專利名稱：四環(huán)素調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請是申請日為1995年6月29日的中國專利申請95194899.7的分案申請。本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和生物工程領(lǐng)域，具體是四環(huán)素調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控物。
背景技術(shù)：
通過改變細(xì)胞蛋白的對應(yīng)基因的表達(dá)水平，可以有力地協(xié)助細(xì)胞蛋白的功能分析及后續(xù)的相關(guān)表型的分析。為此，需要一種受外來刺激控制的可誘導(dǎo)表達(dá)體系。理想情況下該體系不僅能介導(dǎo)基因表達(dá)的“開/關(guān)”狀態(tài)，而且能讓基因在給定水平上表達(dá)。
已嘗試采用多種可誘導(dǎo)真核啟動子去控制基因活性，諸如對重金屬離子(Mayo等人(1982)Cell2999-108；Brinstel等人，(1982)Nalure29639-42；Searle等人，(1985)分子細(xì)胞生物學(xué)，51480-1489)，熱激(Nouer等人(1991)《熱激反應(yīng)》，Nouer，L編，CRC，Boca Raton，F(xiàn)L.pp 167-220)或激素(Lee等人(1981)自然294228-232；Hynes等人(1981)美國國家科學(xué)院院刊，782038-2042；Klock等(1987)Nature329734-736；Israal & Kaufman(1989)Res.172589-2604)起反應(yīng)的啟動子。然而，上述體系一般均有下述問題的一種或兩種(1)誘導(dǎo)物(例如，重金屬離子，熱激或固醇類激素)引起多重效果，使分析復(fù)雜化；(2)許多啟動子體系在非誘導(dǎo)狀態(tài)下表現(xiàn)高水平的本底活性，不能徹底關(guān)閉被調(diào)節(jié)基因，誘導(dǎo)因子偏低。
一種避免這些局限的方法是把調(diào)節(jié)成分從進(jìn)化遠(yuǎn)緣物種如大腸桿菌引入高等真核細(xì)胞，預(yù)期這些調(diào)控此類調(diào)節(jié)循環(huán)的效應(yīng)物將對真核細(xì)胞生理不敏感，因而不會在真核細(xì)胞中引起多重效果。例如，大腸桿菌的Lac阻遏子(LacR)/操縱子/誘導(dǎo)物體系在真核細(xì)胞中起作用，用于從三種不同途徑調(diào)節(jié)基因表達(dá)(1)用正確定位于啟動子區(qū)的Lac操縱子阻止轉(zhuǎn)錄起始(Hu與Davidson(1987)細(xì)胞48555-566；Broun等人(1987)細(xì)胞49603-612；Figge等人，(1988)《細(xì)胞》52713-722；Fuerst等人，(1989)美國國家科學(xué)院院刊862549-2553；Deuschle等人(1989)美國國家科學(xué)院院刊865400-5405)；(2)用LacR/操縱子復(fù)合物在延伸期封閉正在轉(zhuǎn)錄的DNA聚合酶II(Deuschle等人(1990)科學(xué)248480-483)；(3)激活對LacR與單純皰疹病毒(HSV)病毒顆粒蛋白16(VP16)活性結(jié)構(gòu)域的融合蛋白起反應(yīng)的啟動子(Labow等人，(1990)分子細(xì)胞生物學(xué)，103343-3356；Baim等人，(1991)美國國家科學(xué)院院刊885072-5076)。
在一種Lac體系中，Lac操縱子相聯(lián)序列的表達(dá)由LacR-VP16融合蛋白組成性激活并且在異丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)存在時被關(guān)閉(Labow等人(1990)，引文見上)。在該體系另一種形式中，用的是一種在IPTG存在時結(jié)合Lac操縱子的LacR-VP16衍生物，提高細(xì)胞溫度，結(jié)合更牢(Baim等人(1991)，引文見上)。這些Lac體系在真核細(xì)胞中應(yīng)用有限，部分上由于IPTG在真核細(xì)胞中作用慢且效率低而必須在接近細(xì)胞毒性水平的濃度用。另外，用溫度變化來誘導(dǎo)基因表達(dá)可能在細(xì)胞中引起多重效果。因此需要一種更有效的可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)系統(tǒng)，包能快而且高水平地誘導(dǎo)基因表達(dá)并且真核細(xì)胞能耐受其中的誘導(dǎo)物而沒有細(xì)胞毒性或多重效果。
已發(fā)現(xiàn)大腸桿菌四環(huán)素(Tc)抗性體系的組分在真核細(xì)胞中起作用并已用于調(diào)節(jié)基因表達(dá)。例如，Tet阻遏子(TetR)能在四環(huán)素不存在時結(jié)合到tet操縱子序列上并阻遏基因轉(zhuǎn)錄，它已能在植物細(xì)胞中以足夠高的濃度來阻遏從含有tet操縱子序列的啟動子起始的轉(zhuǎn)錄(Gatz，C等人，(1992)，植物學(xué)雜志，2397-404)。然而，需要相當(dāng)高的胞內(nèi)濃度的TetR來保持基因在細(xì)胞中低度表達(dá)，這在許多情況下不可能實現(xiàn)，因而導(dǎo)致體系的“泄漏”。
在其它研究工作中，TetR與VP16的激活結(jié)構(gòu)域融合，得到四環(huán)素控制的轉(zhuǎn)錄激活物(tTA)(Gossen，M.和Bujard.H.(1992)美國國家科學(xué)院院刊895547-5551)。tTA融合蛋白受四環(huán)素調(diào)節(jié)的方式與TetR的一樣，即，tTA在四環(huán)素不存在時結(jié)合到tet操縱子序列上，在四環(huán)素存在時不結(jié)合。因此，在該體系中，Tc持續(xù)存在時，基因表達(dá)關(guān)閉，而去掉Tc可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個方面涉及一種可誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)體系，它利用原核生物的Tet阻遏子/操縱子/誘導(dǎo)物體系的組分在真核細(xì)胞中激活基因表達(dá)。在本發(fā)明的體系中，當(dāng)四環(huán)素不存在時，tet操縱子相聯(lián)的核苷酸序列不轉(zhuǎn)錄，但當(dāng)四環(huán)素(或其類似物)存在時，能被快速而張力地誘導(dǎo)。轉(zhuǎn)錄受一種含有至少兩段多肽的融合蛋白誘導(dǎo)，其中一多肽當(dāng)四環(huán)素或四環(huán)素類似物存在時結(jié)合到tet操縱子序列上，另一多肽在真核細(xì)胞中直接或間接地激活轉(zhuǎn)錄。在優(yōu)選實施方案中，融合蛋白的第一多肽是突變的Tet阻遏子，它受Tc調(diào)節(jié)，其方式與野生型阻遏子的相反，即在Tc存在而非不存在時，它結(jié)合到tet操縱子序列上。因此，當(dāng)誘導(dǎo)劑(Tc或Tc類似物)不存在時，tet操縱子相連的核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄不被誘導(dǎo)。當(dāng)誘導(dǎo)劑存在時，tet操縱子相聯(lián)的核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄被本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄激活物(transactivator)融合蛋白激活。
本發(fā)明的可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)體系有下列有利的特性基因表達(dá)的誘導(dǎo)快速、高效且強(qiáng)力(例如，典型地在1000倍與2000倍之間；觀察到過高達(dá)20000倍的表達(dá)增強(qiáng))并且誘導(dǎo)劑不需持續(xù)存在。而且，誘導(dǎo)劑不會在真核細(xì)胞中引起多重效果或細(xì)胞毒性。本發(fā)明的可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)體系可用于細(xì)胞中基因表達(dá)的體外或體內(nèi)調(diào)節(jié)，并且可能在基因治療應(yīng)用和在轉(zhuǎn)基因或同源重組生物體(例如動物或植物)的基因產(chǎn)物的表達(dá)中特別有用。
本發(fā)明的可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)體系涉及至少兩種組分一個四環(huán)素可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活物和被調(diào)節(jié)的靶轉(zhuǎn)錄單元。相反地，本發(fā)明的一個方面涉及Tc可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白及編碼融合蛋白的核苷酸(例如DNA)。優(yōu)選的融合蛋白包括一種Tn10編碼的Tet阻遏子，它在氨基酸位置71、95、101和/或102中任選的至少一個氨基酸位置發(fā)生突變，并經(jīng)操作連接于單純皰疹病毒顆粒蛋白16(VP16)激活結(jié)構(gòu)域上(這樣的融合蛋白的核苷酸和氨基酸序列由SEQ ID NO1和2分別給出)。在一種實施方案中，融合蛋白的激活結(jié)構(gòu)域含有VP16的約127個C-末端氨基酸(例如，SEQ ID NO2的融合蛋白)。在另一實施方案中，激活結(jié)構(gòu)域包括VP16的11個C-末端氨基酸的至少一個拷貝(例如，SEQ ID NO4給出的氨基酸序列)。其它具有所需要的功能活性的突變的Tet阻遏子和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域也在本發(fā)明范圍內(nèi)。另外，轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白可以包括第三種蛋白，它促進(jìn)融合蛋白運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞核中。例如，核定位信號(例如具有SEQ ID NO3給出的氨基酸序列)可以加入融合蛋白中。本發(fā)明進(jìn)一步提供了重組載體和包含編碼本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白的核苷酸的宿主細(xì)胞。本發(fā)明進(jìn)一步提供包含編碼本發(fā)明轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白的核苷酸的轉(zhuǎn)基因與同源重組生物。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄激活物被用于調(diào)節(jié)靶轉(zhuǎn)錄單元的轉(zhuǎn)錄，該單元包含一段經(jīng)操作連接在最小啟動子序列上的待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列和至少一段tet操縱子序列。待轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列可能編碼感興趣的蛋白質(zhì)或是活性RNA分子(例如反義RNA分子或核酸酶)并且可能是外源或內(nèi)源的核苷酸序列。第一核酸編碼本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄激活物，含有轉(zhuǎn)錄激活物的靶轉(zhuǎn)錄單元的第二核酸能加入到核酸組合物中。該核酸組合物可被導(dǎo)入宿主細(xì)胞或生物體中(例如，轉(zhuǎn)基因或同源重組動物或植物)，使靶核苷酸序列的四環(huán)素可誘導(dǎo)表達(dá)得以轉(zhuǎn)錄。
除了提供待轉(zhuǎn)錄的單個核苷酸序列的表達(dá)調(diào)節(jié)體系外，本發(fā)明還特別給出新的靶轉(zhuǎn)錄單元，它們能協(xié)同地或獨立地調(diào)節(jié)待轉(zhuǎn)錄的兩段或多段核苷酸序列。在一個實施方案中，利用一種轉(zhuǎn)錄單元實現(xiàn)兩段待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列的協(xié)同調(diào)節(jié)，該轉(zhuǎn)錄單元中第一待轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列經(jīng)操作連接到tet操縱子序列的5’端，第二待轉(zhuǎn)錄序列經(jīng)操作連接到同一tet操縱子序列的3’端，于是第一和第二核苷酸序列以不同方式被轉(zhuǎn)錄。SEQ IDNO6和7給出了適于這種雙向轉(zhuǎn)錄單元的雙向啟動子。這種轉(zhuǎn)錄單元對同一細(xì)胞中生產(chǎn)異二聚體蛋白(例如抗體鏈)的化學(xué)計量量的兩個亞基或是在同一細(xì)胞中共同表達(dá)目的基因與編碼可檢測標(biāo)記的基因尤其有用，由此可選擇表達(dá)目的基因的細(xì)胞。
在另一實施方案中，用一個轉(zhuǎn)錄單元實現(xiàn)兩段核苷酸序列的獨立調(diào)節(jié)，該轉(zhuǎn)錄單元中第一待轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列經(jīng)操作連接到一種類型的tet操縱子上，第二待轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列經(jīng)操作連接到另一種不同類型的tet操縱子上。然后用兩種不同的轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白來調(diào)節(jié)兩段核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄第一融合蛋白在Tc存在時結(jié)合到第一tet操縱子序列上，而另一融合蛋白在Tc不存在時結(jié)合到第二tet操縱子序列上(或者第一融合蛋白在Tc不存在時結(jié)合到第一tet操縱子序列上，而另一融合蛋白在Tc存在時結(jié)合到第二tet操縱子序列上)。該轉(zhuǎn)錄單元尤其適用于在宿主中獨立調(diào)節(jié)治療基因和自殺基因的表達(dá)。例如，當(dāng)四環(huán)素存在時，激活治療基因的表達(dá)，當(dāng)治療結(jié)束時，除去四環(huán)素，從而激活自殺基因的表達(dá)。
本發(fā)明另一方面涉及一種激活一段核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄的方法，該核苷酸序列經(jīng)操作連接到表達(dá)本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白的宿主細(xì)胞或動物中至少一段tet操縱子序列上。在宿主細(xì)胞中，使細(xì)胞接觸Tc或Tc類似物來激活轉(zhuǎn)錄。在受試驗者(例如轉(zhuǎn)基因或同源重組生物)中通過對受試驗者施用Tc或Tc類似物來激活轉(zhuǎn)錄。不同的Tc類似物以及誘導(dǎo)劑的不同濃度可用來細(xì)調(diào)基因表達(dá)的誘導(dǎo)水平。優(yōu)選的高水平基因表達(dá)Tc類似物包括無水四環(huán)素和強(qiáng)力霉素。本發(fā)明進(jìn)一步提供了用本發(fā)明的調(diào)節(jié)體系來生產(chǎn)和分離感興趣的蛋白的方法。
本發(fā)明另一方面涉及四環(huán)素調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄抑制物，它可以高度可控地抑制連接到一個或多個tet操縱子序列上的基因的表達(dá)。本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄抑制物含有一種包含至少兩段多肽的融合蛋白其中第一多肽結(jié)合到操縱子序列上，異源第二多肽在真核細(xì)胞中直接或間接地抑制轉(zhuǎn)錄。異源第二多肽來自不同于第一多肽的蛋白。由于本發(fā)明的融合蛋白包含真核轉(zhuǎn)錄抑制子(silencer)結(jié)構(gòu)域，預(yù)計它們在阻遏真核細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄時比只用Tet阻遏子更有效。
在本發(fā)明的一個實施方案中，抑制物融合蛋白的第一多肽當(dāng)四環(huán)素(Tc)或其類似物不存在時結(jié)合于tet操縱子序列上，當(dāng)Tc或其類似物存在時不結(jié)合(例如，第一多肽優(yōu)選地是Tet阻遏子，諸如具有SEQ IDNO17給出的氨基酸序列的Tn10來源的Tet阻遏子)。當(dāng)四環(huán)素(或Tc類似物)不存在時，該融合蛋白結(jié)合到經(jīng)操作連接到目的基因上的tet操縱子序列上，從而抑制目的基因的轉(zhuǎn)錄。在另一實施方案中，第一多肽在四環(huán)素存在時結(jié)合到tet操縱子序列上，當(dāng)四環(huán)素不存在時不結(jié)合(例如，第一多肽優(yōu)選的是突變的Tet阻遏子，例如在位點71、95、101和/或102具有氨基酸替換的Tn10來源的Tet阻遏子)。優(yōu)選地，第一多肽具有SEQ ID NO19給出的氨基酸序列，當(dāng)四環(huán)素(或Tc類似物)存在時，該融合蛋白結(jié)合到經(jīng)操作連接到目的基因上的tet操縱子序列上，從而抑制目的基因的轉(zhuǎn)錄。
第二多肽可以是一種蛋白的轉(zhuǎn)錄“抑制子”結(jié)構(gòu)域，該蛋白例如是v-erbA致癌基因產(chǎn)物，果蠅Krueppel蛋白，視黃酸受體α，胸腺激素受體α，酵母Ssn6/Tupl蛋白復(fù)合物，果蠅蛋白even-skipped SIR1，NeP1，果蠅dorasal蛋白，TSF3，SF1，果蠅hunchback蛋白，果蠅knirps蛋白，WT1，Oct-2.1，果蠅engrailed蛋白，E4BP4或ZF5。優(yōu)選的抑制子結(jié)構(gòu)域包括Krueppel的403-466氨基酸殘基(SEQ ID No21給出)和v-erbA的364-635氨基酸殘基(SEQ ID No23給出)。
本發(fā)明的融合蛋白可能進(jìn)一步包括附加的多肽，如促進(jìn)融合蛋白運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞核的第三多肽(即核運(yùn)輸氨基酸序列)。
本發(fā)明進(jìn)一步提供分離到的核酸分子，它們編碼本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄抑制物融合蛋白，以及重組表達(dá)載體，載體中含有適于在宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼轉(zhuǎn)錄抑制物融合蛋白形式的上述核酸分子。本發(fā)明進(jìn)一步提供宿主細(xì)胞，本發(fā)明的重組表達(dá)載體可以引入這些細(xì)胞。因此，在這些宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄抑制物融合蛋白得以表達(dá)。這些宿主細(xì)胞可以是，例如，哺乳動物細(xì)胞(例如人類細(xì)胞)、酵母細(xì)胞、真菌細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞。而且，該宿主細(xì)胞可以是受精的非人類卵細(xì)胞，此時該宿主細(xì)胞可用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因生物，該生物具有表達(dá)轉(zhuǎn)錄抑制物融合蛋白的細(xì)胞。更進(jìn)一步，重組表達(dá)載體可以被設(shè)計為使在宿主細(xì)胞中編碼融合蛋白的核酸和目標(biāo)基因發(fā)生同源重組。這樣的同源重組載體可用于產(chǎn)生能表達(dá)本發(fā)明的融合蛋白的同源重組動物。
在優(yōu)選實施方案中，宿主細(xì)胞(或宿主生物體的細(xì)胞)還含有待轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列，它經(jīng)操作連接到至少一段tet操縱子序列(例如一種目的基因，其表達(dá)可受Tc或其類似物調(diào)節(jié))上。為了在這些宿主細(xì)胞中調(diào)節(jié)tet操縱子相連的目的基因的轉(zhuǎn)錄，可改變與宿主細(xì)胞接觸的Tc(或其類似物)的濃度，例如，若Tc不存在時，轉(zhuǎn)錄抑制物融合蛋白結(jié)合到tet操縱子序列上，則降低與細(xì)胞接觸的Tc的濃度，從而抑制tet操縱子相連的目的基因的轉(zhuǎn)錄(例如，若細(xì)胞先在Tc存在時培養(yǎng)，然后將Tc從培養(yǎng)基中去除以抑制目的基因的轉(zhuǎn)錄)?；蛘撸鬞c存在時轉(zhuǎn)錄抑制物融合蛋白結(jié)合到tet操縱子序列上，則提高與細(xì)胞接觸的Tc的濃度來抑制tet操縱子相連的目的基因的轉(zhuǎn)錄(例如，若細(xì)胞先在Tc不存在時培養(yǎng)，則將Tc添加到培養(yǎng)基中來抑制目的基因的轉(zhuǎn)錄)。
如下所述，本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄抑制物融合蛋白可用于在不同情況下抑制基因表達(dá)。在一具體的優(yōu)選實施方案中，同一宿主細(xì)胞中四環(huán)素調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄抑制物和激活物融合蛋白結(jié)合起來調(diào)節(jié)tet操縱子(tetO)相連的目的基因的轉(zhuǎn)錄，來精確控制目的基因的表達(dá)水平。例如，一種只有在Tc存在時才結(jié)合到tetO上的激活物融合蛋白和一種只有當(dāng)Tc不存在時才結(jié)合到tetO上的抑制物融合蛋白在含有tetO相連的目的基因的宿主細(xì)胞中得以表達(dá)。當(dāng)Tc不存在時，目的基因轉(zhuǎn)錄的基底水平被抑制物融合蛋白抑制。細(xì)胞與Tc(或類似物)接觸后，目的基因的轉(zhuǎn)錄被激活物融合蛋白激活。本發(fā)明的激活物融合蛋白和抑制物融合蛋白也可結(jié)合起來調(diào)節(jié)多個tetO相連的目的基因的表達(dá)。
調(diào)節(jié)目的基因表達(dá)的新型試劑盒也在本發(fā)明范圍內(nèi)。在一實施方案中，本發(fā)明的試劑盒包含至少一種編碼本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白的核酸分子以及靶轉(zhuǎn)錄單元，目的基因可以克隆到其上，以使基因經(jīng)操作連接到tet操縱子序列上。任選地或是附加地，該試劑盒可以包括編碼本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄抑制物融合蛋白的核酸分子。多個目的基因克隆于其上(例如，用于協(xié)同或獨立調(diào)節(jié))的靶轉(zhuǎn)錄單元，也可包括到本發(fā)明的試劑盒中。而且，至少一種四環(huán)素或四環(huán)素類似物可包括到試劑盒中。


圖1是一個條線圖，表示HR5-C11細(xì)胞中四環(huán)素和不同的四環(huán)素類似物(1μg/ml f.c.)對熒光素酶活性的激活。細(xì)胞在所述四環(huán)素不存在(-)或存在時生長3天，然后確定熒光素酶活性。每個實心和陰影線條代表單獨一個培養(yǎng)皿中的熒光素酶活性。
圖2是一張表示HR5-C11細(xì)胞與不同濃度的強(qiáng)力霉素溫育時相對熒光素酶活性的圖，給出的是三個獨立實驗的結(jié)果。
圖3是一張表示HR5-C11細(xì)胞的熒光素酶活性被強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)的動力學(xué)的圖。HR5-C11培養(yǎng)物接觸1μg/ml的強(qiáng)力霉素，在不同的時間間隔測量熒光素酶活性；(*)培養(yǎng)物含有強(qiáng)力霉素，(o)培養(yǎng)物在沒有抗生素情況下生長。
圖4給出不同類型Tet阻遏子的氨基酸序列，表明與B類Tet阻遏子(例如，Tn10來源的)相比，不同類型的Tet阻遏子的氨基酸序列的同源性。其它類型Tet阻遏子中與B類相同的氨基酸位置用虛線顯示。
圖5給出不同類型tet操縱子的核苷酸序列A類(SEQ ID NO11)，B類(SEQ ID NO12)，C類(SEQ ID NO13)，D類(SEQ ID NO14)和E類(SEQ ID NO15)。
圖6是雙向啟動子構(gòu)建體的示意圖，該啟動子通過四環(huán)素調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄激活物協(xié)同調(diào)節(jié)兩個經(jīng)操作連接到同一tet操縱子上的目的基因。
圖7A(SEQ ID NO6)給出雙向啟動子區(qū)域的核苷酸序列，該啟動子通過四環(huán)素調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄激活物協(xié)同調(diào)節(jié)兩個目的基因。
圖7B(SEQ ID NO7)給出一種雙向啟動子區(qū)域的核苷酸序列，該啟動子通過四環(huán)素調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄激活物協(xié)同調(diào)節(jié)兩個目的基因。
圖8是兩張表現(xiàn)利用四環(huán)素調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄激活物的熒光素酶和β-半乳糖苷酶活性的協(xié)同表達(dá)的圖。
圖9A-B是用于四環(huán)素調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄激活物(tTA)表達(dá)的自調(diào)節(jié)啟動子的示意圖。A版表示一種在Tc不存在時結(jié)合到tet操縱子上的野生型含Tet阻遏子的轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白表達(dá)的自調(diào)節(jié)，B版表示一種當(dāng)Tc存在時結(jié)合到tet操縱子上的突變型含Tet阻遏子的轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白表達(dá)的自調(diào)節(jié)。
圖10是一張示意圖，表示當(dāng)四環(huán)素類似物強(qiáng)力霉素濃度漸增時通過四環(huán)素調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄抑制物蛋白(tSD)和四環(huán)素可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白(rtTA)分別進(jìn)行的tet操縱子(tetOwt)相連的目的基因的負(fù)調(diào)控和正調(diào)控。
圖11是一張示意圖，表示將編碼Krueppel或v-erbA抑制子結(jié)構(gòu)域的核酸不改變閱讀框架地融合到編碼Tet阻遏子的核酸(tetR基因)的3’端來構(gòu)建TetR-抑制子結(jié)構(gòu)域融合構(gòu)建體。
圖12是僅帶熒光素酶報告基因的轉(zhuǎn)基因小鼠(右邊的格紋柱)的熒光素酶活性表達(dá)或是當(dāng)強(qiáng)力霉素不存在時(中間的深色柱)或當(dāng)強(qiáng)力霉素存在時(左邊的淺色柱)，帶有熒光素酶報告基因和tTAR轉(zhuǎn)基因的雙轉(zhuǎn)基因小鼠的熒光素酶活性表達(dá)的圖。
具體實施方案本發(fā)明涉及可用于在真核細(xì)胞或動物中以高度可控方式調(diào)節(jié)基因表達(dá)的核酸分子和蛋白質(zhì)。本發(fā)明的體系對基因表達(dá)的調(diào)節(jié)涉及至少兩個組分一個經(jīng)操作連接到調(diào)節(jié)序列上的基因和一種蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)在誘導(dǎo)劑存在或不存在時結(jié)合到調(diào)節(jié)序列上，激活或抑制基因轉(zhuǎn)錄。本發(fā)明的體系利用原核生物的Tet阻遏子/操縱子/誘導(dǎo)物體系的組分在真核生物中激活基因表達(dá)。
本發(fā)明的不同方面涉及一些結(jié)合到tet操縱子(tetO)序列上，能夠激活或抑制基因轉(zhuǎn)錄的融合蛋白，不過它們只有在四環(huán)素或其類似物存在或者不存在時才結(jié)合到tet操縱子序列上。因此，在宿主細(xì)胞中，通過改變與宿主細(xì)胞接觸的四環(huán)素(或類似物)的濃度，用本發(fā)明的融合蛋白激活或抑制經(jīng)操作連接到tet操縱子序列上的基因的轉(zhuǎn)錄(例如，在培養(yǎng)基中加入或去除四環(huán)素，或者對宿主生物體施用四環(huán)素或停止施用四環(huán)素，等等)。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及用本發(fā)明的融合蛋白調(diào)節(jié)的靶轉(zhuǎn)錄單元。除了能調(diào)節(jié)單個tet-操縱子連接的目的基因，本發(fā)明還提供新的轉(zhuǎn)錄單元，它含有兩個或多個待轉(zhuǎn)錄基因，可以被本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白協(xié)同地或獨立地調(diào)節(jié)。用四環(huán)素(或其類似物)激活或抑制基因轉(zhuǎn)錄的方法，和含有這里描述的調(diào)節(jié)體系的組分的試劑盒，也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
在下列小節(jié)中，詳細(xì)地討論含有本發(fā)明的可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)體系的組分的核酸和蛋白及其相互關(guān)系。小節(jié)如下編排I.四環(huán)素可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活物A.轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白的第一多肽B.轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白的第二多肽C.轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白的第三多肽II.轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白的表達(dá)A.表達(dá)載體B.宿主細(xì)胞C.將核酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞D.轉(zhuǎn)基因生物體E.同源重組生物體III.四環(huán)素可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活物調(diào)節(jié)的靶轉(zhuǎn)錄單元A.tet操縱子連接的核苷酸序列的表達(dá)的調(diào)節(jié)B.兩段核苷酸序列的協(xié)同調(diào)節(jié)C.多段核苷酸序列的獨立調(diào)節(jié)D.多段核苷酸序列的混合型協(xié)同與獨立調(diào)節(jié)IV.四環(huán)素調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄抑制物A.轉(zhuǎn)錄抑制物融合蛋白的第一多肽B.轉(zhuǎn)錄抑制物融合蛋白的第二多肽
C.轉(zhuǎn)錄抑制物融合蛋白的第三多肽D.轉(zhuǎn)錄抑制物融合蛋白的表達(dá)V.本發(fā)明的試劑盒VI.用四環(huán)素或其類似物調(diào)節(jié)基因表達(dá)A.用轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白激活基因表達(dá)B.用轉(zhuǎn)錄抑制物融合蛋白抑制基因表達(dá)C.基因表達(dá)的組合型正調(diào)控與負(fù)調(diào)控VII.本發(fā)明的應(yīng)用A.基因治療B.體外生產(chǎn)蛋白質(zhì)C.體內(nèi)生產(chǎn)蛋白質(zhì)D.人類疾病的動物模型E.生產(chǎn)用于克隆的穩(wěn)定細(xì)胞系I.四環(huán)素可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活物在本發(fā)明的可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)體系中，用轉(zhuǎn)錄激活物蛋白，此處簡稱轉(zhuǎn)錄激活物，激活基因轉(zhuǎn)錄。本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄激活物是融合蛋白。本發(fā)明一方面涉及融合蛋白和編碼融合蛋白的核酸(例如，DNA)。術(shù)語“融合蛋白”意指經(jīng)操作連接到一起的至少兩段多肽，典型地具有不同來源。至于多肽，術(shù)語“經(jīng)操作連接”意指兩段多肽連接后每段多肽都執(zhí)行其預(yù)定的功能。典型的，兩段多肽通過肽鍵共價連接。融合蛋白優(yōu)選地由標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生。例如，編碼第一多肽的DNA分子連接到編碼第二多肽的另一DNA分子上，得到的雜交DNA分子在宿主細(xì)胞中表達(dá)融合蛋白。DNA分子相互以5’到3’取向連接，因而連接后編碼的多肽的轉(zhuǎn)錄框架不變(即，DNA分子在框架內(nèi)連接到一起)。
