個(gè)元件由alpB序列或由其衍生的序列編碼，第二個(gè)元件由alpA序列或由其衍生的序列，特別是由一種包括(d)在序列號(hào)3中所示的核苷酸序列(e)在遺傳密碼簡(jiǎn)并性范圍內(nèi)與(d)的序列相應(yīng)的核苷酸序列或(f)在嚴(yán)格條件下與(d)或/和(e)的序列雜交的核苷酸序列的DNA分子所編碼。
第二種多肽即復(fù)合物的AlpA成分優(yōu)選含有序列號(hào)4中所示的氨基酸序列、與該序列至少80％且優(yōu)選至少90％同源的氨基酸序列或與這些序列發(fā)生免疫學(xué)交叉反應(yīng)的氨基酸序列。
本發(fā)明的多肽AlpB或其部分可被用作免疫原來制備抗體。因而本發(fā)明還涉及一種針對(duì)本發(fā)明多肽或復(fù)合物的抗體?？贵w優(yōu)選針對(duì)N-末端例如序列號(hào)2中所示氨基酸序列的前340個(gè)特別是前250個(gè)氨基酸。
本發(fā)明的另一方面涉及一種含有本發(fā)明的DNA分子、本發(fā)明的多肽、本發(fā)明的多肽復(fù)合物或本發(fā)明的抗體作為活性物質(zhì)，并任選性地加入常見的藥物輔助物質(zhì)、稀釋劑、添加劑和載體的藥物組合物。
本發(fā)明的藥物組合物一方面可用于診斷幽門螺桿菌感染。優(yōu)選通過利用含有本發(fā)明的特異性針對(duì)alpB基因DNA序列的雜交探針或通過利用本發(fā)明的DNA分子作為引物的擴(kuò)增來進(jìn)行核酸水平上的診斷。在蛋白質(zhì)水平上優(yōu)選在本發(fā)明的抗體的協(xié)助下進(jìn)行診斷。
在另一方面，該藥物組合物還可用于預(yù)防或治療幽門螺桿菌感染。對(duì)于治療性應(yīng)用，將AlpB多肽或其部分選擇性地同AlpA多肽或其部分一起用于制備一種主動(dòng)免疫疫苗或?qū)⒖贵w用于制備一種被動(dòng)免疫疫苗。
將通過下述實(shí)施例和附圖來進(jìn)一步闡明本發(fā)明。


圖1顯示了含有調(diào)節(jié)區(qū)域和alpA基因(序列號(hào)3)5′末端的質(zhì)粒pMu140的限制性圖譜。通過插入轉(zhuǎn)座子TnMax9(見三角形標(biāo)記的TnMax9)使alpA基因失活。當(dāng)質(zhì)粒表達(dá)時(shí)，獲得一種alpA-β-內(nèi)酰胺酶融合蛋白。pMu140是來自突變基因庫(kù)的原始克隆，通過再轉(zhuǎn)化和同源重組從該基因庫(kù)獲得粘附缺陷性幽門螺桿菌菌株P(guān)1-140。
圖2展示了含有alpB基因的一部分和全部alpB基因(序列號(hào)1)的質(zhì)粒pMT5的限制性圖譜。將復(fù)制起點(diǎn)orifd和來自轉(zhuǎn)座子TnMax9的氯霉素轉(zhuǎn)移酶基因catGC用于突變的alpA基因位點(diǎn)和側(cè)翼alpB基因區(qū)的選擇性反克隆。Res指TnMax9的解離位點(diǎn)，而IR指轉(zhuǎn)座子的反向重復(fù)序列。M13-FP和M12-RP1指含有M12正向和反向測(cè)序引物的序列區(qū)域。在克隆位點(diǎn)SacI和StuI之間的接頭區(qū)來自質(zhì)粒pBluescript II KS。
圖3顯示粘附素AlpA和AlpB之間氨基酸序列的比較。(A)利用GCG程序BESTFIT(Devereux等，1984)進(jìn)行序列比較，并覆蓋完整的多肽AlpA和AlpB。垂直的線表示相同的氨基酸；點(diǎn)表示保守的氨基酸置換。在序列的末端注明了兩序列之間的相似性或同一性程度。(B)在可能負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)整合到細(xì)菌外膜中的兩種多肽的C-末端區(qū)域(位點(diǎn)341-518)中可看到顯著高的同一性程度。以一個(gè)苯丙氨酸(F)結(jié)束的5個(gè)氨基酸的C-末端區(qū)域也是典型的，這在革蘭氏陰性細(xì)菌的分泌蛋白情況下表明外膜中的插入(Struyvé等，1991)。
序列號(hào)1表示幽門螺桿菌粘附基因alpB的核苷酸序列和對(duì)應(yīng)的氨基酸序列。
序列號(hào)2表示來自幽門螺桿菌的AlpB粘附多肽的氨基酸序列。
序列號(hào)3表示幽門螺桿菌粘附基因alpA的核苷酸序列和對(duì)應(yīng)的氨基酸序列。
序列號(hào)4表示來自幽門螺桿菌的AlpA粘附多肽的氨基酸序列。
實(shí)施例1一個(gè)幽門螺桿菌質(zhì)粒基因庫(kù)的構(gòu)建建立了一個(gè)幽門螺桿菌野生型菌株69A的染色體DNA的質(zhì)?；驇?kù)。通過Leying等(1992)的方法從幽門螺桿菌中分離染色體DNA并分別用限制性內(nèi)切酶Sau3A I和Hpa II部分酶切。隨后在一制備性瓊脂糖凝膠中分離DNA片段并從凝膠中洗脫3-6kb的片段。將這些DNA片段連接到為此目的而特殊構(gòu)建的并已用限制性酶Bgl II和Cla I切開的質(zhì)粒載體pMin2中，并連接(T4連接酶)，用連接混合物轉(zhuǎn)化衍生自菌株HB101的含有溶原性λ噬菌體λCH616并已經(jīng)用轉(zhuǎn)座子TnMax9轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株E181(Bayer和Roulland-dussoix，1969)中。在這個(gè)過程中獲得了大約2400個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)化子。
將含有最小載體pMin2的大腸桿菌菌株DH5α以保藏號(hào)10007保存在“Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSM)”，Mascheroder Weg lb，D-38124 Braunschweig中。含有轉(zhuǎn)座子衍生物pTnMax9的大腸桿菌菌株E181以保藏號(hào)10008保存在DSM中。
實(shí)施例2幽門螺桿菌突變體的分離為了進(jìn)行轉(zhuǎn)座子誘變，每10個(gè)轉(zhuǎn)化子收集在一起，并相互誘導(dǎo)，這意味著總共進(jìn)一步處理了190組，每個(gè)10-20個(gè)克隆。從這個(gè)獨(dú)立帶有突變的幽門螺桿菌基因的突變中分離了191個(gè)氨芐青霉素抗性的大腸桿菌質(zhì)粒克隆。從大腸桿菌中分離這192個(gè)質(zhì)粒并用于幽門螺桿菌菌株69A的再轉(zhuǎn)化。從這些在編碼分泌蛋白的基因中可能突變了的192個(gè)轉(zhuǎn)化中分離了135個(gè)幽門螺桿菌突變體。然后在對(duì)已喪失結(jié)合Kato III上皮細(xì)胞能力的幽門螺桿菌突變體的篩選檢測(cè)中檢測(cè)幽門螺桿菌突變體群。
為此，用FITC標(biāo)記突變體并在37℃同上皮細(xì)胞培養(yǎng)1小時(shí)。通過用一熒光顯微鏡觀察直接進(jìn)行粘附檢測(cè)。在這種情況下發(fā)現(xiàn)了2個(gè)表現(xiàn)出粘附性大大降低的突變體(P1-140和P1-179a號(hào))。
