一種低拷貝pTerm質(zhì)粒及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種低拷貝pTerm質(zhì)粒及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，所述的低拷貝pTerm系列質(zhì)粒包括rop基因、rep基因、原核生物轉(zhuǎn)錄終止子以及抗生素抗性基因。本發(fā)明的一種低拷貝pTerm系列質(zhì)粒具有拷貝數(shù)低、容量大、穩(wěn)定性高等特點(diǎn)，可用于結(jié)構(gòu)復(fù)雜基因、包括重復(fù)序列、不穩(wěn)定基因以及長(zhǎng)片段基因的克隆、篩選、測(cè)序和基因組的構(gòu)建等基因工程領(lǐng)域，對(duì)基因的高效率、高質(zhì)量合成具有重要的作用。
【專利說(shuō)明】一種低拷貝pTerm質(zhì)粒及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】和基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種低拷貝、大容量、高穩(wěn)定 性的pTerm質(zhì)粒及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 質(zhì)粒是染色質(zhì)外的遺傳因子，能夠進(jìn)行自主復(fù)制，是一種能獨(dú)立復(fù)制的復(fù)制子。 質(zhì)粒是一種雙鏈共價(jià)閉合環(huán)形DNA分子，可自然形成超螺旋結(jié)構(gòu)，不同質(zhì)粒大小在2kb? 300kb之間。
[0003] 質(zhì)粒雖然不是宿主生存所必需的遺傳元件，但是能夠給予宿主細(xì)胞某些特殊的性 質(zhì)，例如抗藥性等。質(zhì)?？梢宰鳛檩d體用于克隆外源基因，廣泛應(yīng)用于基因克隆、測(cè)序及基 因合成等領(lǐng)域。人們一方面不斷從自然界發(fā)現(xiàn)新質(zhì)粒，另一方面也不斷在已有質(zhì)粒的基礎(chǔ) 上構(gòu)建衍生質(zhì)粒，作為基因工程的載體。
[0004] 所謂復(fù)制子，即是一個(gè)遺傳單位，包括DNA復(fù)制起點(diǎn)（ori)及其相關(guān)的調(diào)控原件。 每個(gè)質(zhì)粒DNA上都含有ori，在質(zhì)粒中ori是一段特定的DNA序列，長(zhǎng)約幾百堿基對(duì)，只有 ori能被宿主細(xì)胞復(fù)制及蛋白質(zhì)識(shí)別的質(zhì)粒才能在該種細(xì)胞中復(fù)制，不同質(zhì)粒復(fù)制控制狀 況主要與ori的序列結(jié)構(gòu)相關(guān)。
[0005] 根據(jù)質(zhì)粒復(fù)制的特點(diǎn)，質(zhì)粒被分為嚴(yán)緊型和松弛型兩類。嚴(yán)緊型質(zhì)粒也稱低拷貝 數(shù)質(zhì)粒，每個(gè)細(xì)胞中拷貝數(shù)有限，大約一個(gè)至十幾個(gè)；松弛型質(zhì)粒也稱高拷貝數(shù)質(zhì)粒，其拷 貝數(shù)較多，可達(dá)幾百個(gè)。恒定的拷貝數(shù)與質(zhì)粒復(fù)制控制系統(tǒng)、宿主細(xì)胞遺傳背景及生長(zhǎng)條件 有關(guān)。尤其是高拷貝數(shù)質(zhì)粒更是因其分子量小、拷貝數(shù)高、操作方便、易于大量制備等優(yōu)點(diǎn) 而成為實(shí)驗(yàn)中的首選。
[0006] 松弛型質(zhì)粒（高拷貝數(shù)質(zhì)粒）通常帶有藍(lán)白斑篩選功能（例如puc系列載體），這 個(gè)特點(diǎn)給基因克隆帶來(lái)了極大的方便。用于藍(lán)白斑篩選的載體具有一段稱為Iacz'的基 因 ，Iacz '中包括：一段β-半乳糖苷酶的啟動(dòng)子序列；編碼α肽鏈的序列；一個(gè)多克隆位 點(diǎn)（MCS)。MCS位于編碼α肽鏈的序列中，是外源DNA的插入位點(diǎn)。設(shè)計(jì)適用于藍(lán)白斑篩 選的基因工程菌為β -半乳糖苷酶缺陷型菌株，這種宿主菌的染色體基因組中編碼β -半 乳糖苷酶的基因突變，造成其編碼的β -半乳糖苷酶失去正常N段一個(gè)146個(gè)氨基酸的短 肽（即α肽鏈），從而不具有生物活性，即無(wú)法作用于X-gal產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)。雖然上述缺陷 株基因組無(wú)法單獨(dú)編碼有活性的β-半乳糖苷酶，但當(dāng)菌體中含有帶lacz'的質(zhì)粒后，質(zhì)粒 lacz'基因編碼的α肽鏈和菌株基因組表達(dá)的N端缺陷的β-半乳糖苷酶突變體互補(bǔ)，具 有與完整β_半乳糖苷酶相同的作用，能夠使X-gal生成藍(lán)色物質(zhì)，這種現(xiàn)象即α-互補(bǔ)。 以上是攜帶空載體的菌株產(chǎn)生的表型。當(dāng)外源DNA與含lacz'的載體連接時(shí)，會(huì)插入進(jìn)MCS， 使α肽鏈讀碼框破壞，這種重組質(zhì)粒不再表達(dá)α肽鏈，將它導(dǎo)入宿主缺陷菌株則無(wú) α互 補(bǔ)作用，不產(chǎn)生有活性β -半乳糖苷酶，即不可分解培養(yǎng)基中的X-gal產(chǎn)生藍(lán)色，培養(yǎng)表型 呈現(xiàn)白色菌落。