A.轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白的第一多肽本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白部分地含有第一多肽，該多肽在四環(huán)素或其類似物存在時結(jié)合到tet操縱子序列上。融合蛋白的第一多肽優(yōu)選地是突變的Tet阻遏子。術(shù)語“突變的Tet阻遏子”包括這樣的多肽，它們具有與野生型Tet阻遏子相似的氨基酸序列但至少有一個氨基酸與野生型Tet阻遏子的不同。術(shù)語“野生型Tet阻遏子”指自然界存在的蛋白質(zhì)，它們在原核細(xì)胞中當(dāng)Tc不存在時阻遏從tet操縱子序列開始的轉(zhuǎn)錄。突變的Tet阻遏子與野生型Tet阻遏子的氨基酸差別可能是一個或多個氨基酸的替換，一或多個氨基酸的缺失或一個或多個氨基酸的添加。本發(fā)明的突變的Tet阻遏子有下列功能特性(1)多肽能結(jié)合tet操縱子序列，即，它保留野生型Tet阻遏子的DNA結(jié)合特異性；2)它能被四環(huán)素以與野生型Tet阻遏子相反的方式調(diào)節(jié)，即，突變的Tet阻遏子僅當(dāng)Tc(或Tc類似物)存在時而不是在Tc不存在時才結(jié)合tet操縱子序列。
在優(yōu)選實施方案中，有上述的功能特性的突變的Tet阻遏子是通過在野生型Tet阻遏子序列中替換氨基酸殘基得到的。例如實施例1描述的，在氨基酸位置71、95、101和102有氨基酸替換的Tn10來源的Tet阻遏子具有所需的功能特性，因而可用作本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白的第一多肽。SEQ ID NO2(位置1-207)給出該突變Tet阻遏子的氨基酸序列。在突變Tet阻遏子的一個實施方案中，位置71由谷氨酸突變?yōu)橘嚢彼?，位?5由天冬氨酸突變?yōu)樘於０?，位?01由亮氨酸突變?yōu)榻z氨酸，位置102由甘氨酸突變?yōu)樘於彼?，但本發(fā)明不限于這些特定的突變。比這全部四種氨基酸少的突變可能足以得到具有所需功能特性的Tet阻遏子。相應(yīng)地，Tet阻遏子優(yōu)選地在這些位置中的至少一個發(fā)生突變。在這些和其它氨基酸位置的氨基酸發(fā)生替換、缺失或添加，但仍保留所需的突變Tet阻遏子的功能特性，也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。Hinrichs，W等人(1994)科學(xué)264418-420中描述的Tet阻遏子-四環(huán)素復(fù)合物-的晶體結(jié)構(gòu)可用于合理地設(shè)計突變的Tet阻遏子?；谠摻Y(jié)構(gòu)，氨基酸位置71位于四環(huán)素結(jié)合袋(pocket)外面，表明該位點的突變對獲得本發(fā)明的突變Tet阻遏子的所需功能特性不是必需的。相反，氨基酸位置95、101和102位于保守的四環(huán)素結(jié)合袋之內(nèi)。因此，Tet阻遏子的四環(huán)素結(jié)合袋可被定向突變，以獲得本發(fā)明的突變的Tet阻遏子。
根據(jù)本發(fā)明的方法，可產(chǎn)生能加入本發(fā)明的融合蛋白的其他突變型Tet阻遏子。許多不同類型的Tet阻遏子已被描述，例如A、B、C、D和E(其中Tn10編碼的阻遏子是B類阻遏子)。不同類型的Tet阻遏子的氨基酸序列，包括含有上述突變的區(qū)域，有高度同源性(即占蛋白質(zhì)長度的40-60％)。圖4給出并比較了不同類型Tet阻遏子的氨基酸序列。Tovar，K等人在(1988)分子基因遺傳學(xué)21576-80中也有描述。相應(yīng)地，能夠在其它類型的Tet阻遏子中引入與上述Tn10來源的Tet阻遏子中等價的突變，以包括到本發(fā)明的融合蛋白中。例如，在所有5種阻遏子類型中均為天冬氨酸的氨基酸位置95，可在任一類阻遏子中突變成天冬酰胺。相似地，在所有5種阻遏子類型中均為甘氨酸的位置102，可在任一類阻遏子中突變成天冬氨酸。對本領(lǐng)域的技術(shù)人員，其他的合適的等價突變是顯而易見的，可用此處描述的方法來產(chǎn)生并檢驗其功能。Waters，S.H.等人(1983)核酸研究116089-6105，Unger，B.等人(1984)基因31103-108，Unger，B.等人(1984)核酸研究，127693-7703以及Tover，K.等人(1988)分子基因遺傳學(xué)，215.76-80分別給出A、C、D和E類的Tet阻遏子的核苷酸與氨基酸序列。根據(jù)本發(fā)明的講授可突變這些野生型序列，用于此處描述的可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)體系。
不同于上述突變的是，如實施例1所述通過誘發(fā)野生型Tet阻遏子并篩選能產(chǎn)生其它合適的突變型Tet阻遏子(即，具有上述的所需功能特性)。Hillen，W.和Schollmeier，K.(1983)核酸研究11525-539和Postle，K.等人(1984)核酸研究124849-4863給出野生型B類的Tet阻遏子的核苷酸和氨基酸序列。野生型A、C、D和E類阻遏子的核苷酸和氨基酸序列見上引文。突變型Tet阻遏子可如下產(chǎn)生和篩選編碼野生型Tet阻遏子的核酸(例如DNA)經(jīng)隨機(jī)誘變，得到的突變型核酸摻入表達(dá)質(zhì)粒，引入宿主細(xì)胞以便篩選。篩選檢測法可用于篩選僅當(dāng)四環(huán)素存在時才結(jié)合到tet操縱子序列上的Tet阻遏子。例如，在表達(dá)載體中將突變核酸的文庫引入大腸桿菌菌株，其中tet操縱子控制編碼Lac阻遏子的基因的表達(dá)，而Lac阻遏子控制編碼篩選標(biāo)記(例如藥物抗性)的基因的表達(dá)。Tet阻遏子結(jié)合到細(xì)菌tet操縱子序列上會抑制Lac阻遏子的表達(dá)，從而誘導(dǎo)選擇標(biāo)記基因的表達(dá)。根據(jù)可選擇的表現(xiàn)型(例如藥物抗性)來選擇表達(dá)標(biāo)記的細(xì)胞。對于野生型Tet阻遏子，選擇標(biāo)記基因的表達(dá)在Tc不存在時發(fā)生。根據(jù)只有在Tc存在時核酸誘導(dǎo)細(xì)菌中選擇標(biāo)記基因的表達(dá)的能力，用該體系選擇編碼突變的Tet阻遏子的核酸。
轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白的第一多肽(例如突變的Tet阻遏蛋白)能特異地結(jié)合tet操縱子序列。每種類型的Tet阻遏子均有對應(yīng)的靶tet操縱子序列。相應(yīng)地，術(shù)語“tet操縱子序列”將包括所有類型的tet操縱子序列，例如A、B、C、D和E類。這五種類型的tet操縱子的核苷酸序列由圖5和SEQ ID NO11-15給出，其描述見于Waters，S.H.等人(1983)引文見上，Hiuan，W.和Schollmeier.K.(1983)引文見上，Stuber，D.和Bujard，H.(1981)美國國家科學(xué)院院刊78167-171，Unger，B.等人(1984)引述見上和Tovar，K.等人(1988)引述見上。在優(yōu)選實施方案中，突變的Tet阻遏子是Tn10編碼的阻遏子(即B類)，而且tet操縱子序列是B類tet操縱子序列?？蛇x地，突變的A類Tet阻遏子可與A類tet操縱子序列共用，其它類型的Tet阻遏子/操縱子依此類推。
制備結(jié)合A類tet操縱子的突變的Tet阻遏子的另一種方法是進(jìn)一步誘變此處描述的已突變的Tn10來源的Tet阻遏子(B類阻遏子)，使它不再有效地結(jié)合到B類操縱子上而是有效地結(jié)合到A類操縱子上。已發(fā)現(xiàn)A類或B類操縱子的核苷酸位置6是對互補(bǔ)阻遏子識別操縱子至關(guān)重要的核苷酸(B類操縱子的位置6是G/C對而A類操縱子的位置6是A/T對)(見Wissman等人(1988)分子生物學(xué)雜志202397-406)。已發(fā)現(xiàn)A類或B類Tet阻遏子的氨基酸位置40是對識別操縱子的位置6至關(guān)重要的氨基酸殘基(氨基酸位置40在B類阻遏子中為蘇氨酸而在A類阻遏子中為丙氨酸)。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)B類阻遏子的Thr 40替換為Ala可以改變其結(jié)合特性，從而使阻遏子結(jié)合A類操縱子(相似地，A類阻遏子的Ala 40替換為Thr可以改變其結(jié)合特性從而使阻遏子結(jié)合B類操縱子)(見Altschmied等人(1988)EMBO.J.74011-4017)。相應(yīng)地，可以用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)(例如，定點誘變)進(jìn)一步將氨基酸殘基40從Thr變?yōu)锳la來改變此處給出的突變型Tn10來源的Tet阻遏子的結(jié)合特性。
具有特定突變(例如在位置71、95、101和/或102，如上述)的突變型Tet阻遏子可以通過用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)在編碼野生型阻遏子的核酸中引入核苷酸變化而制得，例如用摻入核苷酸突變的寡聚核苷酸引物的PCR介導(dǎo)的突變或定點誘變。另外，若從文庫中篩選確定了一個突變型Tet阻遏子，可以從文庫的載體中回收突變的核酸。為了制備本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白，將編碼突變型Tet阻遏子的核酸在框架內(nèi)連接到另一編碼轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的核酸上，融合構(gòu)建體被摻入重組表達(dá)載體中。通過將重組表達(dá)載體引入宿主細(xì)胞或動物中可以表達(dá)轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白。
B.轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白的第二多肽轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白的第一多肽經(jīng)操作連接到第二多肽上，后者在真核細(xì)胞中直接或間接激活轉(zhuǎn)錄。為了經(jīng)操作地將第一和第二多肽連接起來，典型地將編碼第一和第二多肽的核苷酸序列在框架內(nèi)連到一起，產(chǎn)生編碼融合蛋白的嵌合體基因，也可用其它手段將第一和第二多肽經(jīng)操作連接起來而保留每條多肽的功能(例如，化學(xué)交聯(lián))。在優(yōu)選實施方案中，轉(zhuǎn)錄激活物的第二多肽本身具有轉(zhuǎn)錄激活活性(例如，第二多肽直接激活轉(zhuǎn)錄)。在另一實施方案中，第二種多肽通過間接的機(jī)制激活轉(zhuǎn)錄，通過募集轉(zhuǎn)錄激活蛋白與融合蛋白相互作用。相應(yīng)地，術(shù)語“在真核細(xì)胞中激活轉(zhuǎn)錄的多肽”包括直接或間接激活轉(zhuǎn)錄的多肽。
在真核細(xì)胞中激活轉(zhuǎn)錄的多肽在本領(lǐng)域是已知的。特別地，已描述了許多DNA結(jié)合蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域并且表明該結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)移到異源蛋白質(zhì)上仍保留其激活功能。用于本發(fā)明的融合蛋白的優(yōu)選多肽是單純皰疹病毒顆粒蛋白16(此處稱為VP16，其氨基酸序列由Triezenberg，S.J.等人(1988)Genes Dev.2718-729給出)。在一個實施方案中，用了VP16的約127個C末端氨基酸。例如，具有SEQ ID NO2(位置208-235)給出的氨基酸序列的多肽被用作融合蛋白的第二多肽。在另一實施方案中，保留轉(zhuǎn)錄激活能力的VP16C末端區(qū)約11個氨基酸的至少一個拷貝被用作第二多肽。優(yōu)選地用該區(qū)域的二聚體(即約22個氨基酸)。合適的VP16的C末端肽部分見Seipel，K.等人(EMBO J.(1992)，134961-4968)的描述。例如，具有SEQ ID NO4給出的氨基酸序列的肽二聚體(由SEQ ID NO3給出的核苷酸序列編碼)可用作融合蛋白的第二多肽。
其它的在真核細(xì)胞中具有轉(zhuǎn)錄激活能力的多肽可用于本發(fā)明的融合蛋白。根據(jù)相似的結(jié)構(gòu)特征將不同蛋白中發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域分別歸類。轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的類型包括酸性轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域、富脯氨酸轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域、富絲氨酸/蘇氨酸轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域和富谷氨酰胺轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。酸性轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的例子包括已經(jīng)描述的VP16區(qū)域和GAL4的氨基酸殘基753-881。富脯氨酸激活結(jié)構(gòu)域的例子包括CTF/NF1的氨基酸殘基399-499和AP2的氨基酸殘基31-76。富絲氨酸/蘇氨酸轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的例子包括ITF1的氨基酸殘基1-427和ITF2的氨基酸殘基2-451。富谷氨酰胺激活結(jié)構(gòu)域的例子包括Oct1的氨基酸殘基175-269和Sp1的氨基酸殘基132-243。每一上述區(qū)域的氨基酸序列和其它有用的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的描述均由Seipel，K.等人(EMBO J.(1992)134961-4968)公開。
除了上述轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，可用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)鑒定的新的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。通過將多肽連到另一具有DNA結(jié)合活性的多肽上并確定被融合蛋白激活的靶序列轉(zhuǎn)錄量，可檢測多肽的轉(zhuǎn)錄激活能力。例如，本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法利用待檢測轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域和GAL4DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如氨基酸殘基1-93)的融合蛋白。該融合蛋白被用來激活連到GAL4結(jié)合位點的標(biāo)記基因的表達(dá)(見例如，Seipel，K.等人(1992)EMBO J.114961-4968及其引用文獻(xiàn))。
在另一實施方案中，融合蛋白的第二多肽通過募集轉(zhuǎn)錄激活物與融合蛋白作用來間接激活轉(zhuǎn)錄。例如，本發(fā)明的突變型tetR可以融合到能夠介導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活物蛋白進(jìn)行蛋白-蛋白相互作用的多肽結(jié)構(gòu)域(例如，二聚化結(jié)構(gòu)域)上，比如宿主細(xì)胞的外源激活物。已表明DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的功能性結(jié)合不一定是共價的(見例如，F(xiàn)ields與Song(1989)自然340245-247，Chien等人(1991)美國國家科學(xué)院院刊889578-9582；Gyuris等人(1993)細(xì)胞75791-803；和Zervos，A.S.(1993)細(xì)胞72223-232)。相應(yīng)地，融合蛋白的第二多肽不一定直接激活轉(zhuǎn)錄也可能與具有相容的蛋白-蛋白相互作用結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的外源多肽形成穩(wěn)定的相互作用。適宜的相互作用(或二聚化)結(jié)構(gòu)域的例子包括亮氨酸拉鏈(Landschulz等人(1989)科學(xué)2431681-1688)，螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域(Murre.C.等人(1989)細(xì)胞58537-544)和鋅指結(jié)構(gòu)域(Frankel，A.D.等人(1988)科學(xué)24070-73)。融合蛋白中二聚化結(jié)構(gòu)域與外源核因子的作用將核因子的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域募集到融合蛋白上，進(jìn)而募集到融合蛋白結(jié)合的tet操縱子序列上。
C.轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白的第三多肽除了突變的Tet阻遏子和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，本發(fā)明的融合蛋白還包括經(jīng)操作連接的第三多肽，它促進(jìn)融合蛋白向細(xì)胞核運(yùn)輸。當(dāng)包括到蛋白質(zhì)中以后能促進(jìn)蛋白質(zhì)向核中運(yùn)輸?shù)陌被嵝蛄性诒绢I(lǐng)域是已知的，被稱為核定位信號(NLS)。核定位信號典型地包括一段堿性氨基酸，結(jié)合到異源蛋白(例如，本發(fā)明的融合蛋白)上以后，核定位信號促進(jìn)蛋白質(zhì)運(yùn)輸?shù)胶酥?。核定位信號連接到異源蛋白上，暴露在蛋白的表面，并不干擾蛋白質(zhì)的功能。優(yōu)選地，NLS結(jié)合到蛋白質(zhì)的一端，例如N末端。能包括在本發(fā)明的融合蛋白中的NLS的一個非限制性的氨基酸序列的例子由SEQ ID NO5給出。優(yōu)選地，編碼核定位信號的核酸用標(biāo)準(zhǔn)DNA技術(shù)在框架內(nèi)拼接到編碼融合蛋白的核酸上(例如在5’端)。
包含著具有SEQ ID NO1給出的核苷酸序列的本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄激活物的質(zhì)粒pUHD 17-1已根據(jù)布達(dá)佩斯協(xié)議于1994年7月8日保藏于德國布朗施威格的德國微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSM)保藏號是DSM 9279。
II.轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白的表達(dá)A.表達(dá)載體編碼上述轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白的本發(fā)明的核酸，可以以一種適于在宿主細(xì)胞中表達(dá)融合蛋白的形式摻入重組表達(dá)質(zhì)粒。術(shù)語“以一種適于在宿主細(xì)胞中表達(dá)融合蛋白的形式”指重組表達(dá)質(zhì)粒含有一段或多段調(diào)節(jié)序列，它(們)經(jīng)操作連接到編碼融合蛋白的核酸上，并能使核酸轉(zhuǎn)錄成mRNA，mRNA翻譯成融合蛋白。術(shù)語“調(diào)節(jié)序列”在本領(lǐng)域中含義明確，包括啟動子、增強(qiáng)子及其它表達(dá)控制成分(例如多聚腺苷化信號)。此類調(diào)節(jié)序列在本領(lǐng)域廣為人知，其描述見Goeddel，《基因表達(dá)技術(shù)酶學(xué)方法》185，學(xué)術(shù)出版社，San Diego，CA(1990)。應(yīng)當(dāng)理解，表達(dá)質(zhì)粒的設(shè)計可能依賴于將被轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞的選擇和/或?qū)⒈槐磉_(dá)的融合蛋白的量等因素。
在哺乳動物細(xì)胞中使用時，重組表達(dá)載體的控制功能常常由病毒遺傳物質(zhì)提供。例如，常用的啟動子來源于多瘤病毒、腺病毒2、細(xì)胞肥大病毒和猿病毒40。利用病毒調(diào)節(jié)成分指導(dǎo)融合蛋白的表達(dá)可使融合蛋白在許多宿主細(xì)胞中高水平組成性表達(dá)。在優(yōu)選的重組表達(dá)載體中，編碼融合蛋白的序列上游(即5’)是人類細(xì)胞肥大病毒IE啟動子，下游(即3’)是SV40多聚(A)信號。例如，用與實施例1描述的表達(dá)質(zhì)粒相似的表達(dá)質(zhì)粒。人類細(xì)胞肥大病毒IE啟動子的描述見Boshart等人(1985)Cell41521-530。其它可用的通用表達(dá)啟動子包括HSV-Tk啟動子(其描述見McKnight等人(1984)Cell37253-262)和β-肌動蛋白啟動子(例如人類β-肌動蛋白啟動子，其描述見Ng等人(1985)分子細(xì)胞生物學(xué)52720-2732)。
另外，重組表達(dá)載體的調(diào)節(jié)序列能在特定細(xì)胞類型中指導(dǎo)融合蛋白的表達(dá)，即，使用組織特異性調(diào)節(jié)成分?？捎玫慕M織特異性啟動子的非限制例子包括清蛋白啟動子(肝特異性，Pinkert等人(1987)Genes Rev.1268-277)，淋巴特異性啟動子(Calame與Eaton(1988)Adv.Immunol.43235-275)，特別是T細(xì)胞受體的啟動子(Winoto和Baltimore(1989)EMBO J.8729-733)和免疫球蛋白的啟動子(Banerji等人(1983)Cell33729-740；Queen和Baltimore(1983)Cell33741-748)。神經(jīng)元特異性啟動子(例如，神經(jīng)纖維啟動子，Byrne和Ruddle(1989)美國國家科學(xué)院院刊865473-5477)，胰特異性啟動子(Edlund等人(1985)Science230912-916)和哺乳動物腺特異性啟動子(例如，牛乳乳清啟動子，美國專利4,873,316號和歐洲申請公開264,166號)。發(fā)育調(diào)節(jié)的啟動子也包括在內(nèi)，例如鼠hox啟動子(Kessel和Gruss(1990)Science249374-379)和α-胎蛋白啟動子(Campes和Tilghman(1989)Genes Dev.3537-546)。
另外，可制得編碼轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白的自調(diào)節(jié)構(gòu)建體。為此，編碼融合蛋白的核酸經(jīng)操作連接到最小啟動子序列和至少一段tet操縱子序列上。例如，SEQ ID NO1的核酸可連到具有SEQ ID NO8、9或10給出的核苷酸序列的啟動子上(SEQ ID NO8和9的核酸包括一個最小CMV啟動子和十個tet操縱子；SEQ ID NO10的核酸包括一個TK啟動子和十個tet操縱子)。圖9B給出這樣的自調(diào)節(jié)構(gòu)建體的示意圖。當(dāng)該核酸被引入細(xì)胞時(例如在重組表達(dá)載體中)，由于“泄漏”，會有轉(zhuǎn)錄激活物基因的少量基底轉(zhuǎn)錄。當(dāng)Tc(或其類似物)存在時，這些少量的轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白會結(jié)合到編碼轉(zhuǎn)錄激活物的核苷酸序列上游的tet操縱子序列上，激活編碼轉(zhuǎn)錄激活物的核苷酸序列的進(jìn)一步轉(zhuǎn)錄，于是引起細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白的進(jìn)一步產(chǎn)生。本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員應(yīng)當(dāng)理解，這樣的自調(diào)節(jié)啟動子可以與其它四環(huán)素調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄激活物共用，例如與野生型Tet阻遏子融合蛋白(tTA)，其描述見Gossen.M.和Bujard.H.(1992)美國國家科學(xué)院院刊895547-5551，后者當(dāng)Tc不存在時結(jié)合到tet操縱子上(見圖9A)。當(dāng)與該轉(zhuǎn)錄激活物共用時，若Tc不存在，則編碼該轉(zhuǎn)錄激活物的核苷酸序列的自調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄被激活。含有編碼上面引用Gossen和Bujard(1992)描述的tTA的核苷酸序列的質(zhì)粒pUHD 15-3，經(jīng)操作連到自調(diào)節(jié)啟動子上。該質(zhì)粒根據(jù)布達(dá)佩斯協(xié)議已于1994年7月8日保藏于德國布朗施威格的德國微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSM)，保藏號DSM 9280。
在一個實施方案中，本發(fā)明的重組表達(dá)載體是一個質(zhì)粒，如實施例1所述。備選地，本發(fā)明的重組表達(dá)載體可以是病毒或其部分，使引入病毒核酸的核酸能夠表達(dá)。例如可用復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺病毒相關(guān)病毒。用這些病毒生產(chǎn)重組逆轉(zhuǎn)錄病毒和在體內(nèi)或體外感染細(xì)胞的操作規(guī)程見《分子生物學(xué)現(xiàn)代操作規(guī)程》，Ausubel，F(xiàn).M.等人(編)，Greene出版社，(1989)9.10-9.14節(jié)和其它標(biāo)準(zhǔn)實驗室手冊，合適的逆轉(zhuǎn)錄病毒的例子包括pLJ，pZIP，pWE和pEM。本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員對它們都很熟悉。合適的包裝病毒系的例子包括ψCrip、ψCre、ψ2和ψAm?？梢圆僮飨俨《镜幕蚪M，使它編碼并表達(dá)轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白但失去在正常裂解病毒生命周期中復(fù)制的能力。例如見Berkner等人(1988)生物技術(shù)6616；Rosenfeld等人(1991)Science252431-434；以及Rosenfeld等人(1992)Cell68143-155。來自腺病毒株Ad型5 d1324或其它腺病毒株(例如Ad2，Ad3，Ad7等)的合適的腺病毒載體對本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員來說都很熟悉。另外，如Tratschin等人(1985)分子細(xì)胞生物學(xué)，53251-3260描述的腺病毒相關(guān)病毒可用來表達(dá)轉(zhuǎn)基因融合蛋白。
B.宿主細(xì)胞通過將編碼融合蛋白的核酸引入宿主細(xì)胞使本發(fā)明的融合蛋白在真核細(xì)胞中表達(dá)，其中該核酸適于在宿主細(xì)胞中表達(dá)融合蛋白。例如，可將編碼融合蛋白的本發(fā)明的重組表達(dá)載體引入宿主細(xì)胞。接，編碼融合蛋白的核酸經(jīng)操作連接到調(diào)節(jié)序列(例如啟動子序列)上但沒有附加的載體序列，可以引入宿主細(xì)胞。此處，術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括任何真核細(xì)胞或細(xì)胞系，只要這些細(xì)胞或細(xì)胞系與待表達(dá)蛋白質(zhì)、所選的篩選體系或所用的發(fā)酵體系相容即可?？捎玫牟溉閯游锛?xì)胞系的非限制性的例子包括CHO dhfr-細(xì)胞(Urlaub和Chasin(1980)美國國家科學(xué)院院刊774216-4220)，293細(xì)胞(Graham等人(1977)病毒遺傳學(xué)雜志，86 pp 59)或骨髓瘤細(xì)胞如SP2或NSO(Galfre和Milstein(1981)酶學(xué)方法，73(B)3-46)。
除了這些細(xì)胞系，本發(fā)明也可應(yīng)用于正常細(xì)胞，如修飾用于基因治療目的的細(xì)胞或修飾后用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因或同源重組動物的胚胎細(xì)胞。對基因治療目的有特殊價值的細(xì)胞類型的例子包括造血干細(xì)胞、成骨細(xì)胞、肝細(xì)胞、白細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞和皮膚上皮及氣管上皮。另外，對轉(zhuǎn)基因或同源重組動物，胚胎干細(xì)胞和受精卵細(xì)胞經(jīng)修飾可包含編碼轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白的核酸。而且植物細(xì)胞可經(jīng)修飾用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。
本發(fā)明可廣泛應(yīng)用，包括非哺乳動物的真核細(xì)胞，包括昆蟲(例如Sp.frugiperda)，酵母(例如釀酒酵母，裂殖酵母，P.pastoris，乳酸克雷伯氏菌，H.polymorpha；一般性綜述見Fleer，R.(1992)生物技術(shù)的當(dāng)代觀念3(5)486-496)，真菌和植物細(xì)胞。在釀酒酵母中表達(dá)的載體的例子包括pYepSecl(Baldari等人(1987)Embo J.6229-234)，pMfa(Kurjan和Herskowitz，(1982)Cell30933-943)，pJRY88(Schultz等人(1987)Gene54113-123)和pYES2(Invitrogen公司，San Diego，CA)。融合蛋白在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)可用桿狀病毒表達(dá)載體(見例如O’Reilly等人(1992)《桿狀病毒表達(dá)載體實驗手冊，Stockton出版社)?？晒┍磉_(dá)蛋白的桿狀病毒載體包括pAc系列(Smith等人(1983)分子細(xì)胞生物學(xué)32156-2165)和pVL系列(Lucklow，V.A.和Summers，M.D.(1989)病毒學(xué)17031-39)。
C.將核酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞可以用轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將編碼融合蛋白的核酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞中。術(shù)語“轉(zhuǎn)染”包括所有將核酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞的常規(guī)技術(shù)，包括磷酸鈣共沉淀，DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，脂轉(zhuǎn)染，電穿孔和微注射。轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的適當(dāng)方法見于Sambrook等人(分子克隆實驗手冊，第二版，冷泉港出版社(1989))，及其它實驗教材。
用本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的數(shù)目至少部分依賴所用重組表達(dá)載體的類型和所用轉(zhuǎn)染技術(shù)的類型。核酸可瞬時地導(dǎo)入宿主細(xì)胞，或是典型地，為了長時間調(diào)節(jié)基因表達(dá)，核酸穩(wěn)定地整合到宿主細(xì)胞的基因組中或成為宿主細(xì)胞中穩(wěn)定的附加體。導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞的質(zhì)粒載體典型地只以低頻率整合到宿主細(xì)胞DNA中。為了鑒定這些整合部分，通常將含有選擇標(biāo)記(例如藥物抗性)的基因同目的核酸一同引入宿主細(xì)胞。優(yōu)選的選擇標(biāo)記包括那些對某些藥物(例如G418和Hydromycin)有抗性的選擇標(biāo)記。選擇標(biāo)記可以通過與目的核酸不同的質(zhì)粒引入，或是在同一質(zhì)粒上引入。用本發(fā)明的核酸(例如重組表達(dá)載體)感染的宿主細(xì)胞和選擇標(biāo)記基因可用選擇標(biāo)記選擇細(xì)胞來識別。例如，如果選擇標(biāo)記基因編碼帶有新霉素抗性的基因，接受核酸的宿主細(xì)胞可用G418選擇。摻入選擇標(biāo)記基因的細(xì)胞會生存下去，而其它細(xì)胞死亡。
被編碼本發(fā)明融合蛋白的核酸轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞可以進(jìn)一步被一個或多個用作融合基因的靶的核酸轉(zhuǎn)染。靶核酸含有經(jīng)操作連接到至少一段tet操縱子序列的待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列(由下面第III小節(jié)詳細(xì)描述)。
可以用常規(guī)轉(zhuǎn)染技術(shù)在體外將編碼本發(fā)明的融合蛋白的核酸導(dǎo)入在培養(yǎng)基中生長的真核細(xì)胞(例如磷酸鈣沉淀，DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染，電穿孔等)。核酸也可在體內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中，例如應(yīng)用適于在體內(nèi)將核酸引入細(xì)胞的呈遞機(jī)制，諸如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(見例如Ferry，N.等人(1991)美國國家科學(xué)院院刊888377-8381；和Kay.M.A.等人(1992)人類基因療法3641-647)，腺病毒載體(見例如Rosenfeld，M.A.(1992)Cell68143-155；和Herz，J和Gerard，R.D.(1993)美國國家科學(xué)院院刊902812-2816)。受體介導(dǎo)的DNA攝取(見例如，Wu，G.和Wu，C.H.(1988)生物化學(xué)雜志26314621；Wilson等人(1992)生物化學(xué)雜志267963-967；和美國專利5,166,320號)，DNA直接注射(見例如Acsadi等人(1991)Nature332815-818；和Wolff等人(1990)Science2471465-1468)或粒子轟擊(見例如Cheng，L.等人(1993)美國國家科學(xué)院院刊904455-4459，和Zelenin，A.V.等人(1993)FEBS letters31529-32)。因此，對基因療法用途，細(xì)胞或在體外修飾后給受試者施用或，任選地，細(xì)胞可直接在體內(nèi)修飾。
