專利名稱：來自有蹄動物胚胎的培養(yǎng)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞系的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了新的培養(yǎng)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(CICM)細(xì)胞、細(xì)胞系，以及它們的制備方法。在延長培養(yǎng)期間，本發(fā)明的培養(yǎng)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(CICM)具有與發(fā)育中胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)相似的形態(tài)，并與其同樣或高度相似地表達(dá)細(xì)胞標(biāo)記。這些培養(yǎng)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(CICM)是通過新的培養(yǎng)技術(shù)和/或通過導(dǎo)入可調(diào)節(jié)的分化抑制基因(DI)而產(chǎn)生的?？蓪⒈景l(fā)明的培養(yǎng)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(CICM)細(xì)胞系用于生產(chǎn)分化細(xì)胞、組織、器官和/或整只動物，優(yōu)選有蹄動物，理想的是那些已被遺傳修飾從而基因組中含有合適的異源DNA、或已經(jīng)選擇得到的含有遺傳理想性狀的分化細(xì)胞、組織、器官和/或整只動物。這項(xiàng)工作是利用體外培養(yǎng)技術(shù)或通過嵌合或核移植胚胎、胎兒和/或后代來完成的。而且，此培養(yǎng)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(CICM)細(xì)胞也可用于克隆(核移植過程)以產(chǎn)生在遺傳上完全相同的胚胎、胎兒和/或后代。
背景技術(shù)：
在體外從早期植入前小鼠胚胎中得到胚胎干細(xì)胞系(ES cell lines)的方法是眾所周知的(可見如，Evans等，自然，29:154-156(1981)；Martin，美國國家科學(xué)院院報(bào)，78:7634-7638(1981))。只要存在成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層(Evans，等，出處同前)或分化抑制源(Smith等，發(fā)育生物學(xué)，121:1-9(1987))，即可在未分化狀態(tài)下對ES細(xì)胞進(jìn)行傳代。
以前已有報(bào)道表明ES細(xì)胞有許多應(yīng)用。例如，曾有報(bào)道說ES細(xì)胞可用做研究分化、尤其是研究參與早期發(fā)育調(diào)節(jié)的基因的體外模型。當(dāng)小鼠ES細(xì)胞被引入植入前的小鼠胚胎中時(shí)，它們能產(chǎn)生種系嵌合體，這證明了小鼠ES細(xì)胞的多潛能性(Bradley等，自然，309:255-256(1984))。
由于ES細(xì)胞具有將其基因組傳遞給下一代的能力，通過利用含有或不含有所需遺傳修飾的ES細(xì)胞，在牲畜的種系加工中具有潛在的效用。而且，就牲畜類動物如有蹄動物而言，來自類似植入前的牲畜胚胎的核可以支持去核卵母細(xì)胞發(fā)育完整(Smith等，Biol.Reprod.,40:1027-1035(1989)；和Keefer等，Biol.Reprod.,50:935-939(1994))。這一情況與據(jù)報(bào)道8細(xì)胞期以外的小鼠胚胎的核轉(zhuǎn)移后不能支持去核卵母細(xì)胞發(fā)育的結(jié)果相反(Cheong等，Biol.Reprod.,48:958(1993))。因此，由于來自牲畜類動物的ES細(xì)胞可以為核移植過程提供經(jīng)遺傳操作或未經(jīng)操作的全能性供體核的可能來源，這種ES細(xì)胞是非常合乎需要的。
許多研究組報(bào)道了據(jù)稱為多能性的胚胎細(xì)胞系的分離。例如，Notarianni等，J.Reprod.Fert.Suppl.,43:255-260(1991)報(bào)道了來自豬和綿羊胚泡的據(jù)稱是穩(wěn)定的多能性細(xì)胞系的建立，該細(xì)胞系顯示出與經(jīng)免疫外科術(shù)自綿羊胚泡分離的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的原代培養(yǎng)物中的細(xì)胞相似的一些形態(tài)和生長特性(出處同前)。還有，Notarianni等，J.Reprod.Fert.Suppl.,41:51-56(1990)公開了來自豬胚泡的、被認(rèn)為是多能性胚胎細(xì)胞系在培養(yǎng)中的維持和分化。此外，Gerfen等，動物生物技術(shù)，6(1):1-14(1995)公開了從豬胚泡分離胚胎細(xì)胞的方法。在不使用條件培養(yǎng)基的情況下，這些細(xì)胞可在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層中穩(wěn)定地維持。據(jù)報(bào)道這些細(xì)胞在培養(yǎng)過程中分化為幾種不同的細(xì)胞類型(Gerfen等，出處同前)。