兩個(gè)突變體在第二個(gè)粘附模型即人胃的組織切片中也表現(xiàn)出缺乏粘附性。幽門螺桿菌野生型菌株和所有其它突變體在這個(gè)模型中仍表現(xiàn)出了強(qiáng)的粘附性。
在圖1中展示了用來制備突變體菌株P(guān)1-140的質(zhì)粒pMu140。質(zhì)粒pMu179a(未示)用來制備突變體菌株P(guān)1-179a。兩個(gè)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到幽門螺桿菌69A中導(dǎo)致證明在細(xì)菌染色體中無二次突變發(fā)生的確定的粘附缺陷，而不是在克隆的粘附素基因中TnMax9的插入導(dǎo)致所觀察到的幽門螺桿菌突變體表型。由轉(zhuǎn)座子TnMax9滅活的質(zhì)粒克隆pMu140和pMu179基因的作圖和測(cè)序表明兩個(gè)克隆是同樣的基因，只是轉(zhuǎn)座子被插入不同的位點(diǎn)。因?yàn)樗幋a的蛋白是一種脂蛋白，即由一脂質(zhì)錨錨定在膜中的蛋白質(zhì)，故對(duì)應(yīng)的基因被稱為AlpA(粘附相關(guān)脂蛋白A)。我們從膜蛋白和某些保守蛋白在蛋白C-末端序列(C-末端苯丙氨酸；struyve等，1991)的計(jì)算機(jī)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)所得的資料支持嵌入革蘭氏陰性細(xì)菌外膜的整合膜蛋白的觀點(diǎn)。
實(shí)施例3alpB粘附基因的鑒定在AlpB基因位點(diǎn)的遺傳學(xué)鑒定過程中，將側(cè)翼基因組序列克隆到大腸桿菌中并測(cè)序。通過從幽門螺桿菌染色體反克隆(back-cloning)TnMax9插入實(shí)現(xiàn)下游alpA側(cè)翼區(qū)域的克隆。用限制性內(nèi)切酶SalI和StuI切割突變體P1-179a(見實(shí)施例2)的染色體DNA，用T4連接酶將所形成的DNA片段同來自質(zhì)粒pBluescript II KS多接頭的SacI-Hinc II片段環(huán)化，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E131感受態(tài)細(xì)胞中，并用氯霉素篩選。
由于只有通過TnMax9在染色體中插入的復(fù)制起點(diǎn)orifd和定位在TnMax9中的氯霉素抗性基因才能發(fā)生復(fù)制與增殖，故所獲得的所有轉(zhuǎn)化子均應(yīng)含有突變的alpA基因并具有側(cè)翼序列。進(jìn)一步分析了所獲重組質(zhì)粒中的一個(gè)pMT5(圖2)。
pMT5的測(cè)序和由此構(gòu)建的亞克隆表明在alpA基因后(終止密碼子后67個(gè)核苷酸)有另一個(gè)編碼一個(gè)518個(gè)氨基酸的多肽并被稱為alpB(序列號(hào)1和2)開放讀框的起點(diǎn)?；谶z傳學(xué)結(jié)構(gòu)，可以設(shè)想一個(gè)操縱子、alpA和alpB可能由同一個(gè)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄(多順反子mRNA)。
AlpB基因產(chǎn)物具有與AlpA完全相同數(shù)目的氨基酸。AlpB多肽序列N-末端區(qū)的分析表明存在一個(gè)經(jīng)典的代表分泌性多肽的原核信號(hào)序列。AlpA和AlpB之間在氨基酸水平上的比較顯示全部多肽有46％的相同性。C-末端部分(氨基酸341-518)顯示66％的相同性(圖3)。
實(shí)施例4粘附基因AlpA和AlpB之間的功能聯(lián)系為了研究AlpA和AlpB之的功能聯(lián)系，在alpB基因的不同位點(diǎn)上(位點(diǎn)97和位點(diǎn)1108)引入兩個(gè)TnMax9轉(zhuǎn)座子插入并通過自然轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入幽門螺桿菌69a的基因組中。通過DNA印跡雜交證實(shí)轉(zhuǎn)座子在幽門螺桿菌染色體中的正確插入以及因而alpB基因的失活。
分析所獲得的alpB缺陷突變體結(jié)合胃上皮細(xì)胞的能力。發(fā)現(xiàn)兩種alpB突變體不結(jié)合來自組織切片的胃上皮細(xì)胞。
通過免疫印跡能夠證實(shí)AlpA在alpB突變體中的穩(wěn)定表達(dá)。這表明，AlpB直接負(fù)責(zé)alpB突變體的粘附缺陷。作為結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和兩種多肽C-末端區(qū)域高度同源性的結(jié)果，可以設(shè)想AlpB也是被插入到細(xì)菌外膜中而存在，并且可能與AlpA形成一個(gè)復(fù)合物。這個(gè)復(fù)合物可能以一個(gè)異二聚體或多聚體的集合物作為有效的功能性粘附素。而一個(gè)亞單位無論AlpA或AlpB的缺失都導(dǎo)致粘附素復(fù)合物功能的喪失，因而可以引起細(xì)菌的粘附缺陷。
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序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人(A)姓名Max-Planck-Gesellschaft zur Foerderung derWissenschaften e.V.Berlin(B)街Hofgartenstr.2(C)城市慕尼黑
(E)國(guó)家德國(guó)(F)郵政編碼80539(ii)發(fā)明題目來自幽門螺桿菌的新型粘附素(iii)序列數(shù)4(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release #1.0，版本#1.30(EPA)(2)序列號(hào)1的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1557個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)成線類型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型基因組DNA(vi)初始來源(A)生物幽門螺桿菌(vii)直接來源(B)克隆alpB(ix)特征(A)名稱CDS
