一種microRNA的超分支滾環(huán)擴(kuò)增檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種microRNA的超分支滾環(huán)擴(kuò)增檢測(cè)方法。該方法包括以下步驟：設(shè)計(jì)一條頸環(huán)結(jié)構(gòu)的逆轉(zhuǎn)錄引物，一條鎖式探針和一對(duì)分支滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)（HRCA）的擴(kuò)增引物；建立逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，用于microRNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；建立鎖式探針的連接體系，用于鎖式探針的連接反應(yīng)；建立超分支滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)體系，用于以環(huán)化的鎖式探針為模板的超分支滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)；配置2%的瓊脂糖凝膠，用于擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)。該方法通過擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后在瓊脂糖凝膠上是否呈階梯狀條帶來判斷目標(biāo)microRNA的有無，具有較高的靈敏度、特異度和準(zhǔn)確度，并且操作簡(jiǎn)單，無需昂貴的檢測(cè)儀器，適合臨床推廣。
【專利說明】—種microRNA的超分支滾環(huán)擴(kuò)增檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于核酸分子檢測(cè)領(lǐng)域，涉及miR-21的超分支滾環(huán)擴(kuò)增檢測(cè)方法?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]MicroRNA是一類廣泛存在于真核生物體內(nèi)的，長(zhǎng)度為18~25個(gè)核苷酸的非編碼小分子RNA，通過與mRNA的3’非翻譯區(qū)特異性結(jié)合的方式，導(dǎo)致靶mRNA的降解或是抑制其蛋白質(zhì)翻譯過程，從而達(dá)到調(diào)芐基因表達(dá)的目的。
[0003]研究表明microRNA可以作為許多重要疾病的生物學(xué)標(biāo)志物。特別是其與腫瘤之間的相關(guān)性近年來成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)50%以上的miCToRNA基因位點(diǎn)都位于腫瘤形成相關(guān)區(qū)域，且與正常組織相比，腫瘤組織的miCToRNA表達(dá)譜明顯不同，提示microRNA與腫瘤的形成密切相關(guān)。
[0004]microRNA以其穩(wěn)定，易檢測(cè)、檢測(cè)方法不會(huì)對(duì)患者造成痛苦、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)勝過于當(dāng)今臨床許多疾病的標(biāo)志物和病理檢測(cè)方法。并且，在許多疾病的早期階段microRNA的表達(dá)就明顯異常。在對(duì)于腫瘤和miCToRNA相關(guān)性的研究中發(fā)現(xiàn)，某些microRNA可以促進(jìn)腫瘤的形成與發(fā)展(促癌基因)，而某些microRNA可以抑制腫瘤的形成與發(fā)展(抑癌基因)。研究發(fā)現(xiàn)，抑制某些促癌microRNA基因的表達(dá)或是促進(jìn)抑癌microRNA的表達(dá)，會(huì)明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增長(zhǎng)；促癌microRNA的含量在腫瘤不同分期的表達(dá)量是不同的；促癌microRNA的表達(dá)量越多，病人預(yù)后越差；相同疾病不同個(gè)體的microRNA表達(dá)譜也不盡相同。因此，microRNA對(duì)于疾病的早期診斷、臨床分期、靶向治療、個(gè)體化治療以及預(yù)后評(píng)估等都具有很高的價(jià)值，適合臨床推廣。
[0005]HiiCT0RNA對(duì)許多疾病的診斷、治療以及預(yù)后密切相關(guān)，迫切需要發(fā)展一種能夠靈敏、特異、快速、準(zhǔn)確并且低成本的檢測(cè)方法。目前，檢測(cè)microRNA的方法主要是northern雜交和生物芯片技術(shù)。Northern雜交由于其檢測(cè)靈敏度低而受限。芯片技術(shù)雖然具有高通量的優(yōu)點(diǎn)，但因其需要結(jié)合其他擴(kuò)增技術(shù)(PCR)，并且需要信號(hào)分子對(duì)待檢物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記這就使其檢測(cè)的靈敏度降低，而且步驟繁雜且成本較高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種應(yīng)用超分支滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(HRCA)檢測(cè)microRNA的方法。該方法靈敏、特異、操作簡(jiǎn)單并且成本較低。