另外，Saito等，Roux′s Arch.Dev.Biol.,201:134-141(1992)，報(bào)道了培養(yǎng)的牛胚胎干細(xì)胞樣細(xì)胞系，該細(xì)胞系經(jīng)過三次傳代仍能存活，但第4次傳代后就會丟失。更進(jìn)一步的是，Handyside等，在Roux′s Arch.Dev.Biol.,196:185-190(1987)公開了在可允許從小鼠內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離小鼠ES細(xì)胞系的條件下，培養(yǎng)經(jīng)免疫外科術(shù)分離的綿羊胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的方法。Handyside等，(1987)(出處同前)報(bào)道了在這樣的條件下，綿羊內(nèi)細(xì)胞團(tuán)附著、鋪開并發(fā)育成ES細(xì)胞樣和內(nèi)胚層樣細(xì)胞區(qū)，但在延長培養(yǎng)后，只有內(nèi)胚層樣細(xì)胞是明顯可見的(出處同前)。
最近，Cherny等，Theriogenology,41:175(1994)報(bào)道了長期培養(yǎng)物中維持的來源于牛原始生殖細(xì)胞的細(xì)胞系，據(jù)稱該細(xì)胞系是多能性的。在培養(yǎng)約7天后，這些細(xì)胞產(chǎn)生對堿性磷酸酯酶(AP)呈陽性著色的ES樣集落，顯示出形成胚狀體的能力，并自發(fā)分化成至少兩種不同的細(xì)胞類型。據(jù)報(bào)道這些細(xì)胞還表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子OCT4、OCT6和HES1的mRNA，這被認(rèn)為是僅ES細(xì)胞中存在的同源框基因(homeobox genes)表達(dá)模式。
同樣最近，在一個(gè)摘要中，Campbell等Theriogenology,43:181(1995)報(bào)道了九日齡綿羊胚胎來源的、在可促進(jìn)小鼠ES細(xì)胞系分離的條件下培養(yǎng)的胎盤(ED)細(xì)胞進(jìn)行核移植后，可生產(chǎn)出活的小羊?；谒麄兊膶?shí)驗(yàn)結(jié)果，作者斷定來自第9天的綿羊胚胎的ED細(xì)胞在核移植中是全能性的，而且高達(dá)3次傳代后的培養(yǎng)物仍保持了全能性。
甚至更近一些，Campbell等，自然，380:64-68(1996)報(bào)道了通過核移植從培養(yǎng)細(xì)胞系中克隆綿羊。他們使用的細(xì)胞與本發(fā)明的培養(yǎng)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(CICM)細(xì)胞不同。Campbell等人所用的細(xì)胞在組織培養(yǎng)中形成單層，而本發(fā)明中的CICM細(xì)胞則并非如此。作者指出這些細(xì)胞好象“被弄平”了，或呈現(xiàn)出一種“上皮狀”的外觀。相反，本發(fā)明的CICM細(xì)胞在以未分化狀態(tài)生長時(shí)，能繼續(xù)保持為多層集落或集落部分。此外，Campbell等人所用的細(xì)胞為細(xì)胞角蛋白和層粘連蛋白A/C陽性。相反地，本發(fā)明的CICM細(xì)胞為細(xì)胞角蛋白陰性。
此外，并無跡象顯示Campbell等人的細(xì)胞是未分化的。確切地說，此參考文獻(xiàn)只指出了這些細(xì)胞在核移植過程中是有用的。還有，這些細(xì)胞并非在與成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層保持經(jīng)常接觸的條件下培養(yǎng)的。確切地說，Campbell等人(1996)的培養(yǎng)細(xì)胞在培養(yǎng)過程中明顯地將成纖維細(xì)胞推到邊上，而它們自己生長在培養(yǎng)板的上面。
