專利名稱：：高等植物質(zhì)體中的核－編碼的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及植物基因工程，特別是高等植物中的質(zhì)體基因轉(zhuǎn)化。本發(fā)明提供了可用于不同植物種類中表達(dá)感興趣外源基因新的啟動子序列。發(fā)明領(lǐng)域葉綠體基因以包含質(zhì)體-編碼亞單位的RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄，其中的亞單位與大腸桿菌RNA聚合酶α，β及β′亞單位同源。該酶所用啟動子與大腸桿菌σ70-啟動子類似，包括-35和-10共同元件(G.L.Igloi和H.Kossel，植物科學(xué)的主要綜述10，525，1992；W.Gruissem和J.C.Tonkyn，植物科學(xué)的主要綜述12-19，1993)質(zhì)體編碼的RNA聚合酶對啟動子的選擇依賴于核編碼的sigma-樣因子((Link等1994，植物啟動子和轉(zhuǎn)錄因子，SpringerVerlag，Heidelberg，63-83頁)。另外，一些啟動子的轉(zhuǎn)錄活性由核編碼的與中心啟動子上游的元件相互作用的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控(L.A.Allison和P.Maliga，EMBO雜志143721-3730；R.Iratni，L.Baeza，A.Andreeva，R.Mache，S.Lerbs-Mache，基因Dev.8，2928，1994)。這些因子介導(dǎo)質(zhì)體基因表達(dá)的核調(diào)控，應(yīng)答于發(fā)育和環(huán)境的變化。已有關(guān)于質(zhì)體中另一個(gè)轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)存在的推測。然而，迄今為止還沒有支持這一推測的直接證據(jù)。質(zhì)體中另一新的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)的確認(rèn)代表了植物基因工程領(lǐng)域一個(gè)巨大的進(jìn)步。這樣的系統(tǒng)使用于質(zhì)體轉(zhuǎn)化的植物種類具有更大的自由度和范圍，并利于通過可由重組DNA技術(shù)操縱的構(gòu)建物進(jìn)行外源蛋白和RNAs的組織特異地表達(dá)。發(fā)明概述本發(fā)明提供了用于穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化多細(xì)胞植物質(zhì)體的DNA構(gòu)建物和萬法。本發(fā)明的DNA構(gòu)建物擴(kuò)展了能被轉(zhuǎn)化的植物種類范圍，并利于感興趣的外源基因的組織特異地表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了含有被核編碼的質(zhì)體(NEP)RNA聚合酶識別的新啟動子序列的DNA構(gòu)建物。DNA構(gòu)建物包括一個(gè)轉(zhuǎn)化DNA，后者包括定靶部分，用于插入至少一個(gè)感興趣的外源基因的至少一個(gè)克隆位點(diǎn)，感興趣的外源基因的表達(dá)由NEP聚合酶識別的啟動子調(diào)控，及質(zhì)體可選擇的標(biāo)記基因。增加感興趣的外源基因的表達(dá)的為質(zhì)體編碼的質(zhì)體(PEP)RNA聚合酶識別的啟動子因子的應(yīng)用是本發(fā)明的另一個(gè)方面。如上所述的構(gòu)建物，這些構(gòu)建物也包括一個(gè)定靶部分，和一個(gè)用于感興趣的外源基因表達(dá)的克隆位點(diǎn)。質(zhì)體編碼的質(zhì)體RNA聚合酶識別的啟動子特征存在于光合組織，如葉中。而本發(fā)明的核編碼的聚合酶轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)指導(dǎo)質(zhì)體基因的表達(dá)，亦存在于根，種子和分生組織中。大多數(shù)植物包括玉米，棉花和小麥中，植物的再生通過體細(xì)胞的胚胎產(chǎn)生完成(即，涉及分生組織)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案中，通過本發(fā)明的NEP質(zhì)體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，啟動子和聚合酶的應(yīng)用，大大便利了這些農(nóng)作物的有效的質(zhì)體轉(zhuǎn)化。本發(fā)明的NEP啟動子插入現(xiàn)有的質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體，其應(yīng)用方法，見如美國專利No.5,451,513及美國未決申請?zhí)?8/189,256，所述，和由Svab&Maliga所述，美國國家科學(xué)院院刊，90，913(1993)，其公開內(nèi)容均引入本文的參考文獻(xiàn)。為獲得轉(zhuǎn)基因植物，用可選的標(biāo)記基因轉(zhuǎn)化非光合組織的質(zhì)體，標(biāo)記基因由NEP啟動子表達(dá)，由核編碼的聚合酶轉(zhuǎn)錄。類似地，為表達(dá)感興趣的蛋白，用由核編碼的聚合酶轉(zhuǎn)錄的NEP啟動子，構(gòu)建用于非光合組織的高水平表達(dá)的表達(dá)試劑盒。本發(fā)明的另一方面中，本發(fā)明的PEP啟動子插入現(xiàn)有的質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體及其使用方法。本發(fā)明的另一方面，通過雙重NEP/PEP啟動子的使用，還將NEP轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)與σ70-型系統(tǒng)結(jié)合起來。附圖簡述圖1.煙草質(zhì)體基因組中定向基因置換造成的rpoB的缺失。(A)通過質(zhì)粒PLAA57中aadA側(cè)翼的質(zhì)體DNA序列同源重組(對角線)，導(dǎo)致野生型質(zhì)體基因組(ptDNA)中rpoB(Sacl至SmaI片段)為aadA序列取代。產(chǎn)生ΔrpoB質(zhì)體基因組(ΔrpoBptDNA)?？s寫rpoB，rpoC1，rpoC2是編碼大腸桿菌樣RNA聚合酶的β，β′，β″亞單位的質(zhì)體基因；aadA是一個(gè)嵌合的抗壯觀霉素基因。限制性酶識別位點(diǎn)P，PstI；Sm，SmaI；Sc，SacI。(B)色素缺乏與rpoB缺失相關(guān)。從來源于三個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化株(Nt-pLAA57-11B株，第1和2泳道；Nt-pLAA57-16B株，第3和4泳道；Nt-pLAA57-18C株，第5和6泳道)和野生型綠葉組織(Nt，第7泳道)的綠色(第1，3，5泳道)和白色(第2，4，6泳道)葉組織分離總細(xì)胞DNA。DNA用PstI進(jìn)行消化，膠印跡與含部分rpoC1(圖1A中的深黑線)的DNA片段(核苷酸位置ptDNA的22883-24486，按照K.Shinozaki，等(EMBO雜志5，2043，1986)編號)雜交。探針與野生基因組的一個(gè)9.0kb片段雜交，與來自ΔrpoBptDNA的一個(gè)4.2kb片段雜交。(C)DNA膠印跡分析確證了Nt-pLAA57-10A株的白色枝條(第2泳道)和來自同一株的嫁接嵌合植物的白色種子后代(第3泳道)中野生型ptDNA拷貝的缺失。野生型綠葉組織的DNA載于1泳道。注意ΔrpoB植物中野生型ptDNA片段的缺失。印跡制法同圖1B。圖2.rpoB的缺失導(dǎo)致色素缺乏的表型。(A)顯示了綠色野生型(左)，色素缺乏的ΔrpoB(右)，及嵌合(中)植物。(B)溫室中開花的嵌合植物。注意白色的葉緣表明第二葉層中的ΔrpoB質(zhì)體，它形成了種系細(xì)胞。圖3.(A)ΔrpoB植物葉肉細(xì)胞中的質(zhì)體(P)缺少系統(tǒng)的光合作用膜?？s寫N，核；V，囊(vesicles)；M，線粒體(B)為比較起見，顯示了具有類囊體膜(T)的野生型葉綠體(Cp)的電子顯微照片。(A)和(B)中的放大倍率均為7,800X。圖4.(上部分)ΔrpoB植物中質(zhì)體mRNA的積累(A)光合成基因和(B)遺傳系統(tǒng)基因。凝膠印跡由總細(xì)胞RNA制備(A，每泳道3微克；B，每泳道5微克)來自野生型(1，3，5泳道)及ΔrpoB(2，4，6泳道)葉組織，與指出的質(zhì)體基因序列雜交。(下部分)以上所示印跡再以25SrDNA序列探測。雜交信號通過一個(gè)分子動力學(xué)PhosphorImager定量，并使之標(biāo)準(zhǔn)化至25SrRNA信號。