專利名稱：p27蛋白的表達及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及禽白血病病毒P27蛋白的表達以及所述蛋白的應用。
背景技術：
禽白血病(Avian Leukosis)是由禽白血病病毒和禽肉瘤病病毒群中的病毒引起的禽類多種腫瘤性疾病的統稱[1]。禽白血病是禽類的常見病，目前沒有疫苗，也沒有有效的抗病毒藥，常通過凈化措施，培育無白血病雞群。
禽白血病病毒可以垂直或水平傳播，給養(yǎng)雞業(yè)生產造成很大危害，國內獸醫(yī)、人醫(yī)生物制品廠生產的數種禽胚源疫苗和禽胚源細胞苗，均以雞胚為原材料，若不通過禽白血病抗原的檢測，引起病毒的擴散與再感染，其危害可想而之。并且涉及到人類的公共衛(wèi)生問題。
目前用瓊脂擴散方法，檢測抗原，也有用補體結合試驗方法、螢光法、酶聯法，這些方法僅限于在實驗室研究，在敏感性、特異性、穩(wěn)定性等方面均有一些問題，停留在研究階段，所以不能應用于生產中檢測，目前尚缺乏有效的檢測手段。
P27基因是禽白血病病毒不同亞群之間的一段高度保守的基因。p27蛋白是病毒核心外殼的主要成分，有許多易于檢測的病毒抗原，是制備群特異性抗體的首選抗原。
已經克隆了p27和gag基因(祝曉春陳福勇常建宇《中國獸醫(yī)雜志》2001年(第37卷)第8期，8-10頁)。
禽白血病病毒的繁殖是一項相當繁瑣的工作，目前尚無專一適用的細胞系用于該病毒的繁殖。制備方法無論是用細胞繁殖還是接種雞體制備血漿毒都存在著成本高、產量低、耗時、操作繁雜、純度不高等問題。
本發(fā)明人經過多年研究成功地對p27蛋白進行了原核表達，相對于已有的真核表達而言，本發(fā)明表達外源基因成本低、產量高、安全、易純化、純度高而且簡便易行。

發(fā)明內容
因此，本發(fā)明的目的之一是提供P27蛋白的表達。具體而言，本發(fā)明人在已克隆的p27基因的基礎上，根據已發(fā)表的AMV BAI-A株的基因序列設計了一對特異性引物，以重組質粒pGEM-gag為模板，采用PCR法對p27基因進行亞克隆，構建重組質粒pGEM-p27。對重組質粒PGEM-p27和表達載體pET-28α進行雙酶切，回收酶切產物，連接構建重組表達質粒。將構建成功的重組表達質粒轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中，篩選含重組質粒的基因工程菌。重組工程菌經IPTG誘導得到高效表達，其細胞裂解物用SDS-PAGE及Western blotting進行檢測。用Ni-NTA親和層析法純化表達蛋白，經SDS-PAGE方法及Westernblotingt檢測，分析純化，獲得了高純度的p27蛋白。所述蛋白的純度大于97％，蛋白濃度約為0.53mg/ml。高純度p27蛋白的獲得，為p27單抗的制備，重組p27蛋白結構的探討奠定了基礎。本發(fā)明制備的P27蛋白的分子量約為30KD。制備的P27目的基因片段的大小約為800bp。
本發(fā)明的另一目的是提供P27蛋白作為診斷抗原的應用，從而解決了禽白血病抗原繁殖的難題。
本發(fā)明的目的是用純化的表達蛋白免疫家兔，獲得高效價的抗p27單特異性多克隆抗體，從而可用作各種診斷抗體。
本發(fā)明還提供了含有本發(fā)明表達蛋白的診斷試劑盒?？捎糜跈z測正常健康的原種、曾祖代、祖代、新培育的新品種、國家各地方的地方品種雞群，是否在體內血液、器官、糞便及雞蛋中攜帶雞白血病病毒。檢測國內獸醫(yī)、人醫(yī)生物制品企業(yè)生產的各種來源于雞源為原材料生產的活疫苗，是否攜帶外原雞白血病病毒。檢測市場上流通的各種進口禽用疫苗，是否攜帶雞白血病病毒。檢測國內無特定病原微生物(SPF)雞場生產的產品，是否攜帶外原性雞白血病病毒。以及應用于科學研究等。


圖1是重組表達質粒(pET28α-p27)的PCR鑒定結果。其中1未加模板的對照；2初步鑒定為陽性克隆的PCR擴增結果；3λDNA/EcoRI+HindIII(21226bp，5148bp，2027bp，1584bp，1375bp，947bp，831bp，564bp)圖2是重組表達質粒(pET28α-p27)的雙酶切鑒定結果。1重組表達質粒的雙酶切鑒定；2λDNA/EcoRI+HindIII(21226bp，5148bp，4268bp，2027bp，1584bp，1375bp，947bp，831bp，564bp)。
圖3表明表達產物經15％SDS-PAGE電泳表明表達的融合蛋白的分子量與預期的結果相符。經Alphar Imager進行光密度掃描分析，目的蛋白的表達量占總菌體蛋白約25.3％。1陰性對照含有空載體pET28α(+)的BL21(DE3)的表達產物；2低分子量標準蛋白Maker(97.4KD，66.2KD，43KD，31KD，20.1KD，14.4KD)；3誘導3小時的表達產物；4誘導3小時的表達產物；5誘導4小時的表達產物；6誘導5小時的表達產物圖4是表達菌超聲裂解后的SDS-PAGE分析圖。重組工程菌誘導表達后，離心收集菌體，將菌體進行超聲裂解，超聲裂解后上清液中重組蛋白的含量為22.1％，沉淀中的含量為20.7％。1.超聲裂解后的上清液；2.超聲裂解后的沉淀；3.低分子量標準蛋白Maker；3.誘導表達產物；4.誘導表達產物。
