本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及一種重組蛋白的編碼序列、重組蛋白及其單克隆抗體的制備方法。
背景技術(shù)：
標(biāo)簽蛋白抗體(Tag-antibody)是一類經(jīng)過親和純化的小鼠單克隆抗體。用于檢測各種商品化表達(dá)載體上的標(biāo)簽序列（如：MyC、His、GST、HA等），籍以分析檢驗(yàn)?zāi)康牡鞍椎谋磉_(dá)含量及其功能。其原理是抗原-抗體反應(yīng)，這些標(biāo)簽抗體可以高度特異地結(jié)合對(duì)應(yīng)的標(biāo)簽融合蛋白。標(biāo)簽抗體是開展基因蛋白表達(dá)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因功能研究的常用工具。
常規(guī)的標(biāo)簽蛋白單克隆抗體制備所使用的免疫原是基因工程技術(shù)表達(dá)的完整蛋白，但由于堿基密碼子的緣故，該蛋白在大腸桿菌中表達(dá)困難，表達(dá)量極低，導(dǎo)致后續(xù)的純化工作難以開展，嚴(yán)重阻礙其單克隆抗體的制備。另外，標(biāo)簽蛋白種類繁多，每種標(biāo)簽蛋白單獨(dú)制備，耗時(shí)長、成本高，不利于市場的廣泛推廣和使用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明旨在避免背景技術(shù)中的不足之處，通過設(shè)計(jì)一種重組蛋白并制備其單克隆抗體，從而實(shí)現(xiàn)同時(shí)制備多種標(biāo)簽蛋白單克隆抗體，既增強(qiáng)了檢測靈敏度，又可以同時(shí)制備多種抗體。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：
所述重組蛋白的編碼序列如SEQ ID NO.1所示。
所述重組蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
所述重組蛋白表達(dá)載體是含有SEQ ID NO.1所示編碼序列的質(zhì)粒載體。
上述重組蛋白和重組蛋白表達(dá)載體可用于制備標(biāo)簽蛋白單克隆抗體。
所述標(biāo)簽蛋白單克隆抗體的制備方法包括如下步驟：
（1）合成SEQ ID NO.1所示的重組蛋白編碼序列，并將該重組蛋白編碼序列連接質(zhì)粒載體，進(jìn)而構(gòu)建重組蛋白表達(dá)載體；
（2）將重組蛋白表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選得到重組蛋白表達(dá)菌株；
（3）將重組蛋白表達(dá)菌株大規(guī)模培養(yǎng)后，經(jīng)純化獲取重組蛋白，所述重組蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
（4）將重組蛋白多次免疫Balb/c小鼠，取小鼠脾臟細(xì)胞與sp2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，經(jīng)過多輪篩選和多指標(biāo)鑒定分別獲得針對(duì)重組蛋白所對(duì)應(yīng)的標(biāo)簽蛋白單克隆細(xì)胞株，再由標(biāo)簽蛋白單克隆細(xì)胞株制得標(biāo)簽蛋白單克隆抗體。
下面對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明：
本發(fā)明首先以4種標(biāo)簽結(jié)合蛋白（6xHis、S Tag、Trx和GST）為靶抗原，序列比較結(jié)果顯示所選擇的該抗原表位與其它蛋白序列無明顯同源性。
其次，為了促進(jìn)所選擇抗原表位對(duì)BALB/c小鼠免疫系統(tǒng)的刺激，增強(qiáng)免疫效果，故分別將所選擇的四個(gè)優(yōu)勢抗原表位序列重復(fù)后通過柔性片段（連續(xù)四個(gè)甘氨酸）連接，形成重組蛋白氨基酸序列。
第三步，采用大腸桿菌偏愛密碼子，將重組蛋白氨基酸序列轉(zhuǎn)換為對(duì)應(yīng)的核苷酸序列，以利于重組蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)以提高表達(dá)量。
第四步，化學(xué)合成上一步驟得到的核苷酸序列，并通過酶切連接，將合成得到的核苷酸片段插入表達(dá)載體PET-28a(+),構(gòu)建重組蛋白表達(dá)載體。
第五步，重組蛋白表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌ER2566感受態(tài)細(xì)胞，篩選得到重組蛋白表達(dá)菌株。
第六步，重組蛋白表達(dá)菌株大規(guī)模培養(yǎng)后，超聲破菌并低溫離心后，取溶液上清通過鎳瓊脂糖親和層析柱親和層析，洗脫得到純化重組蛋白。
第七步，純化后的重組蛋白多次免疫BALB/c小鼠后，取其脾臟細(xì)胞與sp2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，經(jīng)過多輪篩選并最終分別得到雜交瘤細(xì)胞株。
第八步，將雜交瘤細(xì)胞株分別制備BALB/c小鼠腹水，使用辛酸-硫酸銨法及Protein G分兩步純化單克隆抗體。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