D.轉(zhuǎn)基因生物體轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白的核酸可以轉(zhuǎn)移到非人類動物的受精卵細(xì)胞中，產(chǎn)生能在一種或幾種細(xì)胞類型中表達(dá)本發(fā)明的融合蛋白的轉(zhuǎn)基因動物。轉(zhuǎn)基因動物是細(xì)胞中含有轉(zhuǎn)基因的動物，其中的轉(zhuǎn)基因在產(chǎn)前，例如胚胎階段引入動物或動物前體。轉(zhuǎn)基因是整合到一個細(xì)胞的基因組中的DNA，從該細(xì)胞發(fā)育出轉(zhuǎn)基因動物，并且該DNA保留在成熟的動物的基因組中，從而指導(dǎo)編碼基因的產(chǎn)物在轉(zhuǎn)基因動物的一種或多種細(xì)胞類型或組織中的表達(dá)，在一個實施方案中，非人類動物是小鼠，當(dāng)然本發(fā)明不限于此。在其它實施方案中，轉(zhuǎn)基因動物是山羊、綿羊、豬、牛或其它家畜。這些動物利于大量生產(chǎn)蛋白質(zhì)(所謂的“基因農(nóng)牧”)。
可以通過例如將編碼融合蛋白的核酸(典型地連到合適的調(diào)節(jié)成分上，諸如組成性或組織特異性增強(qiáng)子)引入受精卵的雄性前核(pronuclei)，例如通過微注射，再讓卵細(xì)胞在假孕雌性動物中發(fā)育，這樣來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物。轉(zhuǎn)基因也可包括內(nèi)含子序列和多核苷化信號來提高轉(zhuǎn)基因表達(dá)的效率。產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物(尤其是諸如老鼠的動物)的方法在本領(lǐng)域已常規(guī)化，其描述見于，例如美國專利4,736,866號和4,870,009號以及Hogan，B等人(1986)《實驗手冊》冷泉港，紐約州，冷泉港出版社。轉(zhuǎn)基因育種動物可用來生育更多的攜帶轉(zhuǎn)基因的動物。攜帶編碼本發(fā)明的融合蛋白的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動物可進(jìn)一步與攜帶其它轉(zhuǎn)基因的其它轉(zhuǎn)基團(tuán)動物交配，例如與含有經(jīng)操作連到tet操縱子序列的基因的轉(zhuǎn)基因動物交配(詳細(xì)討論見下面的III小節(jié))。
應(yīng)當(dāng)理解，除了轉(zhuǎn)基因動物，此處描述的調(diào)節(jié)體系也可應(yīng)用于其它轉(zhuǎn)基因生物體，例如轉(zhuǎn)基因植物?？捎帽绢I(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)得到轉(zhuǎn)基因植物。相應(yīng)地，本發(fā)明涵蓋含有表達(dá)本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白的細(xì)胞的非人類轉(zhuǎn)基因生物體，包括動物和植物(即，編碼轉(zhuǎn)錄激活物的核酸加入到轉(zhuǎn)基因生物體的細(xì)胞中的一條或多條染色體上。
E.同源重組生物體本發(fā)明也提供表達(dá)本發(fā)明的融合蛋白的同源重組非人類生物體。術(shù)語“同源重組生物體”此處用來描述一種生物體，例如動物或植物，它含有一個基因。通過該基因與引入該動物的細(xì)胞，例如該動物的胚胎細(xì)胞，中的DNA分子同源重組而被修飾。在一個實施方案中，非人類動物是小鼠，當(dāng)然本發(fā)明不限于此?？梢援a(chǎn)生一種動物，其中編碼融合蛋白的核酸被引入基因組的特定位點，即該核酸與內(nèi)源基因同源重組。
為了產(chǎn)生這樣的同源重組動物，制備一載體，它含有編碼融合蛋白的DNA，其5’和3’端被附加的真核基因的核酸包圍，并在這里發(fā)生同源重組。包圍著編碼融合蛋白附加的核酸長度足以與真核基因成功地同源重組。典型地，載體中包括幾千個堿基的包圍DNA(在5’端和3’端)(見例如Thomas，K.R.和Capecchi，M.R.(1987)Cell51503同源重組載體的描述)。載體引入胚胎干細(xì)胞系(例如通過電穿孔)再選擇那些引入的DNA與內(nèi)源DNA發(fā)生同源重組的細(xì)胞(見例如Li，E等人(1992)Cell69915)。選擇到的細(xì)胞然后注射入動物(例如鼠)的胚細(xì)胞中形成集群嵌合體(見例如Bradley.A.在畸形瘤和骨髓干細(xì)胞實用方法，E.J.Robertson編(IRL，牛津1987)113-152頁)。然后將嵌合體胚胎移植到適當(dāng)?shù)募僭写菩該狃B(yǎng)動物中讓胚胎發(fā)育。在種質(zhì)細(xì)胞中攜帶同源重組DNA的后代可用來繁殖全部細(xì)胞均含有同源重組DNA的動物。這些“種系傳遞”細(xì)胞可進(jìn)一步與帶有經(jīng)操作連到至少一段tet操縱子序列上的基因的動物交配(詳細(xì)討論見下面的III小節(jié))。
除了上述同源重組方法，酶協(xié)助的點特異性整合體系在本領(lǐng)域已知?？捎糜诒景l(fā)明的調(diào)節(jié)體系的組分，將一個DNA分子整合到另一靶DNA分子的特定位置上。此類酶協(xié)助的整合體系的例子包括Cre重組酶-lox靶系統(tǒng)(例如見Baubonis，W.和Sauer，B.(1993)核酸研究212025-2029；和Fukushige，S.和Sauer，B(1992)美國國家科學(xué)院院刊897905-7909)以及FLP重組酶-FRT靶體系(例如見Dang，D.T.和Perrimon.N.(1992)Dev.Genet.13367-375；和Fiering，S.等人(1993)美國國家科學(xué)院院刊908469-8473)。
III.四環(huán)素可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活物調(diào)節(jié)的靶轉(zhuǎn)錄單元本發(fā)明的融合蛋白用于調(diào)節(jié)靶核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄。該靶核苷酸序列經(jīng)操作連到與融合蛋白結(jié)合的調(diào)節(jié)序列。更明確地，該融合蛋白調(diào)節(jié)經(jīng)操作連到至少一段tet操縱子序列上的核苷酸序列的表達(dá)。相應(yīng)地，本發(fā)明另一方面涉及靶核酸(例如DNA分子)，它含有一段經(jīng)操作連接到至少一段tet操縱子序列上的待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列。這種核酸此處稱為tet調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄單元(或簡稱轉(zhuǎn)錄單元)在轉(zhuǎn)錄單元中，“待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列”典型地包括本身不轉(zhuǎn)錄但(至少部分上)將轉(zhuǎn)錄裝置為轉(zhuǎn)錄定位的最小啟動子序列。最小啟動子序列沿5’到3’方向以磷酸二酯鍵連到待轉(zhuǎn)錄序列上(即，啟動子位于待轉(zhuǎn)錄基因上游)形成連續(xù)核苷酸序列。相應(yīng)地，術(shù)語“待轉(zhuǎn)錄序列”或“靶核苷酸序列”既包括將轉(zhuǎn)錄成mRNA的核苷酸序列又包括經(jīng)操作連接的上游最小啟動子序列。術(shù)語“最小啟動子”指部分啟動子序列，它確定待轉(zhuǎn)錄的連接上的序列的轉(zhuǎn)錄起始位點，但本身即使能夠也不足以有效地起始轉(zhuǎn)錄。因此，這樣的最小啟動子的活性依賴于轉(zhuǎn)錄激活物(例如本發(fā)明的四環(huán)素可誘導(dǎo)的融合蛋白)結(jié)合到經(jīng)操作連接的調(diào)節(jié)序列(例如一段或多段tet操縱子序列)上。在一個實施方案中，最小啟動子來源于人類細(xì)胞肥大病毒(描述見Boshart等人(1985)Cell41521-530)。優(yōu)選地用約+75到-53位和+75到-31的核苷酸。其它適當(dāng)?shù)淖钚幼釉诒绢I(lǐng)域已知，可用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)鑒定。例如，激活連續(xù)相連的信號基因的轉(zhuǎn)錄的功能啟動子(例如氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶，β-半乳糖苷酸或熒光素酶)可被持續(xù)地缺失直到它不能獨自激活信號基因的表達(dá)而必需附加調(diào)節(jié)序列存在。
轉(zhuǎn)錄單元中，靶核苷酸序列(包括待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列及其上游最小啟動子序列)經(jīng)操作連到至少一段tet操縱子序列上。在典型的構(gòu)型中，tet操縱子序列通過磷酸二酯鍵隔適當(dāng)距離經(jīng)操作連到最小啟動子序列的上游(即5’)使調(diào)節(jié)蛋白(例如轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白)結(jié)合tet操縱子序列后靶核苷酸序列轉(zhuǎn)錄。亦即，轉(zhuǎn)錄單元從5’到3’方向包括tet操縱子序列(一個或多個)-最小啟動子-待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列。本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員均應(yīng)理解tet操縱子序列(一個或多個)與最小啟動子之間容許的距離有一定靈活性，盡管典型地tet操縱子序列在最小啟動子上游約200-400堿基對范圍內(nèi)。
含有連在最小啟動子上的tet操縱子序列的tet調(diào)節(jié)的啟動子例子的核苷酸序列由SEQ ID NO8-10給出。SEQ ID NO8和9的核苷酸序列含有連在10個tet操縱子序列上的細(xì)胞肥大病毒最小啟動子；兩段核苷酸序列的操縱子與第一個轉(zhuǎn)錄的核苷酸之間的距離不同。SEQ IDNO10的核苷酸序列含有連在10個tet操縱子序列上的單純皰疹病毒最小tk啟動子。SEQ ID NO8的啟動子對應(yīng)PhCMV*-1，描述見Gossen，M.和Bujard，H.(1992)美國國家科學(xué)院院刊895547-5551。SEQ ID NO9的啟動子對應(yīng)PhCMV*-2，描述亦見Gossen，M.和Bujard，H.引述見上。
另外，本領(lǐng)域已發(fā)現(xiàn)在待轉(zhuǎn)錄序列下游起作用的調(diào)節(jié)成分，因而tet操縱子序列可能經(jīng)操縱連到轉(zhuǎn)錄核苷酸的下游(即3’)。因此，在這種構(gòu)型中，轉(zhuǎn)錄單元從5’到3’方向包括最小啟動子-轉(zhuǎn)錄核苷酸序列-tet操縱子序列(一個或多個)。同樣，應(yīng)當(dāng)理解tet操縱子序列連到下游的容許距離也可能有一定靈活性。
術(shù)語“tet操縱子序列”涵蓋所有類型的tet操縱子(例如A、B、C、D和E)。待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列可以經(jīng)操作連到單個tet操縱子序列上，或者為了提高調(diào)控范圍，它可以經(jīng)操作連到多份tet操縱子序列上(例如二、三、四、五、六、七、八、九、十或更多操縱子序列)。在優(yōu)選實施方案中，待轉(zhuǎn)錄序列經(jīng)操作連到七個tet操縱子序列上。
tet調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄單元可進(jìn)一步用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)加入到重組載體(例如質(zhì)粒或病毒載體)中。轉(zhuǎn)錄單元，或包含它的重組載體，可以如上述用標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)染技術(shù)引入宿主細(xì)胞中。應(yīng)當(dāng)理解，將轉(zhuǎn)錄單元引入宿主細(xì)胞群體中以后，可能有必要選擇能表現(xiàn)出tet操縱子相連的核苷酸序列低水平基底表達(dá)的宿主細(xì)胞克隆(即選擇宿主細(xì)胞，其中轉(zhuǎn)錄單元整合到某一位點，造成tet操縱子相連的核苷酸序列的低水平基底表達(dá))。進(jìn)一步，可用上述操作流程將tet調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄單元引入胚胎期非人類動物的基因組或引入植物細(xì)胞中，產(chǎn)生部分或全部細(xì)胞帶有轉(zhuǎn)錄單元的轉(zhuǎn)基因或同源重組生物體。同樣應(yīng)當(dāng)理解可能有必要選擇轉(zhuǎn)基因或同源生物體，其中感興趣的細(xì)胞中tet操縱子相連的核苷酸序列有低水平基底表達(dá)。
在一個實施方案中，tet調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄單元的靶核苷酸序列編碼目的基因。因此，本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄激活物誘導(dǎo)核苷酸序列表達(dá)并且得到的mRNA翻譯后，在宿主細(xì)胞或動物中產(chǎn)生目的基因。備選地，待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列可以編碼活性RNA分子，例如反義RNA分子或核酸酶。宿主細(xì)胞或動物中活性RNA分子的表達(dá)可用于調(diào)節(jié)宿主內(nèi)部功能(例如，通過抑制編碼蛋白的mRNA的翻譯，阻止感興趣蛋白的生產(chǎn))。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄激活物可用于調(diào)節(jié)引入宿主細(xì)胞或動物的外源核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄?！巴庠础焙塑账嵝蛄惺且欢我胨拗骷?xì)胞的核苷酸序列，典型地是插入宿主的基因組中。外源核苷酸序列可能在宿主基因組其它部分不存在(例如異己的核苷酸序列)或可能是宿主基因組中存在的多一份的序列，它整合到基因組中另一不同位點，待轉(zhuǎn)錄的外源核苷酸序列和經(jīng)操作連接的tet操縱子序列(一個或多個)可以存在于同一個核酸分子中，再引入宿主細(xì)胞或動物。
另外，本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄激活物可用來調(diào)節(jié)與tet操縱子序列相連的內(nèi)源核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄?！皟?nèi)源”核苷酸序列是存在于宿主基因組中的核苷酸序列。內(nèi)源基因可以通過含tetO重組載體和內(nèi)源基因序列之間同源重組經(jīng)操作連到tet操縱子序列上。例如，可制取同源重組載體，它包含至少一段tet操縱子序列和一個最小啟動子，后者3’端由代表內(nèi)源基因的編碼區(qū)的序列包圍，5’端由去除了真正啟動子區(qū)域的內(nèi)源基因上游區(qū)域的序列包圍。包圍序列的長度足以保持載體DNA與內(nèi)源基因成功的同源重組。優(yōu)選地，同源重組載體中包含幾千堿基的包圍DNA。載體DNA與宿主細(xì)胞中內(nèi)源基因同源重組后，內(nèi)源啟動子的一個區(qū)域被含有經(jīng)操作連到最小啟動子上的一個或多個tet操縱子序列的載體DNA取代。因此，內(nèi)源基因的表達(dá)不再受其內(nèi)源啟動子的控制而是受控于tet操縱子序列和最小啟動子。
在另一個實施方案中，tet操縱子序列通過同源重組可以插入內(nèi)源基因的其它位置，優(yōu)選地在5’或3’調(diào)節(jié)區(qū)內(nèi)，以產(chǎn)生一內(nèi)源基因，其表達(dá)受這里描述的四環(huán)素調(diào)節(jié)的融合蛋白的調(diào)節(jié)。例如，一段或多段tetO序列可以插入內(nèi)源基因的啟動子或增強(qiáng)子區(qū)域，而啟動子或增強(qiáng)子內(nèi)能得以保留(即tetO序列引入到啟動子/增強(qiáng)子區(qū)域的位點對啟動子/增強(qiáng)子功能并不十分重要)。改變以后而并不喪失啟動子/增強(qiáng)子功能的啟動子或增強(qiáng)子的區(qū)域在本領(lǐng)域?qū)Χ喾N基因都已知道或是可通過分析重要調(diào)節(jié)區(qū)域的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來確定。含有插入非重要調(diào)節(jié)區(qū)域的tetO序列的內(nèi)源基因仍將保留其以正常的組成性和/或組織特異性方式表達(dá)的能力，但也可通過四環(huán)素控制的轉(zhuǎn)錄抑制蛋白以可控方式減量調(diào)節(jié)。例如，這樣的修飾的內(nèi)源基因的組成性表達(dá)可以用抑制物融合蛋白在四環(huán)素(或類似物)存在時抑制，該抑制物融合蛋白在四環(huán)素(或類似物)存在時結(jié)合到tetO序列上(由下面的N小節(jié)和VI小節(jié)B部分繼續(xù)評述)。
A.tet操縱子連接的核苷酸序列的表達(dá)調(diào)節(jié)tet操縱子連接的核苷酸序列的表達(dá)受本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白的調(diào)節(jié)。因此，融合蛋白和靶核酸都存在于宿主細(xì)胞或生物體中。轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白與靶轉(zhuǎn)錄單位共存于同一宿主細(xì)胞或生物體可由許多不同方法實現(xiàn)。例如，用表達(dá)體系的核酸(例如編碼轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白)轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞選擇出來然后轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可以再轉(zhuǎn)染(亦稱“超轉(zhuǎn)染”)用的是對應(yīng)于表達(dá)體系另一核酸的核酸(例如待轉(zhuǎn)錄的靶核酸)?？捎脙煞N不同的選擇標(biāo)記來選擇，例如第一種核酸的攝取用G418選擇而第二種核酸的攝取用潮霉素選擇。備選地，單一細(xì)胞群體可用對應(yīng)于體系兩組分的核酸轉(zhuǎn)染。相應(yīng)地，本發(fā)明提供一種核酸組成，它包括·第一種核酸編碼激活轉(zhuǎn)錄的融合蛋白，該融合蛋白含有第一種多肽，該多肽在四環(huán)素或四環(huán)素類似物存在時結(jié)合到tet操縱子序列上并且經(jīng)操作連到激活真核細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的第二種多肽上。
·第二種核酸含有經(jīng)操作連到至少一段tet操縱子序列的待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列。
在一個實施方案中，兩種核酸是兩個不同分子(例如兩種不同載體)。在此情況下，宿主細(xì)胞被兩種核酸分子共轉(zhuǎn)染或者先是被一種核酸分子轉(zhuǎn)染然后緊接著被另一種核酸分子轉(zhuǎn)染。在另一實施方案中，兩種核酸分子(即共線性地)連在同一分子上(例如單個載體)。這種情況下，宿主細(xì)胞被單個核酸分子轉(zhuǎn)染。
宿主細(xì)胞可以是體外培養(yǎng)的細(xì)胞或體內(nèi)就有的細(xì)胞(例如定向用于基因療法的細(xì)胞)。宿主細(xì)胞可進(jìn)一步是受精卵細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞或其它用于產(chǎn)生非人類轉(zhuǎn)基因或同源重組動物的胚胎細(xì)胞。含有表達(dá)系統(tǒng)的兩種核酸組分的轉(zhuǎn)基因或同源重組動物可以通過將兩種核酸導(dǎo)入同樣的胚胎期細(xì)胞中產(chǎn)生，或者更優(yōu)選地，在基因組中攜帶體系的一種核酸組分的動物同基因組中攜帶體系的另一核酸組分的動物交配，遺傳到兩種核酸組分的后代可以用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)鑒別。
B.兩段核苷酸序列表達(dá)的協(xié)同調(diào)節(jié)除了提供一種調(diào)節(jié)單個轉(zhuǎn)錄核苷酸序列的表達(dá)的系統(tǒng)，本發(fā)明進(jìn)一步允許經(jīng)操作連到同一tet操縱子序列的兩段核苷酸序列表達(dá)的協(xié)同調(diào)節(jié)。相應(yīng)地，本發(fā)明的另一方面涉及用于協(xié)同調(diào)節(jié)兩個基因的新的tet調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄單元。在該轉(zhuǎn)錄單元中，同一tet操縱子序列調(diào)節(jié)兩個經(jīng)操作相連的核苷酸序列的表達(dá)，這兩個核苷酸序列從共同的tet操縱子序列以相反方向轉(zhuǎn)錄。相應(yīng)地，一段核苷酸序列經(jīng)操作連到tet操縱子序列的一邊(例如，DNA上鏈的5’端)而另一段核苷酸序列經(jīng)操作連到tet操縱子序列的相反一邊(例如，DNA上鏈的3’端)。另外，應(yīng)當(dāng)明白待轉(zhuǎn)錄的每段核苷酸序列包括一個經(jīng)操作相連的最小啟動子序列，它位于待轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列和tet操縱子序列之間。
這樣的轉(zhuǎn)錄單位的代表性例子由圖6示意性給出。在該載體中，經(jīng)操作連到同樣tet操縱子序列的兩段核苷酸序列，相對于tet操縱子序列的反向轉(zhuǎn)錄(即本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白激活后，待轉(zhuǎn)錄序列以趨異方式轉(zhuǎn)錄)。對于“相對于tet操縱子序列反向轉(zhuǎn)錄”指第一段核苷酸序列從DNA一條鏈上5’到3’轉(zhuǎn)錄(例如下面那條鏈)而第二段核苷酸序列從DNA另一條鏈5’到3’轉(zhuǎn)錄(例如上面那條鏈)，得到從tet操縱子序列的雙向轉(zhuǎn)錄。
相應(yīng)地，本發(fā)明提供用于兩段核苷酸序列協(xié)同調(diào)節(jié)地雙向轉(zhuǎn)錄的重組載體。在一個實施方案中，載體包含一段由磷酸二酯鍵連接的核苷酸序列，它從5’到3’方向包括·待轉(zhuǎn)錄的第一段核苷酸序列，經(jīng)操作連接·至少一段tet操縱子序列，經(jīng)操作連接·第二段待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列其中第一段和第二段核苷酸序列從至少一段tet操縱子序列反向進(jìn)行(即第一段和第二段核苷酸序列以趨異方式轉(zhuǎn)錄)。
在另一實施方案中，載體不包括待轉(zhuǎn)錄的第一段和第二段核苷酸序列，而是含有容許將感興趣的核苷酸序列引入載體的克隆位點。相應(yīng)地，在此實施方案中，載體包含一段核苷酸序列，它從5’到3’方向包括·用于引入待轉(zhuǎn)錄的第一段核苷酸序列的第一個克隆位點，經(jīng)操作連接到·至少一段tet操縱子序列，經(jīng)操作連接·用于引入待轉(zhuǎn)錄的第二段核苷酸序列的第二個克隆位點其中引入載體的第一段和第二段核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄從至少一段tet操縱子序列反向進(jìn)行。本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員應(yīng)當(dāng)理解這種類型的“克隆載體”也可能包括最小啟動子序列，引入第一個克隆位點的第一段核苷酸序列經(jīng)操作連到第一個最小啟動子上而引入第二個克隆位點的第二段核苷酸序列經(jīng)操作連到第二個最小啟動子上。備選地，“克隆載體”可能不包括最小啟動子序列，而是包含相連的最小啟動子序列的核苷酸序列引入載體的克隆位點。
術(shù)語“克隆位點”涵蓋至少一個限制性內(nèi)切酶位點，典型地，多個不同限制性內(nèi)切酶位點(例如多聚銜接物)包含于核酸中。
在另外一個實施方案中，用于協(xié)調(diào)兩段核苷酸序列的雙向轉(zhuǎn)錄的載體可以含有待轉(zhuǎn)錄的第一個核苷酸以編碼檢測標(biāo)記(例如熒光素酶或β-半乳糖苷酶)以及用于引入感興趣的第二段核苷酸序列的克隆位點。
此處描述的用于在一個載體中協(xié)同調(diào)節(jié)兩段待轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列的兩個不同的合適雙向啟動子區(qū)域的核苷酸序列，由圖7A和7B給出(分別為SEQ ID NO6和7)。圖7A的結(jié)構(gòu)中，兩個最小啟動子均來源于CMV啟動子。在圖7B的結(jié)構(gòu)中，結(jié)構(gòu)上的一個最小啟動子來源于CMV啟動子，而另一個最小啟動子來源于TK啟動子。含有本發(fā)明的雙向啟動子的質(zhì)粒pUHDG 1316-8根據(jù)布達(dá)佩斯協(xié)議于1994年7月8日保藏于德國布朗施威格的德國微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSM)，保藏號為DSM 9287。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄單元用于經(jīng)操作連到相同tet操縱子序列的兩段核苷酸序列的雙向轉(zhuǎn)錄，對協(xié)調(diào)兩段感興趣的核苷酸序列的表達(dá)很有用。優(yōu)選地，至少一段待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列是真核核苷酸序列。在一種應(yīng)用中，載體用于同一細(xì)胞中生產(chǎn)一種異二聚體分子的化學(xué)計量量的兩個亞基。例如，該載體可用于在同一細(xì)胞中生產(chǎn)抗體重鏈和輕鏈，或在同一細(xì)胞中生產(chǎn)生長因子受體亞基。在另一種應(yīng)用中，載體用于表達(dá)在確立一種特定細(xì)胞表現(xiàn)型時相互作用的兩個基因產(chǎn)物。在另一種應(yīng)用中，該載體用來共同表達(dá)指示物功能和目的基因，其中指示物用來鑒測目的基因的表達(dá)。因此，兩種協(xié)調(diào)表達(dá)的序列其一編碼目的基因，另一編碼檢測標(biāo)記，例如表面標(biāo)記物或酶(例如β-半乳糖苷酶或熒光素酶)，它們用來選擇表達(dá)目的基因的細(xì)胞。
可用本發(fā)明的Tc可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活物用四環(huán)素(或其類似物)誘導(dǎo)兩段協(xié)同調(diào)節(jié)的核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄來調(diào)節(jié)兩段核苷酸序列的表達(dá)。因此，在該體系中，當(dāng)Tc(或類似物)不存在時兩種核苷酸序列的表達(dá)都“關(guān)”，而Tc(或類似物)存在時表達(dá)又“開”。備選地，協(xié)同調(diào)節(jié)兩段核苷酸序列的載體可與本領(lǐng)域已知的其它四環(huán)素調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子共同使用。例如，野生型tet阻遏子的轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白融合到轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域上，在Tc(或類似物)不存在時激活基因表達(dá)，例如tTA，描述見Gossen，M.和Bujard，H.(1992)美國國家科學(xué)院院刊895547-5551，它也可以與該靶轉(zhuǎn)錄單元共同用來協(xié)同調(diào)節(jié)。
C.多種核苷酸序列表達(dá)的獨立調(diào)節(jié)本發(fā)明進(jìn)一步允許兩段或多段待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列的獨立或反向調(diào)節(jié)。相應(yīng)地，本發(fā)明的另一方面涉及用于兩個或多個基因的獨立調(diào)節(jié)的新型tet調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄單元。為了獨立調(diào)節(jié)兩段待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列的表達(dá)，一段核苷酸序列經(jīng)操作連接到一種類型的tet操縱子序列上，另一核苷酸序列經(jīng)操作連接到另一種類型的tet操縱子序列上。相應(yīng)地，本發(fā)明提供至少一種用于獨立調(diào)節(jié)兩段核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄的重組載體。在一個實施方案中，載體包含·經(jīng)操作連接到至少一段第一種類型的tet操縱子序列上的待轉(zhuǎn)錄的第一段核苷酸序列；和·經(jīng)操作連接到至少一段第二種類型的tet操縱子序列上的待轉(zhuǎn)錄的第二段核苷酸序列。
(應(yīng)當(dāng)理解每段待轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列也包含一段經(jīng)操作相連的上游最小啟動子序列。)兩個獨立調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄單元可能包含于單個載體上，或任選地，在兩個不同載體上。含有待轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列的重組載體可以依前述引入宿主細(xì)胞或動物。
在另一實施方案中，載體并不含有待轉(zhuǎn)錄的第一段和第二段核苷酸序列，而是含有允許將目的基因引入載體的克隆位點。相應(yīng)地，在該實施方案中，載體包含·引入經(jīng)操作連接到至少一段第一種類型的tet操縱子序列上的待轉(zhuǎn)錄的第一段核苷酸序列的第一克隆位點；和·引入經(jīng)操作連接到至少一段第二種類型的tet操縱子序列上的待轉(zhuǎn)錄的第二段核苷酸序列的第二克隆位點。該克隆載體可能已經(jīng)包括經(jīng)操作分別連接到第一和第二克隆位點的第一和第二最小啟動子。備選地，包含著經(jīng)操作連接上的最小啟動子的待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列可被引入克隆載體。
在另一實施方案中，用于獨立調(diào)節(jié)兩段核苷酸序列的載體可能含有經(jīng)操作連到至少一段第一類型的tet操縱子序列的待轉(zhuǎn)錄第一核苷酸，例如編碼檢測標(biāo)記或自殺基因，以及引入第二段感興趣的核苷酸序列的克隆位點，以使其經(jīng)操作連到至少一段第二種類型的tet操縱子序列。
本領(lǐng)域的專業(yè)人員應(yīng)當(dāng)理解tet操縱子序列的類型的不同組合可用于獨立調(diào)節(jié)兩段核苷酸序列。例如，第一段tet操縱子序列可以是A類，第二段可以是B類；或者第一段tet操縱子序列可以是B類而第二段可以是C類，等等。優(yōu)選地，所用的兩段tet操縱子的一段是B類操縱子。
通過進(jìn)一步在宿主細(xì)胞中引入一個或多個核酸，它們編碼兩種獨立結(jié)合不同類型的tet操縱子序列的不同轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白，可以在宿主細(xì)胞中調(diào)節(jié)第一和第二段核苷酸序列的獨立轉(zhuǎn)錄。第一融合蛋白含有一段多肽，當(dāng)四環(huán)素或四環(huán)素類似物存在時該多肽結(jié)合tet操縱子序列且該多肽經(jīng)操作連到在真核細(xì)胞中激活轉(zhuǎn)錄的多肽上(例如，本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白，例如突變的Tn10來源Tet阻遏子連接到VP16激活區(qū)域)。第二融合蛋白含有一段當(dāng)四環(huán)素或四環(huán)素類似物不存在時結(jié)合tet操縱子序列的多肽，它經(jīng)操作連上一段在真核細(xì)胞中激活轉(zhuǎn)錄的多肽(例如野生型Tn10來源的Tet阻遏子連上VP16激活區(qū)域，諸如tTA，描述見Gossen，M.和Bujard，H.(1992)美國國家科學(xué)院院刊895547-5551)。在一個實施方案中，第一融合蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)錄單元中所用的第一類型的tet操縱子序列而第二融合蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)錄單元中所用的第二類型的tet操縱子序列。備選地，在另一實施方案中，第一融合蛋白結(jié)合第二類tet操縱子而第二融合蛋白結(jié)合第一類tet操縱子。
