專利名稱：精子生成相關(guān)蛋白、其編碼序列及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及新的編碼人精子生成相關(guān)蛋白-Sgrg的多核苷酸，以及此多核苷酸編碼的多肽。本發(fā)明還涉及此多核苷酸和多肽的用途和制備。具體地說，本發(fā)明的多肽是一種與精子生成和發(fā)育相關(guān)的蛋白。
男性生殖環(huán)節(jié)很多，主要的有男性生殖系統(tǒng)的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)，睪丸的精子發(fā)生，精子在附睪中的成熟，精子排出過程中與精囊，前列腺分泌的精漿混合而成精液，精子從男性生殖道排出體外并輸入到女性生殖道內(nèi)，精子在女性輸卵管內(nèi)與卵子受精等環(huán)節(jié)，在這些環(huán)節(jié)中受到干擾和影響，都可發(fā)生生育障礙。
據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，世界發(fā)達(dá)國(guó)家5％-8％的育齡夫婦可能有不育問題，而發(fā)展中國(guó)家的某些地區(qū)可高達(dá)30％。按WHO推薦的標(biāo)準(zhǔn)，夫婦婚后同居一年以上，未用任何避孕措施，由于男性方面的原因造成女方不孕者，稱為男性不育癥。男性不育的病因在臨床上分為性功能障礙，免疫不育，精漿異常，先天性疾病，生殖道感染，精索靜脈曲張，內(nèi)分泌異常，輸精管阻塞，精子異常，睪丸功能障礙及環(huán)境因素等等。
近年來，隨著醫(yī)療水平的不斷進(jìn)步，一部分男性不育癥在臨床上找到了較為有效的治療手段。但是由于對(duì)于男性生殖機(jī)理了解尚十分不夠，男性不育，特別是精子發(fā)生異常所引起的不育，還停留在經(jīng)驗(yàn)性治療的階段。與精子發(fā)生相關(guān)的基因的克隆也報(bào)道不多。因此，在分子水平上了解精子發(fā)生中的生化事件具有十分重要的實(shí)際應(yīng)用意義。
因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)新的新的與精子生成和/或生成有關(guān)的蛋白。
本發(fā)明的目的是提供一種新的人精子生成相關(guān)蛋白-Sgrg蛋白以及其片段、類似物和衍生物。
本發(fā)明的另一目的是提供編碼這些多肽的多核苷酸。
本發(fā)明的另一目的是提供生產(chǎn)這些多肽的方法以及該多肽和編碼序列的用途。
在本發(fā)明的第一方面，提供新穎的分離出的Sgrg多肽，該多肽是人源的，它包含具有SEQ ID NO2或3氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO2或3氨基酸序列的多肽。
在本發(fā)明的第二方面，提供編碼分離的這些多肽的多核苷酸，該多核苷酸包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少70％相同性(a)編碼上述人Sgrg多肽的多核苷酸；和(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，該多核苷酸的序列是選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中561-1364位的序列(Sgrg蛋白的編碼區(qū))；(b)具有SEQ ID NO1中781-1364位的序列(成熟的Sgrg蛋白的編碼區(qū))(c)具有SEQ ID NO1中1-1640位的序列。
在本發(fā)明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞或者被上述多核苷酸直接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的第四方面，提供了制備具有人Sgrg蛋白活性的多肽的方法，該方法包含(a)在適合表達(dá)人Sgrg蛋白的條件下，培養(yǎng)上述被轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有人Sgrg蛋白活性的多肽。
在本發(fā)明的第五方面，提供了與上述的人Sgrg多肽特異性結(jié)合的抗體。還提供了可用于檢測(cè)的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中連續(xù)的10-1640個(gè)核苷酸。
在本發(fā)明的第六方面，提供了模擬、促進(jìn)、拮抗人Sgrg多肽活性的化合物，以及抑制人Sgrg多肽的表達(dá)的化合物。還提供了篩選和/或制備這些化合物的方法。較佳地，該化合物是人Sgrg多肽的編碼序列或其片段的反義序列。
在本發(fā)明的第七方面，提供了檢測(cè)樣品中是否存在Sgrg蛋白的方法，它包括將樣品與Sgrg蛋白的特異性抗體接觸，觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在Sgrg蛋白。
在本發(fā)明的第八方面，提供了一種檢測(cè)與人Sgrg多肽異常表達(dá)相關(guān)的疾病或疾病易感性的方法，該方法包括檢測(cè)編碼所述多肽的核酸序列中是否存在突變。
在本發(fā)明的第九方面，提供了本發(fā)明多肽和編碼序列的用途。例如本發(fā)明多肽可被用于篩選促進(jìn)人Sgrg多肽活性的激動(dòng)劑，或者篩選抑制人Sgrg多肽活性的拮抗劑、或者被用于肽指紋圖譜鑒定。本發(fā)明的人Sgrg蛋白的編碼序列或其片段，可被作為引物用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)，或者作為探針用于雜交反應(yīng)，或者用于制造基因芯片或微陣列。
在本發(fā)明的第十方面，提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明的人Sgrg多肽或其激動(dòng)劑、拮抗劑以及藥學(xué)上可接受的載體。這些藥物組合物可治療少精癥，畸形精子等病癥。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術(shù)的公開，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。
下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實(shí)施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書所界定的本發(fā)明范圍。


圖1是本發(fā)明的人Sgrg蛋白與人類紅血球增多癥相關(guān)基因PRV-1(GI9857661)的氨基酸序列同源性比較圖。上方序列是人Sgrg，下方序列是人PRV-1蛋白。相同的氨基酸在兩個(gè)序列之間用氨基酸字母標(biāo)出，相似的氨基酸用“+”。
圖2是本發(fā)明的人Sgrg蛋白表達(dá)產(chǎn)物的電泳圖。