一是通過分子生物學(xué)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了四種標(biāo)簽結(jié)合蛋白抗原表位的重復(fù)及串聯(lián)表達(dá)，增強(qiáng)目的抗原表位對(duì)小鼠免疫系統(tǒng)的刺激，排除了無關(guān)序列可能帶來的干擾；
二是作為免疫原的重組蛋白僅含有四種標(biāo)簽蛋白抗原表位，保證了最終得到的單克隆抗體僅特異性識(shí)別該四種標(biāo)簽蛋白，并篩選同時(shí)得到四種標(biāo)簽蛋白，提高了檢測的靈敏度，降低實(shí)驗(yàn)成本。
三是采用大腸桿菌偏愛密碼子優(yōu)化重組蛋白對(duì)應(yīng)的核苷酸序列，從而大大提高了重組蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)水平。
具體實(shí)施方式
一、4種標(biāo)簽蛋白抗原表位選擇
以4種標(biāo)簽蛋白為靶抗原，利用生物軟件DNAssist2.0分析其抗原表位序列的親水性及抗原性，分別選擇6xHis、S Tag、Trx和GST抗原表位A、B、C和D。同時(shí)，序列比較結(jié)果表明所選擇的A、B、C和D抗原表位序列特異性高，與其它蛋白序列無明顯同源性。
二、4種標(biāo)簽蛋白抗原表位的串聯(lián)
為增強(qiáng)所選擇抗原表位對(duì)小鼠免疫系統(tǒng)的刺激以利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，將標(biāo)簽蛋白A、B、C和D四種抗原表位序列分別通過柔性片段（連續(xù)四個(gè)甘氨酸）連接，得到重組蛋白氨基酸序列，其具體序列如序列表SEQ ID N0.2所示。
三、優(yōu)化編碼重組蛋白的核苷酸序列
為了提高重組蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)量，在重組蛋白氨基酸序列不變的前提下,根據(jù)大腸桿菌偏愛密碼子將編碼重組蛋白的氨基酸序列轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的核苷酸序列，具體序列如序列表SEQ ID NO.1所示，并在其上下游分別添加酶切位點(diǎn)BamHI和EcoRI對(duì)應(yīng)的核苷酸序列后，由杭州賢至生物科技有限公司合成。合成后的目的基因克隆于pMD19-T載體(寶生物工程大連有限公司)中。
四、構(gòu)建重組蛋白表達(dá)載體
用限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI(寶生物工程大連有限公司)于37℃分別雙酶切含目的基因的pMD19-T載體和PET-28a(+)載體（德國Novagen公司）12小時(shí)，酶切產(chǎn)物分別行1％瓊脂糖凝膠電泳，并分別切膠回收目的基因和PET-28a(+)載體（本發(fā)明所使用的膠回收試劑盒均來自寧波中鼎生物技術(shù)有限公司）。使用T4連接酶(寶生物工程大連有限公司)將回收的目的基因和PET-28a(+)載體按一定的比例于4℃連接12小時(shí)后，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞（杭州賢至生物科技有限公司），并涂布于含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB平板，于37℃恒溫培養(yǎng)12小時(shí)之后，于平板上挑取單克隆菌株至含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基，37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)12小時(shí)后，采用質(zhì)粒純化試劑盒（本發(fā)明所使用的質(zhì)粒純化試劑盒均來自于寧波中鼎生物技術(shù)有限公司）提取質(zhì)粒，經(jīng)BamHI和EcoRI雙酶切鑒定后得到正確的重組表達(dá)載體。
五、構(gòu)建重組蛋白E表達(dá)菌株
將構(gòu)建好的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化E.coli ER2566感受態(tài)細(xì)胞，并涂布于含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB平板，于37℃過夜培養(yǎng)。第二日，挑取平板上單克隆菌株至含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基，37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)8小時(shí)后，加誘導(dǎo)劑異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（終濃度為1.0mmol/L）誘導(dǎo)表達(dá)4個(gè)小時(shí)后制備蛋白電泳樣品。13.5%聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果表明重組蛋白成功表達(dá)，得到重組蛋白表達(dá)菌株。
六、純化重組蛋白F