[0007]本發(fā)明提供的一種MicroRNA的超分支滾環(huán)擴(kuò)增檢測(cè)方法，主要包含步驟:設(shè)計(jì)頸環(huán)結(jié)構(gòu)的逆轉(zhuǎn)錄引物、鎖式探針和支鏈擴(kuò)增引物；設(shè)計(jì)鎖式探針的連接體系，用于鎖式探針的連接；設(shè)計(jì)HRCA的擴(kuò)增體系，用于以鎖式探針為模板的擴(kuò)增反應(yīng)；對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)其擴(kuò)增結(jié)果。
[0008]具體地，所述檢測(cè)方法包含以下步驟:
[0009]I)逆轉(zhuǎn)錄引物的設(shè)計(jì):逆轉(zhuǎn)錄引物是按照與靶microRNA堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則所設(shè)計(jì)，使其3 ‘端末尾6個(gè)堿基與IE microRNA3 ‘端末尾6個(gè)堿基互補(bǔ)配對(duì),并形成一種頸環(huán)結(jié)構(gòu)。[0010]2)鎖式探針的設(shè)計(jì):鎖式探針把以microRNA為模板所逆轉(zhuǎn)錄出的cDNA序列中的一段連續(xù)排列的堿基作為識(shí)別序列，其中5’端為15個(gè)堿基，3’端為25個(gè)堿基，5’端磷酸化；進(jìn)一步地，然后選擇一些無關(guān)序列作為中間的連接序列，并使用DNAMAN version6軟件對(duì)鎖式探針進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，保證二級(jí)結(jié)構(gòu)最?。籟0011]3)根據(jù)鎖式探針的序列設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增引物CFp CF2 ；
[0012]4)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系的建立:包含microRNA、逆轉(zhuǎn)錄引物、dNTPs、10XRT緩沖液、RNA酶抑制劑、逆轉(zhuǎn)錄酶、DEPC H2O ；
[0013]5)鎖式探針連接體系的建立:包含步驟4)形成的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、鎖式探針、TaqDNA連接酶、10 X Taq DNA連接酶緩沖液、ddH20 ；
[0014]6)超分支滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)體系的建立:包含步驟5)形成的連接產(chǎn)物、dNTPs、CF2引物、Bst DNA聚合酶、IOXBst DNA聚合酶緩沖液、ddH20 ;
[0015]7)超分支滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物的檢測(cè):取步驟6)形成的擴(kuò)增產(chǎn)物于2%的瓊脂糖凝膠上電泳觀察電泳條帶，若呈階梯狀分布，則該方法被成功建立。反之，若無擴(kuò)增條帶或擴(kuò)增條帶不呈階梯狀分布則該方法無效。
[0016]優(yōu)選地,步驟I)中通過sanger數(shù)據(jù)庫(kù)獲得所要檢測(cè)的目標(biāo)microRNA的堿基序列。用DNAMAN version6軟件來查看頸環(huán)RT-Primer的頸環(huán)結(jié)構(gòu)特征。步驟I)中設(shè)計(jì)頸環(huán)結(jié)構(gòu)的逆轉(zhuǎn)錄引物的原因是:一方面提高逆轉(zhuǎn)錄效率，另一方面增加DNA-RNA識(shí)別的特異性?？紤]其原因是頸部的堿基堆積使得DNA和RNA結(jié)合的雙鏈結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定；頸環(huán)的空間結(jié)構(gòu)的限制使得它識(shí)別靶RNA的特異性增加。
[0017]優(yōu)選地,步驟2)中除了與逆轉(zhuǎn)錄引物結(jié)合的microRNA的6個(gè)堿基外,其余逆轉(zhuǎn)錄出的cDNA序列都要設(shè)計(jì)在鎖式探針3’端的識(shí)別序列中，這樣才可以保證該反應(yīng)的特異性。
[0018]優(yōu)選地，步驟2)中鎖式探針5’端特異性識(shí)別序列和3’端特異性識(shí)別序列的Tm值不同，以增加識(shí)別反應(yīng)的特異性。
