Abcb1基因多態(tài)性焦磷酸測序方法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于檢測ABCB1基因多態(tài)性的焦磷酸測序檢測方法及試劑盒。本發(fā)明對ABCB1基因多態(tài)性檢測具體是指多態(tài)性位點(diǎn)rs1128503，rs2032582和rs1045642的單核苷酸多態(tài)性。本發(fā)明從核酸提取到完成多態(tài)性檢測報(bào)告，全程只需5小時(shí)，可以快速、準(zhǔn)確、高通量對ABCB1基因進(jìn)行定性定量檢測，指導(dǎo)患者的個(gè)性化用藥。
【專利說明】ABCB1基因多態(tài)性焦磷酸測序方法及試劑盒
所屬【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地，涉及一種ABCBl基因多態(tài)性焦磷酸測序方法及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]ABCBl轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族是一類跨膜蛋白，其主要功能是利用ATP水解產(chǎn)生的能量將與其結(jié)合的底物等主動轉(zhuǎn)出質(zhì)膜，ABCBl基因在人類多藥耐藥基因族中起主導(dǎo)作用，其表達(dá)受各種因素的影響，屬于可調(diào)控基因。研究顯示與ABCBl的基因表達(dá)、蛋白結(jié)合能力影響較大的3個(gè)單核苷酸多態(tài)性分別為:rsll28503，rs2032582和rsl045642。ABCBl定位于人類7號染色體q21.1，由28個(gè)外顯子組成，編碼一個(gè)170kDa的跨膜糖蛋白-P糖蛋白。它是人體內(nèi)重要的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白之一，在胃腸道、肝臟、腎臟、腦等重要組織器官廣泛分布，參與多種藥物的吸收、分布及分泌和排泄。
[0003]ABCBl是一種能量依賴性藥物輸出泵，當(dāng)化療藥物靠濃度梯度到達(dá)細(xì)胞后與ABCBl蛋白結(jié)合，導(dǎo)致ATP結(jié)合區(qū)活化，此時(shí)其核苷酸結(jié)合位點(diǎn)與ATP結(jié)合，ATP隨即水解為ADP釋放能量，在Mg2+作用下使P糖蛋白形態(tài)發(fā)生變化，在藥物尚未發(fā)生細(xì)胞毒作用之前被轉(zhuǎn)移至細(xì)胞外，使細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低，于是作用到藥物靶位細(xì)胞核位置的藥物濃度相對降低而產(chǎn)生多藥耐藥。rs2032582是位于ABCBl外顯子上第893位密碼子上G到T / A突變，導(dǎo)致893位丙氨酸突變?yōu)榻z氨酸或蘇氨酸，生化分析證實(shí)這種突變會影響藥物轉(zhuǎn)運(yùn)。GG野生型細(xì)胞內(nèi)的鉬類藥物濃度高于突變型，導(dǎo)致細(xì)胞死亡和嚴(yán)重的中心粒細(xì)胞毒性。在美國前列腺癌人群中被發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)和rsl045642的多倍型與多西紫杉醇治療的中性粒細(xì)胞毒性的顯著相關(guān)。
[0004]氯吡格雷是一種新型噻吩吡啶類的抗血小板藥物，氯吡格雷為藥物前體，本身無活性，氯吡格雷約50%經(jīng)胃腸道吸收后在肝臟內(nèi)迅速代謝，血漿中原形藥物濃度極低。氯吡格雷在小腸的吸收受到ABCBl基因編碼的質(zhì)子泵P糖蛋白調(diào)控。研究表明ABCBl基因rsll28503,rs2032582和rsl045642三者存在連鎖不平衡關(guān)系含有兩個(gè)ABCB1C3435T等位基因變異體可降低氯吡格雷的血藥濃度。在對白種人中研究時(shí)發(fā)現(xiàn)攜帶3435TT突變型純合子基因型個(gè)體的P糖蛋白的表達(dá)量比正常野生型個(gè)體低51 %。FAST-MI研究顯示攜帶兩個(gè)ABCB1C3435T等位基因的患者比沒有攜帶的主要終點(diǎn)事件(死亡，非致命性卒中、心肌梗死等)的風(fēng)險(xiǎn)高。在接受氯吡格雷治療的患者中，ABCB13435C —T基因型與心血管死亡、心肌梗死及卒中等事件風(fēng)險(xiǎn)呈顯著相關(guān)(P=0.0064)，與ABCBl基因型3435CT / CC攜帶者相比，純合子TT攜帶者主要終點(diǎn)事件風(fēng)險(xiǎn)增加72% ;在健康人群中，純合子3435TT攜帶者應(yīng)用氯吡格雷后血小板最大聚集率出現(xiàn)絕對降低，但降幅較CT / CC攜帶者減小7.3%(P=0.0127)。ABCBl基因型3435TT攜帶者降低了對血小板的抑制，且在氯吡格雷治療期間復(fù)發(fā)性缺血事件的風(fēng)險(xiǎn)有所增加。