在本發(fā)明中，術(shù)語“Sgrg蛋白”、“Sgrg多肽”或“精子生成相關(guān)蛋白Sgrg”可互換使用，都指具有人精子生成相關(guān)蛋白Sgrg氨基酸序列(SEQ ID NO2或3)的蛋白或多肽。它們包括含有或不含起始甲硫氨酸的Sgrg蛋白，也包括含信號(hào)肽或不含信號(hào)肽的Sgrg蛋白。
如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。
如本文所用，“分離的Sgrg蛋白或多肽”是指Sgrg多肽基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化Sgrg蛋白?；旧霞兊亩嚯脑诜沁€原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。Sgrg多肽的純度能用氨基酸序列分析。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。
本發(fā)明還包括人Sgrg蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然人Sgrg蛋白相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個(gè)或多個(gè)保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個(gè)化合物(比如延長(zhǎng)多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據(jù)本文的教導(dǎo)，這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。
在本發(fā)明中，術(shù)語“人Sgrg多肽”指具有人Sgrg蛋白活性的SEQ ID NO.2或3序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與人Sgrg蛋白相同功能的、SEQ ID NO.2或3序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括人Sgrg蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與人Sgrg DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人Sgrg多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含人Sgrg多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長(zhǎng)的多肽外，本發(fā)明還包括了人Sgrg多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人Sgrg多肽序列的至少約10個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個(gè)連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供人Sgrg蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人Sgrg多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，“人Sgrg蛋白保守性變異多肽”指與SEQ ID NO2或3的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)，最佳地至多3個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。
表1
本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡(jiǎn)并的變異體。如本文所用，“簡(jiǎn)并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID NO2或3所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)，但與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
編碼成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術(shù)語“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個(gè)序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴(yán)格條件”是指(1)在較低離子強(qiáng)度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時(shí)加有變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上，更好是95％以上時(shí)才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物學(xué)功能和活性。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長(zhǎng)度至少含15個(gè)核苷酸，較好是至少30個(gè)核苷酸，更好是至少50個(gè)核苷酸，最好是至少100個(gè)核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴(kuò)增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離編碼Sgrg蛋白的多聚核苷酸。
本發(fā)明中的多肽和多核苷酸優(yōu)選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質(zhì)。
本發(fā)明的人Sgrg核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長(zhǎng)度較短時(shí)。通常，通過先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長(zhǎng)的片段。
目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；2301350-1354)被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。特別是很難從文庫中得到全長(zhǎng)的cDNA時(shí)，可優(yōu)選使用RACE法(RACE-cDNA末端快速擴(kuò)增法)，用于PCR的引物可根據(jù)本文所公開的本發(fā)明的序列信息適當(dāng)?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成。可用常規(guī)方法如通過凝膠電泳分離和純化擴(kuò)增的DNA/RNA片段。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或Sgrg蛋白編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。
