納米粒子表面用dna四面體為支架并引滾環(huán)擴增反應(yīng)的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種納米粒子表面用DNA四面體為支架并引發(fā)滾環(huán)擴增反應(yīng)的方法，將制備好的DNA四面體組裝在納米粒子表面后，DNA四面體上延伸出的一段單鏈DNA可作為引物DNA，使用與特定aptamer序列互補的環(huán)形DNA作為擴增模板，與引物DNA雜交并引發(fā)滾環(huán)擴增反應(yīng)，制備的產(chǎn)物為納米粒子表面多apatmer結(jié)構(gòu)組成的多條長單鏈DNA；本發(fā)明可有效調(diào)控納米粒子表面DNA的分布密度從而提高引物DNA與環(huán)DNA的雜交效率，通過滾環(huán)擴增技術(shù)，擴增得到的多aptamer結(jié)構(gòu)的長單鏈DNA，極大提高CTC的捕獲效率，從而在細胞檢測、捕獲及細胞成像等研究領(lǐng)域有著潛在的應(yīng)用價值。
【專利說明】納米粒子表面用DNA四面體為支架并引滾環(huán)擴增反應(yīng)的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于納米材料功能化及DNA納米技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，涉及一種DNA自組裝而成的DNA四面體作為支架組裝在納米材料表面，且DNA四面體上延伸出的一段單鏈DNA引發(fā)滾環(huán)擴增反應(yīng)，所得產(chǎn)物為納米粒子表面負載多條特定識別性能的長單鏈DNA，此結(jié)構(gòu)可用于細胞檢測、捕獲及細胞成像等研究。

【背景技術(shù)】
[0002]惡性腫瘤目前已成為世界上死亡率最高的重大疾病之一，而隨著腫瘤發(fā)病率的日趨升高，人們針對惡性腫瘤的認識和研究的研究也在不斷加深:早期、高效和特異性的CTC捕獲不僅是腫瘤的早期診斷的一個有力手段，同時通過釋放所獲CTC并針對其生物學特性進行深入研究，也有利于腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生以前的風險評估和治理方案的制定。而目前針對CTC的捕獲技術(shù)卻存在一些問題，如因CTC數(shù)量稀少原因而捕獲技術(shù)效率不高從而導致CTC較難檢測到；另外，捕獲過程中對CTC活性產(chǎn)生一定損傷，影響其后期的生物學特性研究等。因此，如何實現(xiàn)CTC的高效捕獲和有效釋放得到生物學特性完全的CTC是目前腫瘤轉(zhuǎn)移研究中亟待解決的生命科學問題。
[0003]腫瘤特異性Aptamer (核酸適配體)的研究近年來逐漸興起和不斷豐富，它是用配體指數(shù)富集法系統(tǒng)進化(SELEX)技術(shù)篩選獲得一段單鏈DNA或RNA，借其自身形成的空間結(jié)構(gòu)與靶標分子特異性識別，具備靶分子廣、親和力高、特異性強、易改造修飾等傳統(tǒng)生物抗體所不具備的諸多優(yōu)越性能，為腫瘤靶向研究和治療提供了一類理想的靶向識別分子。但同時，雖然組裝在材料表面的aptamer可以特異性地識別腫瘤細胞表面受體，由于磁性納米粒子表面有限的組裝面積以及aptamer在粒子表面可能的倒伏組裝狀態(tài)均使得CTC的識別和捕獲效率有待提聞。滾環(huán)擴增技術(shù)可以使組裝在納米材料表面DNA序列實現(xiàn)復制，并得到長的單鏈DNA產(chǎn)物，且單鏈DNA產(chǎn)物由一重復片段組成。但納米材料表面的DNA密度控制不當，不僅導致擴增效率不高，而且所獲長單鏈DNA產(chǎn)物相互纏繞，并導致聚集使得受體識別變得困難。
[0004]而DNA四面體為DNA的擴增問題提供了可能的解決路徑。它是由六條DNA單鏈配對而成，具有聞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和剛性。研究表明，DNA四面體可以有效提聞DNA探針在表面分布排列的均一性，并精確調(diào)控探針之間的距離，從而顯著提高了生物檢測的靈敏度和特異性。因此將可在充分利用和發(fā)展納米技術(shù)特有的優(yōu)勢的基礎(chǔ)上，有望為腫瘤的早期診斷提供新的高效檢測手段并為研究腫瘤的轉(zhuǎn)移發(fā)生和發(fā)展等生命科學問題提供有力的理論基礎(chǔ)和技術(shù)依據(jù)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種在納米材料表面用DNA四面體作為反應(yīng)支架并引發(fā)滾環(huán)擴增的方法。