圖5是純化產物的SDS-PAGE分析圖。裂解的菌體上清用鎳鏊合劑親和層析，在不同咪唑濃度的洗脫條件下，進行重組蛋白的純化。SDS-PAGE電泳的結果顯示，僅在分子量約30KDa處有一條清晰的目的蛋白帶，而且只有在咪唑濃度為80mM和100mM的洗脫液中含高純度的目的蛋白，其純度大于97％，用紫外吸收法測得蛋白的濃度約為0.53mg/ml。其中1穿透液；2NTA-0洗脫液；3NTA-20洗脫物；4NTA-40洗脫物；5NTA-60洗脫物；6NTA-80洗脫物；7NTA-100洗脫物；8低分子量標準蛋白Maker；9NTA-200洗脫物；10NTA-1000洗脫物。
圖6是表達產物的Western印跡分析圖。其中1低分子量標準蛋白Maker(97.4KD，66.2KD，43KD，31KD，20.1KD)；2經誘導表達后的菌體蛋白。
圖7是抗血清的Western印跡分析圖。其中1Western印跡結果；2低分子量標準蛋白Maker(97.4KD，66.2KD，43KD，31KD，20.1KD)。
圖8為使用本發(fā)明p27蛋白的檢測試劑盒的示意圖。
以下通過是實施例進一步說明本發(fā)明，實施例僅僅是說明性的，而不以任何方式限制權利要求的保護范圍。
實施例實施例1 P27蛋白制備工藝1重組工程菌的制備構建用于表達p27蛋白的重組工程菌，所用的表達載體是pET28α，宿主菌是大腸桿菌BL21(DE3)。
(1)重組工程菌的構建過程①待插入的目的片斷的制備a)重組質粒pGEM-Teasy/p27的雙酶切以BmaHI和SalI對重組質粒pGEM-Teasy/p27進行雙酶切，反應體系如下總反應體系為 50μlBmaHI2μlSalI 2μl10×T緩沖液 7.5μl底物DNA 20μl滅菌水 18.5μl以上各組分混勻，短暫離心后，于37℃溫育6小時。
b)酶切產物的回收瓊脂糖凝膠電泳酶切產物。
↓將凝膠取出置于Alpha Imager進行觀察，并成像。
↓紫外燈下切下含目的片段的凝膠，分別裝入已稱量過的離心管。
↓按照DNA快速回收試劑盒的操作步驟，回收目的片斷。
②載體pET-28α(+)的雙酶切對載體做與(1)相同的酶切處理。
酶切結束后補水至100μl，用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)和氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提，乙醇沉淀洗滌后，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> ③酶切片段與質粒載體的連接經BamHI和SalI雙酶切的p27基因，插入到同樣經同樣雙酶切的表達載體pET-28α(+)中，用T4DNA連接酶連接構建成重組質粒pET28α-p27。反應體系如下在0.5ml微量離心管中依次加入下列成分10×Ligation緩沖液2μlpET-28α(+)(50ng) 1μl
p27 9μl(依據回收的p27的濃度而定)T4DNA連接酶 1μl加水至終體積為20μl混勻后瞬時離心后，16℃連接12小時，而后于4℃連接24小時或更長時間。
④連接產物的轉化a.從-80℃低溫冰箱中取出感受態(tài)細胞JM109，迅速冰浴化開。
b.取10μl連接產物加入100μl感受態(tài)細胞內，輕輕混勻，冰浴30分鐘。
c.42℃熱激90秒，期間勿搖離心管。
d.迅速冰浴5分鐘。
e.加入800μl SOC培養(yǎng)基，混勻。160rpm，37℃復壯1小時。
f.取100μl振搖培養(yǎng)物涂布于含Kana(終濃度為30μg/ml)的LB平板上，37℃放置至液體被吸收。
g.倒置平板，于37℃培養(yǎng)12小時。
⑤陽性克隆的鑒定重組質粒鑒定的方法很多，本試驗選用了限制性內切酶酶切和PCR的方法對陽性克隆進行鑒定。
a.重組質粒的提取按照前述方法進行重組質粒的小抽提b.PCR擴增法鑒定重組質粒對提取的重組質粒進行1∶100稀釋，用前述方法進行PCR擴增、回收。并用1.2％瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產物，在約800bp處有一特異性目的帶的質粒，初步確定為陽性重組質粒。
c.雙酶切法鑒定a)挑取1個陰性菌落和初步鑒定為陽性的菌落，分別接種于1.5ml含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振搖培養(yǎng)16小時。
b)采用上述堿裂解法提取質粒。
c)對提取的質粒進行酶切鑒定。
選用BmaHI和SalI對所提質粒進行酶切鑒定，所加樣品如下總反應體系為20μlBmaHI 1μlSalI1μl
10×T緩沖液3μl底物DNA15μl加水至終體積為 20μl以上各組分混勻，短暫離心后，于37℃溫育4小時。