[0019]優(yōu)選地，步驟3)中一對(duì)擴(kuò)增引物中的CF1為與鎖式探針互補(bǔ)的cDNA，只需設(shè)計(jì)鎖式探針3’端與CDNA3’端識(shí)別的序列包括到最后一個(gè)堿基即可；CF2為鎖式探針連接序列中的一段序列。
[0020]優(yōu)選地，所述CF2探針的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示。頸環(huán)引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，鎖式探針的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0021]優(yōu)選地，步驟4)包含:逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系的建立:15 4 1^體系包含1^(^01?^5 4 1^、50nM 逆轉(zhuǎn)錄引物 3μ L、0.25mM dNTPs0.15 μ L、10 X RT 緩沖液 1.5μ L,20U/y L RNA 酶抑制劑 0.19μ L、50U/y L 逆轉(zhuǎn)錄酶 I μ L、DEPC Η204.16 μ L ；16°C 30min，42°C 30min,85°C 5min。
[0022]優(yōu)選地，步驟5)包含:鎖式探針連接體系的建立:20 μ L體系包含步驟4)形成的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物15 μ L、IOOnM的鎖式探針2 μ L、40U/y L的TaqDNA連接酶0.2 μ L、10XTaq DNA連接酶緩沖液2 μ UddH2O0.8 μ L，46°C反應(yīng)10~60min。
[0023]優(yōu)選地，步驟6)包含:超分支滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)體系的建立:20 μ L體積包含步驟5)形成的連接產(chǎn)物 10 μ L、10mM dNTPslyLUOuM CF2 引物 2 μ L、8U/μ L Bst DNA 聚合酶
0.5 μ L、10XBst DNA 聚合酶緩沖液 2μ L、ddH204.5 μ L。
[0024]本發(fā)明利用HRCA后將擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，電泳后觀察條帶是否呈階梯狀分布來達(dá)到檢測(cè)目標(biāo)microRNA的目的，其有益效果如下:[0025]1.靈敏度高，能夠檢測(cè)到靶microRNA的濃度為10pM。
[0026]2.特異性好:鎖式探針兩端識(shí)別序列的Tm值不同；只有在鎖式探針的識(shí)別序列與cDNA的與之互補(bǔ)的序列完全互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，并且結(jié)合后3’端與5’端序列緊密相鄰時(shí)，才能完成鎖式探針的連接反應(yīng)，只要3’端有錯(cuò)配堿基存在時(shí)，連接反應(yīng)就不能完成。因此，保證了該反應(yīng)的特異性。
[0027]3.檢測(cè)時(shí)間短，擴(kuò)增效率高，Ih內(nèi)HRCA的擴(kuò)增效率可達(dá)到IO9倍。
[0028]4.成本較低，不需要使用昂貴的儀器去檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，而且不需要配備專業(yè)型的技術(shù)人才。
[0029]為讓本發(fā)明的上述和 其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能更明顯易懂，下文特舉較佳實(shí)施例，并配合附圖，作詳細(xì)說明如下。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]圖1為逆轉(zhuǎn)錄引物結(jié)構(gòu)示意圖,其結(jié)構(gòu)的最小自由能=-14.86kcal/mol。
[0031]圖2為miR-21的HRCA鎖式探針和擴(kuò)增引物結(jié)構(gòu)示意圖；其中CF1為與鎖式探針互補(bǔ)的cDNA，CF2則為鎖式探針連接序列中的一段序列，用框架表示。
[0032]圖3為本發(fā)明提供的ー種MicroRNA的超分支滾環(huán)擴(kuò)增檢測(cè)方法的原理示意圖。
[0033]圖4為鎖式探針濃度優(yōu)化電泳圖；M:DL2000marker ;鎖式探針濃度為1:1 U M ;2:1OOnM ；3:10nM ；4 =InM ；5:無模板；模板濃度均為IOOnM ;連接反應(yīng)及HRCA反應(yīng)時(shí)間均為Ih0
[0034]圖5為鎖式探針連接時(shí)間優(yōu)化電泳圖；M:DL2000marker;連接時(shí)間分別為1:1Omin ；2:20min ；3:30min ；4:40min ；5:50min;6:60min ；7:ddH20 作空白對(duì)照；連接反應(yīng)中模板濃度均為IOOnM ;鎖式探針濃度為IOOnM ；HRCA反應(yīng)時(shí)間為lh。