[0005]焦磷酸測序技術(shù)(Pyrosequencing)作為一種新的序列分析技術(shù),相對傳統(tǒng)的Sanger測序法，焦磷酸測序更快、更簡單，且便宜得多。焦磷酸測序方法由4種酶催化同一反應(yīng)體系中的酶級聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，在每一輪測序反應(yīng)中，只加入一種dNTP，若該dNTP與模板配對，聚合酶就能將其加入到引物鏈中并釋放出等摩爾數(shù)的焦磷酸(PPi)。PPi可最終轉(zhuǎn)化為可見光信號，并由Pyrogram TM轉(zhuǎn)化為一個(gè)峰值,其高度與核苷酸數(shù)目成正比。其操作簡單，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可以行大規(guī)模分析。
[0006]基于以上所述，本發(fā)明采用焦磷酸測序?qū)BCBl基因的三個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行檢測，對進(jìn)行化療的腫瘤患者或接受氯吡格雷治療的患者提供個(gè)性化治療方案提供決策依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于，提供一組用于檢測ABCBl基因多態(tài)性位點(diǎn)rsl 128503的核苷酸序列。
[0008]本發(fā)明的目的在于，提供一種用于檢測ABCBl基因多態(tài)性位點(diǎn)rs2032582的核苷酸序列。
[0009]本發(fā)明的目的 在于，提供一種用于檢測ABCBl基因多態(tài)性位點(diǎn)rsl045642的核苷酸序列。
[0010]本發(fā)明的目的在于，提供一種用于檢測ABCBl基因多態(tài)性位點(diǎn)rsll28503、rs2032582和rs 104564的焦磷酸測序方法及試劑盒。
[0011]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0012]一組用于檢測ABCBl基因多態(tài)性位點(diǎn)rsll28503、rs2032582和rsl045642的焦磷酸測序方法中使用的PCR引物及測序引物，其特征在于，其組成為:
[0013]檢測rsll28503的PCR引物對，上游引物和下游引物的核苷酸序列分別如序列表SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示，測序引物如序列表SEQ ID N0.3所示；
[0014]檢測rs2032582的PCR引物對，上游引物和下游引物的核苷酸序列分別如序列表SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.5所示，測序引物如序列表SEQ ID N0.6所示；
[0015]檢測rsl045642的PCR引物對，上游引物和下游引物的核苷酸序列分別如序列表SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8所示，測序引物如序列表SEQ ID N0.9所示；
[0016]一組用于檢測ABCBl基因多態(tài)性位點(diǎn)rsll28503、rs2032582和rsl045642的焦磷酸測序方法中使用的核酸，其特征在于，該組核酸包括核苷酸序列分別如序列表SEQ IDN0.1和SEQ ID N0.2所示的用于rsll28503PCR擴(kuò)增的引物對和測序引物SEQ ID N0.3、如序列表SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.5所示的用于rs2032582PCR擴(kuò)增的引物對和測序引物SEQ ID N0.6、如序列表SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8所示的用于rsl045642PCR擴(kuò)增的引物對和測序引物SEQ ID N0.9和攜帶有SEQ ID N0.10所示的陽性對照。
[0017]一種用于檢測ABCBl基因多態(tài)性位點(diǎn)rsll28503、rs2032582和rsl045642的焦磷酸測序試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括:
[0018]PCR 緩沖液；
[0019]用于rsll28503PCR擴(kuò)增上游引物，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示，測序引物如SEQ ID N0.3所示；