每泳道下顯示了對于每個(gè)探針野生型的信號強(qiáng)度高出ΔrpoB的倍數(shù)。圖5.ΔrpoB植物中轉(zhuǎn)錄從一個(gè)不規(guī)范啟動子開始。(A)用引物延伸分析來定位野生型(1，3泳道)和ΔrpoB(2，4泳道)植物中rbcL和16SrDNA轉(zhuǎn)錄本5′末端。初級轉(zhuǎn)錄本由圈標(biāo)出(野生型為空心，ΔrpoB為實(shí)心)，加工轉(zhuǎn)錄本由三角標(biāo)出。未知起源的轉(zhuǎn)錄本用星號標(biāo)出。用與引物延伸反應(yīng)中相同的引物產(chǎn)生伴隨的序列梯(加樣順序GATC)。每個(gè)延伸產(chǎn)物旁邊的數(shù)字標(biāo)出了距rboL編碼序列的第一個(gè)核苷酸和成熟的16SrRNA第一個(gè)核苷酸的距離。(B)定位野生型(第2泳道)和ΔrpoB(第3泳道)植物中的16SrRNA的初級轉(zhuǎn)錄本?？?cè)~RNA(20微克)體外加帽，帶帽的16SrRNA與互補(bǔ)的RNA探針雜交后通過RNA酶保護(hù)識別。帶帽保護(hù)的產(chǎn)物如(A)中標(biāo)出。第一泳道包括所示大小的標(biāo)準(zhǔn)RNA。(C)16SrDNA上游區(qū)的DNA序列和始于質(zhì)體編碼(σ70型，P1)和核編碼(P2)的聚合酶(P1，P2的名稱基于A.Vera和M.Sugiura，現(xiàn)代基因?qū)W27，280，1995)的啟動子的轉(zhuǎn)錄本。共同的啟動區(qū)(-35和-10)框出。起始位點(diǎn)如(A)和(B)中，以圈標(biāo)出。從16SrDNA編碼區(qū)上游的第一個(gè)核苷酸開始編號(煙草質(zhì)體基因組中，-1＝核苷酸102757)。圖6.野生型和ΔrpoB煙草葉中質(zhì)體mRNA的累積。質(zhì)體基因的印跡(見實(shí)施例I)如下分組。(A)野生型葉中mRNA顯著多于ΔrpoB植物的葉中。(B)野生型和ΔrpoB植物的葉中mRNA水平相當(dāng)，或(C)ΔrpoB葉中mRNA水平較高。凝膠印跡用來自野生型(第一泳道)和ΔrpoB(第二泳道)葉組織的總細(xì)胞RNA(每泳道3微克)制備，與所示質(zhì)體基因序列雜交。(較低的組)為控制載樣，上面所示的印跡再與25SrDNA序列雜交。圖7.定位野生型和ΔrpoB煙草葉中atpB轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。(A)引物延伸分析。由野生型(wt)和ΔrpoB(T57)樣品得到的末端標(biāo)記的引物延伸產(chǎn)物與用相同引物得到的同源序列并排跑膠。序列旁邊的數(shù)字指示距ATG翻譯起始位點(diǎn)的距離。從NEP和PEP得到的初級轉(zhuǎn)錄本分別以實(shí)心和空心圈標(biāo)出。(B)體外加帽和RNA酶保護(hù)試驗(yàn)來確認(rèn)初級轉(zhuǎn)錄本的5′末端。各泳道分別載以帶有(2，4)和不帶(1，5)保護(hù)的互補(bǔ)反義RNA的ΔrpoB(T57；1，2)和野生型(wt；4，5)RNA樣品。分子量(MW)標(biāo)記物(100，200，300，400和500核苷酸)載于第三泳道。(A)中轉(zhuǎn)錄本5′末端對應(yīng)于括號中保護(hù)的片段大小-254(277nt)，-289(311)。注意未保護(hù)的RNA樣品中出現(xiàn)在200nt標(biāo)記物稍下方的偽跡。(C)atpB-rbcL兩個(gè)基因間區(qū)的物理定位。atpBNEP和PEP啟動子的初級轉(zhuǎn)錄本5′末端的定位如(A)中標(biāo)出。圖8.定位野生型和ΔrpoB煙草葉中atpI轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。(A)引物延伸分析。由野生型(wt)和ΔrpoB(T57)樣品得到的末端標(biāo)記的引物延伸產(chǎn)物與用相同引物得到的同源序列并排跑膠。序列旁邊的數(shù)字指示距ATG翻譯起始位點(diǎn)的距離。從NEP和PEP得到的初級轉(zhuǎn)錄本分別以實(shí)心和空心圈標(biāo)出。(B)體外加帽和RNA酶保護(hù)試驗(yàn)來確認(rèn)初級轉(zhuǎn)錄本的5′末端。各泳道分別載以帶有(2，4)和不帶(1，5)保護(hù)的互補(bǔ)反義RNA的ΔrpoB(T57；1，2)和野生型(wt；4，5)RNA樣品。分子量(MW)標(biāo)記物(100，200，300，400和500核苷酸)載于第三泳道。(A)中轉(zhuǎn)錄本5′末端對應(yīng)于括號中保護(hù)的片段大小-130(235nt)，-207，209，212(303，305，309；未分離)。注意未保護(hù)的RNA樣品中出現(xiàn)在200nt標(biāo)記物稍下方的偽跡。(C)rps2-atpI兩個(gè)基因間區(qū)的物理定位。atpINEP和PEP啟動子的初級轉(zhuǎn)錄本5′末端的定位如(A)中標(biāo)出。圖9.定位野生型和ΔrpoB煙草葉中clpP轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。(A)引物延伸分析。由野生型(wt)和ΔrpoB(T57)樣品得到的末端標(biāo)記的引物延伸產(chǎn)物與用相同引物得到的同源序列并排跑膠。序列旁邊的數(shù)字指示距ATG翻譯起始位點(diǎn)的距離。從NEP和PEP得到的初級轉(zhuǎn)錄本分別以實(shí)心和空心圈標(biāo)出。(B)體外加帽和RNA酶保護(hù)試驗(yàn)來確認(rèn)初級轉(zhuǎn)錄本的5′末端。各泳道分別載以帶有(2，4)和不帶(1，5)保護(hù)的互補(bǔ)反義RNAΔrpoB(T57；1，2)和野生型(wt；4，5)RNA樣品。分子量(MW)標(biāo)記物(100，200，300，400和500核苷酸)載于第三泳道。(A)中轉(zhuǎn)錄本5′末端對應(yīng)于括號中保護(hù)的片段大小-53(96nt)，-95(138nt)，-173(216nt)，及-511(69nt)。注意未保護(hù)的RNA樣品中出現(xiàn)在200nt標(biāo)記物稍下方的偽跡。(C)clpP-psbB兩個(gè)基因間區(qū)的物理定位。clpPNEP和PEP啟動子的初級轉(zhuǎn)錄本5′末端的定位如(A)中標(biāo)出。圖10.定位野生型和ΔrpoB煙草葉中accD轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。(A)引物延伸分析。由野生型(wt)和ΔrpoB(T57)樣品得到的末端標(biāo)記的引物延伸產(chǎn)物與用相同引物得到的同源序列并排跑膠。序列旁邊的數(shù)字指示距ATG翻譯起始位點(diǎn)的距離。PaccD-129NEP啟動子的初級轉(zhuǎn)錄本以實(shí)心圈標(biāo)出。(B)體外加帽和RNA酶保護(hù)試驗(yàn)來確認(rèn)初級轉(zhuǎn)錄本的5′末端。各泳道分別載以帶有(2，4)和不帶(1，5)保護(hù)的互補(bǔ)反義的RNAΔrpoB(T57；1，2)和野生型(wt；4，5)RNA樣品。分子量(MW)標(biāo)記物(100，200，300，400和500核苷酸)載于第三泳道。(A)中-57轉(zhuǎn)錄本5′末端對應(yīng)于保護(hù)的103nt片段。注意未保護(hù)的RNA樣品中出現(xiàn)在200nt標(biāo)記物稍下方的人工產(chǎn)物。(C)accD-rbcL兩個(gè)基因間區(qū)的物理定位。標(biāo)出了PaccD-129NEP啟動子的初級轉(zhuǎn)錄本5′未端的定位。圖11.NEP啟動子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)側(cè)翼的DNA序列排列?？虺龆嘤诹鶎ζヅ涞暮塑账帷＾D(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)鄰近的共同序列在下面顯示。5′末端的位置以實(shí)心圈標(biāo)出。注意，Prps12-152和Prps16-107沒有加帽，可能不是初級轉(zhuǎn)錄本。圖12.通過識別不同的啟動子，NEP和PEP聚合酶提供了質(zhì)體基因選擇性轉(zhuǎn)錄的機(jī)制。注意一些基因只有PEP啟動子(光系統(tǒng)I和光系統(tǒng)II)，其它既有PEP，又有NEP啟動子(大多數(shù)管家基因)，或僅有NEP啟動子(accD)。圖13.NEP啟動子表達(dá)的嵌合質(zhì)體基因的系統(tǒng)圖。