Van Stekelenburg-Hamers等人，Mol.Reprod.Dev.,40:444-454(1995)報(bào)道了來自牛胚泡內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞的據(jù)稱是永久細(xì)胞系的分離和鑒定。作者在不同的條件下從第8或9天的牛胚泡中分離和培養(yǎng)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)，以確定哪一種飼養(yǎng)細(xì)胞和培養(yǎng)基對支持牛內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)細(xì)胞附著和生長是最有效的。基于其實(shí)驗(yàn)結(jié)果，他們斷定，通過使用STO(小鼠成纖維細(xì)胞)飼養(yǎng)細(xì)胞(取代牛子宮上皮細(xì)胞)和利用去炭血清(優(yōu)于正常血清)補(bǔ)加到培養(yǎng)基中，培養(yǎng)ICM細(xì)胞的附著和生長能力得到了提高。然而，Van Stekelenbury等人報(bào)道，他們的細(xì)胞系更象是上皮細(xì)胞，而不太象多能性ICM細(xì)胞(出處同前)。
更進(jìn)一步的是，Smith等人，1994年10月27日公開的WO94/24274,Evans等人，1990年4月5日公開的WO90/03432，以及Wheeler等人，1994年11月24日公開的WO94/26889，均報(bào)道了據(jù)稱能用于制作轉(zhuǎn)基因動物的動物干細(xì)胞的分離、篩選和增殖。公開于1990年4月5日的WO90/03432(Evans等人)也報(bào)道了來自豬和牛品種的、據(jù)稱具有多能性的胚胎干細(xì)胞的獲得，據(jù)稱該胚胎干細(xì)胞對于轉(zhuǎn)基因動物的制作是有用的。此外，發(fā)表于1994年11月24日的WO94/26884(Wheeler等人)公開了據(jù)稱對于嵌合體和轉(zhuǎn)基因有蹄動物的制作有用的胚胎干細(xì)胞。因此，從上述內(nèi)容可以明顯看到，由于ES細(xì)胞系在如克隆胚胎或轉(zhuǎn)基因胚胎的產(chǎn)生以及核移植中具有潛在應(yīng)用，許多研究小組已在試圖生產(chǎn)ES細(xì)胞系。
有蹄動物內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)細(xì)胞在核移植中的使用也已有報(bào)道。例如，Collas等人在Mol.Reprod.Dev.,38:264-267(1994)中公開了通過將裂解的供體細(xì)胞顯微注射入去核的成熟卵母細(xì)胞中而進(jìn)行的牛內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞的核移植。該文述及，將胚胎體外培養(yǎng)7天以產(chǎn)生十五個(gè)胚泡，將這些胚泡植入牛受體后，結(jié)果有4只受孕，出生兩只小牛。Keefer等人在Biol.Reprod.,50:935-939(1994)中也公開了將牛內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)細(xì)胞用作核移植中的核供體以產(chǎn)生胚泡，將這些胚泡移植入牛受體后，結(jié)果產(chǎn)生了若干活后代。此外，Sims等人在美國國家科學(xué)院院報(bào)，90:6143-6147(1993)中述及，通過將短期體外培養(yǎng)的牛內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)細(xì)胞的核移植到去核的成熟卵母細(xì)胞中，可產(chǎn)生小牛。
除此之外，也有報(bào)道表明，短期培養(yǎng)的胎盤細(xì)胞(多達(dá)三次傳代)經(jīng)核移植后產(chǎn)生了活的小羊(Campbell等，Theriogenology,43:181(1995))。另外還有有關(guān)在核移植中使用牛多能性胚胎細(xì)胞和產(chǎn)生嵌合胎兒的報(bào)道(Stice等，Theriogenology,41:301(1994))。
盡管前述文獻(xiàn)已有有關(guān)報(bào)道，然而，對具有改良特性如與發(fā)育中胚胎、尤其是有蹄動物胚胎的ICM細(xì)胞的形態(tài)特征相同或基本相似，且同樣或基本相似地表達(dá)細(xì)胞標(biāo)記的培養(yǎng)ICM細(xì)胞和細(xì)胞系仍然存在很大的需求。此外，在本領(lǐng)域內(nèi)對生產(chǎn)這些改良的培養(yǎng)ICM細(xì)胞和細(xì)胞系的方法也有很大的需求。
發(fā)明目的本發(fā)明的一個(gè)目的是提供新的和改良的培養(yǎng)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)細(xì)胞和細(xì)胞系。
本發(fā)明的較具體的目的是提供與發(fā)育中胚胎的ICM形態(tài)特征和表達(dá)細(xì)胞標(biāo)記相同或基本相似的新的改良的培養(yǎng)ICM細(xì)胞和細(xì)胞系。
