本發(fā)明屬于有機(jī)化合物合成技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種藥物化合物mPEG₃-替諾福韋酯及其合成工藝，具體地，涉及一種mPEG₃-替諾福韋酯的制備方法。

背景技術(shù)：

富馬酸替諾福韋酯(Tenofovir Disoproxil Fumarate，TDF)，化學(xué)名為(R)-[[2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-1-甲基乙氧基]甲基]膦酸二異丙氧羰氧基甲酯富馬酸鹽，是美國Gilead Sciences公司研發(fā)的一種新型核苷酸類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，主要通過抑制HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶的活性而抑制HIV病毒的復(fù)制。該制劑2001年首次在美國上市，目前已在加拿大、歐洲等多個(gè)國家和地區(qū)上市，其作為治療HIV的一線藥物，具有很好的應(yīng)用前景。

替諾福韋的活性成分替諾福韋雙磷酸鹽可通過直接競爭性地與天然脫氧核糖底物相結(jié)合而抑制病毒聚合酶，及通過插入DNA中終止鏈。替諾福韋幾乎不經(jīng)胃腸道吸收，因此進(jìn)行酯化、成鹽，成為替諾福韋酯富馬酸鹽。替諾福韋酯具有水溶性，可被迅速吸收并降解成活性物質(zhì)替諾福韋，替諾福韋然后被轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚源x產(chǎn)物替諾福韋雙磷酸鹽。

富馬酸替諾福韋酯現(xiàn)有生產(chǎn)工藝是從替諾福韋一水合物或者無水物作為起始原料與氯甲基碳酸異丙酯經(jīng)酯化反應(yīng)后合成替諾福韋酯，然后與富馬酸成鹽得富馬酸替諾福韋酯，但現(xiàn)有合成技術(shù)中反應(yīng)轉(zhuǎn)化率偏低，其主要原因是由于替諾福韋在酯化時(shí)先進(jìn)行單酯化，然后繼續(xù)反應(yīng)成雙酯，但是單酯化后因?yàn)槲蛔柙龃螅磻?yīng)活性降低，雙酯化難度加大，導(dǎo)致反應(yīng)中一直有單酯存在而影響反應(yīng)收率。且因?yàn)閱稳〈a(chǎn)物大量存在，反應(yīng)后處理也比較困難，產(chǎn)品質(zhì)量較難保證。雖然通過增加原料投料量來促進(jìn)反應(yīng)的正向進(jìn)行，但是這會(huì)大大提高生產(chǎn)成本，并且當(dāng)原料增加到一定量時(shí)，反應(yīng)正向進(jìn)行會(huì)達(dá)到一個(gè)平衡，不在繼續(xù)轉(zhuǎn)化。此外，現(xiàn)有合成技術(shù)中酯化反應(yīng)均使用高沸點(diǎn)的溶劑，而替諾福韋酯在高溫下不穩(wěn)定，無法直接回收，所以后處理時(shí)一般都采用大量的冰水進(jìn)行鹽析或者大量的水洗滌，導(dǎo)致大量溶劑進(jìn)入污水處理系統(tǒng)，不僅增加了環(huán)保的壓力，而且由于溶劑無法回收利用造成產(chǎn)品成本太高。

此外，目前已知的富馬酸替諾福韋酯可能引起的不良反應(yīng)有：(1)全身無力；(2)胃腸道反應(yīng)：輕至中度的胃腸道不適，常見的有腹瀉、腹痛、食欲減退、惡心、嘔吐和胃腸脹氣、胰腺炎；(3)代謝系統(tǒng)：低磷酸鹽血癥(1％發(fā)生率)；脂肪蓄積和重新分布，包括向心性肥胖、水牛背、末梢消瘦、乳房增大、庫興綜合征；(4)可能引起乳酸中毒、與脂肪變性相關(guān)的肝腫大等；(5)神經(jīng)系統(tǒng)：頭暈、頭痛；(6)呼吸系統(tǒng)：呼吸困難；(7)皮膚：藥疹。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本申請發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，采用三甘醇單甲醚對甲苯磺酸酯修飾后的替諾福韋酯，與現(xiàn)有技術(shù)及對照品四甘醇單甲醚對甲苯磺酸酯修飾后的替諾福韋酯相比，對PBMC細(xì)胞具有減輕的毒性，對HIV-1_TC-1感染的PBMC有很好的抑制HIV-1_TC-1在PBMC中復(fù)制的作用。有鑒于此，本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種安全、質(zhì)量好的mPEG₃-替諾福韋酯產(chǎn)品。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：