[0006]本發(fā)明的目的之二是通過滾環(huán)擴增技術(shù)，擴增得到多aptamer結(jié)構(gòu)的長單鏈DNA，用于CTC的聞效捕獲。
[0007]—種納米粒子表面用DNA四面體為支架并引發(fā)滾環(huán)擴增反應(yīng)的方法，其特征在于，制備好的DNA四面體組裝在納米粒子表面后，DNA四面體上延伸出的一段單鏈DNA可作為引物DNA，使用與特定aptamer序列互補的環(huán)形DNA作為擴增模板，與引物DNA雜交并引發(fā)滾環(huán)擴增反應(yīng)，制備的產(chǎn)物為納米粒子表面多apatmer結(jié)構(gòu)組成的多條長單鏈DNA,通過aptamer與細胞表面特定受體的結(jié)合從而用作細胞檢測、捕獲及細胞成像探針。
[0008]所述的DNA四面體為四條單鏈DNA通過DNA雜交，自組裝而成的一種四面體結(jié)構(gòu)。
[0009]所述的納米粒子為納米金、量子點、磁性納米粒子中的一種。
[0010]所述的DNA四面體組裝在納米粒子表面為巰基修飾的DNA四面體通過Au_S鍵，或NH2-修飾的DNA四面體通過縮合反應(yīng)等組裝在納米金表面或有含-C00H基的納米粒子表面。
[0011]所述的延伸的一段單鏈DNA，為10-30個堿基的一段DNA序列。
[0012]所述的特定aptamer序列為在受體存在的情況下可與其特異性結(jié)合的一段DNA序列，如可與循環(huán)腫瘤細胞表面受體(EpCAM)結(jié)合的aptamer結(jié)構(gòu)。
[0013]所述的擴增模板為含有一段非aptamer互補的DNA無關(guān)序列。
[0014]所述的多apatmer結(jié)構(gòu)組成的多條長單鏈DNA為aptamer結(jié)構(gòu)與無關(guān)序列間隔出現(xiàn)的DNA單鏈，無關(guān)序列可降低aptamer與受體結(jié)合的位阻效應(yīng)。
[0015]本發(fā)明可有效調(diào)控納米粒子表面DNA的分布密度從而提高引物DNA與環(huán)DNA的雜交效率，構(gòu)建功能高效的生物探針用于細胞檢測、捕獲及細胞成像領(lǐng)域。

【具體實施方式】
[0016]實施例1:
等量的 A 鏈(5，- GTG AAAAA AAAAA GCA -ACA TTC CTA AGT CTG AAA CAT TAC AGCTTG CTA CAC GAG AAG AGC CGC CAT AGT A_3，)，B鏈(5，- TAT CAC CAG GCA GTT GAC AGTGTA GCA AGC TGT AAT AGA TGC GAG GGT CCA ATA C -3，)，C鏈(5，- TCA ACT GCC TGG TGATAA AAC GAC ACT ACGTGG GAA TCT ACT ATG GCG GCT CTT C -3，)，D鏈(5，- TTC AGA CTTAGG AAT GTG CTT CCC ACG TAG TGT CGT TTG TAT TGG ACC CTC GCA T -3，)與 TM buffer(20mM, Tris, 50mM MgCl2, pH 8.0)，充分混勻后，95°C下加熱2min，然后30s內(nèi)迅速降至4°C。制備好的DNA四面體用PAGE電泳及AFM進行回收、驗證。
[0017]實施例2:
等量的 A 鏈(5，- GTG AAAAA AAAAA GCA -ACA TTC CTA AGT CTG AAA CAT TAC AGCTTG CTA CAC GAG AAG AGC CGC CAT AGT A_3，)， B 鏈(5，-HS_C6- TAT CAC CAG GCA GTTGAC AGT GTA GCA AGC TGT AAT AGA TGC GAG GGT CCA ATA C -3， )， C 鏈(5，-HS_C6- TCAACT GCC TGG TGA TAA AAC GAC ACT ACGTGG GAA TCT ACT ATG GCG GCT CTT C -3， )，D 鏈(5' -HS-C6- TTC AGA CTT AGG AAT GTG CTT CCC ACG TAG TGT CGT TTG TAT TGG ACC CTCGCA T -3，)與 TM buffer (20mM, Tris, 50mM MgCl2, pH 8.0)，充分混勻后，95°C下加熱2min,然后30s內(nèi)迅速降至4°C。制備好的DNA四面體用PAGE電泳及AFM進行回收、表征。