(B)位置1..1554(xi)序列描述序列號(hào)1ATG ACA CAA TCT CAA AAA GTA AGA TTC TTA GCC CCT TTA AGC CTA GCG48Met Thr Gln Ser Gln Lys Val Arg Phe Leu Ala Pro Leu Ser Leu Ala1 5 10 15TTA AGC TTG AGC TTC AAT CCA GTG GGC GCT GAA GAA GAT GGG GGC TTT96Leu Ser Leu Ser Phe Ash Pro Val Gly Ala Glu Glu Asp Gly Gly Phe20 25 30ATG ACC TTT GGG TAT GAA TTA GGT CAG GTG GTC CAA CAA GTG AAA AAC 144Met Thr Phe Gly Tyr Glu Leu Gly Gln Val Val Gln Gln Val Lys Asn35 40 45CCG GGT AAA ATC AAA GCC GAA GAA TTA GCC GGC TTG TTA AAC TCT ACC 192Pro Gly Lys Ile Lys Ala Glu Glu Leu Ala Gly Leu Leu Asn Ser Thr50 55 60ACA ACA AAC AAC ACC AAT ATC AAT ATT GCA GGC ACA GGA GGC AAT GTC 240Thr Thr Asn Ash Thr Asn Ile Asn Ile Ala Gly Thr Gly Gly Asn Val65 70 75 80GCC GGG ACT TTG GGC AAC CTT TTT ATG AAC CAA TTA GGC AAT TTG ATT 288Ala Gly Thr Leu Gly Asn Leu Phe Met Asn Gln Leu Gly Asn Leu Ile85 90 95GAT TTG TAT CCC ACT TTG AAC ACT AGT AAT ATC ACA CAA TGT GGC ACT 336Asp Leu Tyr Pro Thr Leu Asn Thr Ser Asn Ile Thr Gln Cys Gly Thr100 105 110ACT AAT AGT GGT AGT AGT AGT AGT GGT GGT GGT GCG GCC ACA GCC GCT 384Thr Asn Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Gly Gly Ala Ala Thr Ala Ala115 120 125GCT ACT ACT AGC AAT AAG CCT TGT TTC CAA GGT AAC CTG GAT CTT TAT 432Ala Thr Thr Ser Asn Lys Pro Cys Phe Gln Gly Asn Leu Asp Leu Tyr130 135 140AGA AAA ATG GTT GAC TCT ATC AAA ACT TTG AGT CAA AAC ATC AGC AAG 480Arg Lys Met Val Asp Ser Ile Lys Thr Leu Ser Gln Asn Ile Ser Lys145 150 155 160AAT ATC TTT CAA GGC AAC AAC AAC ACC ACG AGC CAA AAT CTC TCC AAC 528Asn Ile Phe Gln Gly Asn Asn Asn Thr Thr Ser Gln Asn Leu Ser Asn165 170 175CAG CTC AGT GAG CTT AAC ACC GCT AGC GTT TAT TTG ACT TAC ATG AAC 576Gln Leu Ser Glu Leu Asn Thr Ala Ser Val Tyr Leu Thr Tyr Met Asn180 185 190TCG TTC TTA AAC GCC AAT AAC CAA GCG GGT GGG ATT TTT CAA AAC AAC 624Ser Phe Leu Asn Ala Asn Asn Gln Ala Gly Gly Ile Phe Gln Asn Asn195 200 205ACT AAT CAA GCT TAT GGA AAT GGG GTT ACC GCT CAA CAA ATC GCT TAT 672Thr Asn Gln Ala Tyr Gly Asn Gly Val Thr Ala Gln Gln Ile Ala Tyr210 215 220ATC CTA AAG CAA GCT TCA ATC ACT ATG GGG CCA AGC GGT GAT AGC GGT 720Ile Leu Lys Gln Ala Ser Ile Thr Met Gly Pro Ser Gly Asp Ser Gly225 230 235 240GCT GCC GCA GCG TTT TTG GAT GCC GCT TTA GCG CAA CAT GTT TTC AAC 768Ala Ala Ala Ala Phe Leu Asp Ala Ala Leu Ala Gln His Val Phe Asn245 250 255TCC GCT AAC GCC GGG AAC GAT TTG AGC GCT AAG GAA TTC ACT AGC TTG 816Ser Ala Asn Ala Gly Asn Asp Leu Ser Ala Lys Glu Phe Thr Ser Leu260 265 270GTG CAA AAT ATC GTC AAT AAT TCT CAA AAC GCT TTA ACG CTA GCC AAC 864Val Gln Asn Ile Val Asn Asn Ser Gln Asn Ala Leu Thr Leu Ala Asn275 280 285AAC GCT AAC ATC AGC AAT TCA ACA GGC TAT CAA GTG AGC TAT GGC GGG 912Asn Ala Asn Ile Ser Asn Ser Thr Gly Tyr Gln Val Ser Tyr Gly Gly290 295 300AAT ATT GAT CAA GCG CGA TCT ACC CAA CTA TTA AAC AAC ACC ACA AAC 960Asn Ile Asp Gln Ala Arg Ser Thr Gln Leu Leu Asn Asn Thr Thr Asn305 310 315 320ACT TTG GCT AAA GTT AGC GCT TTG AAT AAC GAG CTT AAA GCT AAC CCA 1008Thr Leu Ala Lys Val Ser Ala Leu Asn Asn Glu Leu Lys Ala Asn Pro325 330 335TGG CTT GGG AAT TTT GCC GCC GGT AAC AGC TCT CAA GTG AAT GCG TTT 1056Trp Leu Gly Asn Phe Ala Ala Gly Asn Ser Ser Gln Val Asn Ala Phe340 345 350AAC GGG TTT ATC ACT AAA ATC GGT TAC AAG CAA TTC TTT GGG GAA AAC 1104Asn Gly Phe Ile Thr Lys Ile Gly Tyr Lys Gln Phe Phe Gly Glu Asn355 360 365AAG AAT GTG GGC TTA CGC TAC TAC GGC TTC TTC AGC TAT AAC GGC GCG 1152Lys Asn Val Gly Leu Arg Tyr Tyr Gly Phe Phe Ser Tyr Asn Gly Ala370375 380GGC GTG GGT