[0007] 雖然帶有藍(lán)白斑篩選功能的高拷貝數(shù)質(zhì)粒給基因克隆提供了極大的方便，但是其 β -半乳糖苷酶的啟動(dòng)子屬于強(qiáng)啟動(dòng)子，能夠大量啟動(dòng)外源基因的轉(zhuǎn)綠、翻譯，這也導(dǎo)致了 某些結(jié)構(gòu)復(fù)雜的基因、轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物對(duì)宿主有毒性的基因無(wú)法克隆。目前通常使用以下 兩種方式克隆這類"難度"基因：①選用低拷貝或單拷貝質(zhì)粒作為克隆載體；②選用可以降 低質(zhì)?？截悢?shù)的菌株，例如ΕΡΙ400。盡管這些方法可以成功克隆部分"難度"基因，但是仍 有很多基因無(wú)法克隆，究其原因是因?yàn)檫@些載體盡管拷貝數(shù)低，但是通常還是帶有藍(lán)白斑 篩選功能，仍具有大量啟動(dòng)外源基因的轉(zhuǎn)綠、翻譯的強(qiáng)啟動(dòng)子，并且即使質(zhì)粒中不帶有藍(lán)白 斑篩選功能，不具有相應(yīng)的強(qiáng)啟動(dòng)子，質(zhì)粒中其它啟動(dòng)子（例如抗生素抗性基因啟動(dòng)子）也 可以啟動(dòng)外源基因的低量轉(zhuǎn)錄、翻譯，因此，如何克服現(xiàn)有質(zhì)粒載體存在的上述缺陷，提高 克隆"難度"基因的成功率是很多科研人員需要解決的首要問(wèn)題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明解決的問(wèn)題在于提供一種低拷貝、大容量、高穩(wěn)定性的pTerm系列質(zhì)粒，并 進(jìn)一步公開(kāi)其構(gòu)建方法及應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明的目的將通過(guò)以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)：
[0010] -種低拷貝pTerm質(zhì)粒，所述質(zhì)粒包括rop基因、rep基因、原核生物轉(zhuǎn)錄終止子 以及抗生素抗性基因；所述原核生物轉(zhuǎn)錄終止子設(shè)置于多克隆位點(diǎn)的兩端；所述抗生素抗 性基因?yàn)锳mp基因或Kan基因。
[0011] 優(yōu)選的，所述Amp基因具有如SEQ ID No. 1所不的序列結(jié)構(gòu)，所述Kan基因具有如 SEQ ID No. 4所示的序列結(jié)構(gòu)。
[0012] 優(yōu)選的，所述質(zhì)粒的拷貝數(shù)為40-60個(gè)。
[0013] 優(yōu)選的，所述質(zhì)粒記為pTerm-LA，具有如SEQ ID No. 8所示的序列結(jié)構(gòu)；所述質(zhì)粒 中，自 5'端第 120bp ?713bp 為 Terminator 基因；869bp ?1729bp 為 Amp 基因；1878bp ? 2506bp為rep基因；3231bp?3455bp為rop基因；其中多克隆位點(diǎn)在427bp?468bp處； 或者
[0014] 所述質(zhì)粒記為pTerm-LK，具有如SEQ ID No. 8所示的序列結(jié)構(gòu)；所述質(zhì)粒中，自5' 端第 120bp ?713bp 為 Terminator 基因；869bp ?1684bp 為 Kan 基因；1833bp ?2461bp 為rep基因；3186bp?3410bp為rop基因；其中多克隆位點(diǎn)在427bp?468bp處。
[0015] -種構(gòu)建低拷貝pTerm質(zhì)粒的方法，包括以下步驟：
[0016] 步驟一：人工設(shè)計(jì)并合成所述的rep基因、rop基因、原核生物轉(zhuǎn)錄終止子基因、抗 生素抗性基因片段；
[0017] 步驟二：運(yùn)用多段重組法將所述rep基因、rop基因、原核生物轉(zhuǎn)錄終止子基因、抗 生素抗性基因片段連接環(huán)化，最終得到環(huán)形的質(zhì)粒。
[0018] 優(yōu)選的，所述的多段重組法為Gibson重組方法，反應(yīng)體系及條件：按1: 1: 1:1的摩 爾比取所述rep基因、rop基因、原核生物轉(zhuǎn)錄終止子基因、抗生素抗性基因片段，加入滅菌 去離子水，再加入Gibson Assembly Master Mix試劑，50°C下反應(yīng)至得到環(huán)形質(zhì)粒。
[0019] 一種構(gòu)建低拷貝pTerm系列質(zhì)粒的方法，包括以下步驟：
[0020] 步驟一：人工合成所述抗生素抗性Amp基因或Kan基因片段；
[0021] 步驟二：按照權(quán)利要求5或6所述方法構(gòu)建得到含所述抗生素抗性Amp基因或 Kan基因的pTerm質(zhì)粒，分別以所述含抗生素抗性Amp基因或Kan基因的質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì) F-pTerm-LA/LK、R-pTerm_LA/LK為引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到rep-rop-原核生物轉(zhuǎn)錄終止子 基因片段；
[0022] 步驟三：運(yùn)用Gibson重組方法，將構(gòu)建的所述rep-rop-原核生物轉(zhuǎn)錄終止子基因 片段與分別與所述抗生素抗性Kan基因或Amp基因片段進(jìn)行組裝。
[0023] 優(yōu)選的，所述步驟二中，所述引物包括：
[0024] F-pTerm-LA/LK :5，-ctgtcagaccaagtttactcatatatactttag-3，；
[0025] R-pTerm-LA/LK :5' -actcttcctttttcaatattattgaagcatttatc-3,;
[0026] 優(yōu)選的，所述的Gibson重組方法反應(yīng)體系及條件：按1:1的摩爾比取所述 rep-rop-原核生物轉(zhuǎn)錄終止子基因片段與所述第二抗生素抗性基因片段，加入滅菌去離子 水，再加入Gibson Assembly Master Mix試劑，50°C下反應(yīng)至得到環(huán)形質(zhì)粒。
[0027] 上述低拷貝pTerm質(zhì)粒在基因克隆、篩選和測(cè)序領(lǐng)域中的應(yīng)用。
[0028] 優(yōu)選的，所述pTerm-SC質(zhì)粒在結(jié)構(gòu)復(fù)雜、含有重復(fù)序列以及不穩(wěn)定序列基因的克 隆、篩選和測(cè)序中的應(yīng)用。
[0029] 優(yōu)選的，所述pTerm-SC質(zhì)粒在長(zhǎng)片段基因的克隆、篩選、測(cè)序和基因組合成中的 應(yīng)用。