[0035]圖6為HRCA反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化電泳圖；M:DL2000marker; HRCA反應(yīng)時(shí)間分別為1:60min ；2:50min ；3:40min ；4:30min ；5:20min;6:IOmin ；7:ddH20 作空白對(duì)照；鎖式探針濃度為IOOnM ;連接時(shí)間為30min。
[0036]圖 7 為 HRCA 法檢測(cè) miR-21 靈敏度電泳圖；M:DL2000Marker; I:10pM;2:1OOpM; 3:InM;4:10nM;5:IOOnM;6:ddH20 作空白對(duì)照。
[0037]圖 8 為 HRCA 法檢測(cè) miR-21 特異度電泳圖；M:DL2000marker ；1:miR_21，2:與miR-21有I個(gè)堿基不同的RNA ；3:與miR-21有2個(gè)堿基不同的RNA。
[0038]圖9為本發(fā)明提供的ー種MicroRNA的超分支滾環(huán)擴(kuò)增檢測(cè)方法各步驟特異性驗(yàn)證的電泳圖；M:DL2000Marker;l:miR_21; 2:無逆轉(zhuǎn)錄酶；3:無Taq DNA連接酶；4 --無BstDNA聚合酶。
【具體實(shí)施方式】
[0039]實(shí)施例1:
[0040]以下結(jié)合附圖，以miR-21 (其核苷酸序列如SEQ IN N0:4所示)為研究對(duì)象，進(jìn)ー步對(duì)本發(fā)明進(jìn)行闡述。
[0041]I材料與方法
[0042]1.1 材料[0043]人工合成的鎖式探針(如SEQ ID NO: 2所示)和頸環(huán)引物(如SEQ ID NO:1所示)由上海Invitrogen公司合成。MiR-21的序列(如SEQ ID N0:4所示)來自sanger數(shù)據(jù)庫(kù)，由大連TaKaRa公司合成。逆轉(zhuǎn)錄酶(ABI公司)；TaqDNA連接酶，BstDNA聚合酶(NEB公司)；dNTPs, DL2000Marker (TaKaRa 公司)；常規(guī) PCR 擴(kuò)增儀(Mycycler，Bio-Rad, USA);凝膠成像系統(tǒng) VersarDoclOOO (Bio-Rad, USA)
[0044]1.2 方法
[0045]1.2.1頸環(huán)引物和鎖式探針的設(shè)計(jì)
[0046]參照Chen 等方法(CHEN C，RIDZON D A, BR00MER A J, et al.Real-timequantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR[J].Nucleic AcidsRes, 2005, 33:179-183.)設(shè)計(jì)特異性逆轉(zhuǎn)錄引物。鎖式探針的設(shè)計(jì)遵循Zhang等(ZhangD Y，Liu B.Detection of target nucleic acids and proteins by amplificationcircularizable probes [J].Expert Rev.Mol.Diagn, 2003, 3 (2): 237-248.)的鎖式探針設(shè)計(jì)原則。鎖式探針的5’端有15個(gè)堿基，3’端有25個(gè)堿基與逆轉(zhuǎn)錄引物序列特異性識(shí)別，結(jié)合后緊密相鄰。使用DNAMAN version6軟件(美國(guó)Lynnon Biosoft公司)對(duì)鎖式探針進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，按照得到二級(jí)結(jié)構(gòu)最小的原則來設(shè)計(jì)其中間的無關(guān)序列。實(shí)驗(yàn)中所用到的引物及鎖式探針序列如下表1:
[0047]表1
[0048]
Wl片段長(zhǎng)度~
鎖式探針 5 '-P-A TGTTGA GTC GTA TCCAGTGCCJCCJJCJACJM 90
GTTGATCTGTCTATTCACCTTATGCTTAACTC.TA
CACTTAT TA GCTTA TCA GA CTG-3'
顱壞リ I 物 5 ^GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCAC 50
TGG ATACG ACTC AAC A-3'
CF2Sf-TCTGTCTATTCACCTTATGCT-B21
MiR-21 5,-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3,22
[0049]具體請(qǐng)參照?qǐng)D1至圖3，其中圖1為頸環(huán)引物結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為miR-21的HRCA鎖式探針和擴(kuò)增引物結(jié)構(gòu)示意圖；其中CF1為與鎖式探針互補(bǔ)的cDNA，CF2則為鎖式探針連接序列中的一段序列，用框架表示；圖3為本發(fā)明所述的檢測(cè)方法的原理示意圖，其原理如下:
[0050]當(dāng)被檢測(cè)的microRNA存在時(shí)，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)會(huì)發(fā)生得到cDNA，然后鎖式探針兩端的識(shí)別序列會(huì)與cDNA結(jié)合完成鎖式探針的連接。連接成環(huán)后的鎖式探針在引物CF1XF2和具有鏈置換特性的BstDNA聚合酶的作用下進(jìn)行HRCA反應(yīng)。首先，由CF1形成一條具有大量串聯(lián)重復(fù)序列且與環(huán)形模板完全互補(bǔ)配對(duì)的單鏈DNA分子，然后，CF2會(huì)與該單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合并酶促延伸，同時(shí)置換掉下游結(jié)合到擴(kuò)增產(chǎn)物上由CF2擴(kuò)增出的產(chǎn)物，之后被置換掉的CF2產(chǎn)物又會(huì)做為CF1的模板進(jìn)行擴(kuò)增，該反應(yīng)反復(fù)進(jìn)行，擴(kuò)增產(chǎn)物便會(huì)在短時(shí)間內(nèi)以指數(shù)倍増加。
[0051 ] 1.2.2逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系及條件
[0052]逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系:miR-215iiL，50nM 逆轉(zhuǎn)錄引物 3iiL，0.25mM dNTPs0.15 u L,10 X RT bufferl.5 μ L, 20U/ μ L RNA 酶抑制劑 0.19 μ L, 50U/ μ L 逆轉(zhuǎn)錄酶 I μ L，加 DEPC 水至反應(yīng)總體積15 μ L。
[0053]逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件:16°C30min,42°C 30min,85°C 5min。
[0054]1.2.3鎖式探針連接體系及反應(yīng)條件的優(yōu)化
[0055]鎖式探針連接體系:逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物15 μ L，鎖式探針2 μ L，40U/ μ L的TaqDNA連接酶
0.2 μ L，10 X Taq DNA 連接酶 Buffer2 μ L,加 ddH20 至總體積為 20 μ L。
[0056]鎖式探針連接條件:46°C反應(yīng)lh。
[0057]鎖式探針為HRCA反應(yīng)的模板，因此其濃度的最適值對(duì)該反應(yīng)十分重要，按照本發(fā)明所述的鎖式探針連接體系和反應(yīng)條件，設(shè)置4個(gè)鎖式探針濃度(I μ MUOOnMUOnM,InM)進(jìn)行連接反應(yīng)，來確定鎖式探針的最適濃度，之后按照1.2.4所述反應(yīng)體系及條件進(jìn)行HRCA反應(yīng)(鎖式探針濃度優(yōu)化電泳圖見圖4)。應(yīng)用最適鎖式探針濃度，分別進(jìn)行l(wèi)Omin、20min、30min、40min、50min、60min的連接時(shí)間對(duì)鎖式探針的連接條件進(jìn)行優(yōu)化,之后按照1.2.4所述反應(yīng)體系及條件進(jìn)行HRCA反應(yīng)(鎖式探針連接時(shí)間優(yōu)化電泳圖見圖5)。
[0058]1.2.4HRCA擴(kuò)增體系及反應(yīng)條件的優(yōu)化
[0059]HRCA 反應(yīng)體系:連接產(chǎn)物 10 μ L, IOmM dNTPsl μ L, 10 μ M CF22 μ L, 8U/ μ LBst DNA聚合酶0.5 μ L，IOXBst DNA聚合酶buffer2 μ L，加 ddH204.5 μ L至反應(yīng)總體積為20 μ L。
[0060]HRCA反應(yīng)條件:65°C反應(yīng)Ih。
`[0061]應(yīng)用最適鎖式探針濃度、適連接時(shí)間，分別進(jìn)行10min、20min、30min、40min、50min、60min的HRCA反應(yīng)(HRCA反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化電泳圖見圖6)。
[0062]實(shí)施例2 =HRCA法檢測(cè)miR-21靈敏度的測(cè)定
[0063]1、將 miR-21 進(jìn)行倍比稀釋，濃度依次為 ΙΟΟηΜ、ΙΟηΜ、ΙηΜ、ΙΟΟρΜ、ΙΟρΜ。
[0064]2、將實(shí)施例1中得到的優(yōu)化條件應(yīng)用到miR-21靈敏度的檢測(cè)(見圖7)。