通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)(Science，1984；2241431)，可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列可用來表達(dá)或生產(chǎn)重組的Sgrg多肽。一般來說有以下步驟(1).用本發(fā)明的編碼人Sgrg多肽的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；(3).從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
本發(fā)明中，人Sgrg多核苷酸序列可插入到重組表達(dá)載體中。術(shù)語“重組表達(dá)載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他載體。在本發(fā)明中適用的載體包括但不限于在細(xì)菌中表達(dá)的基于T7的表達(dá)載體(Rosenberg，et al.Gene，1987，56125)；在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的pMSXND表達(dá)載體(Lee and Nathans，J Bio Chem.2633521，1988)和在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的來源于桿狀病毒的載體?？傊灰茉谒拗黧w內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達(dá)載體的一個(gè)重要特征是通常含有復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含人Sgrg編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，coldSpring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合成。這些啟動(dòng)子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動(dòng)子；λ噬菌體PL啟動(dòng)子；真核啟動(dòng)子包括CMV立即早期啟動(dòng)子、HSV胸苷激酶啟動(dòng)子、早期和晚期SV40啟動(dòng)子、反轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細(xì)胞或其病毒中表達(dá)的啟動(dòng)子。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。
此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。
宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細(xì)菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細(xì)胞；CHO、COS、293細(xì)胞、或Bowes黑素瘤細(xì)胞的動(dòng)物細(xì)胞等。
本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，如果在載體中插入增強(qiáng)子序列時(shí)將會(huì)使轉(zhuǎn)錄得到增強(qiáng)。增強(qiáng)子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個(gè)堿基對(duì)，作用于啟動(dòng)子以增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄。可舉的例子包括在復(fù)制起始點(diǎn)晚期一側(cè)的100到270個(gè)堿基對(duì)的SV40增強(qiáng)子、在復(fù)制起始點(diǎn)晚期一側(cè)的多瘤增強(qiáng)子以及腺病毒增強(qiáng)子等。
本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和宿主細(xì)胞。
用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長(zhǎng)期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。
在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
重組的人Sgrg蛋白或多肽有多方面的用途。這些用途包括(但不限于)直接做為藥物治療Sgrg蛋白功能低下或喪失所致的疾病(如無精子，或精子活力低下等疾病)，和用于篩選促進(jìn)或?qū)筍grg蛋白功能的抗體、多肽或其它配體。用表達(dá)的重組人Sgrg蛋白篩選多肽庫可用于尋找有治療價(jià)值的能抑制或刺激人Sgrg蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本發(fā)明還包括對(duì)人Sgrg DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于人Sgrg基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與人Sgrg基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識(shí)別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制人Sgrg蛋白的分子，也包括那些并不影響人Sgrg蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的人Sgrg基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國(guó)專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的人Sgrg基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)人Sgrg蛋白或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動(dòng)物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷人Sgrg蛋白功能的抗體以及不影響人Sgrg蛋白功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用人Sgrg基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人Sgrg基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而獲得。