發(fā)明詳述若干報(bào)道認(rèn)為存在另外的，質(zhì)體中存在的，核編碼的RNA聚合酶(綜述于Gruissem和Tonkyn，1993；Igloi和Kossel，1992；Mullet，1993；Link，1994)。通過使編碼煙草大腸桿菌樣RNA聚合酶的必需β亞單位的rpoB基因缺失，另一個(gè)由核編碼的質(zhì)體轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)的存在得以證明(Allison等，1996，EMBO雜志152802-2809)。rpoB基因的缺失產(chǎn)生了光合作用缺陷的，色素缺乏的植物。對ΔrpoB植物葉肉細(xì)胞中的質(zhì)體超微結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)了原質(zhì)體樣細(xì)胞器，它缺乏作為具有光合作用活性的葉綠體的特點(diǎn)的堆積排列的類囊體膜。光合作用基因rbcL，psbA，及psbD的轉(zhuǎn)錄本很低，而rp116，atpI，及16SrDNA的mRNA則累加至相當(dāng)于野生型或高于野生型水平。光合作用基因轉(zhuǎn)錄本累加的缺乏歸因于σ70型啟動子活性的缺乏。野生型煙草葉中，核糖體RNA操縱子通常從σ70型啟動子轉(zhuǎn)錄，而ΔrpoB植物中，rRNA操縱子則由非σ70啟動子轉(zhuǎn)錄。rRNA操縱子是質(zhì)體編碼的和核編碼的質(zhì)體RNA聚合酶(分別為PEP和NEP)所識別的第一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位。其它基因的啟動子區(qū)的分析表明rRNA操縱子并非唯一。它是一大類質(zhì)體基因的一員，這類基因?qū)τ赑EP和NEP之每一至少有一個(gè)啟動子，并能被兩個(gè)質(zhì)體RNA聚合酶中的任意一個(gè)表達(dá)。另外，僅為NEP轉(zhuǎn)錄的質(zhì)體基因也被確認(rèn)。而且，數(shù)據(jù)表明在不同質(zhì)體型中有其它基因特異的機(jī)制調(diào)節(jié)NEP轉(zhuǎn)錄水平。已確認(rèn)了成熟的16SrRNA5′末端上游約62個(gè)堿基處的一個(gè)NEP轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。起始位點(diǎn)周圍的序列在眾多研究的植物種類中高度保守，與PEP啟動子共同序列無相似性。對核編碼的聚合酶的識別和結(jié)合很重要的NEP啟動子共同序列(與大腸桿菌型轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)-10和-35序列類似)優(yōu)選位于NEP轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)任一方向約50個(gè)核苷酸以內(nèi)。如實(shí)施例1中更詳細(xì)的描述，存在一些不同的NEP啟動子，有時(shí)發(fā)現(xiàn)NEP啟動子與PEP啟動子相連。本發(fā)明的聚合酶可通過色譜用標(biāo)準(zhǔn)方法純化。柱級分中的NEP聚合酶活性可用包括NEP啟動子區(qū)的DNA部分作為模板在體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中進(jìn)行測試。或者，NEP啟動子部分可結(jié)合于可通過某些方法(如磁珠)分離的基質(zhì)上?；|(zhì)結(jié)合的DNA與植物提取物在核編碼的聚合酶可與DNA結(jié)合的條件下溫育。然后從植物提取物中分離基質(zhì)/DNA/聚合酶復(fù)合物，結(jié)合的蛋白可被分離和鑒定。為了分離編碼核編碼的聚合酶的核基因或cDNA，通過以上述方法的任一種純化的蛋白可用于產(chǎn)生抗體來探測表達(dá)庫。分離NEP聚合酶的另一個(gè)途徑中，對啟動子部分具有特異親合性的蛋白可被分離，并通過微量測序測得N-末端的氨基酸序列。然后可利用氨基酸序列設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)?，用于基因分離的PCR引物。過去已知的質(zhì)體編碼的σ70型轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)的活性特征存在于光合作用活性組織，如葉中。而本發(fā)明的核編碼的聚合酶轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)還可指導(dǎo)根，種子和分生組織中的質(zhì)體基因的表達(dá)。大多數(shù)植物中，包括玉米，棉花和小麥，植物的再生是通過體細(xì)胞的胚胎生成(也就是說涉及分生組織)完成的。通過使用的本發(fā)明的NEP質(zhì)體轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，能使這些農(nóng)作物中進(jìn)行有效的質(zhì)體轉(zhuǎn)化，或大大促進(jìn)之。本發(fā)明的NEP啟動子可插入現(xiàn)有的質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體及其應(yīng)用方法中，如美國專利No.5,451,513和未決的美國申請No.08/189,256中所述，及Svab&Maliga所述，美國國家科學(xué)院院刊90，913(1993)，這些在本文均穿插于文獻(xiàn)中。為獲得轉(zhuǎn)基因植物，非光合作用組織的質(zhì)體以NEP啟動子表達(dá)的可選擇的標(biāo)記基因轉(zhuǎn)化，以核編碼的聚合酶轉(zhuǎn)錄。類似地，為表達(dá)感興趣的蛋白，在非光合作用組織中用核編碼的聚合酶轉(zhuǎn)錄的NEP啟動子構(gòu)建用于高水平表達(dá)的表達(dá)盒。通過使用雙重NEP/PEP啟動子，NEP轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)還可與σ70型系統(tǒng)相結(jié)合。在某些情況下，在光合作用組織中由NEP啟動子表達(dá)轉(zhuǎn)基因也是可以的。以下實(shí)施例I-III中的詳細(xì)描述闡明了制備和使用本發(fā)明的DNA構(gòu)建物及實(shí)施本發(fā)明的方法的優(yōu)選方法。任何未特殊指出的分子克隆和重組DNA技術(shù)均通過標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行，如，Ausubel(編輯)，分子生物學(xué)現(xiàn)行方法.JohnWiley&Sons，Inc.(1994)中通常提出的。以下非限制性的實(shí)施例更詳盡地描述了本發(fā)明。實(shí)施例1通過rpoB的缺失論證另一個(gè)不同的質(zhì)體轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)為在質(zhì)體中建立非大腸桿菌樣RNA聚合酶存在的模型，使大腸桿菌樣酶的必需亞單位之一的基因從煙草質(zhì)體基因組中缺失。然后測定突變質(zhì)體中的mRNA水平。數(shù)據(jù)提示，缺少質(zhì)體編碼的大腸桿菌樣酶時(shí)，一些光基因的表達(dá)顯著降低。而編碼基因表達(dá)器官的質(zhì)體基因的轉(zhuǎn)錄水平卻與野生型植物中類似。因此，非大腸桿菌樣RNA聚合酶選擇性地轉(zhuǎn)錄質(zhì)體基因的一個(gè)分支。這一轉(zhuǎn)錄器官不從典型的大腸桿菌σ70-啟動子啟動，而識別一個(gè)新的啟動子序列。實(shí)施例I的方法和材料質(zhì)粒的構(gòu)建.質(zhì)粒PLAA57是一個(gè)pBSKS+(Stratagene)衍生物，它將SacI帶到ptDNA的BamHI片段(核苷酸22658至29820)中。ptDNA嵌入物中，核苷酸24456與28192間的SacI至SmaIDNA片段，為嵌合的抗壯觀霉素(aadA)基因取代。aadA基因除psbA3′區(qū)較短并包含于所述(J.M.Staub和P.Maliga，植物學(xué)雜志6，547，1994)XbaI至DraI片段中外，與所述(Z.Svab和P.Maliga，美國國家科學(xué)院院刊90，913，1993)完全相同。植物的轉(zhuǎn)化.為進(jìn)行質(zhì)體轉(zhuǎn)化，以pLAA57DNA包被(Z.Svab和P.Maliga，美國國家科學(xué)院院刊90，913，1993)鎢粒，然后用DuPontPDS1000HeBiolistic槍1100p.s.i.將后者引入煙草屬植物葉中。在含500毫克/毫升壯觀霉素二鹽酸鹽的RMOP培養(yǎng)基上無菌挑選轉(zhuǎn)基因苗(Z.Svab，P.Hajdukiewicz，P.Maliga，美國國家科學(xué)院院刊87，8526，1990)。