[0065]2.1逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系及反應(yīng)條件
[0066]逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系:miR-215yL，50nM逆轉(zhuǎn)錄引物 3yL，0.25mM dNTPs0.15 μ L,10 X RT bufferl.5 μ L, 20U/ μ L RNA 酶抑制劑 0.19 μ L, 50U/ μ L 逆轉(zhuǎn)錄酶 I μ L，加 DEPCH2O至反應(yīng)總體積15 μ L。
[0067]逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件:16°C30min,42°C 30min,85°C 5min。
[0068]2.2鎖式探針連接體系及反應(yīng)條件
[0069]鎖式探針連接體系:逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物15 μ L，鎖式探針2 μ L，40U/ μ L的TaqDNA連接酶
0.2 μ L，10 X Taq DNA 連接酶 Buffer2 μ L,加 ddH20 至總體積為 20 μ L。
[0070]鎖式探針連接條件:46°C反應(yīng)30min。
[0071 ] 2.3HRCA反應(yīng)體系及條件
[0072]HRCA 反應(yīng)體系:連接產(chǎn)物 10 μ L, IOmM dNTPsl μ L，10 μ M CF22 μ L, 8U/ μ LBst DNA聚合酶0.5 μ L，IOXBst DNA聚合酶buffer2 μ L，加 ddH204.5 μ L至反應(yīng)總體積為20 μ L。
[0073]HRCA 反應(yīng)條件:65°C 反應(yīng) 50min。
[0074]miR-21的倍比稀釋實(shí)驗(yàn)表明:HRCA法所能檢測(cè)到的模板濃度最低為IOpM (見圖7)。
[0075]實(shí)施例3 =HRCA法檢測(cè)miR-21特異性的測(cè)定
[0076]鑒于miR-21無家族成員，因此發(fā)明人人工合成了 2個(gè)RNA分子用于本實(shí)驗(yàn)特異性的驗(yàn)證。它們除了與miR-21有1個(gè)和2個(gè)堿基的差異外，其余特征同miR-21相同，并用相同的方法對(duì)它們進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果見圖8，表明本發(fā)明提供的檢測(cè)方法可以對(duì)miR-21進(jìn)行特異性檢測(cè)。
[0077]實(shí)施例4:本發(fā)明檢測(cè)miR-21各步驟特異性的驗(yàn)證
[0078]分別以無逆轉(zhuǎn)錄酶、無TaqDNA連接酶、無BstDNA聚合酶與正常反應(yīng)的miR-21進(jìn)行對(duì)照。結(jié)果見圖9，表明本發(fā)明提供的檢測(cè)方法在缺少其中任何一步反應(yīng)的條件下均不可進(jìn)行，確保了本發(fā)明提供的檢測(cè)方法的特異性。
[0079]雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例披露如上，然其并非用以限定本發(fā)明，任何所屬【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，當(dāng)可作些許的更動(dòng)與改進(jìn)，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍當(dāng)視權(quán)利要求所界定者為準(zhǔn)。
【權(quán)利要求】
1.一種miCToRNA的超分支滾環(huán)擴(kuò)增檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)逆轉(zhuǎn)錄引物的設(shè)計(jì):逆轉(zhuǎn)錄引物是按照與靶microRNA堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則所設(shè)計(jì)，使其3’端末尾6個(gè)堿基與IE microRNA3’端末尾6個(gè)堿基互補(bǔ)配對(duì),并形成一種頸環(huán)結(jié)構(gòu)； 2)鎖式探針的設(shè)計(jì):鎖式探針以cDNA序列中的一段連續(xù)排列的堿基作為識(shí)別序列，其中5’端為15個(gè)堿基,3’端為25個(gè)堿基,5’端磷酸化； 3)根據(jù)鎖式探針的序列設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增引物CFpCF2 ； 4)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系的建立:包含microRNA、逆轉(zhuǎn)錄引物、dNTPs、10XRT緩沖液、RNA酶抑制劑、逆轉(zhuǎn)錄酶、DEPC H2O5 