接種重組蛋白表達(dá)菌株至LB液體培養(yǎng)基，加卡那青霉素至終濃度為50μg/mL，37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)8小時(shí)后，用含50μg/mL卡那青霉素的LB液體培養(yǎng)基將該菌按1：100比例稀釋后，分裝至細(xì)菌培養(yǎng)瓶中，置37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)至OD600=0.8，加誘導(dǎo)劑異丙基硫代-β-D-半乳糖苷至終濃度為1.0mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)誘導(dǎo)4小時(shí)。離心收集菌體后，低溫超聲破菌，低溫離心后取上清通過鎳瓊脂糖親和層析柱,經(jīng)洗滌、洗脫最終得到純化重組蛋白。
七、構(gòu)建用于檢測的偶聯(lián)蛋白
將標(biāo)簽蛋白A、B兩個(gè)抗原表位序列分別在N端連接一個(gè)半胱氨酸，合成G、H序列多肽，載體蛋白選擇BSA（Roche公司），用SPDP（PIERCE公司）連接法將合成的多肽分別與BSA偶聯(lián)：4.6mg SPDP溶解740ul DMSO,終濃度為20mM。0.1008g BSA溶解于2ml PBS-EDTA溶液中，室溫靜置1h。HiTrapTM Deaslting column脫鹽柱洗脫多余的SPDP。4mg多肽加入偶聯(lián)好的BSA-SPDP體系中室溫過夜，得到產(chǎn)物BSA-G、BSA-H（由杭州賢至生物科技有限公司合成）。將蛋白GST和TRX（購買于杭州畢肯萊博生物科技有限公司）命名為I、L。
八、雜交瘤細(xì)胞株的獲得
取5-7周齡雌性BALB/c小鼠，基礎(chǔ)免疫每只小鼠皮下多點(diǎn)注射福氏完全佐劑乳化的70μg重組蛋白；15天后進(jìn)行加強(qiáng)免疫，方法為取相同量的重組蛋白用福氏不完全佐劑乳化后，皮下多點(diǎn)注射；第三次加強(qiáng)免疫在15天以后，方法同第二次相同。30天后，取120μg重組蛋白腹腔加強(qiáng)注射，并于腹腔加強(qiáng)注射72小時(shí)后，眼眶取血，并處死小鼠，取其脾臟制備細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)，按1/5于脾細(xì)胞的數(shù)量取生長狀態(tài)良好的sp2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞，混和離心后，加入聚乙二醇（PEG-4000）使二者融合。另外，再加入等體積的飼養(yǎng)細(xì)胞，混勻后分置于96孔細(xì)胞板（200μL/孔），于5％二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)。5天后，半保留換液，10天后采用間接酶聯(lián)免疫吸附法檢測96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清。
具體方法如下：
蛋白BSA-G、BSA-H、I、L分別通過包被液稀釋后（終濃度為1μg/mL），以100μL/孔加入酶標(biāo)板（深圳金燦華實(shí)業(yè)有限公司）,4℃包被12小時(shí)后用洗滌液洗滌一次并拍干；加入封閉液，150μL/孔，37℃封閉2小時(shí)，棄孔內(nèi)液體，拍干；分別加待檢細(xì)胞培養(yǎng)上清及對(duì)照血清, 100μL/孔，37℃孵育1小時(shí)后，洗滌液洗滌三次并拍干；加HRP（辣根過氧化物酶）標(biāo)記的羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃孵育30分鐘后，洗滌液洗滌四次并拍干；每孔加顯色液A和顯色液B各50μL，37℃避光顯色10分鐘后，加終止液終止反應(yīng)，50μL/孔，酶標(biāo)儀450nm波長空白孔校零后讀取OD值。以免疫小鼠的血清作為陽性對(duì)照，相關(guān)溶液配方如下：
包被液：Na2CO3 1.5g，NaHCO3 2.9g, 加雙蒸水定容至1000mL(pH9.6)。
封閉液：Na2HPO4.12H2O 2.68g, NaH2PO4.2H2O 0.39g, NaCl 8.5g，20g牛血清白蛋白，加雙蒸水定容至1000mL(pH7.4)。
洗滌液：Na2HPO4.12H2O 2.68g, NaH2PO4.2H2O 0.39g, NaCl 8.5g，Tween-20 0.5mL，加雙蒸水定容至1000mL(pH7.4)。
顯色液A: 200mg TMB 溶于100mL無水乙醇，加雙蒸水定容至1000mL。
顯色液B: 檸檬酸2.1g,Na2HPO4.12H2O 71g,加雙蒸水定容至1000mL。
使用時(shí)：1mL顯色液A＋1mL顯色液B+0.4μL 30%H2O2
終止液：2M H2SO4, 21.7mL濃H2SO4加雙蒸水定容至1000mL。
對(duì)于檢測陽性的雜交瘤細(xì)胞克隆，再使用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆。經(jīng)過三次亞克隆，分別篩選得到6xHis 3株雜交瘤細(xì)胞株（1F4、8B6、3D7、），S Tag 2株雜交瘤細(xì)胞株（5D6、2C3）；Trx 5株雜交瘤細(xì)胞株（4F4、6B7、3G7、6T5、7H5）；GST3株雜交瘤細(xì)胞株（7F4、2C7、6D7）。
最后將雜交瘤細(xì)胞株分別制備BALB/c小鼠腹水，使用辛酸-硫酸銨法及Protein G分兩步純化單克隆抗體。