轉(zhuǎn)基因的切割物植于并維持在包括瓊脂糖固化的含3％蔗糖的MS鹽(T.Murashinge和F.Skoog，植物生理學(xué)15，493，1962)的RM培養(yǎng)基上。電子顯微照像.用來自生長于含3％蔗糖RM培養(yǎng)基的無菌培養(yǎng)液中的野生型和ΔrpoB插條之完全展開的葉進(jìn)行電子顯微照像。組織在2％戊二醛，0.2％蔗糖，0.1M磷酸鹽緩沖液(PH6.8)中室溫混合2小時(shí)，以0.2％蔗糖，0.1M磷酸鹽緩沖液洗三次?；旌系慕M織在1％四氧化鋨和0.2％蔗糖緩沖液中再混合，在乙醇中脫水，包埋于Spurr′s環(huán)氧樹脂中(硬)，切片，乙酸雙氧鈾和枸緣酸鉛染色以進(jìn)行電子顯微照像。凝膠印跡.總?cè)~DNA按所述方法(I.J.Mettler，植物分子生物學(xué)報(bào)告5，346，1987)制備，以限制性內(nèi)切酶PstI消化，在0.7％瓊脂糖凝膠上分離，用Posiblot轉(zhuǎn)移工具(Stratagene)轉(zhuǎn)移至HybondN(Amersham)。在迅速雜交緩沖液(Amersham)中65℃與任意引物標(biāo)記的片段過夜雜交?？?cè)~RNA按生產(chǎn)廠商的方法，用TRIzol(GIBCObBRL)制備。RNA在1％瓊脂糖/甲醛膠上電泳，然后轉(zhuǎn)移至尼龍膜上，按DNA印跡的方法探測。探針的合成.psbA，atpI，和rp116的雙鏈DNA探針以任意引物PCR產(chǎn)生的32P標(biāo)記的DNA片段來制備。用于PCR的引物序列及它們在煙草ptDNA中的位置(K.Shinozaki，等EMBO雜志5，2043，1986)如下psbA5′引物＝5′-CGCTTCTGTAACTGG-3′(互補(bǔ)于ptDNA的1550至1536位核苷酸)，3′引物＝5′-TGACTGTCAACTACAG-3′(667至682位核苷酸)，atpI，5′引物＝GTTCCATCAATACTG-3′(與核苷酸15985至15971互補(bǔ))，3′引物＝5′-GCCGCGGCTAAAGTT-3′(核苷酸15292至15306)；rp1165′引物＝5′-TCCCACGTTCAAGGT-3′(與核苷酸84244至84230互補(bǔ))，3′引物＝5′-TGAGTTCGTATAGGC-3′(核苷酸83685至83699)。為產(chǎn)生rbcL，psbD/C和16SrRNA的探針，以下限制性DNA片段進(jìn)行32p標(biāo)記rbcL，BamHI片段(ptDNA中核苷酸58047至59285)；psbD/C煙草psbD/C操縱子(核苷酸138447至140855)的SavII至HindII；16SRNA，E.coRI至E.coRV片段(ptDNA中核苷酸138447至140855)片段。煙草25SrRNA的探針來自質(zhì)粒pKDR1(D.Dempsey，K.W.Wobbe，D.F.Klessig，分子植物病理學(xué)83，1021，1993)包含一個(gè)來自在質(zhì)粒pBR325中克隆的煙草25S/18S位點(diǎn)的3.75kbEcoRI片段。當(dāng)與25SrRNA的凝膠印跡雜交時(shí)，32P標(biāo)記的雙鏈DNA探針與未標(biāo)記的質(zhì)粒pKDR1混合，對應(yīng)于存在于濾器上RNA量的2倍多。質(zhì)體基因組拷貝數(shù)校正DNA水平。為研究質(zhì)體基因組拷貝數(shù)的改變是否對基因表達(dá)的估側(cè)區(qū)別有貢獻(xiàn)，總細(xì)胞DNA和RNA從來自野生型和ΔrpoB植物的等量的葉組織制備。為比較每一等量葉組織的質(zhì)體基因組拷貝數(shù)，用等體積的每份DNA制備物進(jìn)行DNA凝膠印跡，以放射標(biāo)記的16SrDNA序列EcoRI至EcoRV片段探測(ptDNA的核苷酸138447至140845)(K.Shinozaki，等，EMBO雜志5，2043，1986)。PhosphorImage分析定量表明每個(gè)樣品中有等量的質(zhì)體基因組拷貝數(shù)。通過等體積的每份RNA制備物上進(jìn)行RNA凝膠印跡測定表明，來自于等量組織樣品的16SRNA的量，在ΔrpoB植物中降低了2.5倍。這一值與以胞漿25SrRNA信號校正時(shí)估側(cè)的3倍降低(圖3B)類似。引物延伸反應(yīng).引物延伸反應(yīng)用3微克(野生型)或10微克(ΔrpoB)的總?cè)~RNA按所述(L.A.Allison和P.Maliga，EMBO雜志，正在印刷中)進(jìn)行，利用以下引物16SrRNA5′-TTCATAGTTGCATTACTTATAGCTTC-3′(與核苷酸102757-102732互補(bǔ))；rbcL5′-ACTTGCTTTAGTCTCTGTTTGTGGTGACAT(與核苷酸57616-57587互補(bǔ))。序列梯以相同的引物利用SequenaseIIkit(USB)產(chǎn)生。體外加帽確認(rèn)初級轉(zhuǎn)錄本.來自野生型和ΔrpoB植物的總?cè)~RNA(20微克)在[α-32p]GTP存在下加帽(J.C.Kennell和D.R.Pring，Mol.Gen.Genet.216，16，1989)。標(biāo)記的16SrRNA通過核糖核酸酶保護(hù)(A.Vera和M.Sugiura，植物分子生物學(xué)19，309，1992)而用RPAIIkit(Ambion)檢測。為制備保護(hù)的互補(bǔ)RNA，16SrDNA上游區(qū)(ptDNA的核苷酸102526-102761)用下列引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增5′引物為5′-CCTCTAGACCCTAAGCCCAATGTG-3′其對應(yīng)于ptDNA的核苷酸102526和102541(K.Shinozaki，等，EMBO雜志5，2043，1986)，下劃線)加XbaI位點(diǎn)；3′引物為5′-CCGGTACCGAGATTCATAGTTGCATTAC-3′與ptDNA的核苷酸102761至102742互補(bǔ)(下劃線)加KpnI位點(diǎn)。擴(kuò)增產(chǎn)物作為XbaI至KpnI片段克隆到Xba至KpnI限制的pBSKS+載體(Stratagene)。為產(chǎn)生與16SrRNA5′末端互補(bǔ)的未標(biāo)記RNA，所得質(zhì)粒與XbaI排成線性，在Megascript(Ambion)反應(yīng)中用T3RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄。標(biāo)記物(100，200，300，400和500核苷酸)用RNACenturyMarkersTemplateSet(Ambion)，按生產(chǎn)廠商的方法制備。72核苷酸標(biāo)記物是來自質(zhì)粒trnV基因的成熟的加工后轉(zhuǎn)錄本，通過RNA酶保護(hù)產(chǎn)生。結(jié)果與討論破壞煙草質(zhì)體中的大腸桿菌樣RNA聚合酶活性導(dǎo)致色素缺乏的表型。為避免破壞其它功能的質(zhì)體基因，缺失定靶于ΔrpoB基因，因?yàn)樗俏ㄒ痪幋a大腸桿菌樣質(zhì)體聚合酶亞單位的操縱子的第一個(gè)閱讀框架(K.Shinozaki，等，EMBO雜志5，2043，1986)。通過一個(gè)克隆的質(zhì)體DNA(ptDNA)片段中的嵌合的，抗壯觀霉素(aadA)基因(Z.Svab和P.Maliga美國國家科學(xué)院院刊90，913，1993)取代rpoB編碼區(qū)的大部分(3212個(gè)堿基對的3015個(gè))和上游非編碼序列的691bp來完成缺失。所得質(zhì)粒通過粒子轟擊引入煙草葉綠體中，在此aadA基因通過質(zhì)體DNA側(cè)翼序列整合入質(zhì)體基因組，如圖1A所示。由于質(zhì)體基因系統(tǒng)為高度多倍體，每個(gè)葉細(xì)胞包含完全相同的ptDNA拷貝達(dá)10,000個(gè)，轉(zhuǎn)化的基因組的選擇性擴(kuò)增通過使被轟擊的組織在含有壯觀霉素的培養(yǎng)基上生長來進(jìn)行。挑選的第一輪可得到許多表現(xiàn)部分白色葉組織的抗壯觀霉素植物(圖2A)。對三個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化株的白色和綠色部分的DNA凝膠印跡分析提示色素缺乏與rpoB的缺失相關(guān)(圖1B)。大部分的色素缺乏組織，如圖1B的第四列，包含野生型和轉(zhuǎn)化基因組拷貝的混合物。野生型ptDNA的缺失對于這些數(shù)據(jù)的解釋很重要。因此，為獲得只含轉(zhuǎn)化質(zhì)體基因組的植物，從白色部分再生幼苗。根據(jù)DNA凝膠印跡分析判斷(圖1C)，這一過程產(chǎn)生了一致的不含野生型ptDNA的白色植物(圖2A)。