[0030] 本發(fā)明利用人工合成的方法，合成一種低拷貝pTerm系列質(zhì)粒，主要技術(shù)手段是 刪除眾多克隆質(zhì)粒所具有的藍(lán)白斑篩選基因及相應(yīng)的強(qiáng)啟動(dòng)子，并且在多克隆位點(diǎn)兩端添 加了多個(gè)防止外源DNA序列從上游質(zhì)粒啟動(dòng)子過(guò)多轉(zhuǎn)錄的原核生物轉(zhuǎn)錄終止子，即不依賴 P因子的原核生物轉(zhuǎn)錄終止子，因此能夠有效遏制外源基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯，從而使該質(zhì)粒能 夠克隆高拷貝、低拷貝載體所不能克隆的基因及對(duì)宿主細(xì)胞有毒害的基因。
[0031] 本發(fā)明的一種低拷貝PTerm系列質(zhì)粒具有拷貝數(shù)低、容量大、穩(wěn)定性高等特點(diǎn)，可 用于結(jié)構(gòu)復(fù)雜基因、包括重復(fù)序列、不穩(wěn)定基因以及長(zhǎng)片段基因的克隆、篩選、測(cè)序和基因 組的構(gòu)建等基因工程領(lǐng)域，對(duì)基因的高效率、高質(zhì)量合成具有重要的作用。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0032] 為了使本發(fā)明的內(nèi)容更容易被清楚的理解，下面根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例并結(jié)合 附圖，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明，其中
[0033] 圖1為pTerm-LA質(zhì)粒的物理圖譜；
[0034] 圖2為pTerm-LK質(zhì)粒的物理圖譜；
[0035] 圖3為pTerm-LA質(zhì)粒構(gòu)建流程模式圖；
[0036] 圖4為膜蛋白基因重組質(zhì)粒的酶切驗(yàn)證圖，其中1為重組質(zhì)粒對(duì)照；2為重組質(zhì)粒 用限制性內(nèi)切酶BamHI+Hind III酶切結(jié)果；3為DS5000DNAMarker ;
[0037] 圖5為人線粒體部分DNA序列重組質(zhì)粒的酶切驗(yàn)證圖，其中1為重組質(zhì)粒對(duì)照，2 為重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶BamH I +Mlu I的酶切結(jié)果，3為DS5000DNA Marker。

【具體實(shí)施方式】
[0038] 實(shí)施例1 :質(zhì)粒pTerm-LA的構(gòu)建
[0039] 質(zhì)粒pTerm-LA的構(gòu)建流程模式圖如圖3所示，具體方法如下：
[0040] 1.設(shè)計(jì)并合成Amp基因，序列全長(zhǎng)921bp，其中31?891為Amp基因，編碼β -內(nèi) 酰胺酶，對(duì)氨芐青霉素有抗性，基因序列如序列表中的序列I ;
[0041] 2.設(shè)計(jì)并合成rep復(fù)制子基因，序列全長(zhǎng)971bp，其中序列149?777bp為rep復(fù) 制子基因序列，基因序列如序列表中的序列2 ;
[0042] 3.設(shè)計(jì)并合成rop基因，序列全長(zhǎng)927bp，其中序列561?785bp為rop基因序列， 基因序列如序列表中的序列3 ;
[0043] 4.設(shè)計(jì)并合成Terminator基因，序列全長(zhǎng)779bp，其中31?289bp為原核生物轉(zhuǎn) 錄終止子，基因序列如序列表中的序列4 ;
[0044] 分別得到以上四個(gè)基因片段，由于四個(gè)片段之間具有30bp重疊互補(bǔ)區(qū)域，因此使 用Gibson Assembly Master Mix(NEB)試劑盒將它們組裝起來(lái)最終得到環(huán)形的質(zhì)粒，記為 pTerm-LA，其測(cè)序序列如SEQ ID No. 8所示。
[0045] Gibson Assembly Master Mix反應(yīng)體系及條件：四個(gè)基因片段各1 μ 1，滅菌去離 子水 6 μ 1，Gibson Assembly Master Mix :10 μ 1，50°C反應(yīng) 1 小時(shí)。
[0046] 取5 μ 1連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOPlOF ^大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，第二天挑選單克隆進(jìn)行菌 檢PCR，并將菌檢到的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明構(gòu)建出的質(zhì)粒與預(yù)期相符，質(zhì)粒大 小為3478bp。質(zhì)粒中主要元件的位置分別是Terminator基因：120bp?713bp ;Amp基因： 869bp ?1729bp ;r印基因：1878bp ?2506bp ;rop 基因：3231bp ?3455bp ;其中多克隆位 點(diǎn)在427bp?468bp處。
[0047] 實(shí)施例2 :質(zhì)粒pTerm-LK的構(gòu)建
[0048] 質(zhì)粒pTerm-LK的構(gòu)建方法和質(zhì)粒pTerm-LA構(gòu)建類似，具體方法如下：
[0049] L設(shè)計(jì)并合成Kan基因，序列全長(zhǎng)876bp，其中31?846為Kan基因，基因序列如 序列表中的序列5 ;
[0050] 2.設(shè)計(jì)并合成rep復(fù)制子基因，序列全長(zhǎng)971bp，其中序列149?777bp為rep復(fù) 制子基因序列，基因序列如序列表中的序列2 ;
[0051] 3.設(shè)計(jì)并合成rop基因，序列全長(zhǎng)927bp，其中序列561?785bp為rop基因序列， 基因序列如序列表中的序列3 ;
[0052] 4.設(shè)計(jì)并合成Terminator基因，序列全長(zhǎng)779bp，其中31?289bp為原核生物轉(zhuǎn) 錄終止子，基因序列如序列表中的序列4 ;