d.)酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳，將凝膠取出置于Alpha Imager進行觀察，并成像。
f.重組表達工程菌的構建將篩選的陽性克隆轉化到大腸桿菌感受態(tài)細胞BL21(DE3)中，篩選陽性菌落。
(2)所需材料和試劑①性內切酶BamHI和SalI②DNA純化回收試劑盒③T4DNA連接酶④載體和宿主菌表達載體pET-28α(+)及其宿主菌BL21(DE3)⑤大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備及轉化所用溶液a.0.1M CaCl22.94g CaCl2·2H2O溶解于200ml滅菌去離子水中。
b.SOB液體培養(yǎng)基在950ml去離子水中加入胰蛋白胨20g，酵母提取物5g，NaCl 0.5g，完全溶解后，加入250mmol/L KCl溶液100ml，用5mol/LNaOH溶液調節(jié)PH值至7.0，加去離子水定容到1L，高壓滅菌30分鐘，使用前加入經0.22μm過濾除菌的2M Mg2+(1M MgCl2，1M MgSO4)。
c.SOC液體培養(yǎng)基SOB培養(yǎng)基1L經高壓滅菌，冷卻后，加入10ml經0.22μm濾膜除菌的3M葡萄糖溶液。
d.LB液體培養(yǎng)基胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，溶解于950ml去離子水中。溶解后，用10M NaOH調節(jié)PH到7.0，加水定容至1L，分裝后高壓滅菌，貯存于4℃。
e.卡那霉素(Kana)貯存液，30mg/ml300mg卡那霉素溶于10ml滅菌水中，過濾除菌，-20℃分裝備用。
f.氨芐青霉素(Amp)貯存液，20mg/ml200mg氨芐青霉素溶于10ml滅菌水中，過濾除菌，-20℃分裝備用。
g.含抗生素的LB固體培養(yǎng)基在1L LB液體培養(yǎng)基中加入15g瓊脂粉，融化后高壓滅菌。待冷卻至約50℃左右，加入抗生素至所需的終濃度，倒制瓊脂板。
⑥提取質粒DNA所用的溶液a.STE液1.17g NaCl2ml1M Tris·Cl(PH8.0)0.4ml 0.5M EDTA(PH8.0)加入160ml雙蒸水溶解混勻，定容至200ml。
b.溶液I0.99g葡萄糖2.5ml 1M Tris·Cl(PH8.0)2ml0.5M EDTA(PH8.0)溶于80ml滅菌水中溶解混勻，定容至100ml，10磅高壓滅菌20分鐘，4℃保存?zhèn)溆谩?br> c.溶液II0.2M NaOH(使用前用10M貯存液現用現稀釋)0.1％ SDS(制成10％溶液現用現稀釋)d.溶液III60ml 5M KAC11.5ml冰乙酸溶于28.5ml水，定容至100ml，此溶液無需滅菌。
e.溶菌酶購自北京新經科公司。用蒸餾水配制成50mg/ml的溶液，貯存于20℃。
⑥TE緩沖液(PH8.0)1ml 1M Tris·Cl(PH8.0)和0.2ml 0.5M EDTA(PH8.0)混合，定容到100ml。
⑦RNAase貯存液(10mg/ml)將10mg RNAase溶于1ml的10mM Tris·Cl(PH7.5)及15mM NaCl中，配成10mg/ml的溶液，于100℃加熱15分鐘，緩慢冷卻至室溫，分裝成小份，凍存于-20℃。
f.苯酚氯仿異戊醇Tris飽和酚(PH＞7.5)靜置分層后吸下層溶液 25ml氯仿 24ml異戊醇 1ml充分混勻，上層覆蓋0.1M Tris·Cl(PH8.0)，裝于棕色瓶中，4℃保存?zhèn)溆谩?br> ⑦瓊脂糖凝膠電泳所用溶液a.50×TAE(Tris-乙酸)Tris堿 121g
冰乙酸 28.55ml0.5M EDTA(PH8.0)50ml加雙蒸水混合，定容至500ml，工作液濃度為1×TAEb.10mg/ml溴化乙錠(EB)貯存液100mg EB溶于10ml雙蒸水中，劇烈攪拌，完全溶解后，室溫下閉光保存。
c.1.2％瓊脂糖凝膠1×TAE 100ml加入1.2g瓊脂糖加熱熔化后加入5μl EB(10mg/ml)混勻，室溫放置。
d.6×凝膠加樣緩沖液溴酚蘭 0.025g二甲苯青FF 0.025g甘油3ml加入一定量去離子水溶解，定容到10ml，分裝。
(3)陽性克隆的鑒定結果①重組表達質粒pET28α-27的PCT鑒定。將提取的質粒pET28α-p27作1∶100稀釋，用前述方法進行PCR擴增，同時設不含模板的陰性對照。電泳PCR產物，擴增的片段與預期分子量(約800bp)大小一致的質粒初步鑒定為陽性重組質粒。結果見圖1。
②重組表達質粒pET28α-27的雙酶切鑒定。重組質粒(pET28α-p27)經BamHI及SalI雙酶切后，電泳可見到兩條大小分別為5.4kb和800bp的條帶，與預期結果相符。結果見圖2。
實施例2 p27基因的誘導表達及表達產物的純化1.p27基因的誘導表達(1)表達過程①挑選生長良好的陽性單菌落接種于3ml LB(含30μg/ml Kana)培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)。