例如，待轉(zhuǎn)錄的第一段核苷酸序列可以連上A類tet操縱子而第一融合蛋白結(jié)合A類tet操縱子，待轉(zhuǎn)錄的第二段核苷酸序列可以連上B類tet操縱子而第二融合蛋白結(jié)合B類tet操縱子。因此，在該實施方案中，當(dāng)Tc(或其類似物)存在時，激活第一段核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄而當(dāng)Tc(或其類似物)不存在時激活第二段核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄。備選地，在另一實施方案中，第一融合蛋白結(jié)合B類操縱子而第二融合蛋白結(jié)合A類操縱子。在這種情況下，當(dāng)Tc(或其類似物)存在時激活第二段核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄而當(dāng)Tc(或其類似物)不存在時激活第一段核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄。用于本體系的適當(dāng)轉(zhuǎn)錄激活物蛋白可根據(jù)I小節(jié)及Gossen，M.t和Bujard，H.(1992)引述見上的描述來設(shè)計。為了抑制同一細(xì)胞中兩種不同類型的Tet阻遏子融合蛋白之間異二聚化，可能有必要誘變轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白之一或二者的二聚化區(qū)域。突變可定向于已知涉及二聚化的TetR C末端區(qū)域。根據(jù)TetR的晶體結(jié)構(gòu)已詳細(xì)描述了該二聚化區(qū)(見Hinrichs，W.等人(1994)Science264418-420)。
本體系允許Tc及其類似物對二種基因表達(dá)的獨立或反向調(diào)控。采用不同的Tc類似物作為誘導(dǎo)劑可能進(jìn)一步使不同序列高水平、低水平或中等水平表達(dá)(詳細(xì)討論見下面的V小節(jié))。上述的用于獨立調(diào)節(jié)兩個基因表達(dá)的本發(fā)明的新型轉(zhuǎn)錄單元可用于下述情況同一細(xì)胞中表達(dá)兩種基因產(chǎn)物，但需要表達(dá)其中一種基因產(chǎn)物而另一基因產(chǎn)物表達(dá)被“關(guān)閉”，或者反過來。例如，本體系特別適用于在同一宿主細(xì)胞中表達(dá)治療基因或自殺基因(即一個編碼一種產(chǎn)物的基因，該產(chǎn)物可用于殺滅細(xì)胞，諸如蓖麻蛋白或單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶)。在許多基因療法條件下，需要表達(dá)在宿主細(xì)胞中用于治療用途的基因，但當(dāng)療程結(jié)束時它有能力殺滅宿主細(xì)胞。用上述體系，通過將治療基因連上一種類型的tet操縱子，將自殺基因連到另一種類型的tet操縱子，能實現(xiàn)這一目的。因此，可以用Tc激活宿主細(xì)胞中治療基因的表達(dá)(這種情況下自殺基因不表達(dá))。然后，一旦療程結(jié)束，去除Tc，則關(guān)閉治療基因的表達(dá)并開啟細(xì)胞中自殺基因的表達(dá)。
D.多段核苷酸序列的混合型協(xié)同與獨立調(diào)節(jié)進(jìn)一步可能通過綜合IIIB小節(jié)描述的體系和IIIC小節(jié)描述的體系來調(diào)節(jié)四段核苷酸序列的表達(dá)，使兩對序列協(xié)同調(diào)節(jié)而一對相對于另一對獨立調(diào)節(jié)。相應(yīng)地，兩個靶轉(zhuǎn)錄單元可設(shè)計成包括·第一核酸從5’到3’方向包括第一段待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列，第一種類型的tet操縱子序列，和第二段待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列，·第二核酸從5’到3’方向包括第三段待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列，第二種類型的tet操縱子序列和第四段待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列。
第一核酸的第一段和第二段核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄從第一種類型tet操縱子序列以趨異方式進(jìn)行。相似地，第二核酸的第三段和第四段核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄從第二種類型tet操縱子序列以趨異方式進(jìn)行。因此，第一段和第二段核苷酸序列的表達(dá)是協(xié)同調(diào)節(jié)的而且第三段和第四段核苷酸序列的表達(dá)也是協(xié)同調(diào)節(jié)的。然而，通過使用兩種不同的轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白。如上所述，其中一種當(dāng)Tc(或其類似物)存在時激活轉(zhuǎn)錄而另一種當(dāng)Tc(或其類似物)不存在時激活轉(zhuǎn)錄，第一段和第二段序列的表達(dá)相對于第三段和第四段序列獨立(或反向)調(diào)節(jié)。一種轉(zhuǎn)錄激活物設(shè)計成結(jié)合第一種類型的tet操縱子而另一種設(shè)計成結(jié)合第二種類型的tet操縱子。在另一實施方案中，這些轉(zhuǎn)錄單元不是已經(jīng)包含了待轉(zhuǎn)錄的第一段、第二段、第三段和/或第四段核苷酸序列，而是含有可引入待轉(zhuǎn)錄的第一段、第二段、第三段和/或第四段核苷酸序列的克隆位點。
IV.四環(huán)素調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄抑制物本發(fā)明的另一方面涉及轉(zhuǎn)錄抑制物融合蛋白。本發(fā)明的抑制物融合蛋白可類似本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白(見上面的I小節(jié))來構(gòu)建，不過它不包括一個在真核細(xì)胞中激活轉(zhuǎn)錄的多肽結(jié)構(gòu)域，而包括一個在真核細(xì)胞中抑制轉(zhuǎn)錄的多肽結(jié)構(gòu)域。該抑制物融合蛋白用于減量調(diào)節(jié)經(jīng)操作連到tetO序列上的基因的表達(dá)。例如，當(dāng)tetO相連的基因引入宿主細(xì)胞或動物中，該基因的基底組成性表達(dá)可能根據(jù)基因所引入的細(xì)胞或組織類型及基因整合的位點而不同。備選地，其中引入了tetO序列的內(nèi)源基因的組成性表達(dá)可能令根據(jù)其周圍其它內(nèi)源調(diào)節(jié)序列的強(qiáng)度而變。此處描述的抑制物融合蛋白提供了可用于以可控方式抑制這樣的tetO相連基因的表達(dá)的組成。
在一個實施方案中，本發(fā)明的抑制物融合蛋白包含第一種多肽，它當(dāng)四環(huán)素(Tc)或其類似物不存在而非存在時結(jié)合tet操縱子序列并且經(jīng)操作連到在真核細(xì)胞中抑制轉(zhuǎn)錄的異源第二種多肽上。在另一實施方案中，抑制物融合蛋白含有第一種多肽，它當(dāng)四環(huán)素存在而非不存在時結(jié)合tet操縱子序列并且經(jīng)操作連到在真核細(xì)胞中抑制轉(zhuǎn)錄的異源第二種多肽上。術(shù)語“異源的”指第二種多肽與第一種多肽來源于不同的蛋白質(zhì)。與轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白相似，轉(zhuǎn)錄抑制融合蛋白可用此處描述的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)制取。
A.轉(zhuǎn)錄抑制物融合蛋白的第一種多肽本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄抑制物融合蛋白部分上包括(i)當(dāng)四環(huán)素(Tc)或其類似物不存在而非存在時，或備選地(ii)當(dāng)四環(huán)素或其類似物存在而非不存在時結(jié)合tet操縱子序列的第一種多肽。
優(yōu)選地，在前面實施方案中，第一種多肽是野生型Tet阻遏子(它當(dāng)Tc不存在而非存在時結(jié)合tet操縱子序列)。任何一種類型的野生型Tet阻遏子(例如A、B、C、D或E)可用作第一種多肽。優(yōu)選地，野生型Tet阻遏子是Tn10來源的Tet阻遏子。野生型Tn10來源的Tet阻遏子的核苷酸序列和氨基酸序列分別由SEQ ID NO16和SEQ ID NO17給出。
備選地，在后者實施方案中，第一種多肽是突變型Tet阻遏子，描述見I小節(jié)A部分(當(dāng)Tc存在時而非不存在時它結(jié)合tet操縱子序列)。任何一種類型的突變型Tet阻遏子(例如A、B、C、D或E)可用作第一種多肽。優(yōu)選地，突變型Tet阻遏子是Tn10來源的阻遏子，在位置71、95、101和/或102有一個或多個氨基酸替換。突變型Tn10來源的Tet阻遏子的核苷酸和氨基酸序列分別由SEQ ID NO18和SEQ ID NO19給出。
B.轉(zhuǎn)錄抑制物融合蛋白的第二多肽轉(zhuǎn)錄抑制物融合蛋白的第一種多肽經(jīng)操作連到在真核細(xì)胞中直接或間接抑制轉(zhuǎn)錄的第二種多肽上。如上面I小節(jié)所述，要經(jīng)操作將融合蛋白的第一種和第二種多肽連接起來，典型的編碼第一種和第二種多肽的核苷酸序列在框連接到一起生成編碼融合蛋白的嵌合體基因。然而，第一種和第二種多肽可用其它方法經(jīng)操作連起來仍保留各種多肽的功能(例如化學(xué)交聯(lián))。盡管此處描述的典型的融合蛋白的第一種多肽在融合蛋白的氨基端而第二種多肽在融合蛋白的羧基端，本領(lǐng)域的專業(yè)人員應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明也可采用相反的取向(即第二種多肽在氨基端而第一種多肽在羧基端)。
在真核細(xì)胞中抑制轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)中多肽結(jié)構(gòu)域在本領(lǐng)域已見描述(綜述見例如，Renkawitz，R.(1990)遺傳學(xué)動態(tài)6192-197；以及Herschbach，B.M.和Johnson，A.D.(1993)細(xì)胞生物學(xué)研究年鑒9479-509)。本領(lǐng)域稱這樣的轉(zhuǎn)錄抑制物結(jié)構(gòu)域為“抑制結(jié)構(gòu)域”或“阻遏子結(jié)構(gòu)域”。盡管許多多肽結(jié)構(gòu)域抑制轉(zhuǎn)錄的確切機(jī)制并不清楚(本發(fā)明也不受機(jī)制的限制)，阻遏子結(jié)構(gòu)域可能有幾種方式來抑制轉(zhuǎn)錄，包括1)競爭性抑制激活物蛋白或通過轉(zhuǎn)錄裝置的結(jié)合，2)阻止DNA結(jié)合激活物的活性3)對通用轉(zhuǎn)錄裝置的功能性預(yù)起始復(fù)合物的裝配的負(fù)干擾。因此，阻遏子基因可能對轉(zhuǎn)錄裝置有直接抑制作用或者可能通過抑制激活物蛋白的活性來間接抑制轉(zhuǎn)錄。相應(yīng)地，術(shù)語“在真核細(xì)胞中抑制轉(zhuǎn)錄的多肽”在此處的用法包括直接或間接抑制轉(zhuǎn)錄的多肽。此處，“抑制”轉(zhuǎn)錄指與轉(zhuǎn)錄抑制物蛋白調(diào)節(jié)以前轉(zhuǎn)錄水平或量相比靶基因的轉(zhuǎn)錄水平或量下降。轉(zhuǎn)錄抑制可以是部分的或完全的。術(shù)語“抑制子”，“阻遏子”和“抑制物”在此處通用，指抑制轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)蛋白或其結(jié)構(gòu)域。
此處描述的轉(zhuǎn)錄“阻遏子”或“抑制子”結(jié)構(gòu)域指的是一種多肽結(jié)構(gòu)域，當(dāng)該結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)移到異源蛋白上仍保留其轉(zhuǎn)錄抑制物功能。已表明含有當(dāng)轉(zhuǎn)移到異源蛋白中仍起作用的阻遏子結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)包括v-erbA致癌基因產(chǎn)物(Baniahmad，A.等人(1992)EMBO J.111015-1023)。胸腺激素受體(Baniahmad，引文見上)、視黃酸受體(Baniahmad，引文見上)和果蠅Krueppel(Kv)蛋白(Licht，J.D.等人(1990)Nature34676-79；Sauer，F(xiàn).和Jackle，H.(1991)Nature353563-566；Licht，J.D.等人(1994)分子細(xì)胞生物學(xué)144057-4066)，其它在真核細(xì)胞中具有轉(zhuǎn)錄抑制物活性的蛋白的非限制性例子包括果蠅homeodomain蛋白even-skipped(eve)，釀酒酵母Ssn6/Tup1蛋白復(fù)合物(見Herschbach和Johnson，引文見上)。酵母SIR1蛋白(見Chien等人(1993)Cell75531-541)，NeP1(見Kohne等人(1993)分子生物學(xué)雜志232747-755)，果蠅dorsal蛋白(見Kirov等人(1994)分子細(xì)胞生物學(xué)14713-722；Jiang等人(1993)EMBO J.123201-3209)，TSF3(見Chen等人(1993)分子細(xì)胞生物學(xué)13831-840)，SF1(見Targa等人(1992)生物化學(xué)生物物理研究通訊188416-423)，果蠅hunchback蛋白(見Zhang等人(1992)美國國家科學(xué)院院刊897511-7515)，果蠅Knirps蛋白(見Gerwin等人(1994)分子細(xì)胞生物學(xué)147899-7908)，WT1蛋白(Wilm氏腫瘤基因產(chǎn)物)(見Anant等人(1994)Oncogene93113-3126；Madden等人(1993)Oncogene81713-1720)，Oct-2.1(見Lillycrop等人(1994)分子細(xì)胞生物學(xué)147633-7642)，果蠅engrailed蛋白(見Bodiani等人(1994)Genes Rev8770-782；Han和Manley，(1993)EMBO J.122723-2733)，E4BP4(見Cowell和Hurst，(1994)核酸研究2259-65和ZF5(見Numoto等人(1993)核酸研究213767-3775)。
在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄抑制物融合蛋白的第二種多肽是果蠅Krueppel蛋白的轉(zhuǎn)錄抑制子結(jié)構(gòu)域?？梢圆捎镁哂凶瓒糇踊钚缘腃末端區(qū)域，諸如天然蛋白的403-466氨基酸(見Sauer，F(xiàn).和Jackle，H.引文見上)。該區(qū)域稱為C64KR。C64KR的核苷酸序列和氨基酸序列分別由SEQ ID NO20和SEQ ID NO21給出。實施例4描述如何構(gòu)建編碼TetR-C64KR融合蛋白的表達(dá)載體，備選地，可以采用具有阻遏子活性的富丙氨酸Kr氨基末端區(qū)域作融合蛋白的第二種多肽。例如，Kr的26-110氨基酸(見Licht，J.D.等人(1990)引文見上)可用作第二種多肽。備選地，涵蓋了Kr抑制子結(jié)構(gòu)域二者中任一個并且仍保留部分或全部抑制活性的短的或長的多肽片段也在考慮之列(例如N末端抑制子結(jié)構(gòu)域的62到92氨基酸，見Licht等人(1994)引文見上)。
在另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄抑制物融合蛋白的第二種多肽是v-erbA致癌基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄抑制子結(jié)構(gòu)域。v-erbA的抑制子結(jié)構(gòu)域定位約對應(yīng)于天然v-erbA致癌基因產(chǎn)物的362-632核苷酸殘基(見Baniahmad等人，引文見上)。相應(yīng)地，涵蓋該區(qū)域的片段用作抑制子結(jié)構(gòu)域的第二種多肽，在一個實施方案中用天然v-erbA蛋白的364-635氨基酸殘基。v-erbA該區(qū)域的核苷酸和氨基酸序列由SEQ ID NO22和SEQ ID NO23分別給出。實施例5描述如何構(gòu)建編碼TetR-v-erbA融合蛋白的表達(dá)載體。備選地，涵蓋v-erbA抑制子區(qū)域仍保留全部或部分抑制活性的短的或長的多肽片段也在考慮之列。例如v-erbA的346-639，362-639，346-632，346-616和362-616氨基酸殘基也可使用。另外，具有內(nèi)部缺失仍保留全部或部分抑制活性的涵蓋該區(qū)域的多肽片段也在本發(fā)明范圍內(nèi)，例如v-erbA的362-468/508-639氨基酸殘基。而且，融合蛋白可包括兩拷貝或更多拷貝的抑制子結(jié)構(gòu)域，諸如兩拷貝的v-erbA 362-616氨基酸殘基。適當(dāng)?shù)膙-erbA的抑制子多肽結(jié)構(gòu)域由Baniahmad，A.等人進(jìn)一步描述(引文見上)。
在另一實施方案中用其它的抑制子結(jié)構(gòu)域，可用的多肽結(jié)構(gòu)域的非限制性例子包括胸腺激素受體α(THRα)的120-140氨基酸殘基，視黃酸受體α(RARα)的143-403氨基酸殘基，Knirps的186-232氨基酸殘基，WT1的N末端區(qū)域(見Anant引文見上)，Oct-2.1的N末端(見Lillycrop引文見上)，E4BP4的65氨基酸結(jié)構(gòu)域(見Cowall和Hurst引文見上)，和ZF5的N末端鋅指結(jié)構(gòu)域(見Numoto，引文見上)。另外，涵蓋這些區(qū)域并仍保留全部或部分抑制物活性的短的或長的多肽片段也在考慮之列。
除了前述轉(zhuǎn)錄抑制物結(jié)構(gòu)域，可用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)鑒別的新的轉(zhuǎn)錄抑制物結(jié)構(gòu)域也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。多肽的轉(zhuǎn)錄抑制物活性可用下述方法檢測1)構(gòu)建一個表達(dá)載體，它編碼的受測抑制子多肽連接到另一具有DNA結(jié)合活性的多肽上(即構(gòu)建一個DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域-抑制子結(jié)構(gòu)域融合蛋白)，2)將該表達(dá)載體同一標(biāo)記基因結(jié)構(gòu)共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，該結(jié)構(gòu)通常在宿主細(xì)胞中組成性表達(dá)并且也含有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合位點，3)確定因為融合蛋白在宿主細(xì)胞中表達(dá)而被抑制的標(biāo)記基因結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄量。例如，本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法利用GAL4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如氨基酸殘基1-147)和受測抑制子結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。該融合蛋白然后用來抑制含有正調(diào)控序列(正常情況下激活組成性轉(zhuǎn)錄)和GAL4結(jié)合位點(見例如Baniahmad，引文見上)的標(biāo)記基因結(jié)構(gòu)的表達(dá)。
C.轉(zhuǎn)錄抑制物融合蛋白的第三多肽除了Tet阻遏子和轉(zhuǎn)錄抑制子結(jié)構(gòu)域，本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄抑制物融合蛋白可以包含經(jīng)操作相連的第三種多肽，它促進(jìn)融合蛋白向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運(yùn)。如同對轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白的描述(見上面的I小節(jié)C部分)，核定位信號可加入到轉(zhuǎn)錄抑制物融合蛋白中。
D.轉(zhuǎn)錄抑制物融合蛋白的表達(dá)編碼本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄抑制物融合蛋白的核酸分子可以加入到重組表達(dá)載體中并引入宿主細(xì)胞，在宿主細(xì)胞中表達(dá)融合蛋白，其描述見上面的II小節(jié)A，B和C部分。優(yōu)選地，表達(dá)本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄抑制物融合蛋白的宿主細(xì)胞還攜帶tet操縱子相連的目的基因(即待轉(zhuǎn)錄的靶核苷酸序列)。
在其細(xì)胞中表達(dá)轉(zhuǎn)錄抑制物融合蛋白的轉(zhuǎn)基因動物可根據(jù)上面的II小節(jié)D部分的描述來獲得。另外，在其細(xì)胞中表達(dá)轉(zhuǎn)錄抑制物融合蛋白的同源重組生物體也被本發(fā)明涵蓋并可根據(jù)上面的II小節(jié)E部分的描述獲得。本發(fā)明提供適于同源重組的重組表達(dá)載體。在一個實施方案中，這樣的表達(dá)載體含有編碼本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄抑制物融合蛋白的核酸分子，它在5’和3’端被附加的真核基因核酸包圍，附加的核酸長度足夠與真核基因成功地同源重組。得到表達(dá)本發(fā)明調(diào)節(jié)體系組分的同源重組生物體的載體和方法及其應(yīng)用。進(jìn)一步由美國專利申請系列號88/260,452詳述。優(yōu)選地，本發(fā)明的在其細(xì)胞中表達(dá)轉(zhuǎn)錄抑制物融合蛋白的轉(zhuǎn)基因或同源重組生物體也在其細(xì)胞中攜帶tet操縱子相連的目的基因(即待轉(zhuǎn)錄的靶核苷酸序列)。
V.本發(fā)明的試劑盒本發(fā)明的另一方面涉及含有本發(fā)明的可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)體系組分的試劑盒。這樣的試劑盒可用于調(diào)節(jié)能克隆到靶轉(zhuǎn)錄單元中的目的基因(即待轉(zhuǎn)錄的感興趣核苷酸序列)的表達(dá)。該試劑盒可能包括編碼轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白或轉(zhuǎn)錄抑制物融合蛋白或二者都有的核酸。另外，本試劑盒也可能提供含有編碼轉(zhuǎn)錄激活物和/或抑制物融合蛋白的核酸的真核細(xì)胞，這些核酸穩(wěn)定地?fù)饺爰?xì)胞中從而在真核細(xì)胞中表達(dá)轉(zhuǎn)錄激活物和/或抑制物融合蛋白。
在一個實施方案中，該試劑盒包括一種運(yùn)載工具，其中緊鄰地有至少兩個容納工具(container meens)第一個容納工具含有編碼本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白的第一種核酸(例如DNA)(舉例來說，編碼第一種多肽的重組表達(dá)載體，當(dāng)四環(huán)素存在時它結(jié)合tet操縱子序列，該多肽經(jīng)操作連接到在真核細(xì)胞中激活轉(zhuǎn)錄的第二種多肽上)，第二個容納工具含有轉(zhuǎn)錄激活物的第二種靶核酸，感興趣的核苷酸序列可以克隆于其中。第二種核酸典型地一個用于引入待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列(可選地包括一段經(jīng)操作相連的最小啟動子序列)的克隆位點和至少一段經(jīng)操作相連的tet操縱子序列。術(shù)語“克隆位點”包括至少一個限制性內(nèi)切酶位點。典型地，核酸內(nèi)有多個不同的限制性內(nèi)切酶位點(例如，多聚銜接物)。
為了利用本試劑盒的組分調(diào)節(jié)感興趣的核苷酸序列的表達(dá)，用常規(guī)重組DNA技術(shù)將該核苷酸序列克隆到本試劑盒的靶載體的克隆位點上，然后第一和第二核酸引入宿主細(xì)胞或動物中。在宿主細(xì)胞或動物中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白然后當(dāng)誘導(dǎo)劑(Tc或其類似物)存在時調(diào)節(jié)感興趣核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄。
另外，在另一實施方案中，本試劑盒包括一種真核細(xì)胞，它被編碼本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白的核酸穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染以使轉(zhuǎn)錄激活物在細(xì)胞中表達(dá)。因此，不僅只包含核酸，上述第一種容納工具也可包括一種真核細(xì)胞系，編碼轉(zhuǎn)錄激活物的第一種核酸被穩(wěn)定地引入其中(例如用磷酸鈣沉淀或電穿孔等常規(guī)方法穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染)。在該實施方案中，目的核酸序列克隆到本試劑盒靶載體的克隆位點上，然后將靶載體引入表達(dá)轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白的真核細(xì)胞中。
備選地或附加地，用于協(xié)同調(diào)節(jié)兩段核苷酸序列表達(dá)的本發(fā)明的重組載體也可加入到本發(fā)明的試劑盒中。試劑盒包括的載體可以容許將兩段目的核苷酸序列引入載體中。因此，在另一實施方案中，本發(fā)明的試劑盒包括1)編碼本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白的第一核酸(或一種真核細(xì)胞，該核酸穩(wěn)定地引入其中)和2)包含一段核苷酸序列的第二核酸，該核苷酸序列從5’到3’方向包括用于引入第一段感興趣核苷酸序列的第一個克隆位點，經(jīng)操作連到至少一段tet操縱子序列上，再經(jīng)操作連到用于引入第二段感興趣核苷酸序列的第二個克隆位點上。其中第一段和第二段核苷酸序列從至少一段tet操縱子序列以相反方向進(jìn)行轉(zhuǎn)錄?？蛇x地，該載體可包括經(jīng)操作相連的最小啟動子序列。在另一實施方案中，載體可能含有一段待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列(例如編碼一種檢測標(biāo)記，如熒光素酶，β-半乳糖苷酶或(AT)和一個用于導(dǎo)入待轉(zhuǎn)錄的第二段感興趣核苷酸序列的克隆位點。
用于獨立調(diào)節(jié)兩段待轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列的表達(dá)的本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄單元和轉(zhuǎn)錄激活物也可加入本發(fā)明的試劑盒中，靶轉(zhuǎn)錄單元可以允許將待轉(zhuǎn)錄的感興趣核苷酸序列引入靶轉(zhuǎn)錄單元中。因此，在另一實施方案中，本發(fā)明的試劑盒包括1)編碼當(dāng)Tc或其類似物存在時結(jié)合第一種類型的tet操縱子的轉(zhuǎn)錄激活物的第一核酸，2)含有一個用于導(dǎo)入待轉(zhuǎn)錄的第一段核苷酸序列的克隆位點的第二核酸，它經(jīng)操作連到至少一段第一種類型的tet操縱子上，3)編碼當(dāng)Tc或其類似物不存在時結(jié)合第二種類型的tet操縱子的轉(zhuǎn)錄激活物的第三核酸，4)含有用于引入待轉(zhuǎn)錄的第二段核苷酸序列的第二個克隆位點的第四核酸(可選地，第二和第四核酸包括最小啟動子序列)。在另一實施方案中，一段待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列(例如編碼自殺基因)已經(jīng)存在于第二或第四核酸中。在另一個實施方案中，編碼轉(zhuǎn)錄激活物的核酸(例如，上述第一和第三核酸)已經(jīng)穩(wěn)定地引入本試劑盒提供的真核細(xì)胞系中。
在另一實施方案中，本發(fā)明的試劑盒包含第一容納工具，它包括編碼本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄抑制物融合蛋白的第一核酸(例如該融合蛋白只當(dāng)Tc存在時或只當(dāng)Tc不存在時抑制真核細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄)，以及第二容納工具，它包括含有用于引入待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列的克隆位點的第二核酸，經(jīng)操作連接到至少一段tet操縱子序列上。本試劑盒可以進(jìn)一步包括第三核酸，它編碼的轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白僅當(dāng)Tc存在時或僅當(dāng)Tc不存在時結(jié)合tetO序列。備選地，第一和/或第三核酸(即編碼抑制物或轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白)可以穩(wěn)定地加入本試劑盒提供的真核宿主細(xì)胞中。
在另外一個實施方案中，本發(fā)明的試劑盒可以包括至少一個四環(huán)素或四環(huán)素類似物。例如，該試劑盒可以包括一種容納工具，包括四環(huán)素，脫水四環(huán)素，強(qiáng)力霉素，環(huán)氧四環(huán)素或此處描述的其它四環(huán)素類似物。
VI.用四環(huán)素或其類似物調(diào)節(jié)基因表達(dá)A.用轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白激活基因表達(dá)在攜帶編碼本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白的核酸和經(jīng)操作連接到tet操縱子序列的核苷酸序列(即待轉(zhuǎn)錄目的基因)的宿主細(xì)胞中，當(dāng)誘導(dǎo)劑四環(huán)素或其類似物不存在時，經(jīng)操作連接到tet操縱子序列上的核苷酸序列并不高水平轉(zhuǎn)錄。該核苷酸序列的基底轉(zhuǎn)錄水平可能依據(jù)宿主細(xì)胞和序列整合位點而變，但當(dāng)Tc不存在時，基底轉(zhuǎn)錄水平通常很低甚至檢測不出來。為了誘導(dǎo)宿主細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄，宿主細(xì)胞與四環(huán)素或四環(huán)素類似物接觸。相應(yīng)地，本發(fā)明的另一方面涉及在真核細(xì)胞或動物中激活核苷酸序列轉(zhuǎn)錄的方法，該序列經(jīng)操作連接到tet操縱子序列上并且表達(dá)本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白。該方法涉及將細(xì)胞接觸四環(huán)素或四環(huán)素類似物或是將四環(huán)素或四環(huán)素類似物施用給含有該細(xì)胞的動物。
術(shù)語“四環(huán)素類似物”包括結(jié)構(gòu)上與四環(huán)素有聯(lián)系且與Tet阻遏子結(jié)合的Ka至少為約106M-1的化合物。優(yōu)選地，四環(huán)素類似物結(jié)合的親和性為約109M-1或更大。這樣的四環(huán)素類似物的例子包括但不限于脫水四環(huán)素，強(qiáng)力霉素，氯四環(huán)素，土霉素及其它。描述見Hlavka和Boothe，“四環(huán)素”，《實驗藥理學(xué)手冊78》，R.K.Blackwood等人(編者)，Springer出版社，Berlin-New York.1985；L.A.Mitscher“四環(huán)素抗生素化學(xué)”，醫(yī)學(xué)研究9，Dekkcr，紐約1978；Noyee開發(fā)公司“四環(huán)素生產(chǎn)方法”，化學(xué)方法綜述，Park Ridge，NJ，2卷，1969；R.C.Evans，“四環(huán)素技術(shù)”，生物化學(xué)參考系列1，Quadrangle Press，紐約，1968；以及H.F.Dowling，“四環(huán)素”，抗生素論文集，no.3，醫(yī)學(xué)百科全書，紐約，1955。優(yōu)選的高水平激活轉(zhuǎn)錄的Tc類似物是脫水四環(huán)素和強(qiáng)力霉素?？梢赃x用比Tc抗生素活性降低的Tc類似物。這類Tc類似物的例子有脫水四環(huán)素、環(huán)氧四環(huán)素和氯四環(huán)素。
為降低體外細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)，將細(xì)胞培養(yǎng)于含Tc或Tc類似物的培養(yǎng)基使細(xì)胞接觸這些化合物。當(dāng)Tc或Tc類似物存在時體外培養(yǎng)細(xì)胞，誘導(dǎo)劑優(yōu)選的濃度范圍是約10到約1000ng/ml?？梢詫c或Tc類似物直接加到已培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基，或是更優(yōu)選地，為高水平誘導(dǎo)基因，細(xì)胞從不含Tc的培養(yǎng)基中收集出來再在含有Tc或其類似物的新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
為了降低體內(nèi)基因表達(dá)，通過將Tc或其類似物施用于受試者，使受試者的細(xì)胞接觸這些化合物。術(shù)語“受試者”包括人和其它非人類動物，如猴、牛、山羊、綿羊、狗、貓、兔、大鼠、小鼠及其轉(zhuǎn)基因或同源重組生物。并且，術(shù)語“受試者”包括植物，如轉(zhuǎn)基因植物。當(dāng)誘變劑施用給人或動物受試者時，劑量調(diào)節(jié)到優(yōu)選地使血清濃度在約0.05到1.0μg/ml之間。可以通過任何有效地達(dá)到體內(nèi)濃度足夠基因誘導(dǎo)的手段將Tc或Tc類似物施用給受試者。適當(dāng)?shù)慕o藥方式的例子包括口服(例如將誘導(dǎo)劑溶解于飲用水中)，緩慢釋放片劑和植入擴(kuò)散泵。為了將Tc或Tc類似物施用給轉(zhuǎn)基因植物，誘導(dǎo)劑可以溶于水再施用給植物。