[0053] 分別得到以上四個(gè)基因片段，由于四個(gè)片段之間具有30bp重疊互補(bǔ)區(qū)域，因此使 用Gibson Assembly Master Mix(NEB)試劑盒將它們組裝起來(lái)最終得到環(huán)形的質(zhì)粒，記為 pTerm-LK,其測(cè)序序列如SEQ ID No. 9所示。
[0054] Gibson Assembly Master Mix反應(yīng)體系及條件：四個(gè)基因片段各1 μ 1，滅菌去離 子水 6 μ 1，Gibson Assembly Master Mix :10 μ 1，50°C反應(yīng) 1 小時(shí)。
[0055] 取5 μ 1連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOPlOF ^大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，第二天挑選單克隆進(jìn)行菌 檢PCR，并將菌檢到的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明構(gòu)建出的質(zhì)粒與預(yù)期相符，質(zhì)粒大 小為3433bp。質(zhì)粒中主要元件的位置分別是Terminator基因：120bp?713bp ;Kan基因： 869bp ?1684bp ;rep 基因：1833bp ?2461bp ;rop 基因：3186bp ?3410bp ;其中多克隆位 點(diǎn)在427bp?468bp處。
[0056] 實(shí)施例3 :以質(zhì)粒pTerm-LA為模板構(gòu)建pTerm-LK質(zhì)粒
[0057] 在質(zhì)粒pTerm-LA的基礎(chǔ)上通過(guò)改變抗生素抗性基因，構(gòu)建得到具有卡那霉素抗 性的質(zhì)粒pTerm-LK，具體方法如下：
[0058] 人工設(shè)計(jì)并合成Kan基因序列，全長(zhǎng)876bp，基因序列如序列表中的序列4,其中堿 基31?846為Kan基因編碼區(qū)。
[0059] 以實(shí)施例1中制備得到的pTerm-LA質(zhì)粒為模板，F(xiàn)-pTerm-LA/LK、R-pTerm-LA/LK 為引物，通過(guò)PCR得到片段rep-rop-Terminator ;
[0060] F-pTerm-LA/LK :5，-ctgtcagaccaagtttactcatatatactttag-3，；
[0061] R-pTerm-LA/LK :5' -actcttcctttttcaatattattgaagcatttatd'。
[0062] 由于該片段與Kan基因序列兩端具有30bp重疊互補(bǔ)區(qū)域，因此采用Gibson Assembly Master Mix(NEB)試劑盒將兩個(gè)片段進(jìn)行組裝。
[0063] Gibson Assembly Master Mix反應(yīng)體系及條件：兩個(gè)DNA片段各1 μ 1，滅菌 去離子水8μ1，Gibson Assembly Master Mix :10yl，50°C反應(yīng)1小時(shí)，即得環(huán)形質(zhì)粒 pTerm-LK，其測(cè)序序列如SEQ ID No. 9所示。
[0064] 取5μ 1連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Τ0Ρ10Γ大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，第二天挑選單克隆進(jìn)行菌 檢PCR，并將菌檢到的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明構(gòu)建出的質(zhì)粒與預(yù)期相符，質(zhì)粒大 小為3433bp。質(zhì)粒中主要元件的位置分別是Terminator基因：120bp?713bp ;Kan基因： 869bp ?1684bp ;rep 基因：1833bp ?2461bp ;rop 基因：3186bp ?3410bp ;其中多克隆位 點(diǎn)在427bp?468bp處。
[0065] 實(shí)施例4 :以質(zhì)粒pTerm-LK為模板構(gòu)建pTerm-LA質(zhì)粒
[0066] 在質(zhì)粒pTerm-LK的基礎(chǔ)上通過(guò)改變抗生素抗性基因，構(gòu)建得到具有氨芐青霉素 抗性的質(zhì)粒pTerm-LA，具體方法如下：
[0067] 人工設(shè)計(jì)并合成Amp基因序列，序列全長(zhǎng)921bp，其中31?891為Amp基因，編碼 β -內(nèi)酰胺酶，對(duì)氨芐青霉素有抗性，基因序列如序列表中的序列1 ;
[0068] 以實(shí)施例2中制備得到的pTerm-LK質(zhì)粒為模板，F(xiàn)-pTerm-LA/LK、R-pTerm-LA/LK 為引物，通過(guò)PCR得到片段rep-rop-Terminator ;
[0069] F-pTerm-LA/LK :5，-ctgtcagaccaagtttactcatatatactttag-3，；
[0070] R-pTerm-LA/LK :5' -actcttcctttttcaatattattgaagcatttatd'。
[0071] 由于該片段與Amp基因序列兩端具有30bp重疊互補(bǔ)區(qū)域，因此采用Gibson Assembly Master Mix(NEB)試劑盒將兩個(gè)片段進(jìn)行組裝。
[0072] Gibson Assembly Master Mix反應(yīng)體系及條件：兩個(gè)DNA片段各1 μ 1，滅菌 去離子水8μ1，Gibson Assembly Master Mix :10yl，50°C反應(yīng)1小時(shí)，即得環(huán)形質(zhì)粒 pTerm-LA,其測(cè)序序列如SEQ ID No. 8所示。