②取出0.05ml接種到5ml LB(含30μg/ml Kana)培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)2～3小時(OD600至0.4～0.6)。
③加入IPTG至終濃度為3mM，30℃誘導表達5小時。
④4℃ 5000rpm離心10分鐘，棄去培養(yǎng)液，收集細菌沉淀，-20℃保存。
(2)表達所用的試劑
①卡那霉素(Kana)貯存液(30mg/ml)300mg卡那霉素溶于10ml滅菌水中，過濾除菌，-20℃分裝備用。
②LB液體培養(yǎng)基胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，溶解于950ml去離子水中。溶解后，用10M NaOH調節(jié)PH到7.0，加水定容至1L，分裝后高壓滅菌，貯存于4℃。
③含Kana的LB固體培養(yǎng)基在1L LB液體培養(yǎng)基中加入15g瓊脂粉，融化后高壓滅菌。待冷卻至約50℃左右，加入Kana至終濃度為30ug/ml，倒制瓊脂板。
④IPTG(1M)2.38g IPTG溶解于10ml滅菌水中，過濾除菌，分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 2.誘導表達菌的超聲裂解(1)超聲裂解的過程①取200ml細菌培養(yǎng)物，12000rpm/分鐘，離心5分鐘，棄上清。
②用10ml NTA-0緩沖液重懸沉淀。
③加入一定量的PMSF至終濃度為1mM。
④加入一定量的溶菌酶(終濃度為0.2mg/ml)。
⑤混勻，冰上放置30分鐘。
⑥超聲波裂解菌體。
⑦加入10％TritonX-100(終濃度為0.05％)，充分混勻，冰上放置15分鐘，冰浴超聲破碎細胞。
⑧加入1M MgCl2至終濃度為1mM，混勻。
⑨室溫放置10分鐘，12,000轉/分鐘，4℃離心20分鐘。
⑩分別取1ml上清和1ml細菌培養(yǎng)物的沉淀。分別加入100μl SDS上樣緩沖液，混勻，煮沸5分鐘。取15μl樣品做SDS-PAGE。
(2)所需試劑①PMSF稱取0.35g PMSF溶于10ml無水乙醇中，配制成200mM儲存液，于-20℃中保存(注意PMSF見水分解，需要在使用前加入)。
②溶菌酶稱取10mg溶菌酶溶于10ml蒸餾水中，分裝成小管，于-20℃中保存。
③10％Triton X-100量取10ml Triton X-100，加入80ml蒸餾水，混勻，使TritonX-100完全溶于蒸餾水中，然后用蒸餾水定容到100ml，室溫保存。
④1M MgCl2稱取20.3g MgCl2·6H2O溶于90ml蒸餾水中，混勻，加蒸餾水定容到100ml，室溫保存。
3.表達產物的純化(1)純化過程以表達p27蛋白的重組工程菌BL21(DE3)的裂解上清為材料，參照上海申能博彩生物科技有限公司的“SNBC 3S NTA Resin使用方法”，對表達的融合蛋白進行活性純化。
①將1ml NTA樹脂裝入層析柱，靜置。
②用10ml NTA-0 buffer平衡層析柱。
③取4ml菌體裂解上清加到NTA層析柱中，流速控制在15ml/小時左右，收集穿透部分，標記為“穿透液”。
④用5ml NTA體積的NTA-0緩沖液洗脫，流速控制在30ml/小時左右。
⑤依次用5ml NTA-20，NTA-40，NTA-60，NTA-80，NTA-100，NTA-200，NTA-1000緩沖液洗脫，流速控制在15ml/小時左右。收集洗脫液，每管收集1ml。
⑥將收集的樣品，進行SDS-PAGE分析，確定目的蛋白在洗脫液中的分布情況。
⑦測定純化蛋白的OD260和OD280，并計算蛋白濃度。通過紫外吸收法測定蛋白濃度的計算公式為蛋白質濃度(mg/ml)＝1.45 OD280-0.74OD260(2)所需的試劑①純化填料SNBC 3S NTA Resin，購自上海申能博彩生物科技有限公司。
②1M咪唑稱取6.81g咪唑溶于100ml蒸餾水中，室溫保存。
③NTA-0Buffer20mM Tris-Hcl(pH7.9)，0.5M NaCl，10％丙三醇。
④NTA-20Buffer20mM Tris-Hcl(pH7.9)，0.5M NaCl，10％丙三醇，20mM咪唑⑤NTA-40Buffer20mM Tris-Hcl(pH7.9)，0.5M NaCl，10％丙三醇，40mM咪唑⑥NTA-60Buffer20mM Tris-Hcl(pH7.9)，0.5M NaCl，10％丙三醇，60mM咪唑⑦NTA-80Buffer20mM Tris-Hcl(pH7.9)，0.5M NaCl，10％丙三醇，80mM咪唑⑧NTA-100Buffer20mM Tris-Hcl(pH7.9)，0.5M NaCl，10％丙三醇，100mM咪唑⑨NTA-200Buffer20mM Tris-Hcl(pH7.9)，0.5M NaCl，10％丙三醇，200mM咪唑⑩NTA-1000Buffer20mM Tris-Hcl(pH7.9)，0.5M NaCl，10％丙三醇，1000mM咪唑4.表達產物及純化產物的SDS-PAGE電泳檢測(1)電泳過程①電泳樣品的制備a.取2ml菌液，12,000g離心2分鐘，去上清，加入100μl滅菌去離子水，懸浮沉淀。加入等體積的2×SDS上樣緩沖液，混勻，煮沸5分鐘。