本體系可使用不同的Tc類似物作為誘導(dǎo)劑的能力使得可以細(xì)調(diào)tet操縱子相連的核苷酸序列的表達(dá)水平。如實施例2顯示，發(fā)現(xiàn)脫水四環(huán)素和強(qiáng)力霉素是強(qiáng)誘導(dǎo)劑。典型地靶序列轉(zhuǎn)錄增加1000-2000倍，誘導(dǎo)因子也可達(dá)到20,000倍。發(fā)現(xiàn)四環(huán)素氯四環(huán)素和土霉素是弱誘導(dǎo)劑，即靶序列誘導(dǎo)增加約10倍左右。因此，根據(jù)所需基因表達(dá)誘導(dǎo)水平選合適的四環(huán)素類似物作誘導(dǎo)劑。也可以通過改變Tc類似物作誘導(dǎo)劑來隨時間改變宿主細(xì)胞或動物中基因表達(dá)的水平。例如，某些情況下在開始時需要基因表達(dá)的驟增然后是持續(xù)的低水平基因表達(dá)。相應(yīng)地，在開始時可以用高水平激活轉(zhuǎn)錄的類似物作誘導(dǎo)劑然后誘導(dǎo)劑改為低水平激活轉(zhuǎn)錄的類似物。而且，當(dāng)調(diào)節(jié)多個核苷酸序列表達(dá)時(例如，一段序列由一種類型的tet操縱子序列調(diào)節(jié)而另一段序列由另一類型的tet操縱子序列調(diào)節(jié)，其描述見上面的III小節(jié)C部分)，可能根據(jù)用哪種轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和用哪種Tc類似物作誘導(dǎo)劑來獨立改變各序列的表達(dá)水平。不同的轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白可能對Tc類似物表現(xiàn)不同響應(yīng)水平。可以用這里描述的(見實施例2)技術(shù)來確定轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白和誘導(dǎo)劑(Tc或Tc類似物)的特點組合誘導(dǎo)基因表達(dá)的水平。另外，可以通過改變誘導(dǎo)劑的濃度來細(xì)調(diào)基因表達(dá)水平。因此，本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)提供的機(jī)制不僅能開啟或關(guān)閉基因表達(dá)，而且能根據(jù)所用的誘導(dǎo)劑的類型和濃度在中等水平上“細(xì)調(diào)”基因表達(dá)水平。
B.用轉(zhuǎn)錄抑制物融合蛋白抑制基因表達(dá)本發(fā)明還提供用本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄抑制物融合蛋白抑制基因表達(dá)的方法。這些方法可以用來減量調(diào)節(jié)tetO相連的目的基因的基底、組成性或組織特異性轉(zhuǎn)錄。例如，經(jīng)操作連到tetO序列上的目的基因，和附加的正調(diào)節(jié)成分(例如組成性或組織特異性增強(qiáng)子序列)將以一定水平在宿主細(xì)胞中表達(dá)，該水平主要由宿主細(xì)胞中正調(diào)節(jié)成分的強(qiáng)度決定。另外，經(jīng)操作連到tetO序列上的目的基因和僅有的一段最小啟動子序列根據(jù)宿主細(xì)胞或組織和/或序列整合位點表現(xiàn)不同程度的基底水平轉(zhuǎn)錄。在含有這樣的靶序列并表達(dá)本發(fā)明的抑制物融合蛋白的宿主細(xì)胞中，可以通過改變與宿主細(xì)胞接觸的Tc(或類似物)的濃度以可控的方式減量調(diào)節(jié)靶序列的轉(zhuǎn)錄。例如，若當(dāng)Tc不存在時抑制物融合蛋白結(jié)合tetO，與宿主細(xì)胞接觸的Tc的濃度降低到抑制靶基因的表達(dá)。優(yōu)選地，當(dāng)Tc不存在時培養(yǎng)宿主細(xì)胞以保持靶基因表達(dá)受阻遏。相似地，不對宿主生物體施用Tc來保持靶基因表達(dá)受阻遏。備選地，若當(dāng)Tc存在時抑制物融合蛋白結(jié)合tetO，增加與宿主細(xì)胞接觸的Tc濃度來抑制靶基因的表達(dá)。例如，Tc加到宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中或?qū)c給藥給宿主生物體來抑制靶基因的表達(dá)。
此處描述的抑制物融合蛋白抑制tetO相連的目的基因，其中tetO序列定位于最小啟動子序列的5’(例如，上面III小節(jié)描述的四環(huán)素調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄單元)。另外，可以用抑制物融合蛋白來抑制目的基因的表達(dá)，其中tetO相連序列位于啟動子序列的3’端，轉(zhuǎn)錄起始位點的5’端。更進(jìn)一步，該抑制物融合蛋白可用于抑制目的基因的表達(dá)，其中tetO相連序列位于轉(zhuǎn)錄起始位點的3’。
上面的VI小節(jié)A部分描述不同的Tc類似物并兼顧類似地可用來調(diào)節(jié)抑制物融合蛋白活性的轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白。另外，VI小節(jié)A部分描述的用Tc(或類似物)體外培養(yǎng)的方法和通過體內(nèi)施用Tc(或類似物)的方法同樣適用于轉(zhuǎn)錄抑制物融合蛋白。
C.基因表達(dá)的組合型正調(diào)控和負(fù)調(diào)控除了單獨用轉(zhuǎn)錄激活物或抑制物融合蛋白調(diào)節(jié)基因表達(dá)，可以組合使用兩種類型的融合蛋白，使宿主細(xì)胞中一個或多個靶基因表達(dá)既有正調(diào)控又有負(fù)調(diào)控。因此，i)當(dāng)Tc不存在時，或ii)當(dāng)Tc存在時結(jié)合tetO的轉(zhuǎn)錄抑制物蛋白可與i)當(dāng)Tc不存在時，或ii)當(dāng)Tc存在時結(jié)合tetO的轉(zhuǎn)錄激活物蛋白組合使用。當(dāng)Tc不存在時結(jié)合tetO的轉(zhuǎn)錄激活物蛋白(例如野生型TetR激活物融合蛋白)由USSN 08/076,726，USSN 08/076,327和USSN 08/260,452進(jìn)一步詳細(xì)描述。當(dāng)Tc存在時結(jié)合tetO的轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白(例如突變型TetR激活物融合蛋白)由此處(見上面I小節(jié))和USSN 08/270,637和USSN 08/275,876描述。轉(zhuǎn)錄抑制物融合蛋白在此處IV小節(jié)描述。
如同上面III小節(jié)C部分描述的，若不止一個tetR融合蛋白在宿主細(xì)胞或生物體內(nèi)表達(dá)可能要采取附加步驟來抑制不同TetR融合蛋白的異二聚化。例如，含一種類型的TetR的轉(zhuǎn)錄激活物可以與含有不與第一種類型TetR異二聚化的另一種類型的TetR的轉(zhuǎn)錄抑制物混和使用。備選地，可以誘變涉及二聚化的TetR的氨基酸序列以抑制異二聚化。然而，即使在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄激活物和轉(zhuǎn)錄抑制物融合蛋白發(fā)生一些異二聚化，也應(yīng)當(dāng)產(chǎn)生足夠量的同二聚體有足夠有效的正調(diào)節(jié)和負(fù)調(diào)節(jié)。
本領(lǐng)域的專業(yè)人員應(yīng)當(dāng)理解，激活物和抑制物蛋白的不同組合，根據(jù)此處的講授，可用來既正調(diào)控又負(fù)調(diào)控單個的tetO相連的目的基因，或協(xié)同地調(diào)節(jié)多個tetO相連的目的基因或獨立地調(diào)節(jié)多個tetO相連的目的基因。所用的確切調(diào)節(jié)成分依賴待轉(zhuǎn)錄基因和所需的轉(zhuǎn)錄類型。下面進(jìn)一步描述怎樣組合使用轉(zhuǎn)錄激活物和抑制物融合蛋白的幾個非限制性例子。然而，根據(jù)此處的講授本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員應(yīng)知道會有許多其它的可能組合，它們也被包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
在優(yōu)選實施方案中，如圖10所示，利用僅當(dāng)四環(huán)素或其類似物不存在時結(jié)合tetO的抑制物融合蛋白(稱為四環(huán)素控制的抑制子結(jié)構(gòu)域，或tSD)和僅當(dāng)四環(huán)素或其類似物存在時結(jié)合tetO的激活物融合蛋白(稱為反式四環(huán)素控制的轉(zhuǎn)錄激活物，或rtTA)的組合在宿主細(xì)胞既正調(diào)控又負(fù)調(diào)控tetO相連的感興趣靶基因的表達(dá)。除了tetO序列，靶基因連接到啟動子上，還可能包含其它使基因在宿主細(xì)胞中以基底水平組成性轉(zhuǎn)錄的正調(diào)節(jié)成份(例如增強(qiáng)子序列)。當(dāng)四環(huán)素或類似物(例如強(qiáng)力霉素)不存在時tSD結(jié)合tetO序列會抑制目的基因的基底組成性轉(zhuǎn)錄，因而保持目的基因被阻遏直到需要基因表達(dá)為止。當(dāng)需要基因表達(dá)時，增大與宿主細(xì)胞接觸的四環(huán)素或類似物(例如強(qiáng)力霉素)的濃度。加藥后，tSD失去結(jié)合tetO序列的能力而先前未結(jié)合的rtTA獲得了結(jié)合tetO序列的能力。結(jié)果rtTA結(jié)合連接目的基因的tetO序列因而激活目的基因的轉(zhuǎn)錄。如前所述，四環(huán)素或類似物的濃度，所用Tc類似物的類型，誘導(dǎo)的持續(xù)時間等均可控制表達(dá)水平。應(yīng)當(dāng)理解，也可用融合蛋白的相反組合(即當(dāng)藥物存在時抑制物結(jié)合，當(dāng)藥物不存在時激活物結(jié)合)。在此情況下，通過使宿主細(xì)胞接觸藥物(例如加Tc或類似物培養(yǎng))保持目的基因的表達(dá)受抑制，而去除藥物又激活基因表達(dá)。
在另一實施方案中，上文所述的激活物和抑制物融合蛋白組合使用以協(xié)同地正調(diào)控或負(fù)調(diào)控兩個目的基因，使用的是上面III小節(jié)B部分描述的雙向tetO相連的轉(zhuǎn)錄單元。在這種情況下，基因1和基因2連到相同的tetO序列上，但取向相反。抑制物融合蛋白用來協(xié)同地阻遏基因1和基因2的基底水平轉(zhuǎn)錄，而轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白用來協(xié)同地激活基因1和基因2的表達(dá)。
在另外一個實施方案中，用上面III小節(jié)C部分描述的tetO相連的轉(zhuǎn)錄單元用激活物和抑制物融合蛋白獨立地調(diào)節(jié)兩個或多個目的基因。例如，當(dāng)Tc或類似物存在時結(jié)合一種類型的tetO序列(例如A類)的轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白與也是當(dāng)Tc或類似物存在時結(jié)合另一種類型的tetO序列(例如B類)的抑制物融合蛋白。在宿主細(xì)胞中，基因1連著A類tetO序列而基因2連著B類tetO序列，當(dāng)藥物不存在時兩種基因都以基底水平表達(dá)，加藥物后激活基因1的表達(dá)而抑制基因2的表達(dá)。
另外，在另一實施方案中，當(dāng)Tc或類似物存在時轉(zhuǎn)錄激活物結(jié)合一種類型的tetO序列(例如A類)。而當(dāng)Tc或類似物不存在時抑制物融合蛋白結(jié)合另一種不同類型的tetO序列(例如B類)。在上段描述的宿主細(xì)胞中，當(dāng)藥物不存在時基因1以基底水平表達(dá)，加藥后激活其表達(dá)。而基因2當(dāng)藥物不存在時被阻遏，加藥后以基底水平表達(dá)。對專業(yè)人員來說，很明顯有其它不同的可能組合。如I小節(jié)A部分所述可制取結(jié)合不同類型tetO序列的轉(zhuǎn)錄激活物和抑制物融合蛋白。如III小節(jié)C部分所述可以制取含有不同類型tetO序列的靶轉(zhuǎn)錄單元。
VII.本發(fā)明的應(yīng)用本發(fā)明可廣泛應(yīng)用于多種情況，這需要能夠開啟和關(guān)閉基因表達(dá)，或迅速、有效、可控又不會造成多重效果及細(xì)胞毒性地調(diào)節(jié)基因表達(dá)水平。因此，本發(fā)明的體系廣泛應(yīng)用于研究真核細(xì)胞、植物和動物中細(xì)胞發(fā)育和分化。例如，可以可控地調(diào)節(jié)細(xì)胞中致癌基因的表達(dá)來研究其功能。另外，本體系可用來調(diào)節(jié)位點特異性重組酶如CRE或FLP的表達(dá)從而在特定的發(fā)育階段在可控條件下不可逆地修飾轉(zhuǎn)基因生物體的基因型。例如，可用Tc調(diào)節(jié)的位點特異性重組酶不可逆地去除插入轉(zhuǎn)基因植物基因組中用于選擇特定轉(zhuǎn)基因植物的藥物抗性標(biāo)記。本發(fā)明的調(diào)節(jié)體系的其它應(yīng)用包括A.基因治療本發(fā)明特別適用于基因治療用途，治療遺傳性或獲得性疾病?；蛑委煹囊话惴椒ò▽⒑怂釋?dǎo)入細(xì)胞，在細(xì)胞中生產(chǎn)被導(dǎo)入的遺傳物質(zhì)編碼的一種或幾種基因產(chǎn)物，來恢復(fù)或增強(qiáng)某一功能活性。有關(guān)基因治療方法的綜述見Anderson，W.F.(1992)Science 256808-813；Miller，A.D.(1992)Nature 357455-460；Friedman，T.(1989)Science 2441275-1281；以及Cournoyer，D.等人(1990)當(dāng)代生物技術(shù)觀念，1196-208。不過，現(xiàn)今的基因療法載體典型地利用對外源轉(zhuǎn)錄因子有響應(yīng)的組成性調(diào)節(jié)成分。這些載體體系沒有能力在受試者中細(xì)調(diào)基因表達(dá)水平。與之形成對照的是，本發(fā)明的可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)體系具備這種能力。
將本發(fā)明的體系用于基因治療用途，在一個實施方案中，要接受基因治療的受試者細(xì)胞經(jīng)修飾，包含1)編碼本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白的核酸，以適于在宿主細(xì)胞中表達(dá)轉(zhuǎn)錄激活物，2)經(jīng)操作連接到tet操縱子序列上的目的基因(例如用于治療用途)。受試者的細(xì)胞可以在體外修飾然后引入受試者或者可直接在體內(nèi)修飾細(xì)胞(細(xì)胞修飾方法的描述見上面的II小節(jié))。通過施用Tc或Tc類似物給受試者來激活受試者細(xì)胞中目的基因的表達(dá)。依據(jù)用何種Tc類似物作誘導(dǎo)劑可改變基因表達(dá)的水平。通過調(diào)整給患者的四環(huán)素或其類似物的劑量從而調(diào)整循環(huán)系統(tǒng)及感興趣組織中藥物濃度來細(xì)調(diào)基因表達(dá)水平。
另外，在另一實施方案中用轉(zhuǎn)錄抑制物融合蛋白進(jìn)一步調(diào)整目的基因的表達(dá)水平。例如，可修飾受試者的細(xì)胞使其含有編碼當(dāng)Tc不存在時結(jié)合tetO的轉(zhuǎn)錄抑制物融合蛋白的核酸。該核酸適于在宿主細(xì)胞中表達(dá)抑制物融合蛋白。因此，在給受試者施用Tc(或類似物)之前，目的基因的基底水平轉(zhuǎn)錄被抑制物融合蛋白保持抑制。加入Tc后，抑制物融合蛋白結(jié)合tetO被抑制而轉(zhuǎn)錄激活物蛋白的結(jié)合被誘導(dǎo)，從而激活目的基因的轉(zhuǎn)錄。圖10示意地描繪了用本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白和轉(zhuǎn)錄抑制物蛋白對基因表達(dá)的組合型正調(diào)控與負(fù)調(diào)控。
本領(lǐng)域的常規(guī)檢測方法，例如酶聯(lián)免疫吸附檢測，可用來監(jiān)控宿主細(xì)胞中被調(diào)節(jié)的感興趣蛋白質(zhì)的表達(dá)并可改變Tc或Tc類似物的濃度直到感興趣蛋白質(zhì)的表達(dá)達(dá)到所需要的水平。相應(yīng)地，可根據(jù)個人的醫(yī)療需要調(diào)整目的基因的表達(dá)，這種需要在個人的一生中可能變化。停止誘導(dǎo)劑的給藥即可停止受試者細(xì)胞中目的基因的表達(dá)。因此，本發(fā)明的調(diào)節(jié)體系比組成性調(diào)節(jié)體系有一個優(yōu)點，即可根據(jù)治療條件的需要細(xì)調(diào)基因表達(dá)的水平。
用于治療遺傳性或獲得性疾病而在受試者細(xì)胞中表達(dá)的特別令人感興趣的基因，它們編碼產(chǎn)物包括腺嘌呤脫氨酶、VIII因子、IX因子、dystrophin、β-球蛋白、LDL受體、CFTR、胰島素、促紅細(xì)胞生成素、抗血管形成因子、生長激素、葡萄糖腦苷酶、β-葡糖苷酶、α1-抗胰蛋白酶、苯丙氨酸水解酶、酪氨酸水解酶、鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶、精氨酰琥珀酸合成酶、UDP葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶、apoA1、TNF、可溶性TNF受體、白介素(例如IL-2)、干擾素(例如α-或γ-IFN)和其它細(xì)胞因子及生長因子。經(jīng)修飾可用于基因療法用途的細(xì)胞類型包括造血干細(xì)胞、成骨細(xì)胞、肝細(xì)胞、白細(xì)胞、皮膚上皮和氣管上皮。用于基因療法的細(xì)胞類型?；蚣胺椒ǖ倪M(jìn)一步描述見例如Wilson，J.M等人(1988)美國國家科學(xué)院院刊853014-3018；Armentano，D.等人(1990)美國國家科學(xué)院院刊876141-6145；Wolff，J.A.等人(1990)Science2471465-1468；Chowdhury，J.R.等人(1991)Science2541802-1805；Ferry，N.等人(1991)美國國家科學(xué)院院刊888377-8381；Wilson，J.M.等人(1992)生物化學(xué)雜志267963-967；Quantin，B.等人(1992)美國國家科學(xué)院院刊892581-2584；Dai，Y等人(1992)美國國家科學(xué)院院刊8910892-10895；van Beusechem，V.W.等人(1992)美國國家科學(xué)院院刊897640-7644；Rosenfeld，M.A.等人(1992)Cell68143-155；Kay，M.A.等人(1992)人類基因治療3641-647；Cristiano，R.J.等人(1993)美國國家科學(xué)院院刊902122-2126；Hwa，P.等人(1993)免疫學(xué)雜志1504104-4115；以及Herz，J.和Gerard，R.
D.(1993)美國國家科學(xué)院院刊902812-2816。
在癌癥治療中特別令人感興趣的基因療法應(yīng)用包括腫瘤滲透白細(xì)胞中細(xì)胞因子基因(例如TNF-α)的過表達(dá)或腫瘤細(xì)胞中細(xì)胞激動素的異位表達(dá)來在腫瘤位置誘發(fā)抗腫瘤免疫反應(yīng)。腫瘤細(xì)胞中一種能將非毒性藥劑轉(zhuǎn)化成毒性藥劑的酶的表達(dá)，腫瘤特異性抗原的表達(dá)來誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)，腫瘤細(xì)胞中腫瘤抑制物基因(例如p53或Rb)的表達(dá)，骨髓細(xì)胞中多重抗藥性基因(例如MDR1和/或MRP)的表達(dá)來保護(hù)這些細(xì)胞免受化療毒性。
在治療病毒引起的疾病中特別令人感興趣的基因療法應(yīng)用包括反式顯性陰性病毒轉(zhuǎn)錄激活蛋白的表達(dá)。例如對HIV的反式顯性陰性tat和rev突變體，或?qū)SV的反式顯性ICp4突變體(見例如Balboni，P.G.等人(1993)病毒醫(yī)學(xué)雜志41289-295；Liem.S.E等人(1993)人類基因治療4625-634；Malim，M.H.等人(1992)實驗醫(yī)學(xué)雜志1761197-1201；Daly，T.J等人(1993)生物化學(xué)328945-8954；以及Smith，C.A.等人(1992)病毒學(xué)191581-588)，反式顯性陰性外殼蛋白的表達(dá)，例如對HIV的env突變體(見例如Steffy，K.R.等人(1993)病毒學(xué)雜志671854-1859)，針對病毒產(chǎn)物的抗體或其片段的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)(“內(nèi)免疫”，見例如Marasco.W.A.等人(1993)美國國家科學(xué)院院刊907889-7893)以及可溶病毒受體的表達(dá)，例如可溶性CD4。另外，本發(fā)明的體系可以在某些情況下用來在細(xì)胞中表達(dá)自殺基因，從而使細(xì)胞在完成其預(yù)定的功能后被消除。例如，可以通過對受試者給藥Tc或Tc類似物誘發(fā)細(xì)胞中自殺基因的表達(dá)使受試者產(chǎn)生免疫反應(yīng)后將免疫用的細(xì)胞從受試者中除去。
本發(fā)明的Tc控制的調(diào)節(jié)體系有許多有利的特性使其特別適用于基因療法。例如，本體系提供基因表達(dá)的“開啟/關(guān)閉”開關(guān)能調(diào)節(jié)受試者體內(nèi)某一基因產(chǎn)物的劑量。許多情況下，需要可控地在特定水平和/或時間上提供基因產(chǎn)物，而不是簡單地讓基因產(chǎn)物在預(yù)定水平上組成性表達(dá)。例如，可以在固定的時間間隔(例如每目、隔日、每周等)“開啟”目的基因，從而在最有效的時間提供最有效水平的目的基因產(chǎn)物，可用標(biāo)準(zhǔn)方法監(jiān)控受試者中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物的水平(例如，用免疫檢測如ELISA或RIA直接監(jiān)控或間接監(jiān)控依賴目的基因產(chǎn)物的功能的實驗參數(shù)，例如血糖水平等)。這種在受試者中按分隔的時間間隔“開啟”基因表達(dá)而使基因在其它時間內(nèi)保持“關(guān)閉”的能力使得不必在分隔的時間間隔中持續(xù)給藥目的基因產(chǎn)物。這種方法使得不必重復(fù)注射基因產(chǎn)物，那樣做可能帶來痛苦和/或引起副作用以及需要醫(yī)生不斷來訪。形成對照的是，本發(fā)明的體系避免了這些缺陷。并且，這種在受試者中按分隔的時間間隔“開啟”基因表達(dá)的能力允許對某些不時表現(xiàn)“爆發(fā)”活性且僅當(dāng)疼痛和癥狀明顯的急性期才需治療的疾病進(jìn)行集中的治療。當(dāng)這些疾病不發(fā)作的時候，表達(dá)體系保持在“關(guān)閉”狀態(tài)。
由于有這種在分隔的時間間隔細(xì)調(diào)基因表達(dá)的能力而尤其有利的基因療法應(yīng)用包括下列非限制性例子風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎受試者中可表達(dá)編碼抑制炎癥細(xì)胞因子(例如TNF，IL-1和IL-12)產(chǎn)生的基因產(chǎn)物的基因。此類抑制物的例子包括細(xì)胞因子受體的可溶形式，另外或備選地，可表達(dá)細(xì)胞因子IL-10和/或IL-4(它激活保護(hù)性Th2型反應(yīng))。另外，可表達(dá)擬糖皮質(zhì)激素受體(GCMR)。
垂體機(jī)能減退只需在少兒早期在受試者中表達(dá)人類生長激活基因，因為此時需要基因表達(dá)，到長成正常體格為止，此時將基因表達(dá)減量調(diào)節(jié)。
傷口愈合/組織再生愈合過程所需因子(例如生長因子，血管形成因子等)只在需要時表達(dá)然后減量調(diào)節(jié)。
抗癌治療用于抗癌治療的基因產(chǎn)物的表達(dá)可僅限于治療期到完成了阻遏腫瘤生長為主，這時基因產(chǎn)物的表達(dá)可被減量調(diào)節(jié)?？赡艿娜硇钥拱┲委煱ㄊ褂媚[瘤滲透白細(xì)胞，它表達(dá)免疫激活分子(例如IL-2，IL-12等)，血管生成抑制物(PF4，IL-12等)Herregulin，Leukoregulin(見PCT出版物WO 85/04662號)，以及用于骨髓支持療法的生長因子，如G-CSF，GM-COF和M-CSF。對于后者，用本反應(yīng)的調(diào)節(jié)體系表達(dá)用于骨髓支持療法的因子使在有規(guī)律的時間間隔從化學(xué)療法轉(zhuǎn)到骨髓支持療法的療法轉(zhuǎn)換簡便了(相似地，同類方法也可用于愛滋病治療，例如簡化了從抗病毒治療向骨髓支持治療的轉(zhuǎn)換)。進(jìn)而也可能使抗癌治療可控地局部定位。例如，用本發(fā)明的調(diào)節(jié)物表達(dá)自殺基因，其中調(diào)節(jié)物本身被例如腫瘤特異性啟動子或輻射誘導(dǎo)的啟動子調(diào)控。
在另一實施方案中，本發(fā)明的調(diào)節(jié)體系通過受本發(fā)明的體系調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)基因在腫瘤中表達(dá)血管生成抑制物。用這種方式表達(dá)血管生成抑制物可能比全身給藥抑制物更有效并會避免任何可能與全身給藥相伴的任何有害副作用。特別地，將血管生成抑制物限制于腫瘤中對于治療正在進(jìn)行與正常細(xì)胞生長相連系的血管生成的兒童的癌癥特別有用。
在另一實施方案中，細(xì)胞因子的高水平調(diào)節(jié)的表達(dá)提供了一種使患者自身免疫反應(yīng)針對腫瘤細(xì)胞的方法。腫瘤細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)化可表達(dá)對增強(qiáng)個體天然免疫反應(yīng)十分重要的趨化物和生長促進(jìn)因子。由于腫瘤周圍有高濃度的細(xì)胞因子，對腫瘤抗原發(fā)生免疫反應(yīng)的可能性也增加了。這類療法的潛在問題是產(chǎn)生細(xì)胞因子的腫瘤細(xì)胞也可能成分免疫反應(yīng)的靶因而可能在尚未確定所有腫瘤細(xì)胞都被消除之前細(xì)胞因子的來源已被殺滅。為對付這個問題，可將能把受感染細(xì)胞從免疫系統(tǒng)屏蔽起來的病毒蛋白的表達(dá)連同相同細(xì)胞中的細(xì)胞因子基因置于調(diào)節(jié)下。一種這類蛋白質(zhì)是腺病毒的E19蛋白(見例如Cox，Science 247715)該蛋白阻止I類HLA抗原運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞表面因而阻止細(xì)胞被宿主細(xì)胞毒性T細(xì)胞識別并裂解。相應(yīng)地，當(dāng)由于細(xì)胞因子表達(dá)誘發(fā)的免疫反應(yīng)發(fā)作時，腫瘤細(xì)胞中E19的受調(diào)節(jié)的表達(dá)將產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞對細(xì)胞毒性T細(xì)胞屏蔽起來。過了一段足夠長的時間，足以殺滅除那些表達(dá)E19的所有腫瘤細(xì)胞，可以關(guān)閉E19表達(dá)，使這些細(xì)胞受被激發(fā)的抗腫瘤免疫反應(yīng)攻擊殺死。
良性前列腺肥大與上述相似，可用本發(fā)明的調(diào)節(jié)物調(diào)節(jié)自殺基因，其中調(diào)節(jié)物本身被例如前列腺特異性啟動子控制。
本發(fā)明的調(diào)節(jié)體系可控地表達(dá)自殺基因(例如細(xì)胞死亡基因，TK基因等)的能力增加了本系統(tǒng)的普遍安全性和有用性。例如，在所需療法結(jié)束時誘發(fā)自殺基因表達(dá)來殺死攜帶基因治療載體的細(xì)胞，諸如生物惰性移植物的細(xì)胞，擴(kuò)散出預(yù)定的原位置的細(xì)胞，等等。而且，一旦轉(zhuǎn)植體腫瘤化或產(chǎn)生副作用，誘導(dǎo)自殺基因即可迅速殺滅這些細(xì)胞。在細(xì)胞中應(yīng)用多于一種Tc控制的“開啟/關(guān)閉”開關(guān)可使自殺基因的調(diào)節(jié)與有治療價值的基因(此處詳述)的調(diào)節(jié)完全獨立。
本發(fā)明的調(diào)節(jié)系統(tǒng)進(jìn)一步提供了在受試者中建立與治療相關(guān)的目的基因產(chǎn)物的表達(dá)水平的能力，而不加調(diào)節(jié)的連續(xù)性表達(dá)使所能達(dá)到的基因產(chǎn)生表達(dá)水平?jīng)]有任何靈活性。可根據(jù)受試者特定的醫(yī)療需要建立與生理相關(guān)的基因產(chǎn)物表達(dá)水平。例如依據(jù)監(jiān)控相關(guān)基因產(chǎn)物水平的實驗室試驗(用上述方法)。除了與上述基因產(chǎn)物的基因劑量一起討論的基因產(chǎn)物及臨床樣本，其它可在特定時間以特定水平表達(dá)的與治療相關(guān)的基因產(chǎn)物包括血友病患者中的XIII因子和IX因子(例如在有受傷危險的時候如運(yùn)動中其表達(dá)上升)，糖尿病患者的胰島素或糊精(根據(jù)受試者疾病狀態(tài)，飲食等)，用于治療紅細(xì)胞減少癥的促紅細(xì)胞生成素(例如在腎衰竭末期需要)，用于動脈硬化或肝中基因療法的低密度脂蛋白受體(LDLr)或極低密度脂蛋白受體(VLDLr)(例如用體外移植體)。治療中央神經(jīng)系統(tǒng)疾病的應(yīng)用也包含在內(nèi)。例如，在老年性癡呆中可實現(xiàn)對用于恢復(fù)乙酰膽堿水平的膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶(ChAT)，神經(jīng)營養(yǎng)因子(例如NGF，BDNGF等)和/或補(bǔ)體抑制物(例如sCR1，sMCP，sDAF，sCD59等)的表達(dá)的“細(xì)調(diào)”。此類基因產(chǎn)物可由例如用本發(fā)明的體系可調(diào)節(jié)地表達(dá)基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)植細(xì)胞提供。而且，可用能提高左旋多巴和多巴胺水平的酪氨酸水解酶(TH)的“細(xì)調(diào)”的表達(dá)來治療帕金森氏病。
除了上述蛋白類基因產(chǎn)物，可以為治療用途在受試者中可控地表達(dá)作為功能性RNA分子的基因產(chǎn)物(例如反義RNA和核酸酶)。例如，可設(shè)計一種核酸酶，它能區(qū)分基因的突變形式和野生形式。相應(yīng)地，可將“正確”基因(例如野生型p53基因)引入細(xì)胞，同時引入對基因突變形式(例如突變型的內(nèi)源p53基因)有特異性的受調(diào)節(jié)的核酸酶，來去除從內(nèi)源基因表達(dá)的有缺陷的mRNA。有些情況下，缺陷型基因的基因產(chǎn)物會干擾外源野生型基因的作用，這時該方法特別有利。
用四環(huán)素或其類似物調(diào)節(jié)使用本發(fā)明的調(diào)節(jié)體系的受試者中基因產(chǎn)物表達(dá)。可用適于將藥物送到所需作用處的途徑給藥(例如，送藥到含有表達(dá)受調(diào)控的基因的細(xì)胞中)。根據(jù)涉及的具體細(xì)胞類型，優(yōu)選的給藥途徑包括口服靜脈給藥和局部給藥(例如透皮途徑達(dá)到皮下定位的移植物的細(xì)胞，例如角質(zhì)細(xì)胞，而避免任何全身治療可能帶來的副作用)。
在某些基因療法情況下，可能有必要或很必要采取步驟來避免或抑制接受治療的受試者中不需要的免疫反應(yīng)。為避免對抗表達(dá)治療基因產(chǎn)物的細(xì)胞，可能的話通常用受試者自己的細(xì)胞來表達(dá)治療基因產(chǎn)物，或是體內(nèi)修飾受試者細(xì)胞或是先從受試者獲取細(xì)胞，在體外修飾后再送回受試者體內(nèi)。在某些情況下，同種異體細(xì)胞或異種細(xì)胞用來表達(dá)目的基因的產(chǎn)物，本發(fā)明的調(diào)節(jié)體系除了調(diào)節(jié)治療基因之外，也可用來調(diào)節(jié)參與細(xì)胞的免疫識別的的一種或多種基因從而抑制對外來細(xì)胞的免疫反應(yīng)。例如，參與T細(xì)胞識別外來細(xì)胞的細(xì)胞表面分子可在用來運(yùn)輸治療基因產(chǎn)物的外來細(xì)胞表面被減量調(diào)節(jié)，例如通過調(diào)節(jié)外來細(xì)胞中切割編碼細(xì)胞表面分子的mRNA的核酸酶的表達(dá)?？捎眠@種方式減量調(diào)節(jié)以抑制不需要的免疫反應(yīng)的特別優(yōu)選的細(xì)胞表面分子包括I類和/或II類主要組織相容性復(fù)合物(MHC)分子，共刺激分子(例如B7-1或/或B7-2)，CD40和各種“粘附”分子，如ICAM-1或ICAM-2。用此處描述的方法來獨立卻又協(xié)同地調(diào)節(jié)相同細(xì)胞中多種基因，宿主細(xì)胞中細(xì)胞表面分子的減量調(diào)節(jié)可與治療基因的增量調(diào)節(jié)相協(xié)同。相應(yīng)地，療程結(jié)束而且治療基因的表達(dá)停止以后，內(nèi)源細(xì)胞表面分子的表達(dá)又可恢復(fù)正常。
而且，如同上面對抗癌治療所述，作為避免不需要的免疫反應(yīng)的一種方法，可在宿主細(xì)胞中用本發(fā)明的體系來調(diào)節(jié)那些減量調(diào)節(jié)MHC抗原表達(dá)的病毒蛋白(例如腺病毒E19蛋白)。