本發(fā)明的一個(gè)更具體的目的是提供具有一定的形態(tài)特征并與發(fā)育中的有蹄動物胚胎的ICM相同或基本相似地表達(dá)細(xì)胞標(biāo)記的新的改良的有蹄動物培養(yǎng)ICM細(xì)胞和細(xì)胞系。
本發(fā)明的另一具體目的是提供改良的培養(yǎng)ICM細(xì)胞和細(xì)胞系，優(yōu)選來自有蹄動物的這類細(xì)胞和細(xì)胞系，它們在延長培養(yǎng)期間具有一定的形態(tài)特征并與發(fā)育中的有蹄動物胚胎的ICM相同或基本相似地表達(dá)細(xì)胞標(biāo)記。
本發(fā)明又一具體目的是提供分離和/或生產(chǎn)這類改良的有蹄動物培養(yǎng)ICM細(xì)胞和細(xì)胞系的新方法。
本發(fā)明的一個(gè)更具體的目的是提供分離和/或生產(chǎn)培養(yǎng)的有蹄動物ICM細(xì)胞或細(xì)胞系(長期培養(yǎng)物則更好)的新方法，所說的ICM細(xì)胞或細(xì)胞系呈現(xiàn)一定的形態(tài)特征并與發(fā)育中的有蹄動物胚胎的ICM相同或基本相似地表達(dá)細(xì)胞標(biāo)記。
本發(fā)明的一個(gè)具體目的是提供培養(yǎng)和篩選呈現(xiàn)一定的形態(tài)特征并與發(fā)育中的有蹄動物胚胎的ICM相同或基本相似地表達(dá)細(xì)胞標(biāo)記的培養(yǎng)的有蹄動物ICM細(xì)胞或細(xì)胞系的新方法，該方法包含以下步驟(ⅰ)用機(jī)械和/或酶促方法獲得胚泡的ICM或從前胚泡期胚胎中獲得ICM祖細(xì)胞；(ⅱ)在飼養(yǎng)層培養(yǎng)物上，優(yōu)選成纖維細(xì)胞上培養(yǎng)所說的ICM；和(ⅲ)從所述培養(yǎng)細(xì)胞中鑒定出具有以下特征的細(xì)胞(a)細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核體積比例較??；(b)有胞質(zhì)小泡；和(c)單個(gè)細(xì)胞較??；
(ⅳ)從剩下的培養(yǎng)細(xì)胞中分離出具有上述特性的細(xì)胞；和(ⅴ)在可使分離細(xì)胞與飼養(yǎng)層直接物理接觸的條件下，將所述分離的細(xì)胞傳代至飼養(yǎng)層、優(yōu)選成纖維細(xì)胞上。
本發(fā)明的一個(gè)更具體目的是通過以下步驟生產(chǎn)改良的培養(yǎng)ICM(ⅰ)通過適當(dāng)?shù)臋C(jī)械和/或酶促方法獲得胚泡期胚胎的ICM，優(yōu)選有蹄動物的胚泡期胚胎的ICM；(ⅱ)在長滿的、優(yōu)選厚的飼養(yǎng)細(xì)胞單層(優(yōu)選含有成纖維細(xì)胞)上培養(yǎng)上述獲得的ICM；(ⅲ)在可以產(chǎn)生多層細(xì)胞集落的條件下培養(yǎng)所述ICM，所說的多層細(xì)胞集落包括第一種基本上位于內(nèi)部的平整上皮樣細(xì)胞群體，以及另一種基本上圍繞著所述內(nèi)層上皮樣細(xì)胞的多層細(xì)胞群體，所說的多層細(xì)胞群體中含有具胞質(zhì)小泡、細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核體積比例較小的、相對較小的細(xì)胞；(ⅳ)通過適當(dāng)?shù)姆墙到庑苑椒ǎ礄C(jī)械和/或酶促方法，將基本上包括在多層細(xì)胞集落周邊的所說的第二種多層細(xì)胞群體分離出來；和(ⅴ)在可使分離細(xì)胞與飼養(yǎng)層直接物理接觸的條件下，將所述分離的細(xì)胞傳代到新的飼養(yǎng)層、優(yōu)選包含成纖維細(xì)胞的飼養(yǎng)層上。
本發(fā)明的另一目的是通過含有下述步驟的方法，提供具有一定的形態(tài)特征并與發(fā)育中的有蹄動物胚胎的ICM相同或基本相似地表達(dá)細(xì)胞標(biāo)記的培養(yǎng)ICM(ⅰ)獲得有蹄動物ICM細(xì)胞或已建好的培養(yǎng)的有蹄動物ICM細(xì)胞系；(ⅱ)將一個(gè)或多個(gè)抑制分化的基因(DI gene)導(dǎo)入所說的ICM細(xì)胞或所說的已建好的ICM細(xì)胞系的核中，優(yōu)選這個(gè)(些)DI基因在誘導(dǎo)型啟動子控制下進(jìn)行表達(dá)；(ⅲ)在可保證所述分化抑制基因(DI gene)表達(dá)的條件下，在飼養(yǎng)層上、優(yōu)選長滿的成纖維細(xì)胞層上培養(yǎng)獲得的轉(zhuǎn)基因ICM細(xì)胞或培養(yǎng)ICM細(xì)胞系；在前述培養(yǎng)方法中使用可表達(dá)一個(gè)或多個(gè)DI基因的ICM細(xì)胞和細(xì)胞系也是本發(fā)明的一個(gè)目的。
本發(fā)明的另一具體目的是將本發(fā)明的改良的培養(yǎng)ICM用于ICM或培養(yǎng)ICM具有適用性的任何用途上，此改良的培養(yǎng)ICM呈現(xiàn)一定的形態(tài)特征并與發(fā)育中的有蹄動物胚胎ICM相同或基本相似地表達(dá)細(xì)胞標(biāo)記。這些用途包括諸如通過體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)分化細(xì)胞、器官和/或整只動物，或者制作嵌合體或核移植胚胎，這些胚胎可以是也可以不是轉(zhuǎn)基因的。