[0018]lmL 15nm金膠溶液中加入20 yL (10 μ M) DNA四面體結(jié)構(gòu)，室溫振蕩過夜后加入lOOmM PB buffer (pH7.4)，終濃度為 10mM，室溫過夜后加入老化液(10 mM PB，2M NaCl，pH7.4)溶液中鹽的終濃度為0.1511。混合物溶液室溫過夜后，4° C 12000rpm/min，15min，離心洗滌3次后，沉淀物于200 yL, pH7.4 PB (10 mM, 0.15 M NaCl)溶液中重懸浮，4°C保存。制備好的DNA四面體用AFM進行回收、表征。
[0019]實施例3:
等量的 A 鏈(5，- GTG AAAAA AAAAA GCA -ACA TTC CTA AGT CTG AAA CAT TAC AGCTTG CTA CAC GAG AAG AGC CGC CAT AGT A_3，)，B 鏈(5，-NH2_C6- TAT CAC CAG GCA GTTGAC AGT GTA GCA AGC TGT AAT AGA TGC GAG GGT CCA ATA C -3’)，C 鏈(5，-NH2_C6- TCAACT GCC TGG TGA TAA AAC GAC ACT ACGTGG GAA TCT ACT ATG GCG GCT CTT C -3’)，D鏈(5，-NH2-C6- TTC AGA CTT AGG AAT GTG CTT CCC ACG TAG TGT CGT TTG TAT TGG ACCCTC GCA T -3’)與 TM buffer (20mM, Tris, 50mM MgCl2, pH 8.0)，充分混勻后，95°C下加熱2min，然后30s內(nèi)迅速降至4°C。制備好的DNA四面體用PAGE及AFM進行回收、表征。10^磁珠溶液(1禮沖20 yL (10 μ M) DNA四面體結(jié)構(gòu)，37°C振蕩過夜后置于磁架之上，磁懸浮，棄除上清(未連接的DNA四面體)，加入100yLpH7.4 PB (10 mM, 0.15 M NaCl)洗滌三次。沉淀物中加入20 μ L PB buffer溶液中重懸浮，4°C保存。
[0020]實施例4:
等量的 A 鏈(5，- GTG AAAAA AAAAA GCA -ACA TTC CTA AGT CTG AAA CAT TAC AGCTTG CTA CAC GAG AAG AGC CGC CAT AGT A_3，)， B 鏈(5，-HS_C6- TAT CAC CAG GCA GTTGAC AGT GTA GCA AGC TGT AAT AGA TGC GAG GGT CCA ATA C -3， )， C 鏈(5，-HS_C6- TCAACT GCC TGG TGA TAA AAC GAC ACT ACGTGG GAA TCT ACT ATG GCG GCT CTT C -3， )，D 鏈(5' -HS-C6- TTC AGA CTT AGG AAT GTG CTT CCC ACG TAG TGT CGT TTG TAT TGG ACC CTCGCA T -3，)與 TM buffer (20mM, Tris, 50mM MgCl2, pH 8.0)，充分混勻后，95°C下加熱2min,然后30s內(nèi)迅速降至4°C。制備好的DNA四面體用PAGE及AFM進行回收、表征。
[0021]lmL 15nm金膠溶液中加入20 yL (10 μ M) DNA四面體結(jié)構(gòu)，室溫振蕩過夜后加入lOOmM PB buffer (ρΗ7.4)，終濃度為 10mM，室溫過夜后加入老化液(10 mM PB，2M NaCl,pH7.4)溶液中鹽的終濃度為0.15M?；旌衔锶芤菏覝剡^夜后，4°C 12000rpm/min, 15min，離心洗滌3次后，沉淀物于200 uL,pH7.4 PB (10 mM, 0.15 M NaCl)溶液中重懸浮，4°C保存。制備好的Au-DNA四面體用AFM進行回收、表征。