b.取20ul純化產物，加入等體積的2×SDS上樣緩沖液，混勻，煮沸5分鐘。
②成膠液的配制表15％分離膠(10ml)和5％濃縮膠(5ml)的配制比例H2O(ml I 液II液 III液 IV液 V液 VI液) (ml) (ml) (ml)(μl) (μl) (μl)分離膠 3.3 42.5 ——100100 4濃縮膠 3.4 0.830——0.630 50 505各組分按表中所給的量混合，配制成10ml 15％的分離膠注入玻璃板間(梳子離膠面的距離約為1cm)，用滅菌去離子水蓋住膠面，放置，使膠凝聚。待分離膠凝固后，吸干膠面上的水，加入配好的濃縮膠，裝上梳子。
③待濃縮膠凝固后，拔出梳子，加滿電泳液并進行加樣。
④上樣取20μl處理好的樣品，并加入蛋白分子量標準和陰性對照。
⑤電泳由負極泳向正極，初期電壓控制在160V，當樣品浸入到分離膠后，加大電壓至180V。當溴酚藍指示劑到達膠板底部1cm時停止電泳，關閉電源。
⑥染色用5倍體積的染色液浸泡凝膠，染色30分鐘，回收染色液。
⑦脫色將凝膠置于脫色液中，脫色期間更換脫色液數次，直至有清晰條帶出現。
⑧與標準蛋白條帶比較，看有無目的條帶的出現。用Alphar Imager進行光密度掃描分析，確定目的蛋白的含量。
(2)凝膠試劑的配制①I液30％丙烯酰胺(W/V)將30g丙稀酰胺和0.8克甲叉雙丙烯酰胺，溶于100ml滅菌去離子水中，PH值不能超過7.0，過濾，于棕色玻璃瓶中4℃保存。
②II液1.5M Tris·Cl緩沖液(PH8.8)將18.17克Tris堿溶于80ml去離子水中，加入約3ml的濃鹽酸調節(jié)PH至8.8，定容至100ml。
③III液1M Tris·Cl緩沖液(PH6.8)將12.1克Tris堿溶于80ml去離子水中，加入約7ml的濃鹽酸調PH至6.8，定容至100ml。
④IV液10％SDS(W/V)將10g SDS溶于100ml去離子水中，加熱助溶。
⑤V液10％過硫酸銨(W/V)0.1克過硫酸銨溶于1ml去離子水中，現用現配。
⑥VI液TEMED原液。
⑦10×電極緩沖液(PH8.3)將30.3克Tris、144.2克甘氨酸和10克SDS，溶于去離子水并定容至1L，使用時10倍稀釋。
⑧2×SDS樣品緩沖液將500mg SDS、10ml巰基乙醇、3ml甘油、4mg溴酚藍和2ml 1M Tris·Cl(PH6.8)，用去離子水定容到10ml，小份分裝，-20℃保存。
⑨染色液0.25克考馬斯亮藍R250溶于45ml甲醇、45ml水以及10ml冰醋酸的混合液中，溶解后用濾紙過濾，以除去顆粒狀物質。
⑩脫色液醋酸100ml，甲醇250ml，加水650ml，混勻使用。
(3)蛋白表達及純化結果①表達產物經15％SDS-PAGE電泳表明表達的融合蛋白的分子量與預期的結果相符。經Alphar Imager進行光密度掃描分析，目的蛋白的表達量占總菌體蛋白約25.3％。結果見圖3。
②重組工程菌誘導表達后，離心收集菌體，將菌體進行超聲裂解，超聲裂解后上清液中重組蛋白的含量為22.1％，沉淀中的含量為20.7％。結果見圖4。
裂解的菌體上清用鎳鏊合劑親和層析，在不同咪唑濃度的洗脫條件下，進行重組蛋白的純化。SDS-PAGE電泳的結果顯示，僅在分子量約30KDa處有一條清晰的目的蛋白帶，而且只有在咪唑濃度為80mM和100mM的洗脫液中含高純度的目的蛋白，其純度大于97％，用紫外吸收法測得蛋白的濃度約為0.53mg/ml。結果附圖5。
5.誘導表達產物的Western印跡檢測
(1)Western印跡過程①取1ml誘導表達的菌液，12000rpm/分鐘離心5分鐘，棄上清，加入50μl滅菌去離子水，懸浮沉淀。加入等體積的2×SDS上樣緩沖液，混勻，煮沸5分鐘。取15μl樣品加樣，進行SDS-PAGE電泳。
②準備轉印條件，如轉印緩沖液(4℃存放)，硝酸纖維素膜(NC膜)，濾紙等。
③SDS-PAGE電泳完畢后，取出凝膠，除去濃縮膠，并切去下方一小角作為標記。帶上手套，按膠的尺寸大小剪取NC膜，同樣切去NC膜的一小角作為標記。將切好的凝膠塊、NC膜、濾紙在轉印緩沖液中浸泡30分鐘。按照海綿墊-濾紙-凝膠-NC膜-濾紙-海綿墊的結構，裝入轉印夾中，各層間不能有氣泡。
④凝膠一側接負極，NC膜一側接正極。
⑤加入轉印緩沖液，將電泳槽置于冰浴中并加磁力攪拌器攪拌，200mA恒流轉印1小時。
⑥轉印結束后，將電泳凝膠放入考馬斯亮藍染色液中染色，以檢測轉印是否完全。
⑦按加樣孔的位置，剪下分子量標準的膜條，用氨基黑染色，觀察轉印效果。NC膜其余部分置于封閉液中，室溫振搖1小時。
⑧封閉后的NC膜置于用封閉液按一定比例稀釋的酶標兔抗p27多抗中，室溫振蕩2小時。
⑨用TBS洗滌NC膜6次，每次10分鐘。
⑩最后將NC膜浸到底物溶液中顯色，出現顏色時，立即用蒸餾水沖洗來終止反應。NC膜可夾在兩張濾紙間避光保存。用染色好的標準分子量凝膠條帶與NC膜一起拍照。
(2)Western印跡試劑①轉印緩沖液甘氨酸14.4克，Tris堿3克，甲醇200ml，加蒸餾水至總量為1L。