在無壯觀霉素的培養(yǎng)基上從這些白色葉再生，全部得到色素缺乏幼苗，證實(shí)了所有葉層和細(xì)胞型中完全缺失野生型質(zhì)體基因組。從生長于無菌培養(yǎng)液中的煙草植物很難得到種子。偶然地，植物由原代轉(zhuǎn)化物再生期間，我們得到了一個(gè)周緣嵌合體(S.Poethig，基因?qū)W趨勢5，273，1989)，與L2葉層的質(zhì)體突變同質(zhì)(圖2A)。此株嫁接于野生型煙草，溫室中長至成熟(圖2B)。自傳粉的花所得的種子產(chǎn)生一律的白色籽苗，其DNA凝膠印跡分析檢測不到任何野生型質(zhì)體基因組(圖1C)。ΔrpoB植物的葉的質(zhì)體中缺乏類囊體膜.色素缺乏的ΔrpoB植物不能光能自養(yǎng)地生長。然而，如果保持在含蔗糖的培養(yǎng)基上來補(bǔ)償其缺乏的光合作用，它們生長正常，但與野生型植物相比，速度降低，沒有表現(xiàn)明顯的器官形態(tài)學(xué)變化。而且，ΔrpoB籽苗高效率地發(fā)芽，長成植物。這些觀察提示植物生長和分化所必須的非光合成的質(zhì)體功能的維持不需要大腸桿菌樣質(zhì)體RNA聚合酶。ΔrpoB植物葉肉細(xì)胞的質(zhì)體超微結(jié)構(gòu)研究表明突變質(zhì)體比野生型葉綠體小和圓，長約2-5微米，而野生型葉綠體長度約5-9微米。因此，ΔrpoB質(zhì)體較未分化的原質(zhì)體大，后者平均大小為1微米(M.R.Thomas和R.J.Rose，植物學(xué)158，329，1983)。另外，ΔrpoB質(zhì)體通常含有不規(guī)則大小和形狀的多種囊泡，缺乏堆積的類囊體膜排列，后者為具光合作用活性的葉綠體的特征(圖3)。ΔrpoB質(zhì)體中質(zhì)體基因的轉(zhuǎn)化得以維持.無β亞單位時(shí)，質(zhì)體σ70型無法轉(zhuǎn)錄。為測定ΔrpoB質(zhì)體中是否有轉(zhuǎn)錄活性維持，用RNA凝膠印跡分析了RNA累積。研究了兩類不同質(zhì)體基因的轉(zhuǎn)錄(K.Shinozaki，等，EMBO雜志5，2043，1986)。第一組包括編碼光合作用器官亞單位的基因psbD/C操縱子，編碼光系統(tǒng)II的亞單位D2和CP43；rbcL，編碼核酮糖-1，5-二磷酸酯羧酸酶的大亞單位；及psbA，編碼光系統(tǒng)II反應(yīng)中心的D1亞單位。第二組包括基因表達(dá)器官組分的編碼基因rp116，編碼核糖體蛋白亞單位和16SrDNA基因。所用質(zhì)體RNA的量校正至胞漿25S核糖體RNA水平。奇怪的是，檢測到了所有測試基因的mRNA累積。然而，兩類基因的ΔrpoB缺失對轉(zhuǎn)錄累積的影響則顯著不同。光合成基因psbD/C，rbcL，和psbA的穩(wěn)態(tài)mRNA水平與野生型相比降低了40-100倍(圖4A；長時(shí)間暴露所有ΔrpoB列均可見信號)。而核編碼的聚合酶基因的轉(zhuǎn)錄水平所受影響則小得多。測得16SrRNA有3倍降低，來自于包含rp116基因的多順反子操縱子的多重轉(zhuǎn)錄本還觀察到了確實(shí)的升高(圖4B)。這些數(shù)據(jù)表明，盡管ΔrpoB植物中編碼光合作用器官的基因的表達(dá)缺損，涉及看家功能的RNA仍能累積至約野生型，或更高水平。ΔrpoB植物中16SrDNA基因?yàn)橐恍碌膯幼愚D(zhuǎn)錄.質(zhì)體RNA的累積證實(shí)了缺乏大腸桿菌樣酶β亞單位的質(zhì)體中有RNA聚合酶活性。已有證明質(zhì)體基因遷移至核(S.L.Baldauf和J.D.Palmer，自然334，262，1990；J.S.Gantt，S.L.Baldauf，P.J.Calie，N.F.Weeden，J.D.PaImer，EMBO雜志10，3073，1991；M.W.Gray，基因?qū)W發(fā)展的當(dāng)前觀點(diǎn)3，884，1993)。因此，可以想象如果存在ΔrpoB的核拷貝，其產(chǎn)品能被轉(zhuǎn)入質(zhì)體，組裝成功能化的大腸桿菌樣酶，質(zhì)體的轉(zhuǎn)錄仍能從σ70型啟動子啟動。為確立ΔrpoB植物中發(fā)現(xiàn)的質(zhì)體轉(zhuǎn)錄本是否源于σ70型啟動子轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物，定位了四個(gè)基因的5′轉(zhuǎn)錄末端，rbcL(K.Shinozaki和M.Sugiura，基因20，91，1982)，16SrDNA(A.Vera和M.Sugiura，當(dāng)前基因?qū)W27，280，1995)，psbA(M.Sugita和M.Sugiura，Mol.Gen.Genet.195，308，1984)及psbD(W.B.Yao，B.Y.Meng，M.Tanaka，M.Sugiura，核酸研究17，9583，1989)，它們的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)過去已確定。沒有一個(gè)5′末端定位在σ70型啟動子起始位點(diǎn)(圖5A中，未顯示rbcL和16SrDNA的數(shù)據(jù))。因此可得出結(jié)論，ΔrpoB質(zhì)體中殘余的RNA聚合酶活性并不歸因于大腸桿菌樣酶，而代表另一個(gè)獨(dú)特的質(zhì)體轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。這一不同的RNA聚合酶被命名為核編碼的質(zhì)體RNA聚合酶(NEP)，以區(qū)別于我們命名為質(zhì)體編碼的質(zhì)體RNA聚合酶(PEP)的大腸桿菌樣酶。既然煙草質(zhì)體基因組的序列已全部測出，且極少數(shù)未確認(rèn)的閱讀骨架與已知的RNA聚合酶亞單位沒有序列相似性(K.Shinozaki，等，EMBO雜志5，2043，1986)，通過核編碼的RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄依賴于核基因產(chǎn)物。在ΔrpoB植物的來自σ70型啟動子轉(zhuǎn)錄的缺乏中，問題仍然存在什么啟動子是質(zhì)體RNA來源。ΔrpoB植物中發(fā)現(xiàn)的16SrRNA5′未端定位于成熟的16SrRNA5′末端上游62核苷酸(圖5A)。體外定位測得這一5′末端為一初級轉(zhuǎn)錄本(圖5B)。最近有報(bào)道在異養(yǎng)培養(yǎng)的煙草細(xì)胞的原質(zhì)體中存在具有類似5′末端的一個(gè)重要的初級轉(zhuǎn)錄本，被命名為P2(A.Vera和M.Sugiura，當(dāng)前基因?qū)W27，280，1995)；這個(gè)轉(zhuǎn)錄本在野生型葉細(xì)胞中也低水平的存在(A.Vera和M.Sugiura，當(dāng)前基因?qū)W27，280，1995；圖5A，長時(shí)間暴露，未顯示)。起始位點(diǎn)周圍的序列在所測的所有植物種類中高度保守，與σ70共同序列無任何相似性(A.Vera和M.Sugiura，當(dāng)前基因?qū)W27，280，1995)?；讦poB植物中其重要的用途，可得出結(jié)論，這一獨(dú)特的啟動子為NEP轉(zhuǎn)錄器官使用。與16SrRNA不同，光合作用基因rbcL，和psbD/C的主要轉(zhuǎn)錄本定位于先前定義的加工末端(rbcL的數(shù)據(jù)見圖5L.hanley-Bowdoin，E.M.Orozco，N.H.Chua，分子細(xì)胞生物學(xué)5，2733，1985；S.Reinbothe，C.Reinbothe，C.Heintzen，C.Seidenbecher，B.Parthier，EMBO雜志12，1505，1993)。其它的少數(shù)轉(zhuǎn)錄本末端定位在加工末端的上游。因此，這些光合作用基因轉(zhuǎn)錄本累積的低水平是上游啟動子活性和隨后的通讀RNA剪切以產(chǎn)生適當(dāng)大小轉(zhuǎn)錄本的結(jié)果。兩個(gè)質(zhì)體轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)的推測功能.ΔrpoB植物中存在NEP系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄的RNA的累積。這提示核編碼的RNA聚合酶在維持質(zhì)體看家基因的表達(dá)中的作用。顯然這些表達(dá)水平足夠支持非光能自養(yǎng)植物的生長和分化。而為光合作用活性葉綠體的發(fā)育提供高水平的質(zhì)體基因轉(zhuǎn)錄本則需要大腸桿菌樣PEPRNA聚合酶。推測的核編碼的RNA聚合酶的功能暗示在葉綠體發(fā)展的早期，PEPRNA聚合酶活化前，對其功能的高度需求(J.E.Mullet，植物生理學(xué)103，309，1993)。