專利名稱：Rna循環(huán)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物工程技術(shù)領(lǐng)域，是一種逆轉(zhuǎn)錄(Reverse Transcription,RT)反應(yīng)方法，可由一份RNA(Ribonucleic Acid，核糖核酸)模板循環(huán)逆轉(zhuǎn)錄得到多倍份的cDNA(Complementary Deoxyribonucleic Acid，互補(bǔ)DNA)的反應(yīng)方法。
現(xiàn)行的RT方法，只能得到與RNA模板相同拷貝數(shù)的cDNA產(chǎn)物。要有效分離低豐度mRNA的cDNA克隆，必須先采取一些非常復(fù)雜的方法進(jìn)行富集。由于樣品來源往往稀少而珍貴，富集工作不僅繁瑣，而且很不經(jīng)濟(jì)。另一方面，常規(guī)RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng))擴(kuò)增有時(shí)也難以對(duì)這樣微量的RNA樣品進(jìn)行檢測(cè)。雖然采用NP-PCR的方法(Nested Primers-PCR，巢式PCR)，能夠進(jìn)一步提高檢測(cè)的靈敏度。然而，其缺點(diǎn)也是很明顯的首先從技術(shù)基礎(chǔ)上看，由于需要使用了4-5個(gè)特異引物(包括逆轉(zhuǎn)錄引物和外內(nèi)引物對(duì))，不僅增加了引物設(shè)計(jì)上的難度，而且不能應(yīng)用于包含隨機(jī)引物的PCR擴(kuò)增如差異展示PCR(Difference Display PCR,DD-PCR)；再者，由于PCR擴(kuò)增量呈指數(shù)增加，連續(xù)2重PCR擴(kuò)增使得對(duì)RNA進(jìn)行定量分析很困難；第三，操作需要進(jìn)行1-2次轉(zhuǎn)移，繁瑣易導(dǎo)致發(fā)生污染；最后，成本較高，接近普通RT-PCR的2倍。
本發(fā)明的目的在于提供一種操作簡便，且能大量提高cDNA產(chǎn)物量的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)方法。本發(fā)明是由一份RNA模板循環(huán)逆轉(zhuǎn)錄得到多倍份的cDNA的反應(yīng)方法，具體是將反應(yīng)體系置于熱循環(huán)儀上進(jìn)行如下步驟的循環(huán)反應(yīng)1．變性，即對(duì)待擴(kuò)增的RNA模板加熱變性，溫度條件89～95℃，保溫定時(shí)間(5～120秒)；2．復(fù)性，即RT引物(用于RT過程中，與RNA鏈結(jié)合并能引導(dǎo)cDNA合成的DNA寡核苷酸)與RNA鏈上的互補(bǔ)序列結(jié)合復(fù)性，溫度條件55～68℃，保溫一定時(shí)間(5～90秒)3．延伸，即逆轉(zhuǎn)錄酶催化RT引物延伸合成cDNA，形成RNA-DNA雜合雙鏈，溫度條件60～70℃，保溫一定時(shí)間(60～180秒)；雜合雙鏈變性解鏈后，RT引物再結(jié)合到RNA鏈上，由逆轉(zhuǎn)錄酶第二次催化引物延伸合成cDNA，如此，利用RNA模板，可以反復(fù)進(jìn)行cDNA合成，因而，稱之為循環(huán)逆轉(zhuǎn)錄(Cycle Reverse Transcription,CRT)。每一次變性-復(fù)性-延伸的過程，就是一次循環(huán)逆轉(zhuǎn)錄的循環(huán)。由于逆轉(zhuǎn)錄是單個(gè)逆轉(zhuǎn)錄引物的單向延伸過程，循環(huán)逆轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致的cDNA的量增加呈線性增長。因此，循環(huán)逆轉(zhuǎn)錄過程可以很方便地用于對(duì)RNA的定量PCR分析。為了方便操作，循環(huán)逆轉(zhuǎn)錄使用(但不限定)在高溫下具有逆轉(zhuǎn)錄催化活性的DNA聚合酶，如FD酶、Tth酶等，并且根據(jù)需要，可以偶聯(lián)PCR反應(yīng)。
本發(fā)明提出的CRT反應(yīng)體系(20μl)如下Tris-HCl pH7.9-9.1,10-50 mmol/L；(NH4)2SO45.0-25mmol/L；MnCl21.0-5.0mmol/L；dNTP 0.2-2.0mmol/L；DTT 0.5-5.0mmol/L；明膠0.05-0.5mg/ml；RT引物0.5-2.0μmol/L；FD酶(或Tth酶)0.5-3U；RNA模板。