[0073] 取5μ 1連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Τ0Ρ10Γ大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，第二天挑選單克隆進(jìn)行菌 檢PCR，并將菌檢到的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明構(gòu)建出的質(zhì)粒與預(yù)期相符，質(zhì)粒大 小為3478bp。質(zhì)粒中主要元件的位置分別是Terminator基因：120bp?713bp ;Amp基因： 869bp ?1729bp ;r印基因：1878bp ?2506bp ;rop 基因：3231bp ?3455bp ;其中多克隆位 點(diǎn)在427bp?468bp處。
[0074] 實(shí)施例5 :質(zhì)粒pTerm-LA、pTerm-LK穩(wěn)定性檢測(cè)
[0075] 分別將實(shí)施例1和3制備的質(zhì)粒pTerm-LA、pTerm-LK轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOPlOFi 感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單克隆菌落在含有相應(yīng)抗生素 （Amp : 100 μ g/μ 1或Kan :50 μ g/μ 1) 的LB培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，之后對(duì)培養(yǎng)的菌液在含有相應(yīng)抗生素 （Amp :100 μ g/μ 1或 Kan :50μ g/μ 1)的平板上劃線培養(yǎng)，對(duì)劃線得到的單克隆重新在含有相應(yīng)抗生素（Amp: 100 μ g/ μ 1或Kan :50 μ g/ μ 1)的平板上再進(jìn)行一次劃線培養(yǎng)，由此得到純的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化克 隆。
[0076] 將得到的純的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化克隆接種到不含有抗生素的LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)20代 (約7h)后，從中取100 μ 1接種至新的不含有抗生素的LB培養(yǎng)基中，37°C繼續(xù)培養(yǎng)20代， 如此重復(fù)6次，最后分別得到40代、60代、80代、100代和120代的細(xì)菌，取上述各代菌 液100 μ 1，稀釋100倍后分別接種至不含有抗生素的LB平板上和含有相應(yīng)抗生素 （Amp : 100 μ g/μ 1 或 Kan :50 μ g/μ 1)的 LB 平板上，37°C培養(yǎng)過(guò)夜。
[0077] 無(wú)抗生素條件下質(zhì)粒的保持率=含有相應(yīng)抗生素 （Amp :100μ g/μ 1或Kan : 50 μ g/ μ 1)的LB平板上的存活菌落數(shù)/不含有抗生素的LB平板上的存活菌落數(shù)。
[0078] 在沒(méi)有選擇壓力的情況下，連續(xù)培養(yǎng)120代，質(zhì)粒pTerm-LA的保持率為99. 9% ; 質(zhì)粒pTerm-LK的保持率為100%。以上結(jié)果表明合成的pTerm-LA、pTerm-LK質(zhì)粒具有較 強(qiáng)的穩(wěn)定性，適用于作為基因工程的克隆載體。
[0079] 實(shí)施例6 :質(zhì)粒pTerm-LA、pTerm-LK拷貝數(shù)檢測(cè)
[0080] 分別轉(zhuǎn)化pTerm-LA、pTerm-LK以及pUC57質(zhì)粒到大腸桿菌T0P10P感受態(tài)細(xì)胞 中，分別挑取四個(gè)單克隆菌落到含有相應(yīng)抗生素 （Amp :100 μ g/μ 1或Kan :50 μ g/μ 1)的 411111^培養(yǎng)基中，371：200印111過(guò)夜培養(yǎng)12小時(shí)，第二天提取質(zhì)粒，最終將質(zhì)粒溶解到5(^1 滅菌TE中，測(cè)質(zhì)粒的濃度得到pUC57的濃度分別是：352ng/l·! l、336ng/l·! l、343ng/l·! 1、 337ng/y 1，pTerm-LA 質(zhì)粒的濃度分別是：30. 8ng/y 1、35· 6ng/y 1、31· lng/μ 1、30· 3ng/ μ 1，pTerm-LK 質(zhì)粒的濃度分別是：33. 5ng/y 1、29· 2ng/y 1、33· 7ng/y 1、33· lng/μ 1，根 據(jù)所測(cè)質(zhì)粒濃度計(jì)算pUC57、pTerm-LA以及pTerm-LK的摩爾濃度。
[0081] 腺嘌呤（A)、鳥嘌呤（G)、胞嘧啶（C)、胸腺嘧啶（T)分子量分別為313. 2、304· 2、 329. 2、289. 2(g/mol)，則：
[0082] pUC57 的分子量=313. 2g/mol X672+304. 2g/mol X691+329. 2g/ mol X 683+289. 2g/molX664 = 837545g/mol ；
[0083] pTerm-LA 的分子量=313. 2g/mol X 845+304. 2g/mol X 924+329. 2g/ mol X 897+289. 2g/molX812 = 1075858g/mol ；
[0084] pTerm-LK 的分子量=313. 2g/mol X 833+304. 2g/mol X 897+329. 2g/ molX855+289. 2g/molX848 = 1060471g/mol ；
[0085] 檢測(cè)得到質(zhì)粒pUC57的平均濃度=342ng/ μ l，pTerm_LA的平均濃度=31. 95ng/ μ 1，pTerm-LK 的平均濃度=32. 375ng/y I ;
[0086] 質(zhì)粒 pUC57 的摩爾濃度=388. 75ng/y l + 837545g/mol = 4. 6415416485E-7mol/ L ；
[0087] 質(zhì)粒 pTerm-LA 的摩爾濃度=31. 95ng/μ I+ 849570g/mol = 3.7607260143E-8mol/L ；