5)鎖式探針連接體系的建立:包含步驟4)形成的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、鎖式探針、TaqDNA連接酶、10 X Taq DNA連接酶緩沖液、ddH20 ； 6)超分支滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)體系的建立:包含步驟5)形成的連接產(chǎn)物、dNTPs、CF2引物、Bst DNA聚合酶、IOXBst DNA聚合酶緩沖液、ddH20 ; 7)超分支滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物的檢測(cè):取步驟6)形成的擴(kuò)增產(chǎn)物于2%的瓊脂糖凝膠上電泳觀察電泳條帶，若呈階梯狀分布，則該方法被成功建立。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟I)中通過sanger數(shù)據(jù)庫(kù)獲得所要檢測(cè)的目標(biāo)microRNA的堿基序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟I)中，用DNAMANversion6軟件來查看逆轉(zhuǎn)錄引物的頸環(huán)結(jié)構(gòu)特征。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)中除了與頸環(huán)結(jié)構(gòu)的逆轉(zhuǎn)錄引物結(jié)合的microRNA的6個(gè)堿基外，cDNA中逆轉(zhuǎn)錄出的堿基序列全部設(shè)計(jì)在鎖式探針3’端的識(shí)別序列中。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)中鎖式探針5’端特異性識(shí)別序列和3’端特異性識(shí)別序列的Tm值不同。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)中一對(duì)擴(kuò)增引物中的CF1為與鎖式探針互補(bǔ)的cDNA，CF2為鎖式探針連接序列中的一段序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述CF2探針的核苷酸序列如SEQIDNO: 3所示；頸環(huán)引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，鎖式探針的核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4)包含:逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系的建立:15 μ L 體系包含 microRNA5y L、50nM 逆轉(zhuǎn)錄引物 3μ L、0.25mM dNTPs0.15 μ LUOXRT 緩沖液 1.5 μ L、20U/ μ L RNA 酶抑制劑 0.19 μ L、50U/ μ L 逆轉(zhuǎn)錄酶 I μ L、DEPC Η204.16 μ L ；16°C 30min，42°C 30min，85°C 5min。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟5)包含:鎖式探針連接體系的建立:20 μ L體系包含步驟4)形成的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物15 μ L、IOOnM的鎖式探針2 μ L、40U/ μ L的TaqDNA 連接酶 0.2 μ LUOXTaq DNA 連接酶緩沖液 2 μ L、ddH200.8 μ L，46°C 反應(yīng) 30min。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟6)包含:超分支滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)體系的建立:20 μ L體積包含步驟5)形成的連接產(chǎn)物10 μ L、10mM dNTPs I μ L、10 μ M CF2引物2μ L,8U/y L Bst DNA 聚合酶 0.5 μ L、10XBst DNA 聚合酶緩沖液 2 μ L、ddH204.5 μ L ;65°C反應(yīng)50min。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103525932SQ201310486552
【公開日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2013年10月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月17日
【發(fā)明者】魯衛(wèi)平, 郭仲莉, 陳鳴, 鄧少麗, 唱?jiǎng)P, 王豐, 顧大勇, 李發(fā)科, 賈雙榮, 何大莉 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院