核編碼的RNA聚合酶對發(fā)育的調(diào)控還被16SrDNA的核編碼的聚合酶P2啟動子在培養(yǎng)的煙草細(xì)胞原質(zhì)體中比在葉綠體中更活潑這一觀察結(jié)果支持(A.Vera和M/Sugiura，當(dāng)前基因?qū)W27，280，1995)。實(shí)施例II高等植物中兩個(gè)不同的RNA聚合酶進(jìn)行轉(zhuǎn)錄是基因表達(dá)的普遍調(diào)控機(jī)制如實(shí)施例I所述，缺乏PEP聚合酶的植物中轉(zhuǎn)錄本的累積導(dǎo)致質(zhì)體核糖體RNA操縱子NEP啟動子的確認(rèn)(Allison等，1996，EMBO雜志143721-3730)。為便于其它的NEP啟動子的定位，研究了ΔrpoB植物中大多數(shù)質(zhì)體基因的mRNA累積。本文所述這一新的啟動子序列可擴(kuò)大適于進(jìn)行質(zhì)體轉(zhuǎn)化的物種范圍，并促進(jìn)感興趣的外源基因組織特異地的表達(dá)。實(shí)施例II的材料和方法RNA凝膠印跡根據(jù)生產(chǎn)廠商的方法，用TRIzol(GIBCOBRL)制備總?cè)~RNA.RNA在1％瓊脂糖/甲醛膠上電泳，然后用Posiblot轉(zhuǎn)移工具(Stratagene)轉(zhuǎn)移至HybondN(Amersham)。在迅速雜交緩沖液(Amersham)中65℃與任意引物標(biāo)記的片段過夜雜交。雙鏈DNA探針以任意引物PCR產(chǎn)生的32P標(biāo)記的DNA片段來制備。用于PCR的引物序列及它們在煙草ptDNA中的位置(K.Shinozaki，等1986，見上)如下</tables>accD60221GGATTTAGGGGCGAA60875GTGATTTTCTCTCCGatpB56370(C)AGATCTGCGCCCGCC55623CCTCACCAACGATCCatpI15985(C)GTTCCATCAATACTC15292GCCGCGGCTAAAGTTclpP73621(C)GACTTTATCGAGAAAG73340GAGGGAATGCTAGACGndhA122115(C)GATATAGTGGAAGCG121602GTGAAAGAAGTTGGGndhB97792(C)CAGTCGTTGCTTTTC97057CTATCCTGAGCAATTndhF113366(C)CTCGGCTTCTTCCTC112749CTCCGTTTTTACCCCORF1901129496(C)GTGACTATCAAGAGG128895GACTAACATACGCCCGORF228092881GCTCGGGAGTTCCTC93552TGCTCCCGGTTGTTCpetB78221GGTTCGAAGAACGTC78842GGCCCAGAAATACCTpsaA43467(C)TTCGTTCGCCGGAACC42743GATCTCGATTCAAGATpsbB75241GGAGCACATATTGTG75905GGATTATTGCCGATGpsbE66772(C)CAATATCAGCAATGCAGTTCATCC66452GGAATCCTTCCAGTAGTATCGGCCrps1438621CACGAAGTATGTGTCCGGATAGTCCrp133/rp11870133GGAAAGATGTCCGAG70636GTTCACTAATAAATCGACrps16mRNA用分離自包含煙草ptDNA序列的核苷酸4938至5363和6149至6656的質(zhì)粒pJS40的EcoRI片段探測(Shinozaki等，見上)。煙草25SrRNA的探針來自質(zhì)粒pKDR1(Dempsey等，分子植物病理學(xué)83；1021，1993)，包含在質(zhì)粒pBR325中克隆的煙草25S/18S位點(diǎn)的3.75kb的EcoRI片段。當(dāng)與25SrRNA的凝膠印跡雜交時(shí)，32P標(biāo)記的雙鏈DNA探針與未標(biāo)記的質(zhì)粒pKDR1混合，對應(yīng)于存在于濾器上RNA量的2倍多。引物延伸反應(yīng).引物延伸反應(yīng)用10微克(野生型)或10微克(ΔrpoB)的總?cè)~RNA按所述(Allison和Maliga，EMBO雜志，152802-2809)進(jìn)行。引物列于下。下劃線的寡核苷酸也被用于產(chǎn)生加帽構(gòu)建物。</tables>accD59758CCGAGCTCTTATTTCCTATCAGACTAAGCatpB56736CCCCAGAACCAGAAGTAGTAGGATTGAatpI15973GTATTGATGGAACATGATAGAACATclpP#174479GGGACTTTTGGAACACCAATAGGCATclpP#274947GGGAGCTCCATGGGTTTGCCTTGGORF190131451CTTCATGCATAAGGATACTAGATTACCORF228087419GGGAGCTCTACATGAAGAACATAAGCCrps216921CCAATATCTTCTTGTCATTTCTCTCrps166185CATCGTTTCAAACGAAGTTTTACCAT序列梯以相同的引物利用SequenaseIIkit(USB)產(chǎn)生。體外加帽確認(rèn)初級轉(zhuǎn)錄本.來自野生型和ΔrpoB植物的總?cè)~RNA(20微克)在[α-32P]GTP存在下加帽(Kennell和Pring，1989，Mol.Gen.Genet.21616-24)。標(biāo)記的RNA被核糖核酸酶保護(hù)(Vera和Sugiura，1992，見上)用RPAIIkit(Ambion)檢測。為制備保護(hù)的互補(bǔ)RNA，16SrDNA上游區(qū)(ptDNA的核苷酸102526-102761)用下列引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。設(shè)計(jì)5′引物以在擴(kuò)增片段的上游加入一個(gè)XbaI位點(diǎn)(下劃線)。設(shè)計(jì)3′引物以在擴(kuò)增片段的下游加入一個(gè)KpnI位點(diǎn)(下劃線)。擴(kuò)增產(chǎn)物如XbaI至KpnI片段克隆到Xba至KpnI限制的pBSKS+載體(Stratagene)。為產(chǎn)生與16SrRNA5′末端互補(bǔ)的未標(biāo)記RNA，所得質(zhì)粒與XbaI排成線性，在Megascript(Ambion)反應(yīng)中用T3RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄。標(biāo)記物(100，200，300，400和500核苷酸)用RNACenturyMarkersTemplateSet(Ambion)，按生產(chǎn)廠商的方法制備。</tables>accD59758CCGAGCTCTTATTTCCTATCAGACTAAGC59576CCGGTACCATAGGAGAAGCCGCCCatpB56750CCGAGCTCGTAGTAGGATTGATTCTCA57131(C)CCGGTACCGGAGCCAATTAGATACAAAatpI15895CCGAGCTCTGACTTGGAAACCCCC16277(C)CCGAATTCTAGTATTCGCAATTTGTclpP74462GGGAGCTCCAGGACTTCGGAAAGG74752(C)GGGGTACCAATACGCAATGGGG74947GGGAGCTCCATGGGTTTGCCTTGG75080(C)GGGGTACCGCTAATTCATACAGAGORF190131424GGGAGCTCCGACCACAACGACCG31724(C)GGGGTACCCTTACATGCCTCATTTCORF228087419GGGAGCTCTACATGAAGAACATAAGCC87154GGGGTACCGTGCCTAAGGGCATATCGGDNA序列分析利用Wisconsin序列分析軟件包(基因?qū)W計(jì)算機(jī)小組，INC.)進(jìn)行DNA序列分析。結(jié)果與討論基于野生型和ΔrpoB葉中mRNA的累積，質(zhì)體基因可分為三類。第一類包括那些基因，其mRNA在野生型葉中累積至高水平，而在ΔrpoB植物的葉中累積至很低水平(圖6A)。屬于這類的基因有psaA(光系統(tǒng)I基因)，psbB和psbE(光系統(tǒng)II基因)，petB(細(xì)胞色素b6/f復(fù)合物基因)，ndhA(呼吸鏈NADH脫氫酶同系物；Matsubayashi等，1987Mol.Gen.Genet.210385393)及rps14(核糖體蛋白基因)。第二類包括質(zhì)體基因，它們的mRNA在野生型和ΔrpoB葉中累積至幾乎相等水平(圖6B)。這類基因包括atpB(ATP合成酶基因)，ndhF(呼吸鏈NADH脫氫酶同系物基因；Matsubayashi等，1987，見上)，rps16(核糖體蛋白基因)及ORF1901(未知功能的一個(gè)基因；Wolfe等，1992，分子生物學(xué)雜志22395-104)。