[0088] 質(zhì)粒 pTerm-LK 的摩爾濃度=32. 375ng/μ I+ 834214g/mol = 3.8808986663E-8mol/L〇
[0089] 因此，pUC57為高拷貝質(zhì)粒，每個(gè)細(xì)胞中質(zhì)粒的拷貝數(shù)為500個(gè)?700個(gè)，由 此可以計(jì)算出質(zhì)粒pTerm-LA的拷貝數(shù)=pTerm-LA的摩爾濃度X (500?700) +pUC57 的摩爾濃度=3· 7607260143E-8 X (500 ?700) +4. 6415416485E-7 = 41 ?57 (個(gè)）， pTerm-LK的拷貝數(shù)=pTerm-LK的摩爾濃度X (500?700) +pUC57的摩爾濃度= 3· 8808986663E-8 X (500 ?700) +4. 6415416485E-7 = 42 ?59 (個(gè)）。
[0090] 故每個(gè)細(xì)胞中質(zhì)粒pTerm-LA的拷貝數(shù)為41?57個(gè)，質(zhì)粒pTerm-LK的拷貝數(shù)為 42?59個(gè)，均為低拷貝質(zhì)粒。
[0091] 實(shí)施例7 :利用質(zhì)粒pTerm-LA構(gòu)建膜蛋白基因的克隆重組體
[0092] 膜蛋白是生物膜功能的主要承擔(dān)者，根據(jù)蛋白分離的難易及在膜中分布的位置， 膜蛋白基本可分為三大類：外在膜蛋白或稱外周膜蛋白、內(nèi)在膜蛋白或稱整合膜蛋白和脂 錨定蛋白。膜蛋白包括糖蛋白，載體蛋白和酶等。膜蛋白的功能是多方面的。有些膜蛋白 可作為"載體"而將物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)出細(xì)胞。有些膜蛋白是激素或其他化學(xué)物質(zhì)的專一受體，如 甲狀腺細(xì)胞上有接受來(lái)自腦垂體的促甲狀腺素的受體。膜表面還有各種酶，使專一的化學(xué) 反應(yīng)能在膜上進(jìn)行，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的能催化磷脂合成的酶等。細(xì)胞的識(shí)別功能也決定于膜 表面的蛋白質(zhì)，這些蛋白常常是表面抗原。表面抗原能和特異的抗體結(jié)合，如人細(xì)胞表面有 一種蛋白質(zhì)抗原HLA，是一種變化極多的二聚體，不同的人有不同的HLA分子，器官移植時(shí)， 被植入的器官常常被排斥，這就是因?yàn)橹踩爰?xì)胞的HLA分子不為受體所接受的緣故。
[0093] 本實(shí)施例的具體實(shí)驗(yàn)過(guò)程如下：
[0094] 1.對(duì)目標(biāo)基因序列進(jìn)行分析和優(yōu)化
[0095] 優(yōu)化后的膜蛋白基因序列如序列表中序列6,序列全長(zhǎng)2142堿基對(duì)。首先將序列 5'、3'端分別添加 BamH I、Hind III酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基，然后設(shè)計(jì)并合成寡核苷酸鏈，通 過(guò)PCR拼接的方法得到膜蛋白基因的全序列。為了測(cè)試pTerm-LA載體優(yōu)越性，將膜蛋白基 因序列、PUC57載體、pCA載體以及pTerm-LA載體用BamH I、Hind III限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶 切并割膠回收純化DNA片段，將酶切后的膜蛋白基因片段和載體使用T4DNA連接酶進(jìn)行連 接，酶切和連接反應(yīng)體系如下：
[0096] PCR產(chǎn)物酶切反應(yīng)體系及反應(yīng)條件：膜蛋白基因片段：4 μ l(200ng)，IOXBuffer : 2yl，BamH I :1μ1;Η?η(1ΙΙΙ:1μ1，Η20:12μ1。37°C，30min。
[0097] 載體酶切反應(yīng)體系及反應(yīng)條件：pTerm-LA (pUC57、pCA、）： L 5 μ I (800ng)， 10XBuffer:2yl，BamH I :1μ1;Η?η(1ΠΙ:1μ1，Η20:14·5μ1。37°C，30min。
[0098] 連接反應(yīng)體系及反應(yīng)條件：2XBuffer :10μ 1，DNA片段：2μ l(80ng)， pTerm-LA(pUC57、pCA、）：1 μ I (20ng)，H2O :6 μ 1，T4DNA 連接酶（ThermoScientific，1000U lOOOCEU/μΙ) :lyl;22°C，30min。
[0099] 將連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化TOPlOF ^大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，第二天分別挑選24個(gè)單克 隆進(jìn)行菌檢PCR，結(jié)果顯示使用pTerm-LA載體的菌檢陽(yáng)性率為100%，而使用pUC57、pCA 載體的菌檢陽(yáng)性率均為0。將使用pTerm-LA載體菌檢到的陽(yáng)性克隆搖菌并抽質(zhì)粒然后進(jìn) 行酶切驗(yàn)證，酶切驗(yàn)證圖如圖4所示，其中1為重組質(zhì)粒對(duì)照；2為重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切 酶BamH I、Hind III酶切結(jié)果，條帶大小和理論值（2172bp、3442bp)相符；3為DS5000DNA Marker,此圖說(shuō)明膜蛋白基因已經(jīng)成功克隆進(jìn)pTerm-LA載體，將酶切正確質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn) 證，測(cè)序結(jié)果顯示序列完全正確。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明pTerm-LA載體能夠用于克隆pUC57、pC 系列載體（pCA、pCK、pCC)所不能克隆的基因序列。
[0100] 實(shí)施例8 :利用質(zhì)粒pTerm-LK構(gòu)建人線粒體部分DNA序列