AAT GGC CCT ACT TAC AAT CAA GTC AAT TTG CTC ACT TAT 1200Gly Val Gly Asn Gly Pro Thr Tyr Asn Gln Val Asn Leu Leu Thr Tyr385 390 395 400GGG GTG GGG ACT GAT GTG CTT TAC AAT GTG TTT AGC CGC TCT TTT GGT 1248Gly Val Gly Thr Asp Val Leu Tyr Asn Val Phe Ser Arg Ser Phe Gly405 410 415AGT AGG AGT CTT AAT GCG GGC TTC TTT GGG GGG ATC CAA CTC GCA GGG 1296Ser Arg Ser Leu ASn Ala Gly Phe Phe Gly Gly Ile Gln Leu Ala Gly420 425 430GAT ACT TAC ATC AGC ACG CTA AGA AAC AGC TCT CAG CTT GCG AGC AGA 1344Asp Thr Tyr Ile Ser Thr Leu Arg Asn Ser Ser Gln Leu Ala Ser Arg435 440 445CCT ACA GCG ACG AAA TTC CAA TTC TTG TTT GAT GTG GGC TTA CGC ATG 1392Pro Thr Ala Thr Lys Phe Gln Phe Leu Phe Asp Val Gly Leu Arg Met450 455 460AAC TTT GGT ATC TTG AAA AAA GAC TTG AAA AGC CAT AAC CAG CAT TCT 1440Asn Phe Gly Ile Leu Lys Lys Asp Leu Lys Ser His Asn Gln His Ser465 470 475 480ATA GAA ATC GGT GTG CAA ATC CCT ACG ATT TAC AAC ACT TAC TAT AAA 1488Ile Glu Ile Gly Val Gln Ile Pro Thr Ile Tyr Asn Thr Tyr Tyr Lys485 490 495GCT GGC GGT GCT GAA GTG AAA TAC TTC CGC CCT TAT AGC GTG TAT TGG 1536Ala Gly Gly Ala Glu Val Lys Tyr Phe Arg Pro Tyr Ser Val Tyr Trp500 505 510GTC TAT GGC TAC GCC TTC TAA 1557Val Tyr Gly Tyr Ala Phe515
(2)序列號(hào)2的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度；518個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述序列號(hào)2Met Thr Gln Ser Gln Lys Val Arg Phe Leu Ala Pro Leu Ser Leu Ala1 5 10 15Leu Ser Leu Ser Phe Asn Pro Val Gly Ala Glu Glu Asp Gly Gly Phe20 25 30Met Thr Phe Gly Tyr Glu Leu Gly Gln Val Val Gln Gln Val Lys Asn35 40 45Pro Gly Lys Ile Lys Ala Glu Glu Leu Ala Gly Leu Leu Asn Ser Thr50 55 60Thr Thr Asn Asn Thr Asn Ile Asn Ile Ala Gly Thr Gly Gly Asn Val65 70 75 80Ala Gly Thr Leu Gly Asn Leu Phe Met Asn Gln Leu Gly Asn Leu Ile85 90 95Asp Leu Tyr Pro Thr Leu Asn Thr Ser Asn Ile Thr Gln Cys Gly Thr100 105 110Thr Asn Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Gly Gly Ala Ala Thr Ala Ala115 120 125Ala Thr Thr Ser Asn Lys Pro Cys Phe Gln Gly Asn Leu Asp Leu Tyr130 135 140Arg Lys Met Val Asp Ser Ile Lys Thr Leu Ser Gln Asn Ile Ser Lys145 150 155 160Asn Ile Phe Gln Gly Asn Asn Asn Thr Thr Ser Gln Asn Leu Ser Asn165 170 175Gln Leu Ser Glu Leu Asn Thr Ala Ser Val Tyr Leu Thr Tyr Met Asn180 185 190Ser Phe Leu Asn Ala Asn Asn Gln Ala Gly Gly Ile Phe Gln Asn Asn195 200 205Thr Asn Gln Ala Tyr Gly Asn Gly Val Thr Ala Gln Gln Ile Ala Tyr210 215 220Ile Leu Lys Gln Ala Ser Ile Thr Met Gly Pro Ser Gly Asp Ser Gly225 230 235 240Ala Ala Ala Ala Phe Leu Asp Ala Ala Leu Ala Gln His Val Phe Asn245 250 255Ser Ala Asn Ala Gly Asn Asp Leu Ser Ala Lys Glu Phe Thr Ser Leu260 265 270Val Gln Asn Ile Val Asn Asn Ser Gln Asn Ala Leu Thr Leu Ala Asn275 280 285Asn Ala Asn Ile Ser Asn Ser Thr Gly Tyr Gln Val Ser Tyr Gly Gly290 295 300Asn Ile Asp Gln Ala Arg Ser Thr Gln Leu Leu Asn Asn Thr Thr Asn305 310 315 320Thr Leu Ala Lys Val Ser Ala Leu Asn Asn Glu Leu Lys Ala Asn Pro325 330 335Trp Leu Gly Asn Phe Ala Ala Gly Asn Ser Ser Gln Val Asn Ala Phe340 345 350Asn Gly Phe Ile Thr Lys Ile Gly Tyr Lys Gln Phe Phe Gly Glu Asn355 360 365Lys Asn Val Gly Leu Arg Tyr Tyr Gly Phe Phe Ser Tyr Asn Gly Ala370 375 380Gly Val Gly Asn Gly Pro Thr Tyr Asn Gln