本發(fā)明的一個(gè)具體目的是提供可用于克隆(核移植過程)的培養(yǎng)ICM細(xì)胞，以生產(chǎn)具有遺傳同一性的有蹄動物胚胎、胎兒和/或后代，或制作嵌合的有蹄動物胚胎、胎兒或后代。
本發(fā)明的另一具體目的是將本文中的培養(yǎng)ICM或由此衍生的細(xì)胞系用于所需的異源DNA的整合中，以及將由此產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因的培養(yǎng)ICM用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因有蹄動物胚胎、胎兒和/或后代，或者制作轉(zhuǎn)基因嵌合的有蹄動物胚胎和/或后代。
附圖簡述

圖1是在無飼養(yǎng)層接觸時(shí)生長的培養(yǎng)CICM細(xì)胞的照片，從中可觀察到胚狀體。
圖2是細(xì)胞角蛋白呈陽性的培養(yǎng)CICM細(xì)胞的照片。
圖3是在成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上的CICM細(xì)胞的照片。只經(jīng)過兩天的培養(yǎng)就可見多層細(xì)胞集落。
圖4和圖5是顯示堿性磷酸酯酶陽性而細(xì)胞角蛋白陰性的CICM細(xì)胞集落的照片。
圖6和圖7顯示了在CICM細(xì)胞培養(yǎng)期間獲得的上皮樣細(xì)胞。這些細(xì)胞是堿性磷酸酯酶(AP)陰性而細(xì)胞角蛋白陽性的。
圖8是CICM細(xì)胞集落的照片。該照片顯示出多層細(xì)胞集落正在變平成為上皮樣細(xì)胞片。位于集落中間的細(xì)胞是堿性磷酸酯酶陰性并呈現(xiàn)扁平上皮樣外觀。相反，周邊細(xì)胞較小，呈現(xiàn)多層的形態(tài)并具有胞質(zhì)小泡。
圖9顯示了顯微注射五天后表達(dá)β-半乳糖苷酶構(gòu)建體的培養(yǎng)豬CICM細(xì)胞。
發(fā)明詳述在對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的討論之前，先提供下述定義。
內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞(ICM細(xì)胞)這是早期胚胎發(fā)育過程中即胚泡期產(chǎn)生的兩種截然不同的細(xì)胞類型中的一種，最終形成飼養(yǎng)層的一部分。這些細(xì)胞已知可應(yīng)用于核移植技術(shù)中，以及嵌合和克隆后代的生產(chǎn)中。
滋養(yǎng)外胚層(TE細(xì)胞)指早期胚胎發(fā)育即胚泡期產(chǎn)生的兩種截然不同的細(xì)胞類型中的另一種，最終形成為胎盤的一部分。
ICM祖細(xì)胞這是前胚泡期胚胎中所含有的細(xì)胞，它們發(fā)育成ICM細(xì)胞。
培養(yǎng)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞指在體外培養(yǎng)了一個(gè)延長期時(shí)間的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞。
培養(yǎng)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(CICM或培養(yǎng)ICM)是呈現(xiàn)一定的形態(tài)特征并與發(fā)育中胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞相同或基本相似地表達(dá)細(xì)胞標(biāo)記的細(xì)胞在本發(fā)明中，這是指與發(fā)育中胚胎如有蹄動物胚胎的ICM所呈現(xiàn)的形態(tài)相同或高度相似的培養(yǎng)ICM細(xì)胞。通常，這類細(xì)胞將以小的多層集落的形式生長；然而，如果一個(gè)集落大小超過大約50-100個(gè)細(xì)胞，一些細(xì)胞就可能分化。
與發(fā)育中的有蹄動物胚胎的ICM相同地表達(dá)細(xì)胞標(biāo)記的CICM，是指該CICM以發(fā)育中的有蹄動物胚胎的未分化ICM的特有方式表達(dá)或不表達(dá)細(xì)胞標(biāo)記?？捎糜阼b別合適的CICM的適當(dāng)細(xì)胞標(biāo)記包括諸如細(xì)胞角蛋白，尤其是細(xì)胞角蛋白8和細(xì)胞角蛋白18，酶類如堿性磷酸酯酶，以及其它一些在ICM中表達(dá)的細(xì)胞標(biāo)記，如rex-1、1amin ac和oct4。理想的狀況是，這些細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)水平(如果有的話)與來自有蹄動物胚胎的未分化ICM的表達(dá)水平是一樣的。