mPEG₃-替諾福韋酯，其結(jié)構(gòu)式如式I所示；

本發(fā)明還提供了一種mPEG₃-替諾福韋酯的制備方法，其制備方法成本低、工藝安全、適合工業(yè)化生產(chǎn)。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：

mPEG₃-替諾福韋酯的制備方法，包括如下進(jìn)行的步驟：

(1)以(R)-9-(2-羥丙基)腺嘌呤為原料，在碳酸鹽的作用下，與三甘醇單甲醚對甲苯磺酸酯反應(yīng)得式II所示的mPEG₃-(R)-9-(2-羥丙基)腺嘌呤；

(2)步驟(1)所得式II化合物與對甲苯磺酰氧甲基磷酸二乙酯在堿的作用下反應(yīng)制得式III所示的mPEG₃-替諾福韋二乙酯；

(3)步驟(2)所得式III化合物在水解試劑作用下經(jīng)水解反應(yīng)制得式IV所示的mPEG₃-替諾福韋；

(4)步驟(3)所得式IV化合物與氯甲基碳酸異丙酯在堿作用下經(jīng)縮合制得式I所示的mPEG₃-替諾福韋酯；

進(jìn)一步，所述的mPEG₃-替諾福韋酯的制備方法，步驟(1)中，所述碳酸鹽為堿金屬碳酸鹽；所用溶劑為N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、二甲亞砜、乙腈和N-甲基吡咯烷酮中的一種或多種。

優(yōu)選的，所述碳酸鹽為碳酸鉀；所用溶劑為N，N-二甲基甲酰胺。

進(jìn)一步，所述的mPEG₃-替諾福韋酯的制備方法，步驟(1)中，(R)-9-(2-羥丙基)腺嘌呤與三甘醇單甲醚對甲苯磺酸酯的摩爾比為1∶1.5-2。

進(jìn)一步，所述的mPEG₃-替諾福韋酯的制備方法，步驟(1)中，所述(R)-9-(2-羥丙基)腺嘌呤與碳酸鹽的摩爾比為1∶2-3。

進(jìn)一步，所述的mPEG₃-替諾福韋酯的制備方法，步驟(1)中，反應(yīng)溫度為90-110℃。

優(yōu)選的，所述反應(yīng)溫度為100℃。

進(jìn)一步，所述的mPEG₃-替諾福韋酯的制備方法，步驟(2)中，所述堿為叔丁氧基鈉、叔丁氧基鉀和叔丁氧基鎂中的一種或多種。

進(jìn)一步，所述的mPEG₃-替諾福韋酯的制備方法，步驟(2)中，先將mPEG3-(R)-9-(2-羥丙基)腺嘌呤溶于溶劑中，所用溶劑為N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、二甲亞砜、乙腈和N-甲基吡咯烷酮中的一種或多種。

優(yōu)選的，所用溶劑為N，N-二甲基甲酰胺。

進(jìn)一步，所述的mPEG₃-替諾福韋酯的制備方法，步驟(2)中，所述mPEG₃-(R)-9-(2-羥丙基)腺嘌呤與對甲苯磺酰氧甲基磷酸二乙酯的摩爾比為1∶1-2。

進(jìn)一步，所述的mPEG₃-替諾福韋酯的制備方法，步驟(2)中，所述mPEG₃-(R)-9-(2-羥丙基)腺嘌呤與堿的摩爾比為1∶8-10。

進(jìn)一步，所述的mPEG₃-替諾福韋酯的制備方法，步驟(2)中，反應(yīng)溫度為30-40℃。

優(yōu)選的，所述反應(yīng)溫度為35℃。

進(jìn)一步，所述的mPEG₃-替諾福韋酯的制備方法，步驟(3)中，所述水解試劑為三甲基溴硅烷和/或三甲基氯硅烷；所用溶劑為N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、二甲亞砜、乙腈和N-甲基吡咯烷酮中的一種或多種。