抗人Sgrg蛋白的抗體可用于免疫組織化學(xué)技術(shù)中，檢測(cè)活檢標(biāo)本中的人Sgrg蛋白。此外，與人Sgrg蛋白結(jié)合的單克隆抗體也可用放射性同位素標(biāo)記，注入體內(nèi)可跟蹤其位置和分布。這種放射性標(biāo)記的抗體可作為一種非創(chuàng)傷性診斷方法用于腫瘤細(xì)胞的定位和判斷是否有轉(zhuǎn)移。
本發(fā)明中的抗體可用于治療或預(yù)防與人Sgrg蛋白相關(guān)的疾病。給予適當(dāng)劑量的抗體可以刺激或阻斷人Sgrg蛋白的產(chǎn)生或活性。
抗體也可用于設(shè)計(jì)成針對(duì)體內(nèi)某一特殊部位的免疫毒素。如人Sgrg蛋白高親和性的單克隆抗體可與細(xì)菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，紅豆堿等)共價(jià)結(jié)合。一種通常的方法是用巰基交聯(lián)劑如SPDP，攻擊抗體的氨基，通過二硫鍵的交換，將毒素結(jié)合于抗體上，這種雜交抗體可用于殺滅人Sgrg蛋白陽性的細(xì)胞(例如淋巴結(jié)細(xì)胞等)。
多克隆抗體的生產(chǎn)可用人Sgrg蛋白或多肽免疫動(dòng)物，如家兔，小鼠，大鼠等。多種佐劑可用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)，包括但不限于弗氏佐劑等。
利用本發(fā)明蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與Sgrg蛋白發(fā)生相互作用的物質(zhì)，如受體、抑制劑、激動(dòng)劑或拮抗劑等。
本發(fā)明蛋白及其抗體、抑制劑、激動(dòng)劑、拮抗劑或受體等，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時(shí)，可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)口服、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。
本發(fā)明的多肽可直接用于疾病治療，例如，用于睪丸生精功能障礙方面的治療。在使用本發(fā)明Sgrg蛋白時(shí)，還可同時(shí)使用其他用于同一病癥的治療劑，如睪丸素等。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明Sgrg多肽或其激動(dòng)劑、拮抗劑以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時(shí)，是將安全有效量的Sgrg蛋白或其拮抗劑、激動(dòng)劑施用于哺乳動(dòng)物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
人Sgrg蛋白的多聚核苷酸也可用于多種治療目的?；蛑委熂夹g(shù)可用于治療由于Sgrg蛋白的無表達(dá)或異常/無活性的Sgrg蛋白的表達(dá)所致的細(xì)胞增殖、發(fā)育或代謝異常。重組的基因治療載體(如病毒載體)可設(shè)計(jì)成表達(dá)變異的Sgrg蛋白，以抑制內(nèi)源性的Sgrg蛋白活性。來源于病毒的表達(dá)載體如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒、單純皰疹病毒、細(xì)小病毒等可用于將Sgrg基因轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)。構(gòu)建攜帶Sgrg基因的重組病毒載體的方法可見于已有文獻(xiàn)(Sambrook，et al.)。另外重組人Sgrg基因可包裝到脂質(zhì)體中，然后再轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)。
抑制人Sgrg mRNA的寡聚核苷酸(包括反義RNA和DNA)以及核酶也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。核酶是一種能特異性分解特定RNA的酶樣RNA分子，其作用機(jī)制是核酶分子與互補(bǔ)的靶RNA特異性雜交后進(jìn)行核酸內(nèi)切作用。反義的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技術(shù)獲得，如固相磷酸酰胺化學(xué)合成法合成寡核苷酸的技術(shù)已廣泛應(yīng)用。反義RNA分子可通過編碼該RNA的DNA序列在體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄獲得。這種DNA序列已整合到載體的RNA聚合酶啟動(dòng)子的下游。為了增加核酸分子的穩(wěn)定性，可用多種方法對(duì)其進(jìn)行修飾，如增加兩側(cè)的序列長(zhǎng)度，核糖核苷之間的連接應(yīng)用磷酸硫酯鍵或肽鍵而非磷酸二酯鍵。
多聚核苷酸導(dǎo)入組織或細(xì)胞內(nèi)的方法包括將多聚核苷酸直接注入到體內(nèi)組織中；或在體外通過載體(如病毒、噬菌體或質(zhì)粒等)先將多聚核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞中，再將細(xì)胞移植到體內(nèi)等。
能與人Sgrg蛋白結(jié)合的多肽分子可通過篩選由各種可能組合的氨基酸結(jié)合于固相物組成的隨機(jī)多肽庫而獲得。篩選時(shí)，必須對(duì)人Sgrg蛋白分子進(jìn)行標(biāo)記。
本發(fā)明還涉及定量和定位檢測(cè)人Sgrg蛋白水平的診斷試驗(yàn)方法。這些試驗(yàn)是本領(lǐng)域所熟知的，且包括FISH測(cè)定和放射免疫測(cè)定。試驗(yàn)中所檢測(cè)的人Sgrg蛋白水平，可以用作解釋人Sgrg蛋白在各種疾病中的重要性和用于診斷Sgrg蛋白起作用的疾病。
一種檢測(cè)檢測(cè)樣品中是否存在Sgrg蛋白的方法是利用Sgrg蛋白的特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)，它包括將樣品與Sgrg蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在Sgrg蛋白。
Sgrg蛋白的多聚核苷酸可用于Sgrg蛋白相關(guān)疾病的診斷和治療。在診斷方面，Sgrg蛋白的多聚核苷酸可用于檢測(cè)Sgrg蛋白的表達(dá)與否或在疾病狀態(tài)下Sgrg蛋白的異常表達(dá)。如Sgrg DNA序列可用于對(duì)活檢標(biāo)本的雜交以判斷Sgrg蛋白的表達(dá)異常。雜交技術(shù)包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術(shù)方法都是公開的成熟技術(shù)，相關(guān)的試劑盒都可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達(dá)分析和基因診斷。用Sgrg蛋白特異的引物進(jìn)行RNA-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)體外擴(kuò)增也可檢測(cè)Sgrg蛋白的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