與發(fā)育中的有蹄動物胚胎的ICM基本相似地表達(dá)細(xì)胞標(biāo)記的CICM是指該CICM所表達(dá)的細(xì)胞標(biāo)記與未分化的發(fā)育中有蹄動物胚胎ICM所特有的細(xì)胞標(biāo)記大部分相同，例如細(xì)胞角蛋白諸如細(xì)胞角蛋白18，酶類諸如堿性磷酸酯酶，以及其它細(xì)胞標(biāo)記諸如rex-1ac和oct4?；鞠嗨剖侵概c有蹄動物胚胎的未分化ICM相比，本發(fā)明的CICM中有些細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)量可以有所改變，有些細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)方式可以有所不同，只要這種變化不會負(fù)面影響所產(chǎn)生的CICM按照本發(fā)明的方法進(jìn)行培養(yǎng)和維持的能力。
總之，與發(fā)育中有蹄動物胚胎的ICM相同或基本相似地表達(dá)細(xì)胞標(biāo)記的CICM細(xì)胞不會表達(dá)細(xì)胞角蛋白18，但表達(dá)堿性磷酸酯酶。檢測這些細(xì)胞標(biāo)記及其它細(xì)胞標(biāo)記表達(dá)的方法在本領(lǐng)域中是已知的(其中的一些在下文引作參考文獻(xiàn))，包括諸如免疫檢測等方法。例如，基于細(xì)胞與適當(dāng)免疫探針(如可提供特異性檢測的標(biāo)記抗體)的反應(yīng)性，可利用這樣的方法檢測某種特殊細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)與否。
然而，如下文所討論的，細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)可能會存在種類差異(例如，來自豬的CICM是堿性磷酸酯酶(AP)陽性的，而來自牛的CICM絕大多數(shù)是AP陰性的)。而且，本發(fā)明的培養(yǎng)ICM也可能包含正常情況下不包含于ICM中的基因，例如，編碼所需產(chǎn)物的基因和/或一個(gè)或多個(gè)抑制分化的基因。
分化抑制基因在本發(fā)明中，分化抑制基因通常是指可抑制ICM分化的任何核酸序列，包括諸如tsA58基因，以及編碼其它T抗原和癌基因產(chǎn)物、細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子如OCT3、LIF和LIF受體的其它基因。這些分化抑制基因在本領(lǐng)域中是已知的，并且在WO91/13150、Okamoto等，細(xì)胞，60:461(1990)；Rosner等，自然，345:686(1990)和Smith等，自然，336:688(1988)中都有描述，所有這些文章都全文引入本文作為參考。其它的合適基因還包括REX-1(Rodgers等，發(fā)育，113:815-824(1991))和FGF-5(Herbert等，發(fā)育，112:407-415(1991))。
誘導(dǎo)型或可調(diào)型啟動子這是指當(dāng)其與目的結(jié)構(gòu)基因如分化抑制基因有效相連時(shí)可以被“打開”，即在特定條件下可啟動轉(zhuǎn)錄的任何啟動子。通常這要求在培養(yǎng)基中存在或缺乏一種或多種取代物，如金屬離子，或要求有其它特殊的培養(yǎng)條件，如特殊的溫度條件，等等。熟知的誘導(dǎo)型或可調(diào)型啟動子的例子包括反應(yīng)元件，諸如四環(huán)素(WO94/29442)、干擾素(Kimura等，細(xì)胞，44:261(1986))、類固醇和金屬硫蛋白的啟動子(Yarranton,G.T.,Curr.Opin.Biotech.,3:506(1992))、溫度誘導(dǎo)型啟動子等等。這些文獻(xiàn)均全文引入本文作為參考。
飼養(yǎng)細(xì)胞指可被用于獲取和/或增殖未分化的培養(yǎng)ICM細(xì)胞系的任何細(xì)胞。這些飼養(yǎng)細(xì)胞優(yōu)選為成纖維細(xì)胞，更優(yōu)選為小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，例如來自12-16日齡的小鼠胎兒。其它的合適飼養(yǎng)細(xì)胞包括諸如來自有蹄動物的成纖維細(xì)胞和子宮上皮細(xì)胞、小雞成纖維細(xì)胞、大鼠成纖維細(xì)胞、STO和SI-m220飼養(yǎng)細(xì)胞系，以及BRL細(xì)胞。