優(yōu)選的，所述水解試劑為三甲基溴硅烷。

優(yōu)選的，所用溶劑為乙腈。

進(jìn)一步，所述的mPEG₃-替諾福韋酯的制備方法，步驟(3)中，水解在室溫條件下進(jìn)行，水解時(shí)間為20-40小時(shí)。

優(yōu)選的，水解時(shí)間為24小時(shí)。

進(jìn)一步，所述的mPEG₃-替諾福韋酯的制備方法，步驟(4)中，所述堿為吡啶、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、N，N-二異丙基乙胺(DIPEA)、2，6-二甲基吡啶、碳酸鈉、碳酸鉀、三乙胺和二乙胺中的一種或多種；所用溶劑為乙醇、乙腈、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、二甲亞砜和N-甲基吡咯烷酮中的一種或多種。

優(yōu)選的，所述堿為三乙胺。

優(yōu)選的，所用溶劑為無水乙醇與N-甲基吡咯烷酮混合物。

進(jìn)一步，所述的mPEG₃-替諾福韋酯的制備方法，步驟(4)中，所述mPEG₃-替諾福韋與氯甲基碳酸異丙酯的摩爾比為1∶5-8。

進(jìn)一步，所述的mPEG₃-替諾福韋酯的制備方法，步驟(4)中，所述mPEG₃-替諾福韋與堿的摩爾比為1∶5-8。

進(jìn)一步，所述的mPEG₃-替諾福韋酯的制備方法，步驟(4)中，反應(yīng)溫度為45-60℃。

優(yōu)選的，反應(yīng)溫度為55℃。

本發(fā)明還提供了mPEG₃-替諾福韋酯的應(yīng)用。所述的mPEG₃-替諾福韋酯在制備治療HIV、HBV藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明提供的mPEG₃-替諾福韋酯，彌補(bǔ)了現(xiàn)有技術(shù)的空缺，與現(xiàn)有技術(shù)相比，對PBMC細(xì)胞具有減輕的毒性，對HIV-1_TC-1感染的PBMC有很好的抑制HIV-1_TC-1在PBMC中復(fù)制的作用，具有安全、質(zhì)量好的優(yōu)點(diǎn)，具有良好的應(yīng)用開發(fā)前景。該化合物的開發(fā)，將為艾滋病患者、乙肝患者帶來福音。

本發(fā)明提供的mPEG₃-替諾福韋酯的制備方法，方法簡潔，原料來源廣，反應(yīng)條件溫和，生產(chǎn)成本低，并且反應(yīng)整體收率高，產(chǎn)品質(zhì)量也相對穩(wěn)定。此外，用乙醇與N-甲基吡咯烷酮做混合溶劑進(jìn)行酯化反應(yīng)，使用低沸點(diǎn)的乙醇作為主要溶劑，可以在溫度較低的條件下將溶劑回收利用，在不影響產(chǎn)品質(zhì)量的前提下解決因溶劑損失導(dǎo)致的成本偏高問題，也減輕了環(huán)保的壓力。

附圖說明

圖1為本發(fā)明所述mPEG₃-替諾福韋酯的制備方法的合成路線圖。

具體實(shí)施方式

所舉實(shí)施例是為了更好地對本發(fā)明的內(nèi)容進(jìn)行說明，但并不是本發(fā)明的內(nèi)容僅限于所舉實(shí)施例。所以熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)上述發(fā)明內(nèi)容對實(shí)施方案進(jìn)行非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整，還包括各具體實(shí)施方式間的任意組合，仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

三甘醇單甲醚對甲苯磺酸酯、四甘醇單甲醚對甲苯磺酸酯購自北京鍵凱科技有限公司；(R)-9-(2-羥丙基)腺嘌呤購自武漢遠(yuǎn)成賽創(chuàng)科技有限公司；對甲苯磺酰氧甲基磷酸二乙酯購自天津威賽諾科技發(fā)展有限公司；其余均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司

實(shí)施例1 式II所示的mPEG₃-(R)-9-(2-羥丙基)腺嘌呤的制備

將(R)-9-(2-羥丙基)腺嘌呤(Ia，22.8g，117mmol)、三甘醇單甲醚對甲苯磺酸酯(Ib，67.2g，211mmol)和K₂CO₃(32.4g，234mmol)溶于DMF(900mL)中，加熱升溫至100℃保溫反應(yīng)7h。反應(yīng)完畢后，冷卻至室溫，加入蒸餾水(1200mL)，攪拌混合均勻。用乙酸乙酯(720mL×4)提取，混合有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥，過濾、濃縮，殘留物用硅膠柱分離得油狀固體產(chǎn)品19.6g，收率49.4％，HPLC純度98.0％。