Val Asn Leu Leu Thr Tyr385 390 395 400Gly Val Gly Thr Asp Val Leu Tyr Asn Val Phe Ser Arg Ser Phe Gly405 410 415Ser Arg Ser Leu Asn Ala Gly Phe Phe Gly Gly Ile Gln Leu Ala Gly420 425 430Asp Thr Tyr Ile Ser Thr Leu Arg Asn Ser Ser Gln Leu Ala Ser Arg435 440 445Pro Thr Ala Thr Lys Phe Gln Phe Leu Phe Asp Val Gly Leu Arg Met450 455 460Asn Phe Gly Ile Leu Lys Lys Asp Leu Lys Ser His Asn Gln His Ser465 470 475 480Ile Glu Ile Gly Val Gln Ile Pro Thr Ile Tyr Asn Thr Tyr Tyr Lys485 490 495Ala Gly Gly Ala Glu Val Lys Tyr Phe Arg Pro Tyr Ser Val Tyr Trp500 505 510val Tyr G1y Tyr Ala phe515(2)序列號(hào)3的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1557個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)成線類型雙鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型基因組DNA(vi)初始來源(A)生物幽門螺桿菌(vii)直接來源(B)克隆alpA(ix)特征(A)名稱CDS(B)位置1..1554(xi)序列描述序列號(hào)3ATG ATA AAA AAG AAT AGA ACG CTG TTT CTT AGT CTA GCC CTT TGC GCT48Met Ile Lys Lys Asn Arg Thr Leu Phe Leu Ser Leu Ala Leu Cys Ala520 525 530AGC ATA AGT TAT GCC GAA GAT GAT GGA GGG TTT TTC ACC GTC GGT TAT96Ser Ile Ser Tyr Ala Glu Asp Asp Gly Gly Phe Phe Thr Val Gly Tyr535 540 545 550CAG CTC GGG CAA GTC ATG CAA GAT GTC CAA AAC CCA GGC GGC GCT AAA 144Gln Leu Gly Gln Val Met Gln Asp Val Gln Asn Pro Gly Gly Ala Lys555 560 565AGC GAC GAA CTC GCC AGA GAG CTT AAC GCT GAT GTA ACG AAC AAC ATT 192Ser Asp Glu Leu Ala Arg Glu Leu Asn Ala Asp Val Thr Asn Asn Ile570 575 580TTA AAC AAC AAC ACC GGA GGC AAC ATC GCA GGG GCG TTG AGT AAC GCT 240Leu Asn Asn Asn Thr Gly Gly Asn Ile Ala Gly Ala Leu Ser Asn Ala585 590 595TTC TCC CAA TAC CTT TAT TCG CTT TTA GGG GCT TAC CCC ACA AAA CTC 288Phe Ser Gln Tyr Leu Tyr Ser Leu Leu Gly Ala Tyr Pro Thr Lys Leu600 605 610AAT GGT AGC GAT GTG TCT GCG AAC GCT CTT TTA AGT GGT GCG GTA GGC 336Asn Gly Ser Asp Val Ser Ala Asn Ala Leu Leu Ser Gly Ala Val Gly615 620 625 630TCT GGG ACT TGT GCG GCT GCA GGG ACG GCT GGT GGC ACT TCT CTT AAC 384Ser Gly Thr Cys Ala Ala Ala Gly Thr Ala Gly Gly Thr Ser Leu Asn635 640 645ACT CAA AGC ACT TGC ACC GTT GCG GGC TAT TAC TGG CTC CCT AGC TTG 432Thr Gln Ser Thr Cys Thr Val Ala Gly Tyr Tyr Trp Leu Pro Ser Leu650 655 660ACT GAC AGG ATT TTA AGC ACG ATC GGC AGC CAG ACT AAC TAC GGC ACG 480Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Ile Gly Ser Gln Thr Asn Tyr Gly Thr665 670 675AAC ACC AAT TTC CCC AAC ATG CAA CAA CAG CTC ACC TAC TTG AAT GCG 528Asn Thr Asn Phe Pro Asn Met Gln Gln Gln Leu Thr Tyr Leu Asn Ala680 685 690GGG AAT GTG TTT TTT AAT GCG ATG AAT AAG GCT TTA GAG AAT AAG AAT 576Gly Asn Val Phe Phe Asn Ala Met Asn Lys Ala Leu Glu Asn Lys Asn695 700 705 710GGA ACT AGT AGT GCT AGT GGA ACT AGT GGT GCG ACT GGT TCA GAT GGT 624Gly Thr Ser Ser Ala Ser Gly Thr Ser Gly Ala Thr Gly Ser Asp Gly715 720 725CAA ACT TAC TCC ACA CAA GCT ATC CAA TAC CTT CAA GGC CAA CAA AAT 672Gln Thr Tyr Ser Thr Gln Ala Ile Gln Tyr Leu Gln Gly Gln Gln Asn730 735 740ATC TTA AAT AAC GCA GCG AAC TTG CTC AAG CAA GAT GAA TTG CTC TTA 720Ile Leu Asn Asn Ala Ala Asn Leu Leu Lys Gln Asp Glu Leu Leu Leu745 750 755GAA GCT TTC AAC TCT GCC GTA GCC GCC AAC ATT GGG AAT AAG GAA TTC 768Glu Ala Phe Asn Ser Ala Val Ala Ala Asn Ile Gly Asn Lys Glu Phe760 765 770AAT TCA GCC GCT TTT