上述體系混勻后，以液蠟封住液面，在熱循環(huán)儀上設(shè)置上述溫度程序，進(jìn)行CRT反應(yīng)。如需繼續(xù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，則只需再向該體系中加入終濃度為0.2-2.0μmol/L的一對(duì)PCR引物，繼續(xù)在熱循環(huán)儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。結(jié)果檢測(cè)同一般的PCR結(jié)果檢測(cè)方法。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)CRT包含變性過程，可以破壞RNA的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，有利于RT的進(jìn)行。CRT反復(fù)利用RNA模板合成cDNA，提高了RT對(duì)RNA模板的利用效率，在不增加成本花費(fèi)的情況下，使得cDNA產(chǎn)物量增加幾十倍。這樣，有利于對(duì)低豐度RNA的檢測(cè)和分析，有利于研究低表達(dá)的基因和發(fā)現(xiàn)新基因。
CRT可以如同普通RT一樣直接偶聯(lián)PCR，能夠有效地提高RT-PCR對(duì)RNA檢測(cè)的靈敏度。與提高RT-PCR靈敏度的常用方法NP-PCR比較，更具有以下優(yōu)點(diǎn)1．技術(shù)設(shè)計(jì)簡單易行。NP-PCR由于需要使用多重特異引物，技術(shù)設(shè)計(jì)要求高；而CRT-PCR不需要多重特異引物，技術(shù)設(shè)計(jì)要求比較簡單。
2．應(yīng)用范圍廣。CRT-PCR可以應(yīng)用在一切RT-PCR領(lǐng)域，包括象DD-PCR這樣包含隨機(jī)引物擴(kuò)增的RT-PCR，而NP-PCR不能。
3．便于定量PCR分析。循環(huán)逆轉(zhuǎn)錄是線性增加過程，通過控制循環(huán)數(shù)即可得到模板濃度梯度，便于應(yīng)用定量PCR分析RNA。而NP-PCR連續(xù)2重PCR擴(kuò)增使得對(duì)RNA進(jìn)行定量分析很困難；4．操作簡便，結(jié)果可靠。CRT-PCR整個(gè)反應(yīng)可以在一管中完成，無須進(jìn)行轉(zhuǎn)移，減少了污染發(fā)生的機(jī)會(huì)，結(jié)果可靠。而NP-PCR操作需要進(jìn)行1-2次轉(zhuǎn)移，易導(dǎo)致發(fā)生污染而造成假陽性。
5．成本低。CRT-PCR的成本與普通RT-PCR幾乎完全相同，只有NP-PCR的成本的一半。
CRT可以在幾乎所有的RT應(yīng)用領(lǐng)域替代普通RT。如克隆cDNA文庫，RT-PCR等。


圖1為CRT基本原理示意圖實(shí)施例HCV(Hepatitis C Virus，丙型肝炎病毒)RNA的檢測(cè)采用一步法制備HCV RNA(具體方法略)。
20μl反應(yīng)體系中含有Tris-HCl pH8.3,25mmol/L；(NH4)2SO415mmol/L；MnCl22.0mmol/L；dNTP 0.5mmol/L；DTT 1mmol/L；明膠0.1mg/ml；逆轉(zhuǎn)錄引物1.25μmol/L；FD酶2U；以及未定量的HCV RNA?；靹蚝?，以液蠟封住液面，在熱循環(huán)儀上設(shè)置反應(yīng)程序92℃ 30s,65℃ 30s,65℃90s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)反應(yīng)；然后，向該體系中加入一對(duì)PCR引物(終濃度為0.5μmol/L)，繼續(xù)在熱循環(huán)儀上進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的PCR，反應(yīng)程序是94℃30s,55℃40s,72℃60s，結(jié)果檢測(cè)采用凝膠電泳EB染色法，在紫外燈下成功地觀察到257bp特異擴(kuò)增帶。同時(shí)采用普通的RT-PCR以及NP-PCR對(duì)照，CRT-PCR的陽性率(88％)與NP-PCR(91％)相當(dāng)，明顯高于普通的RT-PCR(72％)(PCR陽性率=PCR陽性/ELISA陽性)。