檢測(cè)Sgrg基因的突變也可用于診斷Sgrg蛋白相關(guān)的疾病。Sgrg蛋白突變的形式包括與正常野生型Sgrg DNA序列相比的點(diǎn)突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等?？捎靡延械募夹g(shù)如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測(cè)突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達(dá)，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。
本發(fā)明的序列對(duì)染色體鑒定也是有價(jià)值的。簡(jiǎn)而言之，根據(jù)本發(fā)明Sgrg蛋白的cDNA制備PCR引物(優(yōu)選15-35bp)，可以將序列定位于染色體上。然后，將這些引物用于PCR篩選含各條人染色體的體細(xì)胞雜合細(xì)胞。只有那些含有相應(yīng)于引物的人基因的雜合細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生擴(kuò)增的片段。
一旦序列被定位到準(zhǔn)確的染色體位置，此序列在染色體上的物理位置就可以與基因圖數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。這些數(shù)據(jù)可見于例如，V.Mckusick，Mendelian Inheritance inMan(可通過與Johns Hopkins University Welch Medical Library聯(lián)機(jī)獲得)。然后可通過連鎖分析，確定基因與業(yè)已定位到染色體區(qū)域上的疾病之間的關(guān)系。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，提供了一種分離的多核苷酸，它編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。本發(fā)明的多核苷酸是從人外周淋巴血細(xì)胞cDNA文庫中分離出的。其序列如SEQ ID NO1所示，它包含的多核苷酸序列全長(zhǎng)為1640個(gè)堿基，其開放讀框位于561-1364位，編碼全長(zhǎng)為267個(gè)氨基酸的人Sgrg蛋白(SEQ IDNO2)?？蔀橹委煙o精子，或精子活力低下等疾病提供新的治療途徑，因而具有巨大的應(yīng)用前景。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1EST的獲得以不同分裂時(shí)相的小鼠艾氏腹水癌細(xì)胞及小鼠L929細(xì)胞為材料，用硬皮病病人抗血清與其作用，利用間接免疫熒光檢測(cè)抗原在胞內(nèi)的分布情況，得到了一例抗血清。它可以特異性地圍繞在分裂中后期細(xì)胞的染色體周圍。為了尋找這些抗原蛋白，本發(fā)明人用該血清篩選人睪丸λ噬菌體表達(dá)文庫。得到若干克隆，按常規(guī)方法抽取DNA，純化。用λgt11引物測(cè)序，發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)為新的EST，將該EST命名為為YN11。
實(shí)施例2全長(zhǎng)序列的獲得(1)引物合成為了得到包含YN11 EST的全長(zhǎng)cDNA，參照該EST的序列設(shè)計(jì)和合成了如下引物YN11 XF5′-TGG ATC TGC TTC CAC AGT CAT GGA CA-3′(SEQ ID NO6)YN11 NF5′-TAC AGC TCT AGG CCC GAG GTC AGG A-3′(SEQ ID NO7)YN11 NR5′-AGA AGC CAT GGG AAC CCT CGT ATC C-3′(SEQ ID NO8)YN11 R25′-ATT GGC TGC AGG CTG ATG TCT GGA AT-3′(SEQ ID NO9)
(2)5′-端cDNA序列的獲得以Marathon-Ready-cDNA Human Leukocyte(Clontech-7406-1)為模板，用引物YN11 XF和AP1(AP1是試劑盒中提供的引物)參照廠商建議的條件，進(jìn)行RACE-PCR。第一輪PCR產(chǎn)物稀釋10倍后，作為模板用巢式引物YN11NF和AP2(AP2是試劑盒中提供的引物)再次擴(kuò)增。擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物，割膠，純化，克隆到T-A載體(Sangon)，用M13正向和反向引物測(cè)序。
(3)3′-端cDNA序列的獲得采用與5′-端采用完全相同的策略，不同點(diǎn)僅在于引物為YN11NR.+AP1然后YN11R2+AP2。
(4)全長(zhǎng)序列的獲得將3′-端，5′-端序列拼接得到完整的全長(zhǎng)cDNA(GENE BANK登錄號(hào)AF241268)(因申請(qǐng)專利，故在本申請(qǐng)?zhí)峤恢疤幱诒Ｃ軤顟B(tài))。Sgrg cDNA為1640bp(SEQ ID NO1)，含有完整的開放性讀框801bp，編碼含267氨基酸殘基的多肽(SEQ ID NO2)。
經(jīng)SignaIP分析預(yù)測(cè)，SEQ ID NO2中第1-40位氨基酸為指向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的信號(hào)肽。成熟的多肽分子由227個(gè)氨基酸殘基組成(SEQ ID NO3)，其中與人類紅血球增多癥相關(guān)基因PRV-1的同源比較見圖1。PRV-1由兩個(gè)高度相似的結(jié)構(gòu)域組成，形成一個(gè)重復(fù)結(jié)構(gòu)。所以BLAST結(jié)果顯示SGRG與PRV-1的兩個(gè)片段都有同源性。相同性為32％，相似性為49％。
實(shí)施例5Sgrg的染色體定位按廠商建議的條件，利用RH panel Assay(Research Genetics)進(jìn)行Sgrg的染色體定位。將該基因在染色體上定位于19q13.2。
PCR條件95℃ 10分鐘→94℃ 30秒；64℃ 30秒；72℃ 23秒，共30個(gè)循環(huán)→72℃ 3分30秒。
引物YN11 XF和NR(該P(yáng)CR條件是進(jìn)行RH panel Assay的一部分條件)擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)rhserver@shgc.standford.edu分析，結(jié)果表明，與其最緊密連鎖的遺傳標(biāo)記是SHGC 3096.