培養(yǎng)的多層ICM集落指在飼養(yǎng)層上生長的培養(yǎng)ICM的多層集落，它呈現(xiàn)出具有兩種不同且明顯的細(xì)胞群體的多層結(jié)構(gòu)。第一種細(xì)胞群體基本上構(gòu)成了多層細(xì)胞集落的周邊，并且是多層的，這樣的細(xì)胞包括相對較小、具有胞質(zhì)小泡并對AP活性著色呈強(qiáng)陽性的細(xì)胞。另一種細(xì)胞群體基本上包含于此細(xì)胞集落的中間，它基本上由扁平上皮樣細(xì)胞群體組成，這類細(xì)胞的AP活性極小或者沒有。
正如所述，本發(fā)明通常指與以前所報(bào)道的培養(yǎng)ICM相比具有改良特性的培養(yǎng)ICM細(xì)胞和細(xì)胞系。具體地說，這些培養(yǎng)ICM和細(xì)胞呈現(xiàn)一定的形態(tài)特征并與發(fā)育中胚胎的ICM相同或基本相似地表達(dá)細(xì)胞標(biāo)記。
本發(fā)明提供了培養(yǎng)ICM，其具有與發(fā)育中的有蹄動物胚胎的ICM相同或基本相似的新特性組合，該培養(yǎng)ICM具有上文所述的多層細(xì)胞集落形態(tài)，并與發(fā)育中的有蹄動物胚胎的ICM相同或基本相似地表達(dá)細(xì)胞標(biāo)記，例如，它們不表達(dá)細(xì)胞角蛋白18，可能表達(dá)或不表達(dá)堿性磷酸酯酶(取決于具體的品種來源)。
以前的研究者已將堿性磷酸酯酶標(biāo)記或細(xì)胞角蛋白18標(biāo)記獨(dú)立地用于檢測培養(yǎng)細(xì)胞是否與發(fā)育中的有蹄動物ICM具有原來推測的相似性(Piedrahita等，Theriogenology,34:879(1990),Wheeler等，Reprod.Fert.Dev.,6:563(1994)及Talbot等，Mol.Reprod.Dev.,36:139(1993))。因而，本文所制備的CICM中這些細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)很好地證明了可將本發(fā)明的培養(yǎng)技術(shù)用于獲取與發(fā)育中的有蹄動物胚胎的ICM相同或基本相似的ICM。
這與以前所公開的培養(yǎng)ICM如Talbot等人(出處同前)的培養(yǎng)豬ICM相反，后者在體外培養(yǎng)僅兩星期就會分化并失去AP活性。本發(fā)明的培養(yǎng)ICM與Sims等人(出處同前)的培養(yǎng)牛ICM也有所不同，后者只短期培養(yǎng)，但在細(xì)胞懸液體系中被解聚并以單個(gè)細(xì)胞的形式生長。本發(fā)明的培養(yǎng)ICM更不同于前文所述的ES樣細(xì)胞，后者以上皮單層形式生長，且是AP陰性和細(xì)胞角蛋白陽性的。此外，本發(fā)明的培養(yǎng)ICM也不同于Wheeler,Reprod.Fert.Dev.,6:563(1994)和WO94/26884中的ICM，后二者盡管以多層集落形式生長且為細(xì)胞角蛋白陰性(與本發(fā)明的CICM細(xì)胞系相似)，但它們是飼養(yǎng)層非依賴型的。
因而，本發(fā)明提供了新的CICM細(xì)胞和細(xì)胞系，該CICM細(xì)胞和細(xì)胞系若具有正確的形態(tài)和細(xì)胞標(biāo)記特征，應(yīng)是非常適合用于嵌合體和核移植的研究中，以產(chǎn)生分化細(xì)胞、胎兒和后代。通常說來，本文的新CICM細(xì)胞系是通過以下兩種方法中的任意一種而產(chǎn)生的。
第一種方法包括獲取胚泡的ICM或從前胚泡期胚胎中獲取ICM祖細(xì)胞，優(yōu)選來自有蹄動物胚胎。有蹄動物包括許多重要的家畜類動物，如豬、牛、綿羊、馬和山羊。因此，迫切需要可能適合有蹄動物生產(chǎn)的培養(yǎng)有蹄動物細(xì)胞。除此之外，相比于其它已知可有效用于生產(chǎn)培養(yǎng)ICM和轉(zhuǎn)基因動物或克隆動物的物種，如嚙齒類動物，有蹄動物具有更大的優(yōu)越性，因?yàn)樗鼈冊诿庖吆蜕砩隙寂c人類更相近。
胚泡或前胚泡期的有蹄動物胚胎可以通過熟知的方法得到。例如，可以經(jīng)外科剖腹術(shù)，從死后的豬或牛等有蹄動物的生殖道通過外科手術(shù)收集胚泡或前胚泡胚胎，或可通過非外科手術(shù)收集。通常這些胚胎為2-15日齡，優(yōu)選8日齡。收集到胚胎后，部分分離胚泡或前胚泡期有蹄動物胚胎的ICM(如將ICM與滋養(yǎng)層細(xì)胞分離)或任由其保持完整。如果進(jìn)行部分分離，通常是通過適當(dāng)?shù)臋C(jī)械和/或酶促方法如利用培養(yǎng)玻璃針和/或?qū)⑺鼈兣c胰蛋白酶或鏈霉蛋白酶一起保溫等方法來完成。