②封閉液5％的脫脂乳。
③洗滌液TBS20mmol/L Tris(PH 7.5)，150mmol/LNaCl。
④15％的氨基黑(10B)染色液0.15g氨基黑，25ml甲醇，10ml冰醋酸，65ml蒸餾水。
⑤氨基黑脫色液20％甲醇，7％乙酸。
⑥辣根過氧化物酶標兔抗p27多抗來自美國IDEXX公司的禽白血病抗原ELISA檢測試劑盒。
⑦HRP反應緩沖液(SAB)0.05mol/L NaAC(PH5.0)。
⑧HRP顯色溶液(現用現配)20ml 0.05mol/L NaAC(PH5.0)，10mg二氨基聯苯胺(DAB)，10μl H2O2。
(3).結果，見附圖6。序列2蛋白質的總氨基酸數為280，MW＝29850；Max ORF1-840，280AA，MW＝29850實施例3兔抗p27抗體的制備(一)兔抗P27抗體的免疫獲得采用皮下、皮內注射結合肌肉注射的方法，用制備的純化p27蛋白免疫家兔。
1.首免采用皮內和肌肉注射，注射劑量為100μg/只。取一定量的抗原液，加入等量弗氏完全佐劑，進行完全乳化，皮內和肌肉各注射50μg。
2.二免一周后，采用皮下和肌肉注射進行二免，注射劑量為200μg/只。取一定量的抗原液，加入等量弗氏不完全佐劑，進行完全乳化，每只家兔皮下和肌肉各注射100μg。
3.三免二免一周后，進行三免，取一定量的抗原液直接注射，每只家兔皮下和肌肉各注射100μg。
4.四免兩周后，采用耳靜脈注射的方式進行四免。每只家兔皮下和肌肉各注射100μg抗原。免疫時，先注射0.1ml(約20mg)，看家兔是否有過敏反應。觀察30分鐘，如果沒出現過敏反應，將剩余的抗原液全部注射。
5.大約10天后，耳靜脈采血，將收集的血液室溫下凝固后，置于37℃溫箱中1～2小時，吸出血清。檢測是否已經含有p27多抗。
6.以后每隔一周，采用耳靜脈注射的方式對家兔進行加強免疫，劑量為200mg/只。定期對家兔進行心臟采血，收集血清。
(二)兔抗p27抗體的檢測1.瓊擴試驗(AGP)①制備瓊脂板，用打孔器打孔。
②在中間孔分別加入AMV血毒、AMV蛋清毒、標準陽性抗原。
③在周圍孔中分別加入倍比稀釋的血清，添至孔滿為止。
④將平皿放置在37℃恒溫箱中，10小時后觀察結果。
結果顯示，在抗原孔與抗體孔之間出現明顯的沉淀線，兔抗p27抗體的效價達1∶32。
2.Western印跡檢測抗血清為證實免疫家兔所獲得的抗血清為p27蛋白的抗血清，進行了Western印跡分析，試驗步驟如下①取10μl純化的p27蛋白，加入等體積的2×SDS上樣緩沖液，混勻，煮沸5分鐘。取15μl樣品加樣，進行SDS-PAGE電泳。
②準備轉印條件，如轉印緩沖液(4℃存放)，NC膜，濾紙等。
③SDS-PAGE電泳完畢后，取出凝膠，除去濃縮膠，并切去下方一小角作為標記。帶上手套，按膠的尺寸大小剪取NC膜，同樣切去NC膜的一小角作為標記。將切好的凝膠塊、NC膜、濾紙在轉印緩沖液中浸泡30分鐘。按照海綿墊-濾紙-凝膠-NC膜-濾紙-海綿墊的結構，裝入轉印夾中，各層間不能有氣泡。
④凝膠一側接負極，NC膜一側接正極。
⑤加入轉印緩沖液，將電泳槽置于冰浴中并加磁力攪拌器攪拌，200mA恒流轉印1小時。
⑥轉印結束后，將電泳凝膠放入考馬斯亮藍染色液中染色，以檢測轉印是否完全。
⑦按加樣孔的位置，剪下分子量標準的膜條，用氨基黑染色，觀察轉印效果。NC膜其余部分置于封閉液中，室溫振搖1小時。
⑧封閉后的NC膜置于用封閉液按1∶4000比例稀釋的收集的抗血清中，室溫振蕩2小時。
⑨用TBS洗滌NC膜4次，每次10分鐘。
⑩將NC膜置于用封閉液按一定比例稀釋的HRP標記的山羊抗兔IgG中，室溫振蕩1小時。
(11)洗滌方法同⑨(12)最后將NC膜浸到底物溶液中顯色，出現顏色時，立即用蒸餾水沖洗來終止反應。NC膜可夾在兩張濾紙間避光保存。
(13)用染色好的標準分子量凝膠條帶與NC膜一起拍照。抗血清Western印跡檢測結果見圖7(三)所用試劑1.弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑2.瓊脂配方瓊脂粉1g
NaCl 8g蒸餾水 100ml水浴溶化后，將其倒入滅菌的平皿，制成厚度約為3毫米的瓊脂板，冷凝后加蓋放入4℃保存，可在1周內使用。
3.Western印跡試劑(1)轉印緩沖液甘氨酸14.4克，Tris堿3克，甲醇200ml，加蒸餾水至總量為1L。
(2)封閉液5％的脫脂乳(3)洗滌液TBS20mmol/L Tris(PH7.5)，150mmol/LNaCl(4)15％的氨基黑(10B)染色液0.15g氨基黑，25ml甲醇，10ml冰醋酸，65ml蒸餾水。
(5)氨基黑脫色液20％甲醇，7％乙酸。
(6)過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)購自北京鼎國生物技術公司(7)HRP反應緩沖液(SAB)0.05mol/L NaAC(PH5.0)(8)HRP顯色溶液(現用現配)20ml 0.05mol/L NaAC(PH5.0)，10mg二氨基聯苯胺(DAB)，10μl H2O2。