實(shí)施例6Sgrg的組織表達(dá)譜以Sgrg包含ORF的一段cDNA(SEQ ID NO1中615-1364)為探針，與MTE膜(Clontech-7775-1)雜交，結(jié)果顯示該Sgrg在睪丸組織中十分特異地表達(dá)，而在其他組織(如肝，心等)中只有非常低的表達(dá)。
實(shí)施例7Sgrg的基因結(jié)構(gòu)和蛋白結(jié)構(gòu)
(1)基因結(jié)構(gòu)將Sgrg cDNA全長(zhǎng)序列在http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/的DATABASE-htgs做BLAST，結(jié)果發(fā)現(xiàn)人BAC染色體19，CIT978SKB-61I7包含了Sgrg基因，整個(gè)基因的跨度約為23kb?；蚪Y(jié)構(gòu)如下表2 Sgrg的基因結(jié)構(gòu)
(2)蛋白結(jié)構(gòu)用ORF Finder程序(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)預(yù)測(cè)Sgrg蛋白序列，得到一個(gè)267氨基酸的開放閱讀框。經(jīng)分析它可能含有以下結(jié)構(gòu)特點(diǎn)(A)基序1.氨基酸63-66；177-180 N-糖基化位點(diǎn)2.氨基酸21-23；179-181 PKC-磷酸化位點(diǎn)3.氨基酸13-16；40-43；65-68；196-199酪蛋白激酶2磷酸化位點(diǎn)(B)基因家族性分析在http∥fps.sdsc.edu上進(jìn)行基因家族性分析。結(jié)果表明，Sgrg蛋白有包括uPAR簽名序列(CXDXXCN)在內(nèi)的uPAR結(jié)構(gòu)域(C富含結(jié)構(gòu)域)，屬于尿激酶受體超家族。
(C)同源性分析BLAST(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)如圖1所示，Sgrg蛋白與人類紅血球增多癥相關(guān)基因PRV-1(GI9857661)有比較高的同源性，尤其是在uPAR超家族保守區(qū)域內(nèi)的同源性更強(qiáng)。
PRV-1屬于uPAR超家族的一個(gè)成員，它的過高表達(dá)與紅細(xì)胞過分增殖相對(duì)應(yīng)。PRV-1基因也定位于19q13.2的位置，與Sgrg的位置僅僅相隔9kb左右。
實(shí)施例8Sgrg的原位雜交由于Sgrg基因在睪丸組織中特異地表達(dá)，所以為了進(jìn)一步了解它在雄性生殖系統(tǒng)中的作用，以恒河猴睪丸為材料，按常規(guī)方法進(jìn)行原位雜交。結(jié)果發(fā)現(xiàn)它較為單一地曲精細(xì)管的生精細(xì)胞中表達(dá)。這表明，Sgrg的功能與精子的發(fā)育和/或成熟有十分密切的聯(lián)系。
實(shí)施例9Sgrg片段在原核細(xì)胞中的表達(dá)用引物YN11E-C-F(5′-CGC GGA TCC TTG GGG ACC TGT TTC AGT G-3′)(SEQ ID NO10)和YN11E-R(5′-ATAAAGCTTAAATGATGGC AGCAGCAATGG-3′)(SEQ ID NO5)，以人外周血cDNA為模板擴(kuò)增編碼Sgrg蛋白的167-267a.a的DNA。
利用EcoRI和Hind III位點(diǎn)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到PET32(a)(Novagen)中，然后轉(zhuǎn)化宿主E.ColiBL21(DE3)。轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞在IPTG的誘導(dǎo)下表達(dá)。結(jié)果如圖2所示，表達(dá)產(chǎn)物在SDS-PAGE膠中分子量大約為33Kda(含融合蛋白硫氧還原蛋白(Thioredoxin))。
實(shí)施例10抗體的制備用Ni-NTA Agarose(Clontech)純化實(shí)施例中表達(dá)的融合蛋白，將該融合蛋白用作抗原，在兔中制備多克隆抗體。具體程序如下第一次免疫純種新西蘭兔，蛋白用量為240ug/只，用弗氏完全佐劑。4周后，第二次免疫，蛋白用量為140ug/只，用不完全佐劑。之后2周，第三次免疫，蛋白用量為120ug/只，用不完全佐劑。
實(shí)施例11Sgrg對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用為了解Sgrg在細(xì)胞動(dòng)力學(xué)方面可能具有的意義，在本實(shí)施例中進(jìn)行了的集落形成實(shí)驗(yàn)。
用引物YN11E-F-2(5′-TCT AAG CTT ATG GGG GCG AGG CAG ATC CAGATC CAG ACC AGC TCC TCC CAG AC-3′)(SEQ ID NO11)和YN11E-R-2(5′-CGTCTA GAT TAG GAA AAG TGA ATA AAT GAT GGC AGC AGC A-3′)(SEQ ID NO12)，以人外周淋巴血cDNA為模板，通過RT-PCR擴(kuò)增得到Sgrg的編碼區(qū)(SEQ IDNO1中561-1364位)。
然后利用引物上的酶切位點(diǎn)(Xba I和Hind III)，將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到真核表達(dá)載體pRC/CMV(Invitrogen)，形成質(zhì)粒pRC/CMV-Sgrg。用Gibco公司的Lipofectamine(18324-020)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將構(gòu)建好的質(zhì)粒pRC/CMV-Sgrg轉(zhuǎn)染小鼠成纖維細(xì)胞3T3系和人肝癌細(xì)胞系7721。穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞株以低密度接種后，并以空載體pRC/CMV作為陰性對(duì)照，以JCL/L(一種已知的促細(xì)胞增殖因子)作為陽性對(duì)照。結(jié)果如表3所示表3 Sgrg對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用
可以看出，在真核細(xì)胞中過量表達(dá)Sgrg基因會(huì)影響細(xì)胞的增殖。這與uPAR家族的特征也比較吻合。