[0101] 人線粒體DNA分子是一個(gè)長(zhǎng)16569bp的雙鏈閉合環(huán)狀超螺旋DNA，包括重鏈和輕 鏈。人線粒體DNA編碼13個(gè)電子傳遞鏈上的亞基，22個(gè)tRNA和2個(gè)rRNA，這些基因呈緊 密排列，基因內(nèi)沒(méi)有內(nèi)含子，但人線粒體DNA內(nèi)有一個(gè)非編碼區(qū)，稱為控制區(qū)，也叫取代環(huán) (D-Ioop)，含有轉(zhuǎn)錄及復(fù)制的調(diào)控信號(hào)。人線粒體DNA上無(wú)核苷酸結(jié)合蛋白，缺少組蛋白的 保護(hù),并且線粒體內(nèi)無(wú) DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)，因此人線粒體DNA易于突變，并且突變?nèi)菀椎玫?保存。線粒體DNA突變會(huì)產(chǎn)生一系列疾病，到目前為止人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了數(shù)以百計(jì)的與疾病 相關(guān)的線粒體點(diǎn)突變，缺失和重排。
[0102] 本實(shí)施例的具體實(shí)驗(yàn)過(guò)程如下：
[0103] 對(duì)DNA序列進(jìn)行分析和優(yōu)化，序列全長(zhǎng)2000bp，其序列結(jié)構(gòu)如序列表中序列7,首 先將DNA序列5'、3'端分別添加 BamH I、Mlu I酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基，然后設(shè)計(jì)并合成寡 核苷酸鏈，通過(guò)PCR拼接的方法得到全長(zhǎng)序列。為了測(cè)試pTerm-LK載體優(yōu)越性，將目的基 因序列、PUC57載體、pCA載體以及pTerm-LK載體用BamH I、Mlu I限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶 切并割膠回收純化DNA片段，將酶切后的目的基因片段和載體使用T4DNA連接酶進(jìn)行連接， 酶切和連接反應(yīng)體系如下：
[0104] PCR產(chǎn)物酶切反應(yīng)體系及反應(yīng)條件：目的基因片段：4 μ l(200ng)，IOXBuffer : 2yl，BamH I :1μ1;Μ1ιι I :1μ1，Η20:12μ1。37°C，30min。
[0105] 載體酶切反應(yīng)體系及反應(yīng)條件糾61"111-1^(?此57、？04):1.5 4 1(800叩）， 10XBuffer:2yl，BamH I :1μ1;Μ1ιι I :1μ1，Η20:14·5μ1。37°C，30min。
[0106] 連接反應(yīng)體系及反應(yīng)條件：2XBuffer :10μ 1，目的基因片段：2μ l(80ng)， pTerm-LK(pUC57、pCA) :1 μ I (20ng)，H2O :6 μ 1，T4DNA 連接酶（Thermo Scientific, 1000U lOOOCEU/μΙ) :lyl;22°C，30min。
[0107] 將連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化TOPlOF ^大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，第二天分別挑選24個(gè)單克 隆進(jìn)行菌檢PCR，結(jié)果顯示使用pTerm-LK載體的菌檢陽(yáng)性率為100%，而使用pUC57、pCA 載體的菌檢陽(yáng)性率均為0。將使用pTerm-LK載體菌檢到的陽(yáng)性克隆搖菌并抽質(zhì)粒然后進(jìn) 行酶切驗(yàn)證，酶切驗(yàn)證圖如圖5所示，其中1為重組質(zhì)粒對(duì)照；2為重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切 酶BamH I、Mlu I酶切結(jié)果，條帶大小和理論值（2006bp、3409bp)相符；3為DS5000DNA Marker，此圖說(shuō)明目的基因已經(jīng)成功克隆進(jìn)pTerm-LK載體，將酶切正確質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn) 證，測(cè)序結(jié)果顯示序列完全正確。
[0108] 將重組質(zhì)粒用BamH I和Mlu I酶切并膠回收基因片段，再將膠回收的基因片段 與高拷貝pTerm-HK(BamH I和Mlu I酶切并膠回收，蘇州金唯智生物科技有限公司構(gòu)建） 載體用T4DNA連接酶進(jìn)行反應(yīng)，并將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化公司所有感受態(tài)細(xì)胞，第二天各挑取24 個(gè)單克隆進(jìn)行菌檢PCR，結(jié)果顯示菌檢陽(yáng)性率為0,推測(cè)可能是該基因在高拷貝質(zhì)粒載體中 不穩(wěn)定，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果從另一個(gè)角度證明pTerm-LK載體能夠用于克隆pUC57、pTerm-HK高拷 貝類型載體、PC系列低拷貝載體（蘇州金唯智生物科技有限公司專利載體）所不能克隆的 基因序列。
[0109] 顯然，上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說(shuō)明所作的舉例，而并非對(duì)實(shí)施方式的限定。對(duì) 于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在上述說(shuō)明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或 變動(dòng)。這里無(wú)需也無(wú)法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉。而由此所引伸出的顯而易見(jiàn)的變化或 變動(dòng)仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之中。