第三類包括在中mRNA累積顯著多于野生型植物的葉中的基因(圖6C)。這類的典型基因?yàn)閞p133和rp118(核糖體蛋白基因)，accD(編碼乙酰輔酶A羧化酶的一個(gè)亞單位；Sasaki等，1993，植物生理學(xué)108445-449)和ORF2280(推測為ATP酶，功能未知；Wolfe，1994，當(dāng)前基因?qū)W，25379-383)。這類的另外兩個(gè)基因，ndhB(呼吸鏈NADH脫氫酶同系物；Matsubayashi等，1987，見上)，及clpP(編碼ClpATP-依賴的蛋白酶蛋白水解亞單位；Maurizi等，1990，生物化學(xué)雜志26512546-12552；Gray等，1990，植物分子生物學(xué)15947-950)組成這類的一個(gè)亞組，其野生型葉中有相當(dāng)?shù)膍RNA水平。atpB和atpIATP合成酶基因既有NEP，又有PEP啟動子RNA凝膠印跡分析確認(rèn)了許多基因和操縱子，它們在ΔrpoB葉中保持了高的轉(zhuǎn)錄水平。為識別別的NEP啟動子，許多轉(zhuǎn)錄本的5′末端通過引物延伸分析加以定位。5′末端可能是確認(rèn)啟動子的初級轉(zhuǎn)錄本，或由RNA加工產(chǎn)生。由于初級質(zhì)體轉(zhuǎn)錄本的5′末端保留了三磷酸酯基，特異的[32P]GMP被鳥苷轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)移至這些RNA分子，使準(zhǔn)確地區(qū)分初級轉(zhuǎn)錄本和加工的末端成為可能。煙草atpB操縱子，轉(zhuǎn)錄本5′末端已被Orozco等確認(rèn)(1990，當(dāng)前基因?qū)W1765-71)在翻譯起始密碼的上游，核苷酸位置-611，-502，-488，-289，和-255(圖7C)。5′末端相對于翻譯起始密碼(ATG)計(jì)數(shù)，當(dāng)核苷酸直接在A的上游，即在位置-1。引物延伸分析在我們的野生型植物中確認(rèn)了這些5′末端的每一個(gè)(圖7A)。在ΔrpoB樣品中，只存在-289RNA，其5′末端是鳥苷轉(zhuǎn)移酶的底物(圖7B)。因此，-289RNA由一NEP啟動子，PatpB-289轉(zhuǎn)錄。有趣的是，-289轉(zhuǎn)錄本存在于野生型葉中，盡管不如ΔrpoB植物中豐富。ΔrpoB植物中沒有-255，-488和-611轉(zhuǎn)錄本(圖7A)。含這些啟動子(但無PatpB-289)的DNA片段為大腸桿菌RNA聚合酶識別(Orozco等，1990，見上)，被質(zhì)體中的PEP轉(zhuǎn)錄。atpA操縱子包括atpI，-atpH-atpF-atpA基因(圖8C)。野生型煙草葉中，mRNA5′末端已被定位于atpI上游的三個(gè)區(qū)-209區(qū)，5′末端定位于核苷酸-212，-209和-207，及位于核苷酸-130和-85的5′末端。在ΔrpoB葉中，只有-207轉(zhuǎn)錄本可檢測到(圖8A)。這個(gè)轉(zhuǎn)錄本可在ΔrpoBRNA樣品中加帽(圖8B)，因此，它由NEP啟動子轉(zhuǎn)錄。在野生型RNA樣品的體外加帽反應(yīng)中也獲得了這一位置的信號。-209和-212轉(zhuǎn)錄本可能歸因于一個(gè)重疊的PEP啟動子的活性，或野生型植物中NEP啟動子多重轉(zhuǎn)錄本的形成。只存在于野生型葉RNA中的-130轉(zhuǎn)錄本也可被加帽(圖8A，8B)。由于該5′末端上游有適當(dāng)間隔的類似于-10/-35序列，它是由一個(gè)PEP聚合酶轉(zhuǎn)錄的。clpPNEP啟動子在葉綠體中高度表達(dá)。clpP蛋白酶亞單位基因亦屬于既含NEP又含PEP啟動子的一類。野生型植物的引物延伸分析確認(rèn)了在核苷酸-53，-95和-173位置的RNA5′末端，而在ΔrpoB植物中，5′末端定位于-53，-173和-511核苷酸位置(圖9A)。體外加帽反應(yīng)證明這些都是初級轉(zhuǎn)錄本(圖9B)。其中的三個(gè)轉(zhuǎn)錄本由NEP啟動子得到。PclpP-53在野生型和ΔrpoB植物中均高度表達(dá)，因此代表了一類不同的NEP啟動子，具有在不同的組織型中高水平表達(dá)的能力。PclpP-53在菠菜中高度保守(Westhoff，1985，Mol.Gen.Genet.201115-123)。另外的NEPclpP啟動子為PclpP-173和PclpP-511。由于PclpP-511轉(zhuǎn)錄本只在ΔrpoB植物中累積(圖9A)，它可作為調(diào)節(jié)NEP啟動子的候選。還要注意，PclpP-511位于psbB密碼區(qū)以內(nèi)，其表達(dá)可能受趨同的psbBPEP啟動子影響(圖9C)。直接位于clpP上游的唯一PEP啟動子是PclpP-95。由這一啟動子得到的RNA僅在野生型葉中累積，PclpP-95具有使人想起-10-/-35保守區(qū)的上游序列(未顯示)。accD基因僅由NEP啟動子轉(zhuǎn)錄。就磷脂生物合成基因accD而言，mRNA只在ΔrpoB植物中累積至高水平。主要轉(zhuǎn)錄本啟動于核苷酸位置-129(圖10A)，它可在體外加帽(圖10B)。因此，這個(gè)RNA是由NEP啟動子轉(zhuǎn)錄的。由于PaccD-129在具光合作用活性的葉肉細(xì)胞中沒有顯著活性，它可以作為具有不同的，組織特異的表達(dá)方式的調(diào)節(jié)NEP啟動子的候選。NEP啟動子具有鄰接轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的不嚴(yán)格共同序列校準(zhǔn)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)側(cè)翼序列以確定保守的NEP啟動子元件(圖11)。包括在此序列校準(zhǔn)中的有本研究確認(rèn)的九個(gè)啟動子和Prnn-62，Allison等所述的NEP啟動子(1996，見上)。還包括通過體外帶帽證明其5′末端為初級轉(zhuǎn)錄本的PORF2280-1577及PORF1901-41(未顯示數(shù)據(jù))。這些啟動子均在ΔrpoB葉中有活性，而在野生型葉中無活性。假定的NEP啟動子rps2和rps16也包含在此序列校準(zhǔn)中，它們在ΔrpoB葉中有更多的mRNA。這些轉(zhuǎn)錄本的5′末端通過引物延伸分析定位。體外加帽實(shí)驗(yàn)由于mRNA的低含量失敗(未顯示數(shù)據(jù))。緊鄰NEP5′末端側(cè)翼區(qū)多個(gè)序列的校準(zhǔn)，證實(shí)了轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)周圍10個(gè)核苷酸不嚴(yán)格共同序列(圖11)。上游和下游其它核苷酸的保守也很明顯。令人吃驚的是PclpP-53和其它的在葉綠體中高度活性的唯一的NEP啟動子間缺乏序列保守性。由于缺乏序列相似性，這一序列不包括在序列校準(zhǔn)中。PclpP-53轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)周圍的序列在圖11底部單獨(dú)列出。通過識別不同的啟動子，NEP和PEP聚合酶，提供了質(zhì)體基因選擇性轉(zhuǎn)錄的機(jī)制(圖12)。本文提供的數(shù)據(jù)論證了僅含PEP啟動子或NEP啟動子的一些基因，而其它含有PEP和NEP的調(diào)節(jié)序列。實(shí)施例III用于選擇性標(biāo)記基因表達(dá)的NEP啟動子考慮到通用性和廣泛應(yīng)用，很希望在各種組織類型中高水平地表達(dá)可選擇的用于質(zhì)體轉(zhuǎn)化的標(biāo)記基因。目前應(yīng)用的質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體中的可選擇標(biāo)記基因都是由質(zhì)體編碼的RNA聚合酶識別的PEP啟動子表達(dá)。PEP聚合酶轉(zhuǎn)錄光合作用基因和一些看家基因，故而似乎是光合作用活性葉組織中主要的RNA聚合酶?；谌~細(xì)胞中葉綠體的轉(zhuǎn)化，實(shí)現(xiàn)了煙草中有效的質(zhì)體轉(zhuǎn)化。而植物從大多數(shù)農(nóng)學(xué)上重要的谷類作物，包括玉米，水稻，小麥和棉花的葉中的再生卻不可行，或者說不實(shí)際。這些農(nóng)作物中，轉(zhuǎn)基因植物通常通過轉(zhuǎn)化胚胎生長組織培養(yǎng)細(xì)胞或籽苗組織來得到。由于這些組織是非光合作用的，由在非綠色組織中有活性的NEP啟動子表達(dá)標(biāo)記基因顯得尤其優(yōu)越，將便于在所有非光合作用組織類型中質(zhì)體的轉(zhuǎn)化。