實施例4兔抗P27抗體的純化使用常規(guī)的IgG純化的方法，對兔抗P27抗體純化(飽和硫酸鹽沉淀法)。實施例5兔抗P27抗體的反應板包被包被方法將收集的抗血清按一定的比例用包被液稀釋后包被酶標板，4℃過夜；用5％脫脂乳37℃封閉4小時；加樣37℃反應1小時；洗滌3次，加酶標二抗反應1小時；洗滌3次，加底物反應10分鐘讀數用AMV血毒為檢測抗原，并設有陰、陽性對照，進行ELISA試驗。在加入底物10分鐘后，用酶標儀讀取OD值，結果如下表
實施例6含p27蛋白的試劑盒使用本發(fā)明p27蛋白的試劑盒帶有一個盒體，其中盒體(10)、內帶有陽性抗原(1)、陰性抗原(2)、酶標抗體(3)、底物濃縮液(4)、底物稀釋液(5)、樣品稀釋液(6)、洗滌液(7)、和終止液(8)。上述各種液體分別裝在小瓶內。另外，盒體(10)內還帶有5塊96孔用真空封裝的鋁膜包被板。(11)操作說明書。
圖8中(1)陽性抗原、(2)陰性抗原、(3)酶標抗體、(4)底物濃縮液、(5)底物稀釋液、(6)樣品稀釋液、(7)洗滌液、(8)終止液、(9)包被板、(10)盒體、(11)操作說明書使用步驟如下1、加入陰陽性對照抗原，向兩個孔中分別加入1號、2號液、每孔100微升。
2、加樣品將待檢血清或蛋清，加入包被板的孔中(每孔加入100微升)，若用泄殖腔棉拭子需用樣本稀釋液進行1∶1稀釋，加入100微升，37度反應60分鐘。
3、洗滌甩掉板中樣品液，向每孔加入7號液250微升，(前兩次每次浸泡2分鐘)甩掉，后4次不用浸泡，加入洗滌液后甩掉。
4、加酶標抗體每孔加入3號液100微升，37度反應60分鐘，后甩掉液體。
5、洗滌向每孔加入7號液250微升，甩掉，洗4次。
6、加底物甩掉7號液，將4號液與5號液按1∶1混合后每孔加入100微升，反應15分鐘。
7、讀數酶標儀選樣655NM波長讀數，S/P比值大于等于0.15為陽性，小于0.15判為陰性。
中止加入8號液，每孔100微升序列表<110>陳福勇<120>P27蛋白的表達及其應用<140>
<141>2003-11-？<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>800bp<212>核苷酸<213>人工序列<223>合成<400>1CCTGTAGTGA TTAAGACAGA GGGACCGGCC TGGACCCCTC TGGAGCCAAAATTGATCACA AGACTGGCTG ATACGGTCAG GACCAAGGGC TTACGATCCCCGATCACTAT GGCAGAAGTT GAAGCGCTTA TGTCCTCCCC GCTGCTGCCGCATGACGTTA CGAATCTAAT GAGAGTTATT TTAGGGCCTG CCCCATATGCCTTATGGATG GACGCTTGGG GAGTCCAATT GCAGACGGTT ATAGCGGCAGCCACTCGCGA CCCCCGACAC CCAGCGAATG GTCAAGGGCG GGGGGAACGGACTAACTTGG ATCGCTTAAA GGGTCTAGCT GATGGGATGG TGGGCAACCCACAGGGTCAG GCCGCATTAT TAAGACCGGG GGAATTGGTT GCTATTACGGCGGCGGCTCT CCAGGCGTTT AGAGAGGTTG CCCGGCTGGC GGAACCTGCAGGTCCGTGGG CGGATATCAC GCAGGGACCA TCTGAGCCCT TTGTTGATTTTGCCAATCGG CTTATAAAGG CGGTTGAGGG GACAGATCTC CCGCCTTCCGCGCGGGCTCC GGTGATCATT GACTGCCTTA GGCAGAAGTC ACAGCCAGATATTCAGCAGC TTATACGGGC GGCACCCTCC ACGCTGACCA CCCCAGGAGAGATAATCAAA TATGTGCTAG ACAGGCAGAA GACTGCCCCT CTTACGGATCAAGGCATAGC CGCGGCTATG<210>2<211>？氨基酸
<212>蛋白質<213>人工序列<223>合成<400>2ATG GGC AGC CAT CAT CAT CAT CAT CAT AGC AGC GGC CTG GTG CCGMet Gly Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val ProCGC GGC AGC CAT ATG GCT AGC ATG ACT GGT GGA CAG CAA ATG GGTArg Gly Ser His Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met GlyCGC GGA TCC ATG CCT GTA GTG ATT AAG ACA GAG GGA CCG GCC TGGArg Gly Ser Met Pro Vel Vel Ile Les Thr Glu Gly Pro Ala TrpACC CCT CTG GAG CCA AAA TTG