【權(quán)利要求】
1?一種低拷貝pTerm質(zhì)粒，其特征在于，所述質(zhì)粒包括rop基因、rep基因、原核生物轉(zhuǎn) 錄終止子以及抗生素抗性基因；所述原核生物轉(zhuǎn)錄終止子設(shè)置于多克隆位點(diǎn)的兩端；所述 抗生素抗性基因?yàn)锳mp基因或Kan基因。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的低拷貝pTerm質(zhì)粒，其特征在于，所述Amp基因具有如SEQ ID No. 1所示的序列結(jié)構(gòu)，所述Kan基因具有如SEQ ID No. 4所示的序列結(jié)構(gòu)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的低拷貝pTerm質(zhì)粒，其特征在于，所述質(zhì)粒的拷貝數(shù)為 40-60 個(gè)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的低拷貝pTerm質(zhì)粒，其特征在于，所述質(zhì)粒記為pTerm-LA，具 有如SEQ ID No. 8所示的序列結(jié)構(gòu)；所述質(zhì)粒中，自5'端第120bp?713bp為Terminator 基因；869bp ?1729bp 為 Amp 基因；1878bp ?2506bp 為 rep 基因；3231bp ?3455bp 為 rop 基因；其中多克隆位點(diǎn)在427bp?468bp處；或者 所述質(zhì)粒記為pTerm-LK，具有如SEQ ID No. 9所示的序列結(jié)構(gòu)；所述質(zhì)粒中，自5'端 第 120bp ?713bp 為 Terminator 基因；869bp ?1684bp 為 Kan 基因；1833bp ?2461bp 為 rep基因；3186bp?3410bp為rop基因；其中多克隆位點(diǎn)在427bp?468bp處。
5. -種根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的低拷貝pTerm質(zhì)粒的方法，其特征在于，包括以下 步驟： 步驟一：人工設(shè)計(jì)并合成所述的rep基因、rop基因、原核生物轉(zhuǎn)錄終止子以及抗生素 抗性基因片段； 步驟二：運(yùn)用多段重組法將所述的rep基因、rop基因、原核生物轉(zhuǎn)錄終止子以及抗生 素抗性基因片段連接環(huán)化，最終得到環(huán)形的質(zhì)粒。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的低拷貝pTerm質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于，所述的多段重組 法為Gibson重組方法,反應(yīng)體系及條件：按1:1:1:1的摩爾比取所述rep基因、rop基因、原 核生物轉(zhuǎn)錄終止子以及抗生素抗性基因片段，加入滅菌去離子水，再加入Gibson Assembly Master Mix試劑，50°C下反應(yīng)至得到環(huán)形質(zhì)粒。
7. -種構(gòu)建權(quán)利要求1-4任一所述的低拷貝pTerm系列質(zhì)粒的方法，其特征在于，包括 以下步驟： 步驟一：人工合成所述抗生素抗性Amp基因或Kan基因片段； 步驟二：按照權(quán)利要求5或6所述方法構(gòu)建得到含所述抗生素抗性Amp基因或Kan基因 的pTerm質(zhì)粒，分別以所述含抗生素抗性Amp基因或Kan基因的質(zhì)粒為模板，F(xiàn)-pTerm-LA/ LK、R-pTerm-LA/LK為引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到rop-r印-原核生物轉(zhuǎn)錄終止子基因片段； 步驟三：運(yùn)用Gibson重組方法，將構(gòu)建的所述r印-rop-原核生物轉(zhuǎn)錄終止子基因片段 分別與所述抗生素抗性Kan基因或Amp基因片段進(jìn)行組裝。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的低拷貝pTerm質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟二中， 所述引物包括： F-pTerm-LA/LK ：5, -ctgtcagaccaagtttactcatatatactttag-3,； R-pTerm-LA/LK :5' -actcttcctttttcaatattattgaagcatttatc_3,〇
9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的低拷貝pTerm質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于，所述的 Gibson重組方法反應(yīng)體系及條件：按1:1的摩爾比取所述rep-rop-原核生物轉(zhuǎn)錄終止子 基因片段與所述第二抗生素抗性基因片段，加入滅菌去離子水，再加入Gibson Assembly Master Mix試劑，5(TC下反應(yīng)至得到環(huán)形質(zhì)粒。
10.權(quán)利要求1-4任一所述低拷貝pTenn質(zhì)粒在基因克隆、篩選和測(cè)序領(lǐng)域中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/65GK104404069SQ201410670147
【公開(kāi)日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年11月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月20日
【發(fā)明者】薛高旭, 馮愛(ài)華, 孫中平, 廖國(guó)娟 申請(qǐng)人:蘇州金唯智生物科技有限公司