實(shí)施例12RT-PCR法獲得Sgrg編碼序列用RNeasy(Qiagen)從人外周血中分離總RNA。然后用SupertScript II RNaseH-Reverse Transcriptase(Gibco)，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA(按廠商提供條件反應(yīng))。以cDNA為模板，用引物YN11 RT-F和YN11 RT-RYN11RT-F5’AGA TCC AGA CCA GCT CCT CCC-3’(SEQ ID NO14)YN11RT-R5′-AAATGATGGC AGCAGCAATG G-3′(SEQ ID NO5)按以下條件PCR95℃10分鐘→94℃ 30秒；60℃30秒；72℃90秒，共45個(gè)循環(huán)→72℃3分30秒。
擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序，結(jié)果表明與SEQ ID NO1中所示的Sgrg的編碼區(qū)序列相符。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表(1)一般信息(ii)發(fā)明名稱新的精子生成相關(guān)蛋白、其編碼序列及用途(iii)序列數(shù)目14(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1640bp(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO1ATTTAGGATG AACTATGTGT GACAAATGGT GCCGTTGAGT CCTCTCAACT GGGAACGAGT 60CACCGTGTAT CTGGAGACCA TGTGTGTAAC GGGTTGCACC TGCTTGGCTG GATACAAAGA 120ACCATCCATC CCATCAGGGA AATATGCAAC ATGCTTCAAA GAATAAGAAG AGAACTTTGG 180GCCAGTAGAG ACGGGGTTTC ACCGTGTTAG CCAGGATGGT CTCGATCTCC TGACCTCGTG 240ATCCGCCTGC CTTGGCCTCC CAAAGTGCTG GGATTACAGG GCACTGAATG TCAAAGTGAA 300GGAATTCAAT GAAGCCCGGA TCAAGGGCAG GAGCAACCGT GACCCTCTTA AAAGAGCCAA 360TGCCCCATGT AATTAGTGAC GCGCGCGAAT GGATAGACGC TATTCCCACC GTCCCTACAT 420AGCATCCAGC GACACCACAG CCAAGGGACA GGCTTGGCGG AACTGCGGGA GAGAAGAACC 480CTCTGAGCCT GATTGAAAGG CGGTGAAGAG ACAGGAGAGG GGGATCGGTG GGCGGTCCCG 540CCTCCATCTT CAGTTCCCGC ATGGGGGCGA GGCAGATCCA GACCAGCTCC TCCCAGACCT 600CTCCAGAAGA AGCCATGGGA ACCCCTCGTA TCCAGCATTT GCTGATCCTC CTGGTCCTAG 660GAGCCTCCCT CCTGACCTCG GGCCTAGAGC TGTATTGTCA AAAGGGTCTG TCCATGACTG 720TGGAAGCAGA TCCAGCCAAT ATGTTTAACT GGACCACAGA GGAAGTGGAG ACTTGTGACA 780AAGGGGCACT TTGCCAGGAA ACCATACTAA TAATTAAAGC AGGGACTGAG ACAGCCATTT 840TGGCCACGAA GGGCTGCATC CCGGAAGGGG AGGAGGCCAT AACAATTGTC CAGCACTCTT 900CACCTCCCGG CCTGATCGTG ACCTCCTACA GTAACTACTG TGAGGATTCC TTCTGTAATG 960ACAAAGACAG CCTGTCTCAG TTTTGGGAGT TCAGTGAGAC CACAGCTTCC ACTGTGTCAA 1020CAACCCTCCA TTGTCCAACC TGTGTGGCTT TGGGGACCTG TTTCAGTGCT CCTTCTCTTC 1080CCTGTCCCAA TGGTACAACT CGATGCTATC AAGGAAAACT TGAGATCACT GGAGGTGGCA 1140TTGAGTCGTC TGTGGAGGTC AAAGGCTGTA CAGCCATGAT TGGCTGCAGG CTGATGTCTG 1200GAATCTTAGC AGTAGGACCC ATGTTTGTGA GGGAAGCGTG CCCACATCAG CTGCTCACTC 1260AACCTCGAAA GACTGAAAAT GGGGCCACCT GTCTTCCCAT TCCTGTTTGG GGGTTACAGC 1320TACTGCTGCC ATTGCTGCTG CCATCATTTA TTCACTTTTC CTAAGAAGGC ACTTCTGGGC 1380CTGGGTCTGA GGACATCTTT TTTGACTGGG AGCCTTCTTA CTGTTGAGGT TCAACAAGCT 1440GAGGAGTAGA TGGGAATTTG AGGGAGAATA CAGAGATACT ATGAACGTAT TTGACATTTT 1500TAATACAATT TCTGCTATAA TTTTTGTATG CAGTAGGCGT TACTAATAAA CATTTCTGCT 1560GTGAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 1620AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 1640(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度267個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO2MGARQIQTSS SQTSPEEAMG TPRIQHLLIL LVLGASLLTS XLELYCQKGL 50SMTVEADPAN MFNWTTEEVE TCDKGALCQE TILIIKAGTE TAILATKGCI 100PEGEEAITIV QHSSPPGLIV TSYSNYCEDS FCNDKDSLSQ FWEFSETTAS 150TVSTTLHCPT CVAXGTCFSA PSLPYPNGTT RCYQGKLEIT GGXIESSVEV 200KGCTAMIGCR LMSGILAVGP MFVREACPHQ LLTQPRKTEN GATCLPIPVW 250GLQLLLPLLL PSFIHFS 267(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度227個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO3XLELYCQKGL SMTVEADPAN MFNWTTEEVE TCDKGALCQE TILIIKAGTE 50TAILATKGCI PEGEEAITIV QHSSPPGLIV