ATC ACA AGA CTG GCT GAT ACG GTCThr Pro Leu Glu Pro Lys Leu Ile Thr Arg Leu Ala Asp Thr ValAGG ACC AAG GGC TTA CGA TCC CCG ATC ACT ATG GCA GAA GTT GAAArg Thr Lys Gly Leu Arg Ser Pro Ile Thr Met Ala Glu Val GluGCG CTT ATG TCC TCC CCG CTG CTG CCG CAT GAC GTT ACG AAT CTAAla Leu Met Ser Ser Pro Leu Leu Pro His Asp Val Thr Asn LeuATG AGA GTT ATT TTA GGG CCT GCC CCA TAT GCC TTA TGG ATG GACMet Arg Val Ile Leu Gly Pro Ala Pro Tyr Ala Leu Trp Met AspGTC TGG GGA GTC CAA TTG CAG ACG GTT ATA GCG GCA GCC ACT CGCAla Trp Gly Val Gln Leu Gln Thr Val Ile Ala Ala Ala Thr ArgGAC CCC CGA CGC CCA GCG AAT GGT CAA GGG CGG GGG GAA CGG ACTAsp Pro Arg His Tro Ala Asn Gly Gln Gly Arg Gly Glu Arg ThrAAC TTG GAT CGC TTA AAG GGT CTA GCT GAT GGG ATG GTG GGC AACAsn Leu Asp Arg Leu Lys Gly Leu Ala Asp Gly Met Val Gly AsnCCA CAG GGT CAG GCC GCA TTA TTA AGA CCG GGG GAA TTG GTT GCTArg Gln Gly Gln Arg Ala Leu Leu Arg Pro Gly Glu Leu Val AlaATT ACG GCG GCG GCT GTC GAC GCG TTT AGA GAG GTT GCC CGG CTGIle Thr Ala Ala Ala Leu Glu Ala Phe Arg Glu Val Ala Arg LeuGCG GAA CCT GCA GGT CCG TGG TCG GAT ATC ACG CAG GGA CCA TCTAla Glu Pro Ala Gly Pro Trp Ala Asp Ile Thr Gln Gly Pro SerGAG CCC TTT GTT GAT TTT GCC AAT CGG CTT ATA AAG GCG GTT GAGGlu Pro Phe Val Asp Phe Ala Asn Arg Leu Ile Iys Ala Val GluGGG ACA GAT CTC CCG CCT TCC GCG CGG GCT CCG GTG ATC ATT GACGly Thr Asp Leu Pro Pro Ser Ala Arg Ala Pro Val Ile Ile AspTGC CTT AGG CAG AAG TCA CAG CCA GAT ATT CAG CAG GTT ATA CGGCys Leu Arg Gln Lys Ser Gln Pro Asp Ile Gln Gln Leu Ile ArgGCG GCA CCC TCC ACG CTG ACC ACC CCA GGA GAG ATA ATC AAA TATAla Ala Pro Ser Thr Leu Thr Thr Pro Gly Glu Ile Ile Lys Tyr
GTG CTA GAC AGG CAG AAG ACT GCC CCT CTT ACG GAT GAA GGC ATAVal Leu Asp Arg Gln Lys Thr Ala Pro Leu Thr Asp Gln Gly IleGCC GCG GCT ATG TCG TCT GCT ATC CAG CCC TAGAla Ala Ala Met Ser Ser Ala Ile Gln Pro ***
權利要求
1.具有序列1所示核苷酸序列的DNA序列。
2.具有如序列2所示氨基酸序列的p27蛋白。
3.含有序列1的質粒。
4.含有序列1的原核宿主細胞。
5.權利要求4的原核宿主細胞為大腸桿菌細胞。
6.含有序列2所示p27蛋白檢測試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明涉及禽白血病相關的p27蛋白的原核表達及其應用。本發(fā)明通過設計的特異性引物構建了新的重組表達質粒，從而在原核細胞中成功地表達出高水平高純度的p27蛋白。
文檔編號C07K14/005GK1616478SQ200310113280
公開日2005年5月18日 申請日期2003年11月13日 優(yōu)先權日2003年11月13日
發(fā)明者陳福勇 申請人:中國農業(yè)大學