[0022]5μ L 100 μ Μ預成環(huán)DNA與10 μ L 100 μ Μ互補序列加入到0.5mL離心管中混合均勻，90°C下lmin，當管中溶液自然冷卻到室溫時，加入3 μ LT4連接酶及2 μ LT4連接酶緩沖液，25°C環(huán)境下連接16小時以上，結(jié)束后，65°C條件下酶變性lOmin，然后加入3yLT4聚合酶及6 μ LT4聚合酶緩沖液，將溶液混合均勻后在37°C下反應(yīng)24小時以上。酶作用完全后，在高溫下(85°C)處理lOmin，使得溶液中的所有酶都變性完全。最后用30KD的超濾管超濾(10000rpm/min，5min),收集底部溶液，為含有環(huán)狀DNA的混合溶液。
[0023]8μ L Au-DNA 四面體中加入以下溶液:環(huán) DNA (6μ L)，dNTPs (2 μ L, 10 mM), RCAbuffer (2 μ L, 10 X), phi29 polymerase (2 μ L, 10 U/μ L),混合溶液終體積為 20 μ L。然后30°C水浴中擴增30 min。所得產(chǎn)物4°C，5000 rpm/min離心5min，小心去除上清，加入20 μ L Mill1-Q水重懸浮后，取10 μ L上樣，1%瓊脂糖電泳，電壓120V，30min。另10 μ L稀釋到90 uLMill1-Q水中，取5yL滴到平整清潔云母表面，吸附3min后，Mill1-Q滴流沖洗，原子力顯微鏡Tapping-mode成像。
[0024]實施例5:
等量的 A 鏈(5，- GTG AAAAA AAAAA GCA -ACA TTC CTA AGT CTG AAA CAT TAC AGCTTG CTA CAC GAG AAG AGC CGC CAT AGT A_3，)， B 鏈(5，-HS_C6- TAT CAC CAG GCA GTTGAC AGT GTA GCA AGC TGT AAT AGA TGC GAG GGT CCA ATA C -3， )， C 鏈(5，-HS_C6- TCAACT GCC TGG TGA TAA AAC GAC ACT ACGTGG GAA TCT ACT ATG GCG GCT CTT C -3， )，D 鏈(5' -HS-C6- TTC AGA CTT AGG AAT GTG CTT CCC ACG TAG TGT CGT TTG TAT TGG ACC CTCGCA T -3，)與 TM buffer (20mM, Tris, 50mM MgCl2, pH 8.0)，充分混勻后，95°C下加熱2min,然后30s內(nèi)迅速降至4°C。制備好的DNA四面體用PAGE及AFM進行回收、表征。
[0025]lmL 15nm金膠溶液中加入20 yL (10 μ M) DNA四面體結(jié)構(gòu)，室溫振蕩過夜后加入lOOmM PB buffer (ρΗ7.4)，終濃度為 10mM，室溫過夜后加入老化液(10 mM PB，2M NaCl,pH7.4)溶液中鹽的終濃度為0.15M。混合物溶液室溫過夜后，4°C 12000rpm/min, 15min，離心洗滌3次后，沉淀物于200 uL,pH7.4 PB (10 mM, 0.15 M NaCl)溶液中重懸浮，4°C保存。制備好的Au-DNA四面體用AFM進行回收、表征。
[0026]5μ L 100 μ Μ預成環(huán)DNA與10 μ L 100 μ Μ互補序列加入到0.5mL離心管中混合均勻，90°C下lmin，當管中溶液自然冷卻到室溫時，加入3 μ LT4連接酶及2 μ LT4連接酶緩沖液，25°C環(huán)境下連接16小時以上，結(jié)束后，65°C條件下酶變性lOmin，然后加入3yLT4聚合酶及6 μ LT4聚合酶緩沖液，將溶液混合均勻后在37°C下反應(yīng)24小時以上。酶作用完全后，在高溫下(85°C)處理lOmin，使得溶液中的所有酶都變性完全。最后用30KD的超濾管超濾(10000rpm/min，5min),收集底部溶液，為含有環(huán)狀DNA的混合溶液。
[0027]Au-DNA四面體中加入8yLmilliQ水重懸浮后加入以下溶液:環(huán)DNA (6μ L),b1-dNTPs (2 μ L,10 mM), RCA buffer (2 μ L，10X)，phi29 polymerase (2 μ L,10 U/μ L)，混合溶液終體積為20 μ L。然后30° C水浴中擴增30 min。所得產(chǎn)物離心洗滌三次后，加入10 μ L 1/1000 avidin-HRP溶液，37°C水浴中孵育30 min。結(jié)束后200 μ L洗滌液(150mmol/L PBS,0.25% Tween20)洗滌三次，加入 TMB (含 H202)溶液 100 μ L，溶液顏色變藍后顏色不再發(fā)生變化后，酶標儀檢測孔中溶液吸收值。