TSYSNYCEDS FCNDKDSLSQ 100FWEFSETTAS TVSTTLHCPT CVAXGTCFSA PSLPYPNGTT RCYQGKLEIT 150GGXIESSVEV KGCTAMIGCR LMSGILAVGP MFVREACPHQ LLTQPRKTEN 200GATCLPIPVW GLQLLLPLLL PSFIHFS 227()SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQIDNO4AGATCCAGAC CAGCTCCTCC C 21(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO5AAATGATGGC AGCAGCAATG G 21(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度26堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO6TGGATCTGCT TCCACAGTCA TGGACA26(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度25堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQIDNO7TACAGCTCTA GGCCCGAGGT CAGGA 25(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度25堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO8AGAAGCCATG GGAACCCTCG TATCC 25(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度26堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQIDNO9ATTGGCTGCA GGCTGATGTC TGGAAT 26(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度28堿基
(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO10CGCGGATCCT TGGGGACCTG TTTCAGTG28(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度53堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO11TCTAAGCTTA TGGGGGCGAG GCAGATCCAG ATCCAGACCA GCTCCTCCCA50GAC 53(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度40堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO10CGTCTAGATT AGGAAAAGTG AATAAATGAT GGCAGCAGCA 40(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度30堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO13ATAAAGCTTA AATGATGGCA GCAGCAATGG 30(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO14AGATCCAGAC CAGCTCCTCC C 2權(quán)利要求
1.一種分離的人Sgrg多肽，其特征在于，它包含具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
2.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO2或3氨基酸序列的多肽。
3.一種分離的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少70％相同性(a)編碼如權(quán)利要求1和2所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸。
4.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。
5.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸的序列選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中561-1364位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中781-1364位的序列；(c)具有SEQ ID NO1中1-1640位的序列。
6.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求3所述的多核苷酸。
7.一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求6所述的載體。
8.一種具有人Sgrg蛋白活性的多肽的制備方法，其特征在于，該方法包含(a)在適合表達(dá)人Sgrg蛋白的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有人Sgrg蛋白活性的多肽。
9.一種能與權(quán)利要求1所述的人Sgrg蛋白特異性結(jié)合的抗體。
10.一種核酸分子，它含有權(quán)利要求3所述的多核苷酸中連續(xù)的10-1640個(gè)核苷酸。
11.一種藥物組合物，其特征在于，它含有安全有效量的權(quán)利要求1所述的多肽以及藥學(xué)上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的精子生成相關(guān)蛋白－Sgrg蛋白,編碼Sgrg蛋白的多核苷酸和經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生Sgrg蛋白的方法。本發(fā)明還公開了編碼Sgrg蛋白的多核苷酸的用途。本發(fā)明還公開了此Sgrg蛋白用于治療多種疾病的方法,如用于不育癥等疾病。本發(fā)明還提供了含Sgrg蛋白的藥物組合物。
文檔編號(hào)C07H21/00GK1352138SQ0012731
公開日2002年6月5日 申請(qǐng)日期2000年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月9日
發(fā)明者孔祥銀, 楊俊 , 趙國(guó)屏, 倪祖梅, 謝雍 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生物工程研究中心