ACA GGT TTG GTG CAA GGC ATT ATT GAT CAA TCT 816Asn Ser Ala Ala Phe Thr Gly Leu Val Gln Gly Ile Ile Asp Gln Ser775 780 785 790CAA GCG GTT TAT AAC GAG CTC ACT AAA AAC ACC ATT AGC GGG AGT GCG 864Gln Ala Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Asn Thr Ile Ser Gly Ser Ala795 800 805GTT ATT AGC GCT GGG ATA AAC TCC AAC CAA GCT AAC GCT GTG CAA GGG 912Val Ile Ser Ala Gly Ile Asn Ser Asn Gln Ala Asn Ala Val Gln Gly810 815 820CGC GCT AGT CAG CTC CCT AAC GCT CTT TAT AAC GCG CAA GTA ACT TTG 960Arg Ala Ser Gln Leu Pro Asn Ala Leu Tyr Asn Ala Gln Val Thr Leu825 830 835GAT AAA ATC AAT GCG CTC AAT AAT CAA GTG AGA AGC ATG CCT TAC TTG 1008Asp Lys Ile Asn Ala Leu Asn Asn Gln Val Arg Ser Met Pro Tyr Leu840 845 850CCC CAA TTC AGA GCC GGG AAC AGC CGT TCA ACG AAT ATT TTA AAC GGG 1056Pro Gln Phe Arg Ala Gly Asn Ser Arg Ser Thr Asn Ile Leu Asn Gly855 860 865 870TTT TAC ACC AAA ATA GGC TAT AAG CAA TTC TTC GGG AAG AAA AGG AAT 1104Phe Tyr Thr Lys Ile Gly Tyr Lys Gln Phe Phe Gly Lys Lys Arg Asn875 880 885ATC GGT TTG CGC TAT TAT GGT TTC TTT TCT TAT AAC GGA GCG AGC GTG 1152Ile Gly Leu Arg Tyr Tyr Gly Phe Phe Ser Tyr Asn Gly Ala Ser Val890 895 900GGC TTT AGA TCC ACT CAA AAT AAT GTA GGG TTA TAC ACT TAT GGG GTG 1200Gly Phe Arg Ser Thr Gln Asn Asn Val Gly Leu Tyr Thr Tyr Gly Val905 910 915GGG ACT GAT GTG TTG TAT AAC ATC TTT AGC CGC TCC TAT CAA AAC CGC 1248Gly Thr Asp Val Leu Tyr Asn Ile Phe Ser Arg Ser Tyr Gln Asn Arg920 925 930TCT GTG GAT ATG GGC TTT TTT AGC GGT ATC CAA TTA GCC GGT GAG ACC 1296Ser Val Asp Met Gly Phe Phe Ser Gly Ile Gln Leu Ala Gly Glu Thr935 940 945 950TTC CAA TCC ACG CTC AGA GAT GAC CCC AAT GTG AAA TTG CAT GGG AAA 1344Phe Gln Ser Thr Leu Arg Asp Asp Pro Asn Val Lys Leu His Gly Lys955 960 965ATC AAT AAC ACG CAC TTC CAG TTC CTC TTT GAC TTC GGT ATG AGG ATG 1392Ile Asn Asn Thr His Phe Gln Phe Leu Phe Asp Phe Gly Met Arg Met970 975 980AAC TTC GGT AAG TTG GAC GGG AAA TCC AAC CGC CAC AAC CAG CAC ACG 1440Asn Phe Gly Lys Leu Asp Gly Lys Ser Asn Arg His Asn Gln His Thr985 990 995GTG GAA TTT GGC GTA GTG GTG CCT ACG ATT TAT AAC ACT TAT TAC AAA 1488Val Glu Phe Gly Val Val Val Pro Thr Ile Tyr Asn Thr Tyr Tyr Lys100010051010TCA GCA GGG ACT-ACC GTG AAG TAT TTC CGT CCT TAT AGC GTT TAT TGG 1536Ser Ala Gly Thr Thr Val Lys Tyr Phe Arg Pro Tyr Ser Val Tyr Trp1015102010251030TCT TAT GGG TAT TCA TTC TAA 1557Ser Tyr Gly Tyr Ser Phe1035(2)序列號(hào)4的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度518個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述序列號(hào)4Met Ile Lys Lys Asn Arg Thr Leu Phe Leu Ser Leu Ala Leu Cys Ala1 5 10 15Ser Ile Ser Tyr Ala Glu Asp Asp Gly Gly Phe Phe Thr Val Gly Tyr20 25 30Gln Leu Gly Gln Val Met Gln Asp Val Gln Asn Pro Gly Gly Ala Lys35 40 45Ser Asp Glu Leu Ala Arg Glu Leu Asn Ala Asp Val Thr Asn Asn Ile50 55 60Leu Asn Asn Asn Thr Gly Gly Asn Ile Ala Gly Ala Leu Ser Asn Ala65 70 75 80Phe Ser Gln Tyr Leu Tyr Ser Leu Leu Gly Ala Tyr Pro Thr Lys Leu85 90 95Ash Gly Ser Asp Val Ser Ala Asn Ala Leu Leu Ser Gly Ala Val Gly100 105 110Ser Gly Thr Cys Ala Ala Ala Gly Thr Ala Gly Gly Thr Ser Leu Asn115 120 125Thr Gln Ser Thr Cys Thr Val Ala Gly Tyr Tyr Trp Leu Pro Ser Leu130 135140Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Ile