α-珠蛋白基因mRNA的定量分析從外周血制備總RNA(具體方法略)。
設(shè)置10個(gè)反應(yīng)管，每管均為20μl反應(yīng)體系，同樣含有Tris-HCl pH8.3,30mmol/L；(NH4)2SO415mmol/L；MnCl22.0mmol/L；dNTP 0.5mmol/L；DTT 1mmol/L；明膠0.1mg/ml；逆轉(zhuǎn)錄引物1.0μmol/L；FD酶2U；以及RNA模板1μl。混勻后，以液蠟封住液面，在熱循環(huán)儀上設(shè)置反應(yīng)程序94℃ 30s,55℃40s,68℃ 120s，分別進(jìn)行4,8,12,16,20,24,28,32,36,40個(gè)循環(huán)反應(yīng)；然后，向體系中加入預(yù)先混好的PCR補(bǔ)充試劑(含一對(duì)PCR引物，終濃度為0.5μmol/L；內(nèi)參照DNA模板0.01pg，約420個(gè)分子)，繼續(xù)在熱循環(huán)儀上進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的PCR，反應(yīng)程序是94℃30s,55℃40s,72℃60s，結(jié)果檢測(cè)和分析在凝膠掃描成相分析系統(tǒng)下進(jìn)行。結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過24個(gè)循環(huán)逆轉(zhuǎn)錄的cDNA擴(kuò)增量與內(nèi)參照DNA擴(kuò)增量相當(dāng)。因此，樣品中α-珠蛋白基因mRNA的含量約為17分子/μl。
權(quán)利要求
1．由一份RNA模板循環(huán)逆轉(zhuǎn)錄得到多倍份的cDNA的反應(yīng)方法，其特征在于，反應(yīng)體系在熱循環(huán)儀上進(jìn)行熱變性-復(fù)性-延伸等3個(gè)步驟的循環(huán)反應(yīng)過程，每個(gè)循環(huán)過程控制每步驟的溫度和時(shí)間參數(shù)為變性，溫度條件89～95℃，保溫時(shí)間5～120秒；復(fù)性，溫度條件55～68℃，保溫時(shí)間5～90秒；延伸，溫度條件60～70℃，保溫時(shí)間60～180秒。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的逆轉(zhuǎn)錄方法，其特征在于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系(20μl)為Tris-HCl pH7.9-9.1,15-50mmol/L；(NH4)2SO45-25mmol/L；MnCl21.0-5.0mmol/L；dNTP 0.5mmol/L；DTT 1mmol/L；明膠0.1mg/ml；RT引物1.25μmol/L；FD酶(或Tth酶)0.5-3U；RNA模板。
全文摘要
本發(fā)明屬生物工程技術(shù)領(lǐng)域,是一種循環(huán)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)方法。其過程為對(duì)待擴(kuò)增的RNA模板加熱變性后,將RT引物結(jié)合到RNA鏈上,由逆轉(zhuǎn)錄催化酶催化RT引物延伸合成cDNA,形成RNA－DNA雜合雙鏈,重復(fù)變性－復(fù)性－延伸,循環(huán)反應(yīng)幾十次,隨后根據(jù)需要可偶聯(lián)PCR擴(kuò)增或直接用于cDNA文庫克隆。本發(fā)明可有效提高RNA分析和檢測(cè)靈敏度,技術(shù)設(shè)計(jì)簡單易行,操作簡便,成本低。本發(fā)明可應(yīng)用在一切RT應(yīng)用領(lǐng)域。特別適應(yīng)于RNA相關(guān)的臨床檢測(cè)和分析。
文檔編號(hào)C12N15/10GK1216779SQ9812193
公開日1999年5月19日 申請(qǐng)日期1998年9月30日 優(yōu)先權(quán)日1998年9月30日
發(fā)明者毛裕民, 陳燃, 唐榕 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)