實(shí)施例2 式III所示的mPEG₃-替諾福韋二乙酯的制備

將mPEG₃-(R)-9-(2-羥丙基)腺嘌呤(式II，25.4g，74.8mmol)溶于DMF(150mL)中，緩慢加入叔丁氧基鋰(53.9g，673mmol)的2.0M四氫呋喃溶液，然后再緩慢加入對甲苯磺酰氧甲基磷酸二乙酯(Ic，44.8g，89.8mmol)，升溫至35℃攪拌反應(yīng)8h。反應(yīng)完畢后，冷卻至20℃后，加入冰醋酸(6.0mL)，減壓蒸餾除去揮發(fā)物，加入蒸餾水(200mL)。用CH₂Cl₂分次提取，合并提取液，用無水硫酸鈉干燥。過濾、濃縮得油狀固體產(chǎn)品12.8g，收率34.9％，HPLC純度95.8％。

實(shí)施例3 式IV所示的mPEG₃-替諾福韋的制備

將mPEG₃-替諾福韋二乙酯(式III，19.2g，28.8mmol)溶于乙腈(250mL)和三甲基溴硅烷(25mL)中，隔絕空氣室溫?cái)嚢柽^夜。減壓蒸餾除去揮發(fā)物，加入蒸餾水(500mL)，用CH₂Cl₂洗滌。水相用NaOH水溶液調(diào)節(jié)pH至3.2，冷卻攪拌6h。過濾收集固體，依次用冰水和丙酮洗滌，真空干燥得固體6.7g，收率53.7％，HPLC純度98.0％。

實(shí)施例4 式I所示的mPEG₃-替諾福韋酯的制備

在1L反應(yīng)瓶中加入無水乙醇(80mL)、N-甲基吡咯烷酮(8mL)和mPEG₃-替諾福韋(式IV，11.4g，26.2mmol)，開啟攪拌，控制溫度在20℃下滴加三乙胺(13.4g，132mmol)，滴完后繼續(xù)滴加氯甲基碳酸異丙酯(Id，20g，132mmol)，滴完后將反應(yīng)體系升溫至55℃保溫反應(yīng)6h，將反應(yīng)液在40℃以下減壓濃縮至干，向濃縮殘液中加入乙酸乙酯(100mL)和6％的碳酸氫鈉溶液(50mL)，攪拌混勻后分層萃取，有機(jī)相用蒸餾水(50mL)洗滌兩次后，用無水硫酸鈉干燥。過濾、濃縮得油狀固體產(chǎn)品14.9g，收率85.4％，HPLC純度98.5％。ESI-MS：666[M+H]⁺。