[0028]實施例6:
等量的 Α 鏈(5，- GTG AAAAA AAAAA GCA -ACA TTC CTA AGT CTG AAA CAT TAC AGCTTG CTA CAC GAG AAG AGC CGC CAT AGT A_3，)，B 鏈(5，-NH2_C6- TAT CAC CAG GCA GTTGAC AGT GTA GCA AGC TGT AAT AGA TGC GAG GGT CCA ATA C -3’)，C 鏈(5，-NH2_C6- TCAACT GCC TGG TGA TAA AAC GAC ACT ACGTGG GAA TCT ACT ATG GCG GCT CTT C -3’)，D鏈(5，-NH2-C6- TTC AGA CTT AGG AAT GTG CTT CCC ACG TAG TGT CGT TTG TAT TGG ACCCTC GCA T -3’)與 TM buffer (20mM, Tris, 50mM MgCl2, pH 8.0)，充分混勻后，95°C下加熱2min，然后30s內(nèi)迅速降至4°C。制備好的DNA四面體用PAGE及AFM進行回收、表征。10^磁珠溶液(1禮沖20 yL (10 μ M) DNA四面體結(jié)構(gòu)，37°C振蕩過夜后置于磁架之上，磁懸浮，棄除上清(未連接的DNA四面體)，加入100yLpH7.4 PB (10 mM, 0.15 M NaCl)洗滌三次。沉淀物中加入20 μ L PB buffer溶液中重懸浮，4°C保存。
[0029]5μ L 100 μ Μ預成環(huán)DNA與10 μ L 100 μ Μ互補序列加入到0.5mL離心管中混合均勻，90°C下lmin，當管中溶液自然冷卻到室溫時，加入3 μ LT4連接酶及2 μ LT4連接酶緩沖液，25°C環(huán)境下連接16小時以上，結(jié)束后，65°C條件下酶變性lOmin，然后加入3μ LT4聚合酶及6 μ LT4聚合酶緩沖液，將溶液混合均勻后在37°C下反應(yīng)24小時以上。酶作用完全后，在高溫下(85°C)處理lOmin，使得溶液中的所有酶都變性完全。最后用30KD的超濾管超濾(10000rpm/min，5min),收集底部溶液，為含有環(huán)狀DNA的混合溶液。
[0030]磁珠-DNA四面體中加入8yLmilliQ水重懸浮后加入以下溶液:環(huán)DNA (6μ L),b1-dNTPs (2 μ L,10 mM), RCA buffer (2 μ L，10X)，phi29 polymerase (2 μ L,10 U/μ L)，混合溶液終體積為20 μ L。然后30°C水浴中擴增30 min。所得產(chǎn)物磁懸浮洗滌三次后，加入10 μ L 1/1000 avidin-HRP溶液，37°C水浴中孵育30 min。結(jié)束后200 μ L洗滌液(150mmol/L PBS,0.25% Tween20)洗滌三次，加入 TMB (含 H202)溶液 100 μ L，溶液顏色變藍后顏色不再發(fā)生變化后，酶標儀檢測孔中溶液吸收值。
[0031]實施例7:
等量的 Α 鏈(5，- GTG AAAAA AAAAA GCA -ACA TTC CTA AGT CTG AAA CAT TAC AGCTTG CTA CAC GAG AAG AGC CGC CAT AGT A_3，)，B 鏈(5，-NH2_C6- TAT CAC CAG GCA GTTGAC AGT GTA GCA AGC TGT AAT AGA TGC GAG GGT CCA ATA C -3’)，C 鏈(5，-NH2_C6- TCAACT GCC TGG TGA TAA AAC GAC ACT ACGTGG GAA TCT ACT ATG GCG GCT CTT C -3’)，D鏈(5，-NH2-C6- TTC AGA CTT AGG AAT GTG CTT CCC ACG TAG TGT CGT TTG TAT TGG ACCCTC GCA T -3’)與 TM buffer (20mM, Tris, 50mM MgCl2, pH 8.0)，充分混勻后，95°C下加熱2min，然后30s內(nèi)迅速降至4°C。制備好的DNA四面體用PAGE及AFM進行回收、表征。10^磁珠溶液(1禮沖20 yL (10 μ M) DNA四面體結(jié)構(gòu)，37°C振蕩過夜后置于磁架之上，磁懸浮，棄除上清(未連接的DNA四面體)，加入100yLpH7.4 PB (10 mM, 0.15 M NaCl)洗滌三次。