一個(gè)尤其合適的驅(qū)動標(biāo)記基因表達(dá)的啟動子是PclpP-53啟動子。這個(gè)啟動子在ΔrpoB植物的原質(zhì)體中高度表達(dá)，因此它可能在產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因谷類植物的胚胎生成細(xì)胞培養(yǎng)液的原質(zhì)體中亦高度表達(dá)。由于發(fā)現(xiàn)啟動子在葉綠體中有活性，由這些啟動子表達(dá)標(biāo)記基因也將適合于在轟擊的葉培養(yǎng)物中挑選質(zhì)體轉(zhuǎn)化體。由這些啟動子，如PclpP-53啟動子表達(dá)的標(biāo)記基因?qū)⒃讷@得轉(zhuǎn)化質(zhì)體中具有廣泛應(yīng)用。可選擇的標(biāo)記基因?qū)⒂妹绹鴮＠鸑o.5,451,513中列出的規(guī)則構(gòu)建，其主題在本文插入在參考文獻(xiàn)中。圖13中列出了一個(gè)轉(zhuǎn)化的DNA構(gòu)建物。更特異地，PclpP-53啟動子將克隆在編碼質(zhì)體可選擇的標(biāo)記物的DNA部分上游。通過在啟動子片段和可選擇的標(biāo)記物密碼區(qū)間插入適當(dāng)?shù)腄NA序列來提供翻譯的信號。用于提供轉(zhuǎn)錄終止信號和穩(wěn)定嵌合mRNA的質(zhì)體基因的3′非翻譯部分將被克隆在可選擇的標(biāo)記物的下游。既然對NEP和PEP聚合酶的轉(zhuǎn)錄終止的要求可能不同，優(yōu)選利用NEP啟動子表達(dá)的基因的3′非翻譯區(qū)。PclpP-53是一個(gè)尤其強(qiáng)的NEP啟動子。而具有轉(zhuǎn)化質(zhì)體的植物也可通過弱的啟動子得到。前面的實(shí)施例中有一些這樣的弱啟動子，例如PclpP-173。NEP啟動子驅(qū)動的組織特異的質(zhì)體轉(zhuǎn)基因的表達(dá)有組織特異的質(zhì)體轉(zhuǎn)基因的表達(dá)可望用于許多應(yīng)用。一種使植物組織對根線蟲排斥或有毒的蛋白的組織特異地表達(dá)對根來說是理想的。而同樣的蛋白在葉中的表達(dá)將可能使植物資源流失，并影響空中植物部分的利用。由于多數(shù)情況下在非綠色組織中表達(dá)，本發(fā)明所述的NEP啟動子，及通常由NEP聚合酶表達(dá)的啟動子，是轉(zhuǎn)基因表達(dá)的組織特異啟動子的一個(gè)豐富來源。一些NEP啟動子，如PclpP-511，在ΔrpoB植物的原質(zhì)體中高度表達(dá)。原質(zhì)體存在于花椰菜的食用部分。因此，在花椰菜中外源基因的高水平表達(dá)預(yù)期由位于植物的食用部分的該啟動子驅(qū)動。質(zhì)體基因accD編碼原核生物的乙酰輔酶A羧化酶的一個(gè)亞單位，乙酰輔酶A羧化酶參與磷脂的生物合成。有趣的是，野生型葉中accDmRNA水平很低，而ΔrpoB植物的原質(zhì)體中，其水平很高。這一觀察表明PaccD-129活潑參與磷脂生物合成的組織，如富含油的生長中的種子質(zhì)體，的非綠色質(zhì)體中有活性。權(quán)利要求1.一種用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化多細(xì)胞植物質(zhì)體的DNA構(gòu)建物，它包括影響所述轉(zhuǎn)化DNA通過同源重組插入所述質(zhì)體基因組的一個(gè)定靶部分，將可選擇的表型帶給包含所述轉(zhuǎn)化質(zhì)體的植物細(xì)胞的一個(gè)可選擇的標(biāo)記基因，及用于插入編碼感興趣的外源基因的其它可表達(dá)的DNA的克隆位點(diǎn)的轉(zhuǎn)化DNA，其中改進(jìn)包括由核編碼的質(zhì)體RNA聚合酶識別和轉(zhuǎn)錄的5′啟動子元件。2.權(quán)利要求1的DNA構(gòu)建物，其中所述構(gòu)建物插入適于質(zhì)體轉(zhuǎn)化的一個(gè)載體。3.權(quán)利要求1的DNA構(gòu)建物，其中所述5′啟動子元件由質(zhì)體編碼的質(zhì)體RNA聚合酶識別和轉(zhuǎn)錄。4.權(quán)利要求1的DNA構(gòu)建物，其中所述啟動子元件選自質(zhì)體基因的啟動子元件，包括Prrn-62，PORF2280-1577，PatpB-289，PORF1901-41，Prbs2-152，Prps16-107，PatpI-207，Pclp-511，Pclp-173，Pclp-53和PaccD-129。5.權(quán)利要求2的DNA構(gòu)建物，其中所述啟動子元件是Pclp-95。6.一種用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的質(zhì)體和表達(dá)其中至少一個(gè)其它的基因產(chǎn)物的DNA構(gòu)建物，包括a)包括與預(yù)先確定的質(zhì)體基因組序列基本同源的DNA序列的定靶部分，其中質(zhì)體將被此序列轉(zhuǎn)化，所述定靶部分使與所述預(yù)先決定的質(zhì)體基因組序列同源重組成為可能；及b)位于所述定靶部分內(nèi)的可選擇的標(biāo)記基因，所述可選擇的標(biāo)記基因?qū)⒎侵旅目蛇x表型帶給含載有所述DNA構(gòu)建物質(zhì)體的細(xì)胞及c)另外的一個(gè)DNA部分，包括編碼一個(gè)蛋白或其前體的基因的一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位；及d)一個(gè)啟動子序列，可操作地與所述轉(zhuǎn)錄單位相連，所述啟動子序列由核編碼的聚合酶識別，編碼所述蛋白的基因由所述啟動子調(diào)控。7.權(quán)利要求6的DNA構(gòu)建物，其中所述轉(zhuǎn)錄單位編碼一個(gè)可選擇的標(biāo)記基因。8.權(quán)利要求7的DNA構(gòu)建物，其中所述可選擇的標(biāo)記基因受核編碼的質(zhì)體聚合酶轉(zhuǎn)錄的啟動子調(diào)控。9.權(quán)利要求6的DNA構(gòu)建物，其中所述轉(zhuǎn)錄單位編碼一個(gè)報(bào)告基因。10.權(quán)利要求6的DNA構(gòu)建物，其中所述構(gòu)建物插入一個(gè)適于質(zhì)體轉(zhuǎn)化的載體。11.一個(gè)以權(quán)利要求1的DNA構(gòu)建物穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的多細(xì)胞植物。12.一個(gè)以權(quán)利要求2的DNA構(gòu)建物穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的多細(xì)胞植物。13.一種用于得到植物細(xì)胞或多細(xì)胞植物的方法，這些細(xì)胞的質(zhì)體已被至少一種感興趣的外源基因穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化，包括將一個(gè)DNA構(gòu)建物引入植物細(xì)胞中，DNA構(gòu)建物包括a)包括與預(yù)先確定的質(zhì)體基因組序列基本同源的DNA序列的定靶部分，其中質(zhì)體將被此序列轉(zhuǎn)化，所述定靶部分使與所述預(yù)先確定的質(zhì)體基因組序列同源重組成為可能；及b)位于所述定靶部分內(nèi)的可選擇的標(biāo)記基因，所述可選擇的標(biāo)記基因?qū)⒖蛇x表型帶給含載有所述DNA構(gòu)建物質(zhì)體的細(xì)胞；及c)一個(gè)感興趣的外源基因，所述基因由核編碼的質(zhì)體RNA聚合酶識別的啟動子調(diào)控；d)選擇表達(dá)所述表型的細(xì)胞；及e)由含穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的質(zhì)體的所述細(xì)胞再生植物。全文摘要本發(fā)明提供了用于穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化高等植物質(zhì)體的新的DNA構(gòu)建物和方法。本文所述的構(gòu)建物包含由核編碼的質(zhì)體聚合酶和質(zhì)體編碼的質(zhì)體聚合酶轉(zhuǎn)錄的單一的啟動子。本發(fā)明的新構(gòu)建物的應(yīng)用方便了更廣范圍的植物種類的轉(zhuǎn)化,使轉(zhuǎn)化的DNA能在多細(xì)胞植物中進(jìn)行組織特異地表達(dá)。文檔編號C12N15/09GK1199423SQ96197574公開日1998年11月18日申請日期1996年8月1日優(yōu)先權(quán)日1995年8月10日發(fā)明者P·馬利加,L·A·阿利森,P·T·哈杜基維茨申請人:拉杰斯大學(xué)