對比例1：mPEG₄-替諾福韋酯的制備

將(R)-9-(2-羥丙基)腺嘌呤(Ia，22.8g，117mmol)、四甘醇單甲醚對甲苯磺酸酯(215mmol)和K₂CO₃(32.4g，234mmol)溶于DMF(900mL)中，加熱升溫至100℃保溫反應(yīng)7h。反應(yīng)完畢后，冷卻至室溫，加入蒸餾水(1200mL)，攪拌混合均勻。用乙酸乙酯(720mL×4)提取，混合有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥，過濾、濃縮，殘留物用硅膠柱分離得油狀固體產(chǎn)品18.6g。將上述固體產(chǎn)品溶于DMF(150mL)中，緩慢加入叔丁氧基鋰(667mmol)的2.0M四氫呋喃溶液，然后再緩慢加入對甲苯磺酰氧甲基磷酸二乙酯(89.8mmol)，升溫至35℃攪拌反應(yīng)8h。反應(yīng)完畢后，冷卻至20℃后，加入冰醋酸(6.0mL)，減壓蒸餾除去揮發(fā)物，加入蒸餾水(200mL)。用CH₂Cl₂分次提取，合并提取液，用無水硫酸鈉干燥。過濾、濃縮得油狀固體產(chǎn)品11.8g。將上述油狀固體產(chǎn)品溶于乙腈(250mL)和三甲基溴硅烷(25mL)中，隔絕空氣室溫?cái)嚢柽^夜。減壓蒸餾除去揮發(fā)物，加入蒸餾水(500mL)，用CH₂Cl₂洗滌。水相用NaOH水溶液調(diào)節(jié)pH至3.2，冷卻攪拌6h。過濾收集固體，依次用冰水和丙酮洗滌，真空干燥得固體6.3g。在1L反應(yīng)瓶中加入無水乙醇(40mL)、N-甲基吡咯烷酮(4mL)和mPEG₄-替諾福韋(12.2mmol)，開啟攪拌，控制溫度在20℃下滴加三乙胺(66mmol)，滴完后繼續(xù)滴加氯甲基碳酸異丙酯(66mmol)，滴完后將反應(yīng)體系升溫至55℃保溫反應(yīng)6h，將反應(yīng)液在40℃以下減壓濃縮至干，向濃縮殘液中加入乙酸乙酯(100mL)和6％的碳酸氫鈉溶液(50mL)，攪拌混勻后分層萃取，有機(jī)相用蒸餾水(50mL)洗滌兩次后，用無水硫酸鈉干燥。過濾、濃縮得油狀固體產(chǎn)品5.8g。ESI-MS：710[M+H]⁺。

實(shí)施例5 mPEG₃-替諾福韋酯在細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)的抗HIV-1活性

本實(shí)施例所需主要試劑與主要儀器：

主要試劑：

RPMI-1640、胎牛血清為Invitrogen、硫酸鏈霉素(Streptomycin sulfate)、氨芐青霉素、硫酸卡那霉素、HEPES(N-2，2-Hydroxyothyl piperazine-N’-2-ethanesufonic acid)、MTT(3，(4，5-dimethylthiazol-2-yl，噻唑藍(lán))-2，5-diphenyl tetrazolium bromide)、DMF(N，N’-Dimethyl formamine，N，N-二甲基甲酰胺)、Triton X-100、青霉素(Penicillin)、谷氨酰胺(Glutamine)、碳酸氫鈉、碳酸鈉、氯化鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、二甲基亞砜(DMSO)。

主要儀器：

酶標(biāo)儀(Biotek ELX800)、離心機(jī)(Thermo IEC CL40)、二級(jí)生物安全柜(Thermo Forma Class II，A2)、CO₂培養(yǎng)箱(Thermo)、加樣槍(Thermo Finnpipeette F2)。

(1)待試藥物：本發(fā)明的mPEG₃-替諾福韋酯(命名為：化合物GQ-80604)，生產(chǎn)批號(hào)：080604，水不溶，DMSO可溶解，試驗(yàn)時(shí)用DMSO溶解配成適當(dāng)濃度后用培養(yǎng)基稀釋，立即加入細(xì)胞培養(yǎng)。

對照藥物A：mPEG₄-替諾福韋酯。

(2)陽性對照藥：齊多夫定(AZT)，購自東北制藥集團(tuán)市售藥品，片劑，規(guī)格0.1g，避光、密閉、干燥處保存。

(3)病毒

HIV-1臨床分離株選用HIV-1_TC-1，由天津第二人民醫(yī)院惠贈(zèng)。按常規(guī)方法培養(yǎng)制備HIV-1病毒。HIV-1感染性滴定按常規(guī)方法進(jìn)行。病毒小量分裝于凍存管，-80℃保存。

(4)細(xì)胞

人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)自健康人血液濃縮白細(xì)胞中分離，由天津第二人民醫(yī)院惠贈(zèng)。細(xì)胞培養(yǎng)基：RPMI-1640完全培養(yǎng)基，含有10％胎牛血清，2mM L-谷氨酰胺，10mM HEPES，50μM 2-巰基乙醇，100IU/ml青霉素，100μg/ml 鏈霉素。

細(xì)胞按常規(guī)方法進(jìn)行復(fù)蘇，傳代：從液氮中復(fù)蘇細(xì)胞，用RPMI-164培養(yǎng)基洗去凍存液，加入含10％FCS的完全培養(yǎng)基10ml，混勻，37℃ 5％CO₂培養(yǎng)。每隔3天對細(xì)胞傳一次代。實(shí)驗(yàn)前1天傳一次代，使所用細(xì)胞處于對數(shù)生長期。