Gly Ser Gln Thr Asn Tyr Gly Thr145 150 155 160ASn Thr Asn Phe Pro Asn Met Gln Gln Gln Leu Thr Tyr Leu Asn Ala165 170 175Gly Asn Val Phe Phe Asn Ala Met Asn Lys Ala Leu Glu Asn Lys ASn180 185 190Gly Thr Ser Ser Ala Ser Gly Thr Ser Gly Ala Thr Gly Ser Asp Gly195 200 205Gln Thr Tyr Ser Thr Gln Ala Ile Gln Tyr Leu Gln Gly Gln Gln Asn210 215 220Ile Leu Asn Asn Ala Ala Asn Leu Leu Lys Gln Asp Glu Leu Leu Leu225 230 235 240Glu Ala Phe Asn Ser Ala Val Ala Ala Asn Ile Gly Asn Lys Glu Phe245 250 255Asn Ser Ala Ala Phe Thr Gly Leu Val Gln Gly Ile Ile Asp Gln Ser260 265 270Gln Ala Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Asn Thr Ile Ser Gly Ser Ala275 280 285Val Ile Ser Ala Gly Ile Asn Ser Asn Gln Ala Asn Ala Val Gln Gly290 295 300Arg Ala Ser Gln Leu Pro Asn Ala Leu Tyr Asn Ala Gln Val Thr Leu305 310 315 320Asp Lys Ile Asn Ala Leu Asn Asn Gln Val Arg Ser Met Pro Tyr Leu325 330 335Pro Gln Phe Arg Ala Gly Asn Ser Arg Ser Thr Asn Ile Leu Asn Gly340 345 350Phe Tyr Thr Lys Ile Gly Tyr Lys Gln Phe Phe Gly Lys Lys Arg Asn355 360 365Ile Gly Leu Arg Tyr Tyr Gly Phe Phe Ser Tyr Asn Gly Ala Ser Val370 375 380Gly Phe Arg Ser Thr Gln Asn Asn Val Gly Leu Tyr Thr Tyr Gly Val385 390 395 400Gly Thr Asp Val Leu Tyr Asn Ile Phe Ser Arg Ser Tyr Gln Asn Arg405 410 415Ser Val Asp Met Gly Phe Phe Ser Gly Ile Gln Leu Ala Gly Glu Thr420 425 430Phe Gln Ser Thr Leu Arg Asp Asp Pro Asn Val Lys Leu His Gly Lys435 440 445Ile Asn Asn Thr His Phe Gln Phe Leu Phe Asp Phe Gly Met Arg Met450 455 460Asn Phe Gly Lys Leu Asp Gly Lys Ser Asn Arg His Asn Gln His Thr465 470 475 480Val Glu Phe Gly Val Val Val Pro Thr Ile Tyr Asn Thr Tyr Tyr Lys485 490 495Ser Ala Gly Thr Thr Val Lys Tyr Phe Arg Pro Tyr Ser Val Tyr Trp500 505 510Ser Tyr Gly Tyr Ser Phe515
BUDAPEST TREATY ON THE INTERNATIONALRECOGNTTION OF THE DEPOSTT OF MICROORGANISMSFOR THE PURPOSES OF PATENT PROCEDUREINTERNATIONAL FORMMax-planck-Institutfür BiologieSpemannstr.3472076 Tübingen RECEIPT IN THE CASE OF AN ORIGINAL DEPOSTTissued pursuant to Rule 7.1 by theINTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORTTYidentified at the bottom of this page
1where Rule 6.4(d)applies.such date Is the date on which the status of international depositary authority was nequired.Form DSM-BP/4(sole page)07/94
BUDAPEST TREATY ON THE INTERNATIONALRECOGNITION OF THE DEPOSIT OF MICROORGANISMSFOR THE PURPOSES OF PATENT PROCEDUREINTERNATIONAL FORMMax-Planck-Institutfür BiologieSpemannstr.3472076 TübingenVIABILITY STATEMENTissued pursuant to Rule 10.2 by theINTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITYidentified at the bottom of this page
1Indicate the date of original deposit or，where a new deposit or a transfer has been made，the most recent relevant date(date of the new deposit ordate of the transfer).2In the cases referred to in Rule 10.2(a)(ii)and(iii)，refer to the most recent vinbility test.3Mark with a cross the applicable box.4Fill in if the Information has been requested and if the results of the lest were negative.Form DSM-BP/9(sole page)07/94