除了避免或抑制針對運(yùn)輸治療基因產(chǎn)物的外來細(xì)胞的免疫反應(yīng)外，在某些情況下也可能有必要避免或抑制針對在受試者中表達(dá)的本發(fā)明的調(diào)節(jié)體系的某些組分(例如此處描述的調(diào)節(jié)融合蛋白)。因為這些融合蛋白含有可能激活不需要的免疫反應(yīng)的非哺乳動物多肽。有鑒于此，可以設(shè)計和/或選擇在宿主中激活免疫反應(yīng)的能力下降的調(diào)節(jié)融合蛋白。例如可選用具有最低免疫原性的用于調(diào)節(jié)融合蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。鑒于此，皰疹單組病毒蛋白VP16的野生型轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可能不是體內(nèi)應(yīng)用的優(yōu)選的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，因為它可以引起哺乳動物的免疫反應(yīng)。根據(jù)此處所述依照其在宿主中降低的免疫原性可以采用其它的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。例如，可優(yōu)選與宿主相同物種的蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(例如，一種人類蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域用于人體中的調(diào)節(jié)融合蛋白)。備選地，可修飾本發(fā)明的調(diào)節(jié)融合蛋白來降低其在受試者中的免疫原性，例如通過鑒定并修飾融合蛋白-多肽中的一個或多個顯性T細(xì)胞表位(例如，Tet阻遏子半體或轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物半體，如VP16多肽)。這些T細(xì)胞表位可用標(biāo)準(zhǔn)方法鑒定并同樣用標(biāo)準(zhǔn)方法誘變修飾。然后可選擇調(diào)節(jié)物融合蛋白的修飾形式，它與未修飾的融合蛋白相比保留原來的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物活性但在受試者中表現(xiàn)降低的免疫原性。
除前述之外，在需要抑制免疫反應(yīng)的情況下所有能在受試者中一般性或特異性減量調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的常規(guī)方法均可與本發(fā)明的調(diào)節(jié)體系配合使用?？蓪κ茉囌呓o藥普通免疫抑制劑，如環(huán)孢素A和/或FK506。備選地，可用有更特異的免疫抑制的免疫調(diào)節(jié)劑。這類藥劑可包括共刺激分子的抑制物(例如CTLA4Ig融合蛋白，可溶性CD4，抗CD4抗體，抗B7-1和/或抗B7-2抗體或是抗gp39抗體)。
最后，在某些情況下可選用表達(dá)治療基因的細(xì)胞的運(yùn)輸載體，使移植細(xì)胞暴露給免疫系統(tǒng)的程度最小。例如細(xì)胞可移植到帶小孔的生物惰性莢囊/生物可容性膜里，使蛋白質(zhì)(例如感興趣的治療基因產(chǎn)物)擴(kuò)滲出移植體，養(yǎng)料和氧氣擴(kuò)滲進(jìn)移植體而免疫細(xì)胞不能進(jìn)入，從而避免了將移植細(xì)胞暴露給免疫系統(tǒng)(已應(yīng)用于島細(xì)胞移植)。
B.體外生產(chǎn)蛋白質(zhì)可以用體外培養(yǎng)的細(xì)胞實現(xiàn)感興趣蛋白質(zhì)的大規(guī)模生產(chǎn)，這些細(xì)胞經(jīng)修飾含有1)編碼本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白的核酸，它適于在細(xì)胞中表達(dá)該轉(zhuǎn)錄激活物和2)編碼感興趣蛋白質(zhì)的基因，它經(jīng)操作連到tet操縱子序列上。例如，哺乳動物、酵母或真菌細(xì)胞經(jīng)修飾可包含此處描述的這些核酸組分。然后當(dāng)Tc或其類似物存在時用標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵技術(shù)培養(yǎng)經(jīng)修飾的哺乳動物、酵母或真菌細(xì)胞來誘導(dǎo)基因表達(dá)并生產(chǎn)感興趣蛋白質(zhì)。相應(yīng)地，本發(fā)明提供一種分離目的基因的生產(chǎn)工藝流程。在該工藝流程中，宿主細(xì)胞(例如酵母或真菌)，其中引入了編碼本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白的核酸和經(jīng)操作連到至少一段tet操縱子序列上的編碼感興趣蛋白質(zhì)的核酸，當(dāng)四環(huán)素或四環(huán)素類似物存在時在培養(yǎng)基中以生產(chǎn)規(guī)模生長來激活編碼感興趣蛋白的核苷酸序列(即經(jīng)操作連到tet操縱子上的核苷酸序列)的轉(zhuǎn)錄。然后從收獲的宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基中分離感興趣蛋白。可用標(biāo)準(zhǔn)蛋白提純技術(shù)從培養(yǎng)基或收獲的細(xì)胞中分離感興趣蛋白質(zhì)。
C.體內(nèi)生產(chǎn)蛋白質(zhì)本發(fā)明還提供在動物如轉(zhuǎn)基因農(nóng)場動物中感興趣蛋白質(zhì)的大規(guī)模生產(chǎn)。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的進(jìn)步已能生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因家畜，例如牛、山羊、豬和綿羊(綜述見Wall，R.J.等人(1992)細(xì)胞生物化學(xué)雜志，49113-120；和Clark，A.J.等(1987)生物技術(shù)動態(tài)520-24)。相應(yīng)地，可以建立在其基因組中攜帶本發(fā)明的可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)體系的組分的轉(zhuǎn)基因家畜，其中編碼感興趣蛋白的基因經(jīng)操作連到至少一段tet操縱子序列上。通過對轉(zhuǎn)基因動物給藥Tc(或其類似物)可誘導(dǎo)基因表達(dá)及蛋白生產(chǎn)。通過將編碼轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白的核酸與將轉(zhuǎn)錄激活物的表達(dá)限制到某些細(xì)胞中的適當(dāng)?shù)慕M織特異性調(diào)節(jié)成分相連接可將蛋白質(zhì)生產(chǎn)定位于特定的組織。例如，哺乳動物腺特異性調(diào)節(jié)成分，如乳清啟動子(美國專利4,873,316號和歐洲申請出版物264,166號)，可連到轉(zhuǎn)錄激活物轉(zhuǎn)基因上將轉(zhuǎn)錄激活物的表達(dá)限制于乳房組織。因此，當(dāng)Tc(或類似物)存在時，轉(zhuǎn)基因動物的乳房組織生產(chǎn)感興趣蛋白質(zhì)，可設(shè)計成該蛋白分泌到轉(zhuǎn)基因動物的乳汁中，如需要可從乳汁中分離該蛋白。
D.人類疾病的動物模型本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄激活物和抑制物蛋白可單獨或組合起來使用來激活或抑制動物中特定基因的表達(dá)，模擬人類疾病的病理進(jìn)而建立人類疾病的動物模型。例如在宿主動物中，推想?yún)⒂谝环N疾病的目的基因可受一段或多段tet操縱子序列的轉(zhuǎn)錄調(diào)控(例如用此外描述的同源重組)。該動物可與攜帶轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白和/或抑制物融合蛋白的一個或多個轉(zhuǎn)基因的另一動物交配，產(chǎn)生既攜帶四環(huán)素調(diào)節(jié)的融合蛋白又?jǐn)y帶tet調(diào)節(jié)的靶序列的后代?？捎盟沫h(huán)素細(xì)調(diào)這些后代的目的基因的表達(dá)。例如，可用轉(zhuǎn)錄抑制物融合蛋白減量調(diào)節(jié)目的基因的表達(dá)來檢驗基因表達(dá)與疾病的關(guān)系。該方法比用同源重組“剔除”基因來建立疾病的動物模型要好得多，因為此處描述的tet調(diào)節(jié)體系既可調(diào)控目的基因表達(dá)的水平又可調(diào)控基因表達(dá)被減量或增量調(diào)節(jié)的時間。
E.生產(chǎn)穩(wěn)定的細(xì)胞系用于基因克隆及其它用途此處描述的轉(zhuǎn)錄抑制物體系可用來保持基因表達(dá)“關(guān)閉”(即表達(dá)過的)從而能產(chǎn)生用其它方法不能得到的穩(wěn)定細(xì)胞系。例如，攜帶對細(xì)胞有細(xì)胞毒性的基因的穩(wěn)定細(xì)胞系由于毒性基因表達(dá)的“泄漏”很難或不可能得到。通過用本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄抑制物融合蛋白阻遏這樣的毒性基因的表達(dá)可得到攜帶毒性基因的穩(wěn)定細(xì)胞系。這樣的穩(wěn)定細(xì)胞系可用來克隆這樣的毒性基因(例如用Tc或類似物在可控條件下誘導(dǎo)毒性基因的表達(dá))。本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄抑制物體系能夠應(yīng)用的基因克隆表達(dá)的一般方法在本領(lǐng)域已知(見例如Edwards，C.P.和Aruffo，A.(1993)當(dāng)代生物技術(shù)觀念，4558-563)。另外，轉(zhuǎn)錄抑制物體系可應(yīng)用于抑制其它細(xì)胞中基因的基底表達(dá)來得到穩(wěn)定的細(xì)胞系，諸如胚胎干(ES)細(xì)胞系。引入ES細(xì)胞的某些基因的殘留表達(dá)可能導(dǎo)致不能分離到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆。用此處描述的轉(zhuǎn)錄抑制物體系抑制這些基因的轉(zhuǎn)錄可能有助于解決這個問題。
優(yōu)點利用轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白的本發(fā)明的可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)體系面對并解決了本領(lǐng)域中許多其它可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)體系的缺陷。例如，不需要很高胞內(nèi)濃度的本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白即可有效調(diào)節(jié)基因表達(dá)。另外，由于是添加誘導(dǎo)劑而非去除誘導(dǎo)劑來誘導(dǎo)基因表達(dá)。本發(fā)明的體系的誘導(dǎo)動子學(xué)不受誘導(dǎo)劑去除速率的限制因而典型地要快些。而且，基因轉(zhuǎn)錄受誘導(dǎo)時誘導(dǎo)劑并不存在，從而不必以藥劑的持續(xù)存在來保持基因表達(dá)關(guān)閉。
應(yīng)用本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄抑制物融合蛋白來抑制真核細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄也比僅用原核阻遏子(例如TetR，lacR)來抑制真核細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄要有利。由于本發(fā)明的抑制物融合蛋白含有真核轉(zhuǎn)錄抑制子結(jié)構(gòu)域。這些融合蛋白阻遏真核細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄會更有效，因而會潛在地僅需較低胞內(nèi)濃度即可有效阻遏并更不容易“泄漏”。另外，通過將tetO序列插入內(nèi)源基因的調(diào)節(jié)區(qū)域，可用本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄抑制物融合蛋白來減量調(diào)節(jié)內(nèi)源基因的組成性和/或組織特異性表達(dá)。
而且，各種形式的lac體系(例如labow等人(1990)分子細(xì)胞生物學(xué)103343-3356；Baim等人(1991)美國國家科學(xué)院院刊885072-5076)。受限制于誘導(dǎo)劑(IPTG)的不利特性和/或需要提高溫度來誘導(dǎo)基因表達(dá)(可能會誘發(fā)多重效果)，與之相比，本發(fā)明的體系所用的誘導(dǎo)劑(Tc或其類似物)有許多有利的特性1)Tc和其類似物對TetR有高親和性對真核細(xì)胞毒性低，因而可以在不影響細(xì)胞生長或形態(tài)的濃度用來誘導(dǎo)基因；2)存在保留Tet結(jié)合力但抗生素活性降低的Tc類似物并可用作誘導(dǎo)劑，從而避免了Tc的抗生素性質(zhì)可能帶來的副作用；3)Tc和Tc類似物的藥理動力學(xué)特性容許快速而有效的細(xì)胞攝取及穿透生理屏障，例如胎盤及血腦屏障；4)誘導(dǎo)能力不同的Tc類似物能夠細(xì)調(diào)基因表達(dá)水平。
因此，本發(fā)明提供的可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)體系能快速激活基因且沒有細(xì)胞毒性及a range of induction indiccs，誘導(dǎo)后基因表達(dá)增強(qiáng)典型地是1000倍至2000倍之間并可高達(dá)20,000倍。備選地，根據(jù)所選用的誘導(dǎo)劑也能達(dá)到低水平的基因誘導(dǎo)，例如10倍。本體系有廣泛的應(yīng)用前景。這些應(yīng)用包括基因療法，培養(yǎng)細(xì)胞及轉(zhuǎn)基因農(nóng)場動物的大規(guī)模蛋白質(zhì)生產(chǎn)和基因功能的研究，例如基因功能與細(xì)胞發(fā)育與分化的關(guān)系。另外，本發(fā)明的新型轉(zhuǎn)錄單元能夠利用本發(fā)明的調(diào)節(jié)組分協(xié)同地或獨立地調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá)。
本發(fā)明進(jìn)一步由下述實施例來說明但不應(yīng)限制于此。本申請通篇引用的參考資料，專利及公開專利申請的內(nèi)容在此引入作為參考。
實施例1突變型Tet阻遏子的選擇和四環(huán)素可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活物的構(gòu)建當(dāng)四環(huán)素存在時而非不存在時結(jié)合其靶DNA的“反式”Tet阻遏子基本上通過化學(xué)誘變和選擇來制得，描述見Hecht.B.等人(1993)細(xì)菌學(xué)雜志1751206-1210。用亞硝酸鈉化學(xué)誘變編碼野生型Tn10來源的Tet阻遏子的單鏈DNA(編碼鏈和不編碼鏈)。單鏈DNA(40μl Tris-EDTA緩沖液中40μg)與10μl 2.5M乙酸鈉(pH 4.3)和50μl0.25M到2M的硝酸鈉混合，室溫溫育45到60分鐘。誘變后，用逆轉(zhuǎn)錄酶或用Taq DNA聚合酶的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增合成互補(bǔ)鏈。由于誘變過程中在DNA中產(chǎn)生多個突變，將三個基因片段每段約200堿基對，分別亞克隆到重組表達(dá)載體上的Wl(似為野生型)Tet阻遏子基因上去替換野生型基因的相應(yīng)部分。這樣形成一個突變型Tet阻遏子基因庫，其中每個基因在基因的二百堿基對誘變片段中大多僅有一個突變。
用大腸桿菌菌株WH207(λWH25)在遺傳檢測中篩選突變型Tet阻遏子的庫，正選擇Tet阻遏子與其同源操縱子的功能相互作用(菌株的構(gòu)建詳述見Wissmann，A.等人(1991)Generics128225-232)該大腸桿菌菌株中，tet操縱子指導(dǎo)趨異排列的β-半乳糖苷(lacZ)和Lac阻遏子(lacI)基因的表達(dá)，lac調(diào)節(jié)區(qū)域指導(dǎo)半乳糖激酶(galK)基因的表達(dá)。Tet阻遏子結(jié)合tet操縱子關(guān)閉lacI和lacZ基因的轉(zhuǎn)錄。Lac阻遏子不存在時允許galK基因表達(dá)，則大腸桿菌能用半乳糖作唯一碳源，這可作為一個標(biāo)記。lacZ表型可作為第二個標(biāo)記。因此，含有結(jié)合著tet操縱子的Tet阻遏子的細(xì)菌有Gal+，lacZ-表型。當(dāng)四環(huán)素不存在時含有野生型Tet阻遏子的細(xì)菌有Gal+，lacZ-表型。根據(jù)四環(huán)素存在時的Gal+，lacZ-表型可選擇突變型“反式”Tet阻遏子(tTetR)。
rTetR突變體的核苷酸和氨基酸序列由SEQ ID NO1(核苷酸位置1-621)和2(氨基酸位置1-207)分別給出。rTetR突變體的序列分析顯示有下列氨基酸和核苷酸變化氨基酸(位置)受影響的密碼子野生型突變體野生型突變體glu(71) lysGAA AATasp(95) asnGAT AATleu(101) serTTA TCAgly(102) aspGGT GAT另外兩個突變不引起氨基酸交換氨基酸(位置)受影響的密碼子野生型突變體野生型突變體leu(41)leu TTGCTGArg(80)Arg CGTCGC為了將rTetR突變體轉(zhuǎn)變成轉(zhuǎn)錄激活物，編碼rTetR的氨基酸3到135(即涵蓋突變區(qū)域)的399堿基對的XbaI/Eco47III片段與表達(dá)載體pUHD15-1的對應(yīng)限制性片段交換得到pUHD17-1。pUHD15-1中，編碼野生型TetR的核苷酸序列在框地連接著編碼皰疹單組病毒VP16的C末端130個氨基酸的核苷酸序列。這些轉(zhuǎn)錄激活物序列上游由CMV啟動子/增強(qiáng)子包圍，下游由SV40多聚(A)位點包圍(pUHD15-1的構(gòu)建詳述見USSN 08/076,726和Gossen，M.和Bujard，H.(1992)美國國家科學(xué)院院刊895547-5551)，因此，pUHD17-1中，編碼反式TetR突變體的核苷酸序列在框地與VP16序列相連，產(chǎn)生反式Tc控制的轉(zhuǎn)錄激活物(此處稱為tTAR)。rTetR突變區(qū)對TetR野生型區(qū)域的相類的交換用質(zhì)粒pUHD152-1完成，pUHD152-1除了還含有編碼核定位信號的核苷酸序列在框地連接著編碼Tet阻遏子的核苷酸序列的5’端之外，與pUHD15-1相同。核定位信號的氨基酸序列是MPKRPRP(SEQ IDNO5)，它連到TetR二位氨基酸比氨酸。得到的編碼反式Tc控制的轉(zhuǎn)錄激活物的表達(dá)載體包括一核定位信號(此處稱為ntTAR)，該載體命名為pUHD172-1。
實施例2用tTAR四環(huán)素誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活瞬時轉(zhuǎn)染pUHD17-1和pUHD172-1表達(dá)載體用標(biāo)準(zhǔn)磷酸鈣方法瞬時轉(zhuǎn)染入Hela細(xì)胞中，一同轉(zhuǎn)染的標(biāo)記載體pUHC13-3中七聚tet操縱子融合到最小hCMV啟動子和熒光素酶標(biāo)記基因的上游(標(biāo)記載體詳述見USSN08/076,726以及Gossen，M.和Bujard，H.(1992)美國國家科學(xué)院院刊895547-5551)。當(dāng)四環(huán)素(或其類似物)存在或不存在時將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞37℃溫育20小時，然后如下檢測熒光素酶活性在35mm小皿中Eagle’s最低基本培養(yǎng)基中生長至～80％連生的細(xì)胞，用2ml磷酸鹽緩沖的鹽水洗滌，然后室溫下在25mM Tris磷酸鹽，pH 7.8/2mM二硫蘇糖醇/2mM二氨基己烷四乙酸/10％甘油/1％Triton-X-100裂解10分鐘。裂解物從培養(yǎng)皿中括下，用Eppendorfy離心管離心10分鐘。下一步，上清的等份(10μl)與250μl 25mM甘氨酰甘氨酸/15mM MgSO4/5mMATP混和，再用Lumat LB9501(Berthold，Wildbad，聯(lián)邦德國)積分模式(10秒鐘)檢測熒光素酶活性。D-熒光素(L6882，Sigma)用0.5mM。不含熒光素酶基因的Hela細(xì)胞提取物中測到的背景信號與儀器背景不可區(qū)分(80-120相對光單位(rlu)/10秒)。用Bradford法(Bradford，M.M.(1976)分析生物化學(xué)72248-254)確定裂解物的蛋白含量。用編碼tTAR或ntTAR的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞當(dāng)四環(huán)素存在時熒光素酶活性上升。若用脫水四環(huán)素(ATc)代替四環(huán)素，該效果持續(xù)地更加顯著。
穩(wěn)定轉(zhuǎn)染瞬間轉(zhuǎn)染分析完成后，制備表達(dá)載體作細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。將sSV2neo來源的新霉素抗性盒(描述見Southern，P.J.和Berg，P.(1982)應(yīng)用分子遺傳學(xué)，1327-341)整合到轉(zhuǎn)錄激活物表達(dá)載體pUHD17-1和pUHD172-1中，分別得到pUGD17-1neo，pUHD172-1neo。用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將編碼ntTAR的pUHD172-1neo穩(wěn)定整合到Hela細(xì)胞中。用攜帶熒光素酶基因的pUHC13-3在最小CMV啟動子和tet操縱子控制下瞬間超轉(zhuǎn)染10個G418抗性細(xì)胞克隆并分析其表型。三個克隆HR4，HR5手HR10當(dāng)ATc存在時表現(xiàn)熒光素酶活性的較強(qiáng)增長。從這些克隆中選HR5作進(jìn)一步的實驗。
為了得到ntTAR和tet操縱子相連的熒光素酶標(biāo)記基因共同的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染體，HR5細(xì)胞用pUH13-3和pHMR272共轉(zhuǎn)染，后者編碼潮霉素抗性(見Bernhard，H-U等人(1985)Exp.Cell Res.158237-243)，并選擇hygromycin克隆。在一個同類實驗中，HR5細(xì)胞用pUH13-7和pHMR272共轉(zhuǎn)染。pUH13-7含有的最小啟動子序列橫跨與七聚體tetO序列相鄰的HSVtk啟動子的+19至-37，pUH13-7不含最小CMV啟動子。21個潮霉素抗性克隆中，當(dāng)往培養(yǎng)基添加Tc或強(qiáng)力霉素(DC)時10個克隆顯示可誘導(dǎo)的熒光素酶活性。含有連著最小CMV啟動子的熒光素酶標(biāo)記基因的克隆稱為HR5-C，而含有連著最小tk啟動子的熒光素酶標(biāo)記基因的克隆稱為HR5-T。
六個被ntTAR-獨立的標(biāo)記單元穩(wěn)定轉(zhuǎn)染并且先已表現(xiàn)對四環(huán)素有反應(yīng)的HR5克隆在1μg/ml強(qiáng)力霉素存在或不存在情況下平行地生長。每個35mm皿中鋪約3×104個細(xì)胞(每種克隆4個皿)。生長60小時后收獲細(xì)胞并確定提取物中熒光素酶活性(相對光單位(rlu)/μg提取的蛋白質(zhì))。如表1所示，6個克隆的絕對表達(dá)水平表明在幾個含有ntTAR調(diào)節(jié)體系的雙穩(wěn)定細(xì)胞系中熒光素酶基因表達(dá)的激活可達(dá)到超過3個數(shù)量級。
應(yīng)當(dāng)注意，如果不是簡單地往培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)劑而是誘導(dǎo)前洗滌細(xì)胞然后將細(xì)胞重鋪到含有誘導(dǎo)劑的新鮮培養(yǎng)基中可達(dá)到更高的誘導(dǎo)因數(shù)(例如表達(dá)增加高達(dá)20,000倍)。
表1 雙穩(wěn)定luc+/HR5細(xì)胞克隆的Doxycycline依賴型熒光素酶活性熒光素酶活性， rlu/μg蛋白克隆 -強(qiáng)力霉素 +強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)因素HR5-C665 54,911 84562 69,525 1120HR5-C11 100165,671 1660142179,651 1270HR5-C14 43 44,493 103043 56,274 1310HR5-T256 16,696 29840 16,416 410HR5-T15 6.81838 2706.51688 260HR5-T19 4.81135 2365.41285 237用不同四環(huán)素誘導(dǎo)熒光素酶活性檢查四環(huán)素及幾種不同四環(huán)素類似物在HR5-C11細(xì)胞中誘導(dǎo)熒光素酶表達(dá)的能力。HR5-C11細(xì)胞鋪板密度約3×104細(xì)胞/35mm皿(～80％連生)。當(dāng)細(xì)胞完全粘附以后，將濃度為1μg/ml的下列四環(huán)素加入培養(yǎng)物中四環(huán)素-HCl(Tc)，氧四環(huán)素-HCl(OTc)，氯四環(huán)素(CTc)，脫水四環(huán)素-HCl(ATc)和強(qiáng)力霉素(Doxy)。這些化合物可購自Sigma化學(xué)公司，圣路易斯，MO，以濃度為1μg/ml的溶液貯存。生長時不加抗生素(-)的細(xì)胞作對照。3天后收獲細(xì)胞并確定熒光素酶活性和提取物的蛋白含量。結(jié)果由圖1的方塊圖給出。圖中每個塊(封閉的和打陰影線的)代表單個培養(yǎng)皿中相對熒光素酶活性(按提取蛋白的總量歸一化)。不加四環(huán)素的兩板得到的熒光素酶活性平均值定為1。Tc，CTc和OTc的熒光素酶活性激活小。與之對照，ATc和Doxy激活熒光素酶活性分別約為1000和1500倍。
HR5-C11細(xì)胞中熒光素酶活性對強(qiáng)力霉素的劑量反應(yīng)上述檢查不同四環(huán)素誘導(dǎo)能力的實驗顯示強(qiáng)力霉素是所檢查的四環(huán)素中最強(qiáng)力的效應(yīng)物。于是選強(qiáng)力霉素作其劑量效應(yīng)的定量分析。HR5-C11細(xì)胞與不同濃度的強(qiáng)力霉素共溫育并測量熒光素酶活性。三個獨立實驗的數(shù)據(jù)由圖2給出。若在培養(yǎng)基中濃度低于10ng/ml，強(qiáng)力霉素不能有效地誘導(dǎo)熒光素酶活性。然而若濃度提高至高過10ng/ml，觀察到熒光素酶表達(dá)幾乎是線性增長。1μg/ml時得到最大激活。濃度超過3ng/ml，用MTT檢測確定強(qiáng)力霉素對Hela細(xì)胞有輕微的生長抑制效果。
ntTAR體系的誘導(dǎo)動力學(xué)為了檢查強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)的ntTAR介導(dǎo)的基因表達(dá)誘導(dǎo)的動力學(xué)，將強(qiáng)力霉素加到培養(yǎng)基中(終濃度1μg/ml)后監(jiān)測HR5-C11細(xì)胞中熒光素酶活性誘導(dǎo)的時程。當(dāng)強(qiáng)力霉素存在時培養(yǎng)細(xì)胞，過不同的時間間隔，收獲細(xì)胞并依上述確定熒光素酶活性。如圖3所示，與Doxy溫育5.5小時后觀察到熒光素酶活性的100倍誘導(dǎo)。與Doxy溫育小于24時即可達(dá)到完全誘導(dǎo)水平。因此，這些結(jié)果表明細(xì)胞接觸誘導(dǎo)劑后很快發(fā)生基因表達(dá)的誘導(dǎo)。
實施例3用Tc控制的轉(zhuǎn)錄激活物協(xié)同調(diào)節(jié)兩段核苷酸序列的表達(dá)構(gòu)建一個協(xié)同雙向轉(zhuǎn)錄兩段核苷酸序列的重組表達(dá)載體，它從5’到3’方向包括熒光素酶基因，第一個最小啟動子，七段tet操縱子序列，第二個最小啟動子和LacZ基因。該結(jié)構(gòu)由圖6描述。在該結(jié)構(gòu)中，熒光素酶基因和LacZ基因的取向使得它們相對于tet操縱子序列以相反方向轉(zhuǎn)錄，即熒光素酶基因在DNA下鏈以5’到3’方向轉(zhuǎn)錄，而LacZ基因在DNA上鏈以5’到3’方向轉(zhuǎn)錄。熒光素酶基因后接SV40多聚腺苷化信號，而LacZ基因后接β-球蛋白多聚腺苷化信號。
該結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)染至表達(dá)野生型Tet阻遏子-VP16融合蛋白的Hela細(xì)胞系HtTA-1細(xì)胞中(該蛋白稱為tTA，描述見Gossen，M.和Bujard，H.(1992)美國國家科學(xué)院院刊895547-5551)。當(dāng)Tc(或類似物)不存在而非存在時tTA融合蛋白結(jié)合tet操縱子序列。該結(jié)構(gòu)與一種賦予潮霉素抗性的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HtTA-1細(xì)胞中，根據(jù)其潮霉素抗性表型選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆。對選擇出的潮霉素抗性(Hygrr)克隆檢查其熒光素酶和β-半乳糖苷酶活性。對三種標(biāo)記均陽性(Hygrr，luc+，β-gal+)的克隆，通過用遞增量的四環(huán)素培養(yǎng)克隆并測量熒光素酶和β-半乳糖苷酶活性來檢查熒光素酶和β-半乳糖苷酶活性表達(dá)的四環(huán)素依賴型共調(diào)節(jié)。采用Htl 316-8/50克隆的此類實驗的結(jié)果由圖8給出。當(dāng)四環(huán)素不存在時(其時tTA能結(jié)合tet操縱子并且激活基因表達(dá))，熒光素酶和β-半乳糖苷酶活性均能檢測到。當(dāng)存在遞增量的四環(huán)素時，熒光素酶和β-半乳糖苷酶活性被協(xié)同并等量地減量調(diào)節(jié)。此數(shù)據(jù)表明通過將兩個基因經(jīng)操作連到相同tet操縱子序列上可用四環(huán)素控制的轉(zhuǎn)錄激活物協(xié)同調(diào)節(jié)兩個基因的表達(dá)。
實施例4構(gòu)建含有TetR和一個Krueppel抑制子結(jié)構(gòu)域的四環(huán)素調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄抑制物融合蛋白為了構(gòu)建編碼本發(fā)明的四環(huán)素調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄抑制物(亦稱四環(huán)素控制的抑制子結(jié)構(gòu)域，或tSD)的表達(dá)載體，將編碼轉(zhuǎn)錄抑制子結(jié)構(gòu)域的核酸片段連接到含有編碼野生型或修飾的(即突變的)TetR的核苷酸序列的表達(dá)載體上并使抑制子結(jié)構(gòu)域編碼序列在框的與TetR編碼序列相連。質(zhì)粒pUHD141-1含有編碼野生型Tn10來源的Tet阻遏子的核苷酸序列(該阻遏子的核苷酸序列與氨基酸序列分別由SEQ ID NO16和17給出)。pUHD141sma-1中，TetR編碼序列在其5’端連接CMV啟動子，在其3’端連接的核苷酸序列形成多聚銜接物，附加的核苷酸片段可引入其中。該多聚銜接物區(qū)的核苷酸序列為TCC CCG GGT AAC TAA GTAAGG ATC C(SEQ ID NO24)(其中TCC CCG GGT ACC編碼Tet的205-208氨基酸殘基，即Ser-Gly-Ser-Asn)。該多聚銜接物區(qū)包括PspAI(CCC GGG)和BamHI(GGA TCC)的限制性內(nèi)切酶位點。在多聚銜接物區(qū)的下游，質(zhì)粒含有SV40來源的多聚腺苷化信號。pUHD141sma-1載體由圖11示意地描繪。
為了構(gòu)建編碼TetR和來自果蠅Krueppel(Kr)蛋白的轉(zhuǎn)錄抑制子結(jié)構(gòu)域的融合蛋白的表達(dá)載體，用Kr cDNA作模板用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增編碼來自Kr的抑制物結(jié)構(gòu)域的核酸片段。設(shè)計的寡聚核苷酸引物擴(kuò)增編碼Kr的C末端64個氨基酸(稱為C64KR)的核酸片段。該區(qū)域?qū)?yīng)天然蛋白的氨基酸位置403-466。C64KR的核苷酸序列和氨基酸序列由SEQ ID NO20和SEQ ID NO2 1分別給出。PCR引物設(shè)計成包括限制性內(nèi)切酶位點使得到的擴(kuò)增片段在其5’和3’端具有限制性內(nèi)切酶位點。選用那些包含在pUHD141sma-1的多聚銜接物并容許擴(kuò)增片段在框雙向地連到多聚銜接物位點的限制性內(nèi)切酶位點。例如，PCR引物設(shè)計成在編碼C64KR的片段的5’端引入PspAI位點(CCC GGG)在片段3’端引入BamHI位點。標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)完成后用PspAI和BamHI消化擴(kuò)增片段和pUHD141sma-1。然后在標(biāo)記連接條件下將擴(kuò)增片段定向連到pUHD141sma-1的多聚銜接物位點得到表達(dá)載體pUHD141Kr-1，用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來分離所需質(zhì)粒并確認(rèn)其結(jié)構(gòu)，pUHD141Kr-1的結(jié)構(gòu)由圖11示意地描繪。
得到的pUHD141Kr-1表達(dá)載體含有編碼包含著野生型TetR的1-207氨基酸在框地連接Kr的403-466氨基酸(C64KR)的融合蛋白的核苷酸序列。融合蛋白接合處的核苷酸序列和氨基酸序列如下AGTGGG TCC CCG GGT GAC ATG GAA(SEQ ID NO25)和Ser-Gly-Ser-Pro-Gly-Asp-Met-Glu(SEQ ID NO26)。Ser-Gly-Ser對應(yīng)TetR的205-207氨基酸并被多聚銜接物編碼，Asp-Met-Glu對應(yīng)C64KR的403-405氨基酸。
相似地，可以用編碼突變型TetR的核苷酸序列(其核苷酸序列和氨基酸序列分別由SEQ ID NO18和19給出)代替pUHD141-smal中的野生型TetR序列如上述構(gòu)建編碼突變型TetR(只當(dāng)Tc存在時結(jié)合tetO)和C64KR的融合蛋白的表達(dá)載體。