[0032]5μ L 100 μ Μ預成環(huán)DNA與10 μ L 100 μ Μ互補序列加入到0.5mL離心管中混合均勻，90°C下lmin，當管中溶液自然冷卻到室溫時，加入3 μ LT4連接酶及2 μ LT4連接酶緩沖液，25°C環(huán)境下連接16小時以上，結(jié)束后，65°C條件下酶變性lOmin，然后加入3μ LT4聚合酶及6 μ LT4聚合酶緩沖液，將溶液混合均勻后在37°C下反應(yīng)24小時以上。酶作用完全后，在高溫下(85°C)處理lOmin，使得溶液中的所有酶都變性完全。最后用30KD的超濾管超濾(10000rpm/min，5min),收集底部溶液，為含有環(huán)狀DNA的混合溶液。
[0033]磁珠-DNA四面體中加入8yLmilliQ水重懸浮后加入以下溶液:環(huán)DNA (6μ L),dNTPs (2 μ L，10 mM)，RCA buffer (2 μ L，10X)，phi29 polymerase (2 μ L, 10 U/μ L),混合溶液終體積為20yL。然后30° C水浴中擴增30 min。所得產(chǎn)物離心洗滌三次后，力口入50 μ L含有一定數(shù)量CTC的培養(yǎng)液，37°C培養(yǎng)箱中孵育lh后200 μ L洗滌液(150mmol/LPBS，0.25% Tween20)洗滌三次，加入到細胞培養(yǎng)皿中，多聚甲醛(或甲醛)固定劑DAPI染色后，共聚焦熒光顯微鏡下觀察成像。
[0034]實施例8:
等量的 A 鏈(5，- GTG AAAAA AAAAA GCA -ACA TTC CTA AGT CTG AAA CAT TAC AGCTTG CTA CAC GAG AAG AGC CGC CAT AGT A_3，)， B 鏈(5，-SH_C6- TAT CAC CAG GCA GTTGAC AGT GTA GCA AGC TGT AAT AGA TGC GAG GGT CCA ATA C -3， )， C 鏈(5，-SH_C6- TCAACT GCC TGG TGA TAA AAC GAC ACT ACGTGG GAA TCT ACT ATG GCG GCT CTT C -3， )，D 鏈(5' -SH-C6- TTC AGA CTT AGG AAT GTG CTT CCC ACG TAG TGT CGT TTG TAT TGG ACC CTCGCA T -3，)與 TM buffer (20mM, Tris, 50mM MgCl2, pH 8.0)，充分混勻后，95°C下加熱2min,然后30s內(nèi)迅速降至4°C。
[0035]lmL 15nm金膠溶液中加入20 yL (10 μ M) DNA四面體結(jié)構(gòu)，室溫振蕩過夜后加入lOOmM PB buffer (ρΗ7.4)，終濃度為 10mM，室溫過夜后加入老化液(10 mM PB，2M NaCl,pH7.4)溶液中鹽的終濃度為0.15M。混合物溶液室溫過夜后，4°C 12000rpm/min, 15min，離心洗滌3次后，沉淀物于200 uL,pH7.4 PB (10 mM, 0.15 M NaCl)溶液中重懸浮，4°C保存。
[0036]5μ L 100 μ Μ預成環(huán)DNA與10 μ L 100 μ Μ互補序列加入到0.5mL離心管中混合均勻，90°C下lmin，當管中溶液自然冷卻到室溫時，加入3 μ LT4連接酶及2 μ LT4連接酶緩沖液，25°C環(huán)境下連接16小時以上，結(jié)束后，65°C條件下酶變性lOmin，然后加入3μ LT4聚合酶及6 μ LT4聚合酶緩沖液，將溶液混合均勻后在37°C下反應(yīng)24小時以上。酶作用完全后，在高溫下(85°C)處理lOmin，使得溶液中的所有酶都變性完全。最后用30KD的超濾管超濾(10000rpm/min，5min),收集底部溶液，為含有環(huán)狀DNA的混合溶液。