[0020]用于rs2032582PCR擴(kuò)增上游引物，其核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示，下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID N0.5，所示測序引物如SEQ ID N0.6所示;[0021]用于rsl045642PCR擴(kuò)增上游引物，其核苷酸序列如SEQ ID N0.7所示，下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID N0.8所示，測序引物如SEQ ID N0.9所示；；
[0022]dNTP ；
[0023]MgCl2 ；
[0024]Pfu DNA 聚合酶；
[0025]雙蒸水；
[0026]陰性對照:滅菌生理鹽水；
[0027]陽性對照:所述質(zhì)粒攜帶的核苷酸序列如SEQ ID N0.10所示。
[0028]一種用于檢測ABCBl基因多態(tài)性位點(diǎn)rsll28503、rs2032582和rsl045642的焦磷酸測序方法:
[0029](I)樣品采集、核酸提取:本發(fā)明可檢測本發(fā)明可檢測血液和組織切片等樣本；采集到的血液樣本首先通過蛋白酶K消化、裂解之后用氯仿抽提提取核酸或采用商品化試劑盒提取核酸。
[0030](2)在反應(yīng)管 中分別加入反應(yīng)液和核酸，記錄樣品編號和對應(yīng)管號，放入PCR儀中擴(kuò)增；
[0031]其中，最適的PCR反應(yīng)體系如下:
【權(quán)利要求】
1.一組檢測ABCBl基因多態(tài)性焦磷酸測序方法中使用的引物，其特征在于，其組成為:檢測ABCBl基因多態(tài)性位點(diǎn)rsll28503的引物對，上游引物和下游引物的核苷酸序列分別如序列表SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示，其中下游引物SEQ ID N0.2所示引物5’端采用生物素標(biāo)記，ABCBl基因的焦磷酸測序引物，如SEQID N0.3所示。
2.一組檢測ABCBl基因多態(tài)性焦磷酸測序方法中使用的引物，其特征在于，其組成為:檢測ABCBl基因多態(tài)性位點(diǎn)rs2032582的引物對，上游引物和下游引物的核苷酸序列分別如序列表SEQID N0.4和SEQID N0.5所示，其中下游引物SEQ ID N0.5所示引物5’端采用生物素標(biāo)記，ABCBl基因的焦磷酸測序引物，如SEQID N0.6所示。
3.—組檢測ABCBl基因多態(tài)性焦磷酸測序方法中使用的引物，其特征在于，其組成為:檢測ABCBl基因多態(tài)性位點(diǎn)rsl045642的引物對，上游引物和下游引物的核苷酸序列分別如序列表SEQID N0.7和SEQID N0.8所示，其中下游引物SEQ ID N0.2所示引物5’端采用生物素標(biāo)記。ABCBl基因的焦磷酸測序引物，如SEQ ID N0.9所示。
4.一組檢測ABCBl基因多態(tài)性焦磷酸測序方法中攜帶有SEQ ID N0.10所示的陽性對照的陽性對照，陽性對照攜帶有SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2引物對、SEQ ID N0.4和SEQID N0.5引物對以及SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8引物對PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物核酸序列。
5.一種檢測ABCBl基因多態(tài)性焦磷酸測序測序試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括含有SEQID N0.1和SEQ ID N0.2PCR擴(kuò)增引物的PCR反應(yīng)液，SEQID N0.3所示的測序引物;SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.5PCR擴(kuò)增引物的PCR反應(yīng)液，SEQID N0.6所示的測序引物；SEQID N0.7和SEQ ID N0.8PCR擴(kuò)增引物的PCR反應(yīng)液，SEQID N0.9所示的測序引物；其中，SEQID N0.2、SEQ ID N0.5和SEQID N0.8所示引物的5，端進(jìn)行生物素標(biāo)記。
6.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括SEQID N0.10所示的陽性對照，所述陽性對照為插有SEQID N0.10所示核苷酸序列的質(zhì)粒。
【文檔編號】C12N15/11GK103695531SQ201310486429
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年10月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月17日
【發(fā)明者】不公告發(fā)明人 申請人:山東博思源生物技術(shù)有限公司