如實施例2所述將編碼TetR-Kr融合蛋白的表達(dá)載體(例如pUHD141K-1)瞬時或穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染進(jìn)宿主細(xì)胞。在宿主細(xì)胞中表達(dá)TetR-Kr融合基因。如實施例2所述含有一段或多段tetO序列的標(biāo)記基因結(jié)構(gòu)，一個最小啟動子和一個標(biāo)記基因例如熒光素酶也轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞中(標(biāo)記基因結(jié)構(gòu)進(jìn)一步詳述見USSN 08/076,726和Gossen，M.和Bujard，H(1992)美國國家科學(xué)院院刊895547-5551)。如實施例2所述測量當(dāng)遞增濃度的Tc或類似物例如強(qiáng)力霉素存在或不存在時熒光素酶活性。對上述野生型TetR-Kr融合蛋白，通過比較強(qiáng)力霉素存在時(無阻遏)熒光素酶活性量與強(qiáng)力霉素不存在時(阻遏)熒光素酶活性量來確定融合蛋白的轉(zhuǎn)錄抑制能力。還可用表現(xiàn)高基底表達(dá)水平(即強(qiáng)力霉素存在時高表達(dá)水平)的標(biāo)記基因結(jié)構(gòu)利用含有附加的正調(diào)節(jié)成分(例如增強(qiáng)子序列)來檢測融合蛋白的轉(zhuǎn)錄抑制能力。
實施例5構(gòu)建含有TetR和v-erbA抑制子結(jié)構(gòu)域的四環(huán)素調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄抑制物融合蛋白為了構(gòu)建編碼TetR和來自v-erbA致癌基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄抑制子結(jié)構(gòu)域的融合蛋白的表達(dá)載體，如實施例4將編碼來自v-erbA的抑制子結(jié)構(gòu)域的核酸片段在框地連到pUHD141sma-1上。用v-erbA cDNA作模板用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增編碼適合連接pUHD141sma-1的v-erbA抑制子結(jié)構(gòu)域的核酸片段。設(shè)計的寡聚核苷酸引物擴(kuò)增編碼天然v-erbA蛋白的364-635氨基酸的核酸片段。v-erbA該區(qū)域的核苷酸序列和氨基酸序列分別由SEQ ID NO22和SEQ ID NO23給出。如實施例4所述，PCR引物設(shè)計成擴(kuò)增的v-erbA片段在其5’和3’端含有限制性內(nèi)切酶位點，例如5’端有PspAI而3’端有BamHI。標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)完成后，用PspAI和BamHI消化擴(kuò)增片段和pUHD141-sma1，然后在標(biāo)準(zhǔn)連接條件下將擴(kuò)增片段定向連到pUHD141-sma1的多聚銜接物位點得到表達(dá)載體pUHD141-erb1。用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來離所需質(zhì)粒并確認(rèn)其結(jié)構(gòu)。pUHD141erb-1的結(jié)構(gòu)由圖11示意地描繪。
得到的pUHD141erb-1表達(dá)載體含有編碼包含著野生型TetR在框地連接v-erbA的364-635氨基酸的融合蛋白的核苷酸序列。融合蛋白接合處的核苷酸序列和氨基酸序列如下AGT GGG TCC CCG GGT CTGGAC GAC(SEQ ID NO27)和Ser-Gly-Ser-Pro-Gly-Leu-Asp-Asp(SEQ ID NO28)。Ser-Gly-Ser對應(yīng)Tet的205-207氨基酸，Pro-Gly由多聚銜接物編碼，Leu-Asp-Asp對應(yīng)v-erbA抑制子結(jié)構(gòu)域的364-366氨基酸。
如實施例4所述，可以用編碼突變型TetR的核苷酸序列(其核苷酸序列和氨基酸序列分別由SEQ ID NO18和19給出)代替pUHD141-sma1的野生型TetR序列如上述構(gòu)建編碼突變型Tet(僅當(dāng)Tc存在時結(jié)合tetO)和v-erbA抑制子結(jié)構(gòu)域的融合蛋白的表達(dá)載體。
如同實施例4對TetR-Kr融合蛋白那樣在宿主細(xì)胞中表達(dá)TetR-v-erbA融合蛋白并檢測融合蛋白的轉(zhuǎn)錄抑制活性。
實施例6用tTAR在轉(zhuǎn)基因動物中調(diào)節(jié)基因表達(dá)為了檢查tTAR體內(nèi)調(diào)節(jié)基因表達(dá)的能力，構(gòu)建小鼠的轉(zhuǎn)基因株，它含有tTAR表達(dá)結(jié)構(gòu)或標(biāo)記基因經(jīng)操作連著tet操縱子的外源染色體插入序列。含有tTAR表達(dá)結(jié)構(gòu)或tetO相連的標(biāo)記基因的單轉(zhuǎn)基因組雜交然后鑒定雙轉(zhuǎn)基因后代。對tTAR以四環(huán)素依賴形式調(diào)節(jié)標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄的能力對雙轉(zhuǎn)基因動物確定特性。該實施例表明當(dāng)對動物給藥四環(huán)素(或類似物)時tTAR在動物組織內(nèi)有效地激活經(jīng)操作連著tet操縱子的基因的表達(dá)，而當(dāng)四環(huán)素或類似物不存在時tetO相連的基因的表達(dá)保持在本底水平。這些結(jié)果表明此外描述的四環(huán)素控制的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)體系除了在體外細(xì)胞系中在動物體內(nèi)也有效地發(fā)揮作用。
獲得對PhCMV-tTAR表達(dá)單元轉(zhuǎn)基因的小鼠通過將從質(zhì)粒pUHG17-1切下的2.7kb Xhol-Pfml片段前核注射入受精卵得到表達(dá)tTA蛋白的小鼠。該DNA片段包含受人類CMV IE啟動子(位置+75至-675)轉(zhuǎn)錄控制的tTAR基因(SEQ ID NO1給出)和含有一個內(nèi)含子的兔β-球蛋白多聚腺苷化位點。人類CMV IE啟動子是組成性啟動子，只要編碼tTAR的DNA序列整合進(jìn)染色體，該啟動子就在所有細(xì)胞中表達(dá)突變型tetR-VP16融合蛋白。用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將DNA注射入受精卵，濃度約為5ng每μl。用標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程從受注射的受精卵得到轉(zhuǎn)基因小鼠。用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和Southern雜交分析轉(zhuǎn)基因建立者小鼠來探測tTAR轉(zhuǎn)基因是否存在于小鼠的染色體DNA。鑒定得到兩個轉(zhuǎn)基因小鼠系，CR3和CR4，它們與攜帶受tetO序列控制的熒光素酶標(biāo)記基因的另一種轉(zhuǎn)基因小鼠雜交育種(下面詳述)。
獲得對PhCMV*-1熒光素酶標(biāo)記單元轉(zhuǎn)基因的小鼠通過將從質(zhì)粒pUHC13-1切下的3.1kb XhoI-EaeI片段前核注射入受精卵得到攜帶PhCMV*-1luc標(biāo)記基因表達(dá)單元的小鼠。該DNA片段包含受四環(huán)素響應(yīng)的PhCMV*-1啟動子(SEQ ID NO8)轉(zhuǎn)錄控制的熒光素酶基因和含有一個內(nèi)含子的SV40 t早期多聚腺苷化位點。將濃度約為5ng每μl的DNA注射入卵細(xì)胞中用標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程得到轉(zhuǎn)基因小鼠。用Southern雜交分析轉(zhuǎn)基因建立者小鼠探測PhCMV*-1luc轉(zhuǎn)基因是否存在于小鼠的染色體DNA。對tetO相連的熒光素酶標(biāo)記基因轉(zhuǎn)基因的小鼠系，L7，與tTAR轉(zhuǎn)基因系CR3和CR4雜交育種(下面詳述)。
獲得對PhCMV*-1luc和PhCMVtTRR轉(zhuǎn)基因的小鼠構(gòu)建了表達(dá)tTAR或攜帶PhCMV*-1luc單轉(zhuǎn)基因小鼠后，通過將對兩種轉(zhuǎn)基因之一種轉(zhuǎn)基因的異源小鼠雜交育種得到攜帶tTAR表達(dá)載體和熒光素酶標(biāo)記單元的雙轉(zhuǎn)基因小鼠。用標(biāo)準(zhǔn)篩選方法(例如PCR和/或Southern雜交)鑒定雙轉(zhuǎn)基因小鼠來探測tTAR轉(zhuǎn)基因和PhCMV*-1luc轉(zhuǎn)基因是存在于小鼠的染色體DNA。
在小鼠的組織樣本中誘導(dǎo)和分析熒光素酶活性口服時，四環(huán)素和其衍生物強(qiáng)力霉素溶于飲用水濃度200μg每ml，連同5％蔗糖給藥以蓋住抗生素的苦味。對哺乳小鼠，濃度為2mg每ml連同10％蔗糖以保證通過乳汁讓幼鼠充足地攝取。
為了分析熒光素酶活性，用斷頸法處死小鼠，用Ultra-Turrax在含有500μl裂解緩沖液(25mM Tris磷酸鹽，pH 7.8/2mM DTT/2mMEDTA/10％甘油/10％Triton X100)的2ml試管中將組織樣品勻漿。勻漿用液氮冷凍，化凍后15,000g離心5min。取2-20μl上清液，與250μl熒光素酶檢測緩沖液(25mM甘氨酰甘氨酸，pH 7.5/15mM MgSO4/5mMATP)混合，待注射入100μl的125μM熒光素溶液后用Berthold LumatLB 9501測量10sec，用Bradford檢測法確定勻漿中蛋白濃度，熒光素酶活性按相對光單位(rlu)每μg總蛋白計算。
結(jié)論2個攜帶PhCMV-tTAR轉(zhuǎn)基因的系(CR3和CR4)的小鼠與對PhCMV*-1luc轉(zhuǎn)基因的L7系的小鼠交配L7系在不同器官中表現(xiàn)非常低但可檢測到的熒光素酶活性本底，這可能是由于整合位點的位置效應(yīng)。L7單轉(zhuǎn)基因小鼠不同組織中本底熒光素酶活性由圖12圖示描繪，由每個受檢組織右邊的有格子花的柱代表(每個柱代表一種動物的結(jié)果)。當(dāng)四環(huán)素或其類似物強(qiáng)力霉素不存在時(即未誘導(dǎo)條件下)C3/L7雙轉(zhuǎn)基小鼠不同組織中熒光素酶活性由圖12圖示描繪。由每個受檢組織中間的深色柱代表。當(dāng)強(qiáng)力霉素存在時(即誘導(dǎo)條件下)C3/L7雙轉(zhuǎn)基因小鼠不同組織中熒光素酶活性由圖12圖示描繪，由每個受檢組織左邊的淺色柱代表。
在受檢的雙轉(zhuǎn)基因小鼠的七種組織中檢測到熒光素酶活性胰，腎，胃，肌肉，胸腺，心臟和舌。雙轉(zhuǎn)基因小鼠的激活熒光素酶水平的組織模式(即當(dāng)強(qiáng)力霉素存在時)與文獻(xiàn)報導(dǎo)的hCMV IE啟動子的表達(dá)模式相似。這與熒光素酶標(biāo)記基因的表達(dá)受tTAR調(diào)節(jié)一致(tTAR在小鼠中的表達(dá)受hCMV IE啟動子控制)。標(biāo)記基因誘導(dǎo)水平隨不同受檢組織不同。調(diào)節(jié)因數(shù)可高達(dá)100,000倍(即5個數(shù)量級)，例如在胰中。
等價方案本領(lǐng)域的專業(yè)人員應(yīng)了解或是能確定僅用例行的實驗操作即可得到此處描述的本發(fā)明的特定實施方案的許多等價方案。這些等價方案將被下述權(quán)利要求包涵。
序列表(1)一般資料(i)申請人(A)姓名Hermann Bujard(B)街道Remler街9號(C)城市D-69120海德堡(E)國家德國(A)姓名Manfred Gossen(B)街道978 Arlington大街# B(C)城市E1 Cerrito(D)州加利福尼亞(E)國家美國(F)郵政編碼94530(ii)發(fā)明名稱四環(huán)素調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控物(iii)序列數(shù)28(iv)通訊地址(A)收信人LAHIVE & COCKFIELD(B)街道60 State Street，suite 510(C)城市波士頓(D)州馬薩諸塞州(E)國家美國(F)郵政編碼02109-1875(v)計算機(jī)讀取形式(A)介質(zhì)類型軟磁盤(B)計算機(jī)IBM PC兼容型(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件ASCII文本(vii)先前申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)柎?B)提交日期1995年6月7日(C)分類
(vii)先前申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)朥S 08/383,754(B)提交日期1995年2月3日(C)分類(vii)先前申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)朥S 08/275,876(B)提交日期1994年7月15日(C)分類(vii)先前申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)朥S 08/270,637(B)提交日期1994年7月1日(C)分類(viii)律師/代理人資料(A)姓名DeConti，Giulio A，Jr.
(B)登記號31,503(C)參考/登記號BBI-009C2PC(ix)遠(yuǎn)程通訊資料(A)電話(617)227-7400(B)電傳(617)227-5941(2)SEQ ID NO1的資料(i)序列特征(A)長度1008堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)漕愋途€型(ii)分子類型DNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵外顯子(B)位置1..1008(ix)特征
(A)名稱/關(guān)鍵mRNA(B)位置1..1008(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵misc.結(jié)合(B)位置1..207(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵misc.結(jié)合(B)位置208..335(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵CDS(B)位置1..1005(xi)序列描述SEQ ID NO1ATG TCT AGA TTA GAT AAA AGT AAA GTG ATT AAC AGC GCA TTA GAG CTG 48Met Ser Arg Leu Asp Lys Ser Lys Val Ile Asn Ser Ala Leu Glu Leu1 5 10 15CTT AAT GAG GTC GGA ATC GAA GGT TTA ACA ACC CGT AAA CTC GCC CAG 96Leu Asn Glu Val Gly Ile Glu Gly Leu Thr Thr Arg Lys Leu Ala Gln20 25 30AAG CTA GGT GTA GAG CAG CCT ACA CTG TAT TGG CAT GTA AAA AAT AAG 144Lys Leu Gly Val Glu Gln Pro Thr Leu Tyr Trp His Val Lys Asn Lys35 40 45CGG GCT TTG CTC GAC GCC TTA GCC ATT GAG ATG TTA GAT AGG CAC CAT 192Arg Ala Leu Leu Asp Ala Leu Ala Ile Glu Met Leu Asp Arg His His50 55 60ACT CAC TTT TGC CCT TTA AAA GGG GAA AGC TGG CAA GAT TTT TTA CGC 240Thr His Phe Cys Pro Leu Lys Gly Glu Ser Trp Gln Asp Phe Leu Arg65 70 75 80AAT AAG GCT AAA AGT TTT AGA TGT GCT TTA CTA AGT CAT CGC AAT GGA 288Asn Lys Ala Lys Ser Phe Arg Cys Ala Leu Leu Ser His Arg Asn Gly85 90 95GCA AAA GTA CAT TCA GAT ACA CGG CCT ACA GAA AAA CAG TAT GAA ACT 336Ala Lys Val His Ser Asp Thr Arg Pro Thr Glu Lys Gln Tyr Glu Thr100 105 110CTC GAA AAT CAA TTA GCC TTT TTA TGC CAA CAA GGT TTT TCA CTA GAG 384Leu Glu Asn Gln Leu Ala Phe Leu Cys Gln Gln Gly Phe Ser Leu Glu115 120 125
AAT GCA TTA TAT GCA CTC AGC GCT GTG GGG CAT TTT ACT TTA GGT TGC 432Asn Ala Leu Tyr Ala Leu Ser Ala Val Gly His Phe Thr Leu Gly Cys130 135 140GTA TTG GAA GAT CAA GAG CAT CAA GTC GCT AAA GAA GAA AGG GAA ACA 480Val Leu Glu Asp Gln Glu His Gln Val Ala Lys Glu Glu Arg Glu Thr145 150 155 160CCT ACT ACT GAT AGT ATG CCG CCA TTA TTA CGA CAA GCT ATC GAA TTA 528Pro Thr Thr Asp Ser Met Pro Pro Leu Leu Arg Gln Ala Ile Glu Leu165 170 175TTT GAT CAC CAA GGT GCA GAG CCA GCC TTC TTA TTC GGC CTT GAA TTG 576Phe Asp His Gln Gly Ala Glu Pro Ala Phe Leu Phe Gly Leu Glu Leu180 185 190ATC ATA TGC GGA TTA GAA AAA CAA CTT AAA TGT GAA AGT GGG TCC GCG 624Ile Ile Cys Gly Leu Glu Lys Gln Leu Lys Cys Glu Ser Gly Ser Ala195 200 205TAC AGC CGC GCG CGT ACG AAA AAC AAT TAC GGG TCT ACC ATC GAG GGC 672Tyr Ser Arg Ala Arg Thr Lys Asn Asn Tyr Gly Ser Thr Ile Glu Gly210 215 220CTG CTC GAT CTC CCG GAC GAC GAC GCC CCC GAA GAG GCG GGG CTG GCG 720Leu Leu Asp Leu Pro Asp Asp Asp Ala Pro Glu Glu Ala Gly Leu Ala225 230 235 240GCT CCG CGC CTG TCC TTT CTC CCC GCG GGA CAC ACG CGC AGA CTG TCG 768Ala Pro Arg Leu Ser Phe Leu Pro Ala Gly His Thr Arg Arg Leu Ser245 250 255ACG GCC CCC CCG ACC GAT GTC AGC CTG GGG GAC GAG CTC CAC TTA GAC 816Thr Ala Pro Pro Thr Asp Val Ser Leu Gly Asp Glu Leu His Leu Asp260 265 270GGC GAG GAC GTG GCG ATG GCG CAT GCC GAC GCG CTA GAC GAT TTC GAT 864Gly Glu Asp Val Ala Met Ala His Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp275 280 285CTG GAC ATG TTG GGG GAC GGG GAT TCC CCG GGT CCG GGA TTT ACC CCC 912Leu Asp Met Leu Gly Asp Gly Asp Ser Pro Gly Pro Gly Phe Thr Pro290 295 300CAC GAC TCC GCC CCC TAC GGC GCT CTG GAT ATG GCC GAC TTC GAG TTT 960His Asp Ser Ala Pro Tyr Gly Ala Leu Asp Met Ala Asp Phe Glu Phe305 310 315 320GAG CAG ATG TTT ACC GAT CCC CTT GGA ATT GAC GAG TAC GGT GGG TAG1008Glu Gln Met Phe Thr Asp Pro Leu Gly Ile Asp Glu Tyr Gly Gly325 330 335(2)SEQ ID NO2的資料(i)序列特征
(A)長度335氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)漕愋途€型(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Ser Arg Leu Asp Lys Ser Lys Val Ile Asn Ser Ala Leu Glu Leu1 5 10 15Leu Asn Glu Val Gly Ile Glu Gly Leu Thr Thr Arg Lys Leu Ala Gln20 25 30Lys Leu Gly Val Glu Gln Pro Thr Leu Tyr Trp His Val Lys Asn Lys35 40 45Arg Ala Leu Leu Asp Ala Leu Ala Ile Glu Met Leu Asp Arg His His50 55 60Thr His Phe Cys Pro Leu Lys Gly Glu Ser Trp Gln Asp Phe Leu Arg65 70 75 80Asn Lys Ala Lys Ser Phe Arg Cys Ala Leu Leu Ser His Arg Asn Gly85 90 95Ala Lys Val His Ser Asp Thr Arg Pro Thr Glu Lys Gln Tyr Glu Thr100 105 110Leu Glu Asn Gln Leu Ala Phe Leu Cys Gln Gln Gly Phe Ser Leu Glu115 120 125Asn Ala Leu Tyr Ala Leu Ser Ala Val Gly His Phe Thr Leu Gly Cys130 135 140Val Leu Glu Asp Gln Glu His Gln Val Ala Lys Glu Glu Arg Glu Thr145 150 155 160Pro Thr Thr Asp Ser Met Pro Pro Leu Leu Arg Gln Ala Ile Glu Leu165 170 175Phe Asp His Gln Gly Ala Glu Pro Ala Phe Leu Phe Gly Leu Glu Leu180 185 190Ile Ile Cys Gly Leu Glu Lys Gln Leu Lys Cys Glu Ser Gly Ser Ala195 200 205Tyr Ser Arg Ala Arg Thr Lys Asn Asn Tyr Gly Ser Thr Ile Glu Gly210 215 220Leu Leu Asp Leu Pro Asp Asp Asp Ala Pro Glu Glu Ala Gly Leu Ala225 230 235 240
Ala Pro Arg Leu Ser Phe Leu Pro Ala Gly His Thr Arg Arg Leu Ser245 250 255Thr Ala Pro Pro Thr Asp Val Ser Leu Gly Asp Glu Leu His Leu Asp260 265 270Gly Glu Asp Val Ala Met Ala His Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp275 280 285Leu Asp Met Leu Gly Asp Gly Asp Ser Pro Gly Pro Gly Phe Thr Pro290 295 300His Asp Ser Ala Pro Tyr Gly Ala Leu Asp Met Ala Asp Phe Glu Phe305 310 315 320Glu Gln Met Phe Thr Asp Pro Leu Gly Ile Asp Glu Tyr Gly Gly325 330 335(2)SEQ ID NO3的資料(i)序列特征(A)長度33堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)漕愋途€型(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO3GAC GCG CTA GAC GAT TTC GAT CTG GAC ATG TTG33Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu1 5 10(2)SEQ ID NO4的資料(i)序列特征(A)長度11氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)漕愋途€型(ii)分子類型肽類(v)片段類型內(nèi)部的(xi)序列描述SEQ ID NO4Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu1 5 10
(2)SEQ ID NO5的資料(i)序列特征(A)長度7氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)漕愋途€型(ii)分子類型肽類(v)片段類型內(nèi)部的(xi)序列描述SEQ ID NO5Met Pro Lys Arg Pro Arg Pro1 5(2)SEQ ID NO6的資料(i)序列特征(A)長度569堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)漕愋途€型(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO6GAATTCGGGG CCGCGGAGGC TGGATCGGTC CCGGTGTCTT CTATGGAGGT CAAAACAGCG60TGGATGGCGT CTCCAGGCGA TCTGACGGTT CACTAAACGA GCTCTGCTTA TATAGGTCGA 120GTTTACCACT CCCTATCAGT GATAGAGAAA AGTGAAAGTC GAGTTTACCA CTCCCTATCA 180GTGATAGAGA AAAGTGAAAG TCGAGTTTAC CACTCCCTAT CAGTGATAGA GAAAAGTGAA 240AGTCGAGTTT ACCACTCCCT ACCAGTGATA GAGAAAAGTG AAAGTCGAGT TTACCACTCC 300CTATCAGTGA TAGAGAAAAG TGAAAGTCGA GTTTACCACT CCCTATCAGT GATAGAGAAA 360AGTGAAAGTC GAGTTTACCA CTCCCTATCA GTGATAGAGA AAAGTGAAAG TCGAGCTCGC 420TACCCGGGTC GAGTAGGCGT GTACGGTGGG AGGCCTATAT AAGCAGAGCT CGTTTAGTGA 480ACCGTCAGAT CGCCTGGAGA CGCCATCCAC GCTGTTTTGA CCTCCATAGA AGACACCGGG 540ACCGATCCAG CCTCCGCGGC CCCGAATTC 569
(2)SEQ ID NO7的資料(i)序列特征(A)長度520堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)漕愋途€型(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO7AGATCTGCAG GGTCGCTCGG TGTTCGAGGC CACACGCGTC ACCTTAATAT GCGAAGTGGA 60CCGGATCTCG AGTTTACCAC TCCCTATCAG TGATAGAGAA AAGTGAAAGT CGAGTTTACC 120ACTCCCTATC AGTGATAGAG AAAAGTGAAA GTCGAGTTTA CCACTCCCTA TCAGTGATAG 180AGAAAAGTGA AAGTCGAGTT TACCACTCCC TATCAGTGAT AGAGAAAAGT GAAAGTCGAG 240TTTACCACTC CCTATCAGTG ATAGAGAAAA GTGAAAGTCG AGTTTACCAC TCCCTATCAG 300TGATAGAGAA AAGTGAAAGT CGAGTTTACC ACTCCCTATC AGTGATAGAG AAAAGTGAAA 360GTCGAGCTCG GTACCCGGGT CGAGTAGGCG TGTACGGTGG GAGGCCTATA TAAGCAGAGC 420TCGTTTAGTG AACCGTCAGA TCGCCTGGAG ACGCCATCCA CGCTGTTTTG ACCTCCATAC 480AAGACACCGG GACCGATCCA GCCTCCGCGG CCCCGAATTC520(2)SEQ ID NO8的資料(i)序列特征(A)長度450堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)漕愋途€型(ii)分子類型(基因組)DNA(vi)原始來源(A)生物體人類細(xì)胞肥大病毒(B)株K12，Towne(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵mRNA
(B)位置382..450(xi)序列描述SEQ ID NO8GAATTCCTCG AGTTTACCAC TCCCTATCAG TGATAGAGAA AAGTGAAAGT CGAGTTTACC 60ACTCCCTATC AGTGATAGAG AAAAGTGAAA GTCGAGTTTA CCACTCCCTA TCAGTGATAG 120AGAAAAGTGA AAGTCGAGTT TACCACTCCC TATCAGTGAT AGAGAAAAGT GAAAGTCGAG 180TTTACCACTC CCTATCAGTG ATAGAGAAAA GTGAAAGTCG AGTTTACCAC TCCCTATCAG 240TGATAGAGAA AAGTGAAAGT CGAGTTTACC ACTCCCTATC AGTGATAGAG AAAAGTGAAA 300GTCGAGCTCG GTACCCGGGT CGAGTAGGCG TGTACGGTGG GAGGCCTATA TAAGCAGAGC 360TCGTTTAGTG AACCGTCAGA TCGCCTGGAG ACGCCATCCA CGCTGTTTTG ACCTCCATAG 420AAGACACCGG GACCGATCCA GCCTCCGCGG 450(2)SEQ ID NO9的資料(i)序列特征(A)長度450堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)漕愋途€型(ii)分子類型(基因組)DNA(vi)原始來源(A)生物體人類細(xì)胞肥大病毒(B)株Towne(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵mRNA(B)位置382..450(xi)序列描述SEQ ID NO9GAATTCCTCG ACCCGGGTAC CGAGCTCGAC TTTCACTTTT CTCTATCACT GATAGGGAGT 60GGTAAACTCG ACTTTCACTT TTCTCTATCA CTGATAGGGA GTGGTAAACT CGACTTTCAC120TTTTCTCTAT CACTGATAGG GAGTGGTAAA CTCGACTTTC ACTTTTCTCT ATCACTGATA180GGGAGTGGTA AACTCGACTT TCACTTTTCT CTATCACTGA TAGGGAGTGG TAAACTCGAC240TTTCACTTTT CTCTATCACT GATAGGGAGT GGTAAACTCG ACTTTCACTT TTCTCTATCA300
CTGATAGGGA GTGGTAAACT CGAGTAGGCG TGTACGGTGG GAGGCCTATA TAAGCAGAGC360TCGTTTAGTG AACCGTCAGA TCGCCTGGAG ACGCCATCCA CGCTGTTTTG ACCTCCATAG420AAGACACCGG GACCGATCCA GCCTCCGCGG 450(2)SEQ ID NO10的資料(i)序列特征(A)長度398堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)漕愋途€型(ii)分子類型(基因組)DNA(vi)原始來源(A)生物體單純皰疹病毒(B)株KOS(xi)序列描述SEQ ID NO10GAGCTCGACT TTCACTTTTC TCTATCACTG ATAGGGAGTG GTAAACTCGA CTTTCACTTT 60TCTCTATCAC TGATAGGGAG TGGTAAACTC GACTTTCACT TTTCTCTATC ACTGATAGGG 120AGTGGTAAAC TCGACTTTCA CTTTTCTCTA TCACTGATAG GGAGTGGTAA ACTCGACTTT 180CACTTTTCTC TATCACTGAT AGGGAGTGGT AAACTCGACT TTCACTTTTC TCTATCACTG 240ATAGGGAGTG GTAAACTCGA CTTTCACTTT TCTCTATCAC TGATAGGGAG TGGTAAACTC 300GAGATCCGGC GAATTCGAAC ACGCAGATGC AGTCGGGGCG GCGCGGTCCG AGGTCCACTT 360CGCATATTAA GGTGACGCGT GTGGCCTCGA ACACCGAG 398(2)SEQ ID NO11的資料(i)序列特征(A)長度38堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)漕愋途€型