BUDAPEST TREATY ON THE INTERNATIONALRECOGNITION OF THE DEPOSIT OF MICROORGANISMSFOR THE PURPOSES OF PATENT PROCEOUREINTERNATIONAL FORMMax-Planck-Institutfür BiologieSpemannstr.3472076 TübingenRECEIPT IN THE CASE OF AN ORIGINAL DEPOSITissued pursuaut to Rule 7.1 by theINTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITYidentified at the bottom of this page
1Where Rule 6.4(d)applies，such date is the date on which the status of international depositary authority was nequired.Form DSM-BP/4(sole pagc)07/94
BUDAPEST TREATY ON THE INTERNATIONALRECOGNITION OF THE DEPOSIT OF MICROORGANISMSFOR THE PURPOSES OF PATENT PROCEDUREINTERNATIONAL FORMMax-Planck-Institutfür BiologieSpemannstr.3472076 Tübingen VIABILITY STATEMENTissued pursuant to Rule 10.2 by theINTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITYidentified at the bottom af this page
1Indicate the date of original deposit or，where a new deposit or a transfer has been made，the most recent relevant date(date of the new deposit ordate of the transfer).2In the cases referred to in Rule 10.2(a)(ii)and(iii)，refer to the most recent vinbility test.3Mark with a cross the applicable box.4Fill in if the information has been requested and if the results of the lest were negative.Form DSM-BP/9(sole page)07/9權(quán)利要求
1.DNA分子，其包括(a)序列號(hào)1中所示的核苷酸序列(b)在遺傳密碼簡(jiǎn)并性的范圍內(nèi)與(a)的序列相應(yīng)的核苷酸序列或(c)在嚴(yán)格條件下與(a)或/和(b)的序列雜交的核苷酸序列。
2.權(quán)利要求1中所要求的DNA分子，其在核酸水平上與序列號(hào)1中所示的核苷酸序列具有至少80％的同源性。
3.權(quán)利要求1或2中所要求的DNA分子，其長(zhǎng)度具有至少15個(gè)核苷酸。
4.權(quán)利要求1至3中任何一項(xiàng)所要求的DNA分子，其編碼一種能夠粘附于人細(xì)胞的多肽。
5.權(quán)利要求1至4中任何一項(xiàng)所要求的DNA分子，其與下列序列融合(d)序列號(hào)3中所示的核苷酸序列(e)在遺傳密碼簡(jiǎn)并性的范圍內(nèi)與(d)的序列相應(yīng)的核苷酸序列或(f)在嚴(yán)格條件下與(d)或/和(e)的序列雜交的核苷酸序列。
6.載體，其含有至少一個(gè)拷貝的權(quán)利要求1至5中任何一項(xiàng)所要求的DNA分子。
7.細(xì)胞，其由權(quán)利要求6中所要求的載體轉(zhuǎn)化。
8.多肽，其由權(quán)利要求1至5中任何一項(xiàng)所要求的DNA分子編碼。
9.權(quán)利要求8中所要求的多肽，其包括(a)序列號(hào)2中所示的氨基酸序列(b)同來自(a)的序列至少80％同源的氨基酸序列(c)同(a)或/和(b)的序列有免疫學(xué)交叉反應(yīng)的氨基酸序列。
10.權(quán)利要求8或9中所要求的多肽，其能夠粘附于人的細(xì)胞。
11.多肽復(fù)合物，其含有至少兩種多肽成分，其中第一種成分是由權(quán)利要求1至4的任何一項(xiàng)中所要求的DNA分子編碼，第二種成分是由包括(d)序列號(hào)3中所示的核苷酸序列，(e)在遺傳密碼簡(jiǎn)并性的范圍內(nèi)與(d)的序列相應(yīng)的核苷酸序列或(f)在嚴(yán)格條件下與(d)或/和(c)的序列雜交的核苷酸序列的DNA分子編碼。
12.權(quán)利要求11中所要求的復(fù)合物，其第二種成分包括(a)序列號(hào)4中所示的氨基酸序列，(b)與序列(a)至少80％同源的氨基酸序列，(c)與(a)或/和(b)的序列有免疫學(xué)交叉反應(yīng)的氨基酸序列。
13.制備權(quán)利要求8到10中任何一項(xiàng)中所要求的多肽的方法，其中用權(quán)利要求1到5的任何一項(xiàng)中所要求的DNA分子或權(quán)利要求6中所要求的載體轉(zhuǎn)化一種細(xì)胞，在多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)所轉(zhuǎn)化的細(xì)胞并從細(xì)胞或/和培養(yǎng)上清中分離多肽。
14.權(quán)利要求8到10的任何一項(xiàng)中所要求的多肽作為免疫原來制備抗體的用途。
15.針對(duì)權(quán)利要求8到10的任何一項(xiàng)中所要求的多肽，或針對(duì)權(quán)利要求11或12中所要求的復(fù)合物的抗體。
16.權(quán)利要求15中所要求的抗體，其針對(duì)序列號(hào)2中所示氨基酸序列的N-末端。
17.藥物組合物，其含有權(quán)利要求1到5的任何一項(xiàng)中所要求的DNA分子、權(quán)利要求8到10的任何一項(xiàng)中所要求的多肽、權(quán)利要求11或12中所要求的多肽復(fù)合物或權(quán)利要求15或16中所要求的抗體作為活性成分，任選性地加入常用藥物輔助物質(zhì)、稀釋劑、添加劑和載體。
18.權(quán)利要求17中所要求的藥物組合物在幽門螺桿菌感染診斷中的應(yīng)用。
19.權(quán)利要求17中所要求的藥物組合物在制備用于預(yù)防或治療幽門螺桿菌感染的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種來自幽門螺桿菌的粘附基因、由其編碼的多肽和針對(duì)該多肽的抗體。
文檔編號(hào)C12N15/31GK1200763SQ96197802
公開日1998年12月2日 申請(qǐng)日期1996年9月20日 優(yōu)先權(quán)日1995年9月22日
發(fā)明者R·哈斯, S·奧登雷特, T·F·邁耶, A·比魯姆, I·科思塞斯拉茲 申請(qǐng)人:馬普科技促進(jìn)協(xié)會(huì)