(5)GQ-80604對PBMC的毒性試驗(yàn)

在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，100μl PHA-P刺激轉(zhuǎn)化的PBMC(5×105個(gè)細(xì)胞)與100μl不同稀釋度濃度的待測藥物溶液混合，每個(gè)稀釋度3個(gè)重復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置不含藥物的對照孔。37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)。第4天每孔補(bǔ)充100μl含有IL-2(終濃度50U/ml)的新鮮完全細(xì)胞培養(yǎng)基，第7天采用MTT比色法檢測細(xì)胞毒性。ELx800酶標(biāo)儀測定OD值，測定波長為570nm參考波長為630nm。計(jì)算得到CC₅₀值(50％Cytotoxic concentration)，即對50％的PBMC產(chǎn)生毒性時(shí)的藥物濃度。

在人體內(nèi)，HIV感染宿主細(xì)胞主要是CD4⁺T淋巴細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞。從外周血分離獲得的PBMC主要細(xì)胞成分是淋巴細(xì)胞(包括T、B淋巴細(xì)胞)和單核巨噬細(xì)胞。體外HIV感染PBMC實(shí)驗(yàn)時(shí)，HIV-1需要在PHA活化后的PBMC中復(fù)制。本實(shí)驗(yàn)以MTT比色法檢測了GQ-80604對活化PBMC的毒性作用。結(jié)果如表1所示。

表1 GQ-80604和AZT對PBMC細(xì)胞的毒性作用

結(jié)果表明：GQ-80604對PBMC細(xì)胞毒性相對于替諾福韋及mPEG₄-替諾福韋酯顯著降低，而同樣進(jìn)行修飾的對照品A對PBMC細(xì)胞的毒性與AZT沒有顯著性差異，即并非所有對替諾福韋進(jìn)行的聚乙二醇結(jié)構(gòu)修飾都會(huì)帶來細(xì)胞毒性的顯著改變。

(6)GQ-80604對HIV-1_TC-1感染PBMC中病毒復(fù)制的抑制試驗(yàn)

收集PHA刺激72小時(shí)的PBMC，用含有IL-2(終濃度為50U/ml)的1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，染色計(jì)數(shù)，存活率＞98％。調(diào)細(xì)胞濃度5×106/ml，加入HIV-1_TC-1貯存液(M.O.I.＝0.06)，37℃感染4小時(shí)后，離心、PBS洗滌3次，去除游離的病毒。用含有IL-2(終濃度為50U/ml)的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞濃度為5×10⁶/ml。每孔滴加100μl細(xì)胞懸液至含有100μl不同濃度待測藥物的96孔板中。37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)。第4天每孔補(bǔ)加100μl含有IL-2的細(xì)胞培養(yǎng)基，第7天收集培養(yǎng)上清，用終濃度0.5％Triton X-100裂解滅活。采用捕捉p24抗原ELISA方法，計(jì)算出藥物對HIV-1_TC-1在PBMC中復(fù)制表達(dá)p24抗原的抑制率和EC₅₀。

為了檢測GQ-80604抗HIV-1臨床分離株活性作用，我們以從天津市HIV/AIDS患者體內(nèi)分離的HIV-1臨床分離株HIV-1_TC-1感染PBMC，此株臨床分離株是07BC亞型，X4嗜性。結(jié)果如表2所示。

表2 GQ-80604和AZT對HIV-1_TC-1感染PBMC的復(fù)制的抑制試驗(yàn)

結(jié)果表明：GQ-80604對對HIV-1_TC-1感染的PBMC有很好的抑制HIV-1_TC-1在PBMC中復(fù)制的作用，陽性對照化合物AZT三批次實(shí)驗(yàn)的EC₅₀與對照品A作用相當(dāng)。

由表1和表2可知，GQ-80604對PBMC細(xì)胞的毒性較小，同時(shí)對HIV-1_TC-1感染的PBMC有很好抑制HIV-1_TC-1在PBMC中復(fù)制的作用，具有良好的應(yīng)用開發(fā)前景。該化合物的開發(fā)，將為艾滋病患者、乙肝患者帶來福音。

最后說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的宗旨和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。