(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO11ACTTTATCAC TGATAAACAA ACTTATCAGT GATAAAGA 38(2)SEQ ID NO12的資料(i)序列特征(A)長度38堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)漕愋途€型(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO12ACTCTATCAT TGATAGAGTT CCCTATCAGT GATAGAGA 38(2)SEQ ID NO13的資料(i)序列特征(A)長度38堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)漕愋途€型(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO13AGCTTATCAT CGATAAGCTA GTTTATCACA GTTAAATT 38(2)SEQ ID NO14的資料(i)序列特征(A)長度38堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)漕愋途€型(ii)分子類型DNA
(xi)序列描述SEQ ID NO14ACTCTATCAT TGATAGGGAA CTCTATCAAT GATAGGGA 38(2)SEQ ID NO15的資料(i)序列特征(A)長度38堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)漕愋途€型(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO15AATCTATCAC TGATAGAGTA CCCTATCATC GATAGAGA 38(2)SEQ ID NO16的資料(i)序列特征(A)長度621堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)漕愋途€型(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO16ATG TCT AGA TTA GAT AAA AGT AAA GTG ATT AAC AGC GCA TTA GAG CTG48Met Ser Arg Leu Asp Lys Ser Lys Val Ile Asn Ser Ala Leu Glu Leu1 5 10 15CTT AAT GAG GTC GGA ATC GAA GGT TTA ACA ACC CGT AAA CTC GCC CAG 96Leu Asn Glu Val Gly Ile Glu Gly Leu Thr Thr Arg Lys Leu Ala Gln20 25 30AAG CTA GGT GTA GAG CAG CCT ACA TTG TAT TGG CAT GTA AAA AAT AAG 144Lys Leu Gly Val Glu Gln Pro Thr Leu Tyr Trp His Val Lys Asn Lys35 40 45CGG GCT TTG CTC GAC GCC TTA GCC ATT GAG ATG TTA GAT AGG CAC CAT 192Arg Ala Leu Leu Asp Ala Leu Ala Ile Glu Met Leu Asp Arg His His50 55 60
ACT CAC TTT TGC CCT TTA GAA GGG AGC AGC TGG CAA GAT TTT TTA CGT240Thr His Phe Cys Pro Leu Glu Gly Glu Ser Trp Gln Asp Phe Leu Arg55 70 75 80AAT AAG GCT AAA AGT TTT AGA TGT GCT TTA CTA AGT CAT CGC GAT GGA 288Asn Lys Ala Lys Ser Phe Arg Cys Ala Leu Leu Ser His Arg Asp Gly85 90 95GCA AAA GTA CAT TTA GGT ACA CGG CCT ACA GAA AAA CAG TAT GAA ACT 336Ala Lys Val His Leu Gly Thr Arg Pro Thr Glu Lys Gln Tyr Glu Thr100 105 110CTC GAA AAT CAA TTA GCC TTT TTA TGC CAA CAA GGT TTT TCA CTA GAG 384Leu Glu Asn Gln Leu Ala Phe Leu Cys Gln Gln Gly Phe Ser Leu Glu115 120 125AAT GCA TTA TAT GCA CTC AGC GCT GTG GGG CAT TTT ACT TTA GGT TGC 432Asn Ala Leu Tyr Ala Leu Ser Ala Val Gly His Phe Thr Leu Gly Cys130 135 140GTA TTG GAA GAT CAA GAG CAT CAA GTC GCT AAA GAA GAA AGG GAA ACA 480Val Leu Glu Asp Gln Glu His Gln Val Ala Lys Glu Glu Arg Glu Thr145 150 155 160CCT ACT ACT GAT AGT ATG CCG CCA TTA TTA CGA CAA GCT ATC GAA TTA 528Pro Thr Thr Asp Ser Met Pro Pro Leu Leu Arg Gln Ala Ile Glu Leu165 170 175TTT GAT CAC CAA GGT GCA GAG CCA GCC TTC TTA TTC GGC CTT GAA TTG 576Phe Asp His Gln Gly Ala Glu Pro Ala Phe Leu Phe Gly Leu Glu Leu180 185 190ATC ATA TGC GGA TTA GAA AAA CAA CTT AAA TGT GAA AGT GGG TCC 621Ile Ile Cys Gly Leu Glu Lys Gln Leu Lys Cys Glu Ser Gly Ser195 200 205(2)SEQ ID NO17的資料(i)序列特征(A)長度207氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)漕愋途€型(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO17Met Ser Arg Leu Asp Lys Ser Lys Val Ile Asn Ser Ala Leu Glu Leu1 5 10 15Leu Asn Glu Val Gly Ile Glu Gly Leu Thr Thr Arg Lys Leu Ala Gln20 25 30
Lys Leu Gly Val Glu Gln Pro Thr Leu Tyr Trp His Val Lys Asn Lys35 40 45Arg Ala Leu Leu Asp Ala Leu Ala Ile Glu Met Leu Asp Arg His His50 55 60Thr His Phe Cys Pro Leu Glu Gly Glu Ser Trp Gln Asp Phe Leu Arg65 70 75 80Asn Lys Ala Lys Ser Phe Arg Cys Ala Leu Leu Ser His Arg Asp Gly85 90 95Ala Lys Val His Leu Gly Thr Arg Pro Thr Glu Lys Gln Tyr Glu Thr100 105 110Leu Glu Asn Gln Leu Ala Phe Leu Cys Gln Gln Gly Phe Ser Leu Glu115 120 125Asn Ala Leu Tyr Ala Leu Ser Ala Val Gly His Phe Thr Leu Gly Cys130 135 140Val Leu Glu Asp Gln Glu His Gln Val Ala Lys Glu Glu Arg Glu Thr145 150 155 160Pro Thr Thr Asp Ser Met Pro Pro Leu Leu Arg Gln Ala Ile Glu Leu165 170 175Phe Asp His Gln Gly Ala Glu Pro Ala Phe Leu Phe Gly Leu Glu Leu180 185 190Ile Ile Cys Gly Leu Glu Lys Gln Leu Lys Cys Glu Ser Gly Ser195 200 205(2)SEQ ID NO18的資料(i)序列特征(A)長度621堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)漕愋途€型(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO18ATG TCT AGA TTA GAT AAA AGT AAA GTG ATT AAC AGC GCA TTA GAG CTG48Met Ser Arg Leu Asp Lys Ser Lys Val Ile Asn Ser Ala Leu Glu Leu1 5 10 15CTT AAT GAG GTC GGA ATC GAA GGT TTA ACA ACC CGT AAA CTC GCC CAG96Leu Asn Glu Val Gly Ile Glu Gly Leu Thr Thr Arg Lys Leu Ala Gln20 25 30
AAG CTA GGT GTA GAG CAG CCT ACA CTG TAT TGG CAT GTA AAA AAT AAG 144Lys Leu Gly Val Glu Gln Pro Thr Leu Tyr Trp His Val Lys Asn Lys35 40 45CGG GCT TTG CTC GAC GCC TTA GCC ATT GAG ATG TTA GAT AGG CAC CAT 192Arg Ala Leu Leu Asp Ala Leu Ala Ile Glu Met Leu Asp Arg His His50 55 60ACT CAC TTT TGC CCT TTA AAA GGG GAA AGC TGG CAA GAT TTT TTA CGC 240Thr His Phe Cys Pro Leu Lys Gly Glu Ser Trp Gln Asp Phe Leu Arg65 70 75 80AAT AAG GCT AAA AGT TTT AGA TGT GCT TTA CTA AGT CAT CGC AAT GGA 288Asn Lys Ala Lys Ser Phe Arg Cys Ala Leu Leu Ser His Arg Asn Gly85 90 95GCA AAA GTA CAT TCA GAT ACA CGG CCT ACA GAA AAA CAG TAT GAA ACT 336Ala Lys Val His Ser Asp Thr Arg Pro Thr Glu Lys Gln Tyr Glu Thr100 105 110CTC GAA AAT CAA TTA GCC TTT TTA TGC CAA CAA GGT TTT TCA CTA GAG 384Leu Glu Asn Gln Leu Ala Phe Leu Cys Gln Gln Gly Phe Ser Leu Glu115 120 125AAT GCA TTA TAT GCA CTC AGC GCT GTG GGG CAT TTT ACT TTA GGT TGC 432Asn Ala Leu Tyr Ala Leu Ser Ala Val Gly His Phe Thr Leu Gly Cys130 135 140GTA TTG GAA GAT CAA GAG CAT CAA GTC GCT AAA GAA GAA AGG GAA ACA 480Val Leu Glu Asp Gln Glu His Gln Val Ala Lys Glu Glu Arg Glu Thr145 150 155 160CCT ACT ACT GAT AGT ATG CCG CCA TTA TTA CGA CAA GCT ATC GAA TTA 528Pro Thr Thr Asp Ser Met Pro Pro Leu Leu Arg Gln Ala Ile Glu Leu165 170 175TTT GAT CAC CAA GGT GCA GAG CCA GCC TTC TTA TTC GGC CTT GAA TTG 576Phe Asp His Gln Gly Ala Glu Pro Ala Phe Leu Phe Gly Leu Glu Leu180 185 190ATC ATA TGC GGA TTA GAA AAA CAA CTT AAA TGT GAA AGT GGG TCC 621Ile Ile Cys Gly Leu Glu Lys Gln Leu Lys Cys Glu Ser Gly Ser195 200 205(2)SEQ ID NO19的資料(i)序列特征(A)長度207堿基對(B)類型氨基酸(D)拓?fù)漕愋途€型(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO19
Met Ser Arg Leu Asp Lys Ser Lys Val Ile Asn Ser Ala Leu Glu Leu1 5 10 15Leu Asn Glu Val Gly Ile Glu Gly Leu Thr Thr Arg Lys Leu Ala Gln20 25 30Lys Leu Gly Val Glu Gln Pro Thr Leu Tyr Trp His Val Lys Asn Lys35 40 45Arg Ala Leu Leu Asp Ala Leu Ala Ile Glu Met Leu Asp Arg His His50 55 60Thr His Phe Cys Pro Leu Lys Gly Glu Ser Trp Gln Asp Phe Leu Arg65 70 75 80Asn Lys Ala Lys Ser Phe Arg Cys Ala Leu Leu Ser His Arg Asn Gly85 90 95Ala Lys Val His Ser Asp Thr Arg Pro Thr Glu Lys Gln Tyr Glu Thr100 105 110Leu Glu Asn Gln Leu Ala Phe Leu Cys Gln Gln Gly Phe Ser Leu Glu115 120 125Asn Ala Leu Tyr Ala Leu Ser Ala Val Gly His Phe Thr Leu Gly Cys130 135 140Val Leu Glu Asp Gln Glu His Gln Val Ala Lys Glu Glu Arg Glu Thr145 150 155 160Pro Thr Thr Asp Ser Met Pro Pro Leu Leu Arg Gln Ala Ile Glu Leu165 170 175Phe Asp His Gln Gly Ala Glu Pro Ala Phe Leu Phe Gly Leu Glu Leu180 185 190Ile Ile Cys Gly Leu Glu Lys Gln Leu Lys Cys Glu Ser Gly Ser195 200 205(2)SEQ ID NO20的資料(i)序列特征(A)長度192堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)漕愋途€型(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO20GAC ATG GAA AAA GCG ACA CCG GAG ACG ATG GTC CAT TGG ATT TGT CTG 48Asp Met Glu Lys Ala Thr Pro Glu Thr Met Val His Trp Ile Cys Leu1 5 10 15
AAG ATG GAG CCA GCT CTG TGG ATG GCC ATT ACA GCA ACA TCG CAC GGC 96Lys Met Glu Pro Ala Leu Trp Met Ala Ile Thr Ala Thr Ser His Gly20 25 30GCA AGG CAC AGG ACA TTC GTC GGG TTT TCC GGC TGC CTC CAC CGC AAA 144Ala Arg His Arg Thr Phe Val Gly Phe Ser Gly Cys Leu His Arg Lys35 40 45TCC CTC ACG TAC CCA GTG ATA TGC CTG AGC AAA CCG AGC CAG AGG ATT 192Ser Leu Thr Tyr Pro Val Ile Cys Leu Ser Lys Pro Ser Gln Arg Ile50 55 60(2)SEQ ID NO21的資料(i)序列特征(A)長度64氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)漕愋途€型(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO21Asp Met Glu Lys Ala Thr Pro Glu Thr Met Val His Trp Ile Cys Leu1 5 10 15Lys Met Glu Pro Ala Leu Trp Met Ala Ile Thr Ala Thr Ser His Gly20 25 30Ala Arg His Arg Thr Phe Val Gly Phe Ser Gly Cys Leu His Arg Lys35 40 45Ser Leu Thr Tyr Pro Val Ile Cys Leu Ser Lys Pro Ser Gln Arg Ile50 55 60(2)SEQ ID NO22的資料(i)序列特征(A)長度816堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)漕愋途€型(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO22CTG GAC GAC TCG AAG CGC GTA GCC AAG CGG AAG CTG ATC GAG GAG AAC48Leu Asp Asp Ser Lys Arg Val Ala Lys Arg Lys Leu Ile Glu Glu Asn1 5 10 15
CGG GAG CGG CGA CGC AAG GAG GAG ATG ATC AAA TCC CTG CAG CAC CGG 96Arg Glu Arg Arg Arg Lys Glu Glu Met Ile Lys Ser Leu Gln His Arg20 25 30CCC AGC CCC AGC GCA GAG GAG TGG GAG CTG ATC CAC GTG GTG ACC GAG 144Pro Ser Pro Ser Ala Glu Glu Trp Glu Leu Ile His Val Val Thr Glu35 40 45GCG CAC CGC AGC ACC AAC GCG CAG GGC AGC CAC TGG AAG CAG AGG AGG 192Ala His Arg Ser Thr Asn Ala Gln Gly Ser His Trp Lys Gln Arg Arg50 55 60AAA TTC CTG CTC GAA GAT ATC GGT CAG TCG CCC ATG GCC TCC ATG CTT 240Lys Phe Leu Leu Glu Asp Ile Gly Gln Ser Pro Met Ala Ser Met Leu65 70 75 80GAC GGG GAC AAA GTG GAC CTG GAG GCG TTC AGC GAG TTT ACA AAA ATC 288Asp Gly Asp Lys Val Asp Leu Glu Ala Phe Ser Glu Phe Thr Lys Ile85 90 95ATC ACG CCG GCC ATC ACC CGC GTG GTC GAC TTT GCC AAA AAC CTG CCC 336Ile Thr Pro Ala Ile Thr Arg Val Val Asp Phe Ala Lys Asn Leu Pro100 105 110ATG TTC TCG GAG CTG CCG TGC GAG GAT CAG ATC ATC CTG CTG AAG GGC 384Met Phe Ser Glu Leu Pro Cys Glu Asp Gln Ile Ile Leu Leu Lys Gly115 120 125TGC TGC ATG GAG ATC ATG TCG CTG CGC GCC GCC GTG CGC TAC GAC CCC 432Cys Cys Met Glu Ile Met Ser Leu Arg Ala Ala Val Arg Tyr Asp Pro130 135 140GAG AGC GAA ACG CTG ACG CTG AGC GGG GAA ATG GCC GTC AAA CGC GAG 480Glu Ser Glu Thr Leu Thr Leu Ser Gly Glu Met Ala Val Lys Arg Glu145 150 155 160CAG TTG AAG AAC GGA GGG CTG GGG GTC GTG TCT GAT GCC ATC TTC GAC 528Gln Leu Lys Asn Gly Gly Leu Gly Val Val Ser Asp Ala Ile Phe Asp165 170 175CTC GGC AAG TCG CTG TCT GCC TTC AAC CTG GAC GAC ACC GAG GTG GCC 576Leu Gly Lys Ser Leu Ser Ala Phe Asn Leu Asp Asp Thr Glu Val Ala180 185 190CTG CTG CAG GCC GTG CTG CTC ATG TCC TCA GAC CGG ACG GGG CTG ATC 624Leu Leu Gln Ala Val Leu Leu Met Ser Ser Asp Arg Thr Gly Leu Ile195 200 205TGC GTG GAT AAG ATA GAG AAG TGC CAG GAG TCG TAC CTG CTG GCG TTC 672Cys Val Asp Lys Ile Glu Lys Cys Gln Glu Ser Tyr Leu Leu Ala Phe210 215 220GAG CAC TAC ATC AAC TAC CGC AAA CAC AAC ATT CCC CAC TTC TGG TCC 720Glu His Tyr Ile Asn Tyr Arg Lys His Asn Ile Pro His Phe Trp Ser225 230 235 240
AAG CTG CTG ATG AAG GTG GCG GAC CTG CGC ATG ATC GGC GCC TAC CAC 768Lys Leu Leu Met Lys Val Ala Asp Leu Arg Met Ile Gly Ala Tyr His245 250 255GCC AGC CGC TTC CTG CAC ATG AAG GTG GAG TGC CCC ACC GAG CTC TCC 816Ala Ser Arg Phe Leu His Met Lys Val Glu Cys Pro Thr Glu Leu Ser260 265 270(2)SEQ ID NO23的資料(i)序列特征(A)長度272氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)漕愋途€型(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO23Leu Asp Asp Ser Lys Arg Val Ala Lys Arg Lys Leu Ile Glu Glu Asn1 5 10 15Arg Glu Arg Arg Arg Lys Glu Glu Met Ile Lys Ser Leu Gln His Arg20 25 30Pro Ser Pro Ser Ala Glu Glu Trp Glu Leu Ile His Val Val Thr Glu35 40 45Ala His Arg Ser Thr Asn Ala Gln Gly Ser His Trp Lys Gln Arg Arg50 55 60Lys Phe Leu Leu Glu Asp Ile Gly Gln Ser Pro Met Ala Ser Met Leu65 70 75 80Asp Gly Asp Lys Val Asp Leu Glu Ala Phe Ser Glu Phe Thr Lys Ile85 90 95Ile Thr Pro Ala Ile Thr Arg Val Val Asp Phe Ala Lys Asn Leu Pro100 105 110Met Phe Ser Glu Leu Pro Cys Glu Asp Gln Ile Ile Leu Leu Lys Gly115 120 125Cys Cys Met Glu Ile Met Ser Leu Arg Ala Ala Val Arg Tyr Asp Pro130 135 140Glu Ser Glu Thr Leu Thr Leu Ser Gly Glu Met Ala Val Lys Arg Glu145 150 155 160Gln Leu Lys Asn Gly Gly Leu Gly Val Val Ser Asp Ala Ile Phe Asp165 170 175
Leu Gly Lys Ser Leu Ser Ala Phe Asn Leu Asp Asp Thr Glu Val Ala180 185 190Leu Leu Gln Ala Val Leu Leu Met Ser Ser Asp Arg Thr Gly Leu Ile195 200 205Cya Val Asp Lys Ile Glu Lys Cys Gln Glu Ser Tyr Leu Leu Ala Phe210 215 220Glu His Tyr Ile Asn Tyr Arg Lys His Asn Ile Pro His Phe Trp Ser225 230 235 240Lys Leu Leu Met Lys Val Ala Asp Leu Arg Met Ile Gly Ala Tyr His245 250 255Ala Ser Arg Phe Leu His Met Lys Val Glu Cys Pro Thr Glu Leu Ser260 265 270(2)SEQ ID NO24的資料(i)序列特征(A)長度25堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)漕愋途€型(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO24TCCCCGGGTA ACTAAGTAAG GATCC 25(2)SEQ ID NO25的資料(i)序列特征(A)長度24堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)漕愋途€型(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO25AGTGGGTCCC CGGGTGACAT GGAA 24(2)SEQ ID NO26的資料
(i)序列特征(A)長度8氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)漕愋途€型(ii)分子類型多肽(v)片段類型內(nèi)部的(xi)序列描述SEQ ID NO26Ser Gly Ser Pro Gly Asp Met Glu1 5(2)SEQ ID NO27的資料(i)序列特征(A)長度24堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)漕愋途€型(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO27AGTGGGTCCC CGGGTCTGGA CGAC24(2)SEQ ID NO28的資料(i)序列特征(A)長度8氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)漕愋途€型(ii)分子類型多肽(v)片段類型內(nèi)部的(xi)序列描述SEQ ID NO28Ser Gly Ser Pro Gly Leu Asp Asp1 權(quán)利要求
1.一種宿主細(xì)胞，其包含編碼激活轉(zhuǎn)錄的第一融合蛋白的第一核酸，第一融合蛋白包含經(jīng)操作連接在真核細(xì)胞中激活轉(zhuǎn)錄的第二多肽并結(jié)合tet操縱子序列的第一多肽；編碼抑制轉(zhuǎn)錄的第二融合蛋白的第二核酸，第二融合蛋白包含經(jīng)操作連接在真核細(xì)胞中抑制轉(zhuǎn)錄的第四多肽并結(jié)合tet操縱子序列的第三多肽；包含經(jīng)操作連接到至少一段tet操縱子序列上的待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列的第三核酸分子。
2.權(quán)利要求1的宿主細(xì)胞，其中當(dāng)四環(huán)素或四環(huán)素類似物存在時第一多肽結(jié)合tet操縱子序列，當(dāng)四環(huán)素或四環(huán)素類似物不存在時第三多肽結(jié)合tet操縱子序列。
3.權(quán)利要求1的宿主細(xì)胞，其中當(dāng)四環(huán)素或四環(huán)素類似物不存在時第一多肽結(jié)合tet操縱子序列，當(dāng)四環(huán)素或四環(huán)素類似物存在時第三多肽結(jié)合tet操縱子序列。
4.用于協(xié)同雙向轉(zhuǎn)錄第一段和第二段待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列的重組載體，該載體包含一段核苷酸序列，從5’到3’方向含有a)用于引入第一段待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列的第一個克隆位點，其經(jīng)操作連接于b)至少一段tet操縱子序列，其經(jīng)操作連接于c)用于引入第二段待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列的第二個克隆位點，其中引入載體的第一段和第二段核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄相對于至少一段tet操縱子序列反向進(jìn)行。
5.權(quán)利要求4的重組載體，其中第一段和第二段待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列已分別引入第一個和第二個克隆位點。
6.權(quán)利要求5的重組載體，其中第一段和第二段核苷酸序列編碼異二聚體蛋白的多肽亞基。
7.權(quán)利要求5的重組載體，其中第一段核苷酸序列編碼感興趣蛋白，第二段核苷酸序列編碼檢測標(biāo)記。
8.一種核酸組合物，它包含用于獨立調(diào)節(jié)第一段和第二段待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列轉(zhuǎn)錄的至少一種重組載體，該至少一種重組載體包含一段核苷酸序列，其含有a)用于引入第一段待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列的第一個克隆位點，它經(jīng)操作連接到至少一段第一種類型的tet操縱子序列上；和b)用于引入第二段待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列的第二個克隆位點，它經(jīng)操作連接到至少一段第二種類型的tet操縱子序列上。
9.權(quán)利要求8的組合物，其中第一或第二種類型的tet操縱子序列是B類tet操縱子序列。
10.權(quán)利要求8的組合物，其中第一段和第二段待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列已被分別引入第一個和第二個克隆位點。
11.權(quán)利要求10的組合物，其中第一段核苷酸序列含有治療基因而第二段核苷酸序列含有自殺基因。
12.包含一種承載裝置的試劑盒，所述承載裝置中以緊密配合方式含有至少兩個容納裝置，包括含有編碼激活轉(zhuǎn)錄的融合蛋白的第一核酸的第一容納裝置，融合蛋白含有當(dāng)四環(huán)素或四環(huán)素類似物存在時結(jié)合tet操縱子序列并經(jīng)操作連接于在真核細(xì)胞中激活轉(zhuǎn)錄的第二多肽的第一多肽；和含有第二核酸的第二容納裝置，該核酸包含用于引入經(jīng)操作連接到至少一段tet操縱子序列上的待轉(zhuǎn)錄核苷酸序列的克隆位點。
13.權(quán)利要求12的試劑盒，其進(jìn)一步包含含有編碼抑制轉(zhuǎn)錄的融合蛋白的第三核酸的第三容納裝置，融合蛋白含有經(jīng)操作連接于在真核細(xì)胞中抑制轉(zhuǎn)錄的異源第二多肽并結(jié)合tet操縱子序列的第一多肽。
14.權(quán)利要求13的試劑盒，其進(jìn)一步包含含有四環(huán)素或四環(huán)素類似物的第四容納裝置。
全文摘要
本發(fā)明公開的是用于在真核細(xì)胞及生物體中調(diào)節(jié)基因表達(dá)的核酸分子和蛋白質(zhì)。本發(fā)明提供一種轉(zhuǎn)錄激活物融合蛋白，它當(dāng)四環(huán)素(或其類似物)存在而非不存在時結(jié)合tet操縱子序列并激活tet操縱子相連的基因的轉(zhuǎn)錄。本發(fā)明進(jìn)一步提供轉(zhuǎn)錄抑制物融合蛋白，它以可調(diào)節(jié)方式抑制tet操縱子相連的基因的轉(zhuǎn)錄。在一個實施方案中，當(dāng)四環(huán)素(或類似物)不存在而非存在時，抑制物融合蛋白結(jié)合tet操縱子序列。在另一實施方案中，當(dāng)四環(huán)素(或類似物)存在而非不存在時，抑制物融合蛋白結(jié)合tet操縱子產(chǎn)物。本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄激活物和抑制物融合蛋白可組合使用來調(diào)節(jié)一個或多個tet操縱子相連的基因的表達(dá)。公開的還有本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄調(diào)控物能夠?qū)崿F(xiàn)兩個或多個基因表達(dá)的協(xié)同或獨立四環(huán)素調(diào)節(jié)的新型含tet操縱子調(diào)節(jié)單元。本發(fā)明還涵蓋包括該調(diào)節(jié)體系的組分的試劑盒。
文檔編號C07K14/195GK1523112SQ20031011439
公開日2004年8月25日 申請日期1995年6月29日 優(yōu)先權(quán)日1994年7月1日
發(fā)明者H·比雅爾, M·戈森, H 比雅爾 申請人:Basf公司, 艾博特股份有限兩合公司