[0037]Au-DNA四面體中加入8 μ LmilliQ水重懸浮后加入以下溶液:環(huán)DNA(6 μ L)，dNTPs(2 μ L, 10 mM), RCA buffer (2 μ L，10X)，phi29 polymerase (2 μ L, 10 U/μ L)，混合溶液終體積為20 μ L。然后30° C水浴中擴增30 min。所得產(chǎn)物離心洗滌三次后，加入50 μ L含有一定數(shù)量CTC的培養(yǎng)液，37°C培養(yǎng)箱中孵育lh后200 yL洗滌液(150mmol/L PBS，0.25%Tween20)洗滌三次，加入到細胞培養(yǎng)皿中，多聚甲醛(或甲醛)固定劑DAPI染色后，共聚焦熒光顯微鏡下觀察成像。
【權(quán)利要求】
1.一種納米粒子表面用DNA四面體為支架并引發(fā)滾環(huán)擴增反應(yīng)的方法，其特征在于，制備好的DNA四面體組裝在納米粒子表面后，DNA四面體上延伸出的一段單鏈DNA可作為引物DNA，使用與特定aptamer序列互補的環(huán)形DNA作為擴增模板，與引物DNA雜交并引發(fā)滾環(huán)擴增反應(yīng)，制備的產(chǎn)物為納米粒子表面多apatmer結(jié)構(gòu)組成的多條長單鏈DNA,通過aptamer與細胞表面特定受體的結(jié)合從而用作細胞檢測、捕獲及細胞成像探針。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述納米粒子表面用DNA四面體為支架并引發(fā)滾環(huán)擴增反應(yīng)的方法，其特征在于，所述的DNA四面體為四條單鏈DNA通過DNA雜交，自組裝而成的一種四面體結(jié)構(gòu)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述納米粒子表面用DNA四面體為支架并引發(fā)滾環(huán)擴增反應(yīng)的方法，其特征在于，所述的納米粒子為納米金、量子點、磁性納米粒子中的一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述納米粒子表面用DNA四面體為支架并引發(fā)滾環(huán)擴增反應(yīng)的方法，其特征在于，所述的DNA四面體組裝在納米粒子表面為巰基修飾的DNA四面體通過Au-S鍵，或NH2-修飾的DNA四面體通過縮合反應(yīng)等組裝在納米金表面或有含-COOH基的納米粒子表面。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米粒子表面用DNA四面體為支架并引發(fā)滾環(huán)擴增反應(yīng)的方法，其特征在于，所述的延伸的一段單鏈DNA，為10-30個堿基的一段DNA序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述納米粒子表面用DNA四面體為支架并引發(fā)滾環(huán)擴增反應(yīng)的方法，其特征在于，所述的特定aptamer序列為在受體存在的情況下可與其特異性結(jié)合的一段DNA序列，如可與循環(huán)腫瘤細胞表面受體(EpCAM)結(jié)合的aptamer結(jié)構(gòu)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述納米粒子表面用DNA四面體為支架并引發(fā)滾環(huán)擴增反應(yīng)的方法，其特征在于，所述的擴增模板為含有一段非aptamer互補的DNA無關(guān)序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述納米粒子表面用DNA四面體為支架并引發(fā)滾環(huán)擴增反應(yīng)的方法，其特征在于，所述的多apatmer結(jié)構(gòu)組成的多條長單鏈DNA為aptamer結(jié)構(gòu)與無關(guān)序列間隔出現(xiàn)的DNA單鏈，無關(guān)序列可降低aptamer與受體結(jié)合的位阻效應(yīng)。
【文檔編號】C12Q1/68GK104388563SQ201410661164
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年11月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月19日
【發(fā)明者】何丹農(nóng), 顏娟, 胡沖婭 申請人:上海納米技術(shù)及應(yīng)用國家工程研究中心有限公司