然后將部分分離的或完整的含有ICM和至少一部分滋養(yǎng)外胚層的胚泡ICM或來自前胚泡期胚胎的ICM祖細(xì)胞置于一合適的有飼養(yǎng)細(xì)胞層的培養(yǎng)基中。來自前胚泡期胚胎的全部細(xì)胞都置于合適的飼養(yǎng)層上。如前所述，飼養(yǎng)細(xì)胞層包括可便于未分化ICM的篩選和/或增殖的任何細(xì)胞層。飼養(yǎng)細(xì)胞層優(yōu)選包含成纖維細(xì)胞，更優(yōu)選來自小鼠胚胎成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)物。然而，我們認(rèn)為可以用成纖維細(xì)胞系或其他類型的成纖維細(xì)胞來代替。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，對于在培養(yǎng)中獲取和增殖未分化CICM細(xì)胞系來說，飼養(yǎng)層的形態(tài)特征是一個(gè)重要因素。更具體地說，已發(fā)現(xiàn)用于培養(yǎng)ICM的培養(yǎng)板優(yōu)選含有一層厚的長滿的飼養(yǎng)細(xì)胞單層，更優(yōu)選厚的長滿的小鼠成纖維細(xì)胞單層。
如實(shí)施例中更為詳細(xì)的論述，飼養(yǎng)層優(yōu)選得自胚胎成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)物，如來自12-16日齡的小鼠胎兒的細(xì)胞。成纖維細(xì)胞的分離方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的。例如，通過無菌去除合適小鼠胎兒的頭、肝臟、心臟和消化道，然后切碎這些小鼠胎兒并在可保證細(xì)胞分離的合適條件(如將其與含有胰蛋白酶的組合物一起保溫)下溫育，然后將分離的成纖維細(xì)胞鋪到含有合適培養(yǎng)基的組織培養(yǎng)板中，可收集到成纖維細(xì)胞。
可以使用適于維持培養(yǎng)的飼養(yǎng)細(xì)胞如小鼠成纖維細(xì)胞的任何培養(yǎng)基。具體地說，本發(fā)明人選擇將成纖維細(xì)胞鋪到組織培養(yǎng)板中，并在補(bǔ)充有10％胎牛血清(FCS)(Hyclone,Logen,UT)、青霉素(100IU/ml)和鏈霉素(50ug/ml)的α-MEM培養(yǎng)基(Bio Whittaker,Walkersville,MD)中培養(yǎng)。然而，估計(jì)也可換用其它培養(yǎng)基，包括諸如補(bǔ)充有谷氨酰胺、葡萄糖、2-巰基乙醇、MEM非必需氨基酸、5-20％血清、抗體、核苷和谷氨酰胺的DMEM培養(yǎng)基(參見Strojek等，Theriogenology 33:981(1990)；Notarianni等，J.Reprod.Fert.43(Suppl):255(1990))，以及CM β和BRL條件培養(yǎng)基(參見Handyside等，Roux′s Arch.Dev.Biol.,196:185(1987))。
培養(yǎng)成纖維細(xì)胞至長滿后，將其傳代到其它的組織培養(yǎng)板上或直接用于培養(yǎng)ICM細(xì)胞和細(xì)胞系。優(yōu)選地，在傳代后加入ICM之前的某一時(shí)間也用一定量的包含于適當(dāng)培養(yǎng)基如α-MEM中的抗生素如絲裂霉素C處理(絲裂霉素C的用量優(yōu)選為5-100ug/ml，更優(yōu)選約10ug/ml)、或者輻射處理飼養(yǎng)細(xì)胞如成纖維細(xì)胞以終止或阻礙成纖維細(xì)胞的生長。
優(yōu)選在允許培養(yǎng)板中細(xì)胞長成鋪滿單層的條件下培養(yǎng)飼養(yǎng)細(xì)胞如成纖維細(xì)胞。例如，為此，可在37℃、濕潤氣氛中如含有5％ CO2的空氣中培養(yǎng)成纖維細(xì)胞。然而，取決于各種因素如飼養(yǎng)細(xì)胞的類型、傳代數(shù)、種類以及其它因素等，具體的培養(yǎng)條件可以有所變化。
如前文所述，隨后將包含所需飼養(yǎng)層最好是厚且長滿的細(xì)胞單層的培養(yǎng)平板用于獲取和培養(yǎng)本發(fā)明的CICM細(xì)胞和細(xì)胞系。優(yōu)選此過程包括將含有至少一部分滋養(yǎng)外胚層的部分分離的或完整的有蹄動物ICM直接鋪到經(jīng)絲裂霉素C處理過的長滿飼養(yǎng)層上。這可通過可促使培養(yǎng)ICM和飼養(yǎng)細(xì)胞之間直接物理接觸的任何方法來完成。為此，可用不同的方法。例如，可使用玻璃吸管起始ICM和成纖維細(xì)胞間的接觸。或者，可通過將ICM細(xì)胞置于飼養(yǎng)層下面、培養(yǎng)板的底部，或通過離心ICM細(xì)胞以使它們直接鋪于飼養(yǎng)細(xì)胞層上而達(dá)到飼養(yǎng)細(xì)胞層和培養(yǎng)ICM之間的物理接觸。
利用可允許ICM的生長和維持并獲得所需的多層集落形態(tài)的任何培養(yǎng)基，在飼養(yǎng)層上培養(yǎng)ICM。優(yōu)選在含有補(bǔ)加了FCS和0.1mM β-巰基乙醇(Sigma)的α-MEM的生長培養(yǎng)基中維持CICM細(xì)胞和細(xì)胞系。然而，也可換用其它培養(yǎng)基，包括諸如前文所公開的培養(yǎng)基。
在培養(yǎng)期間，必要時(shí)將生長培養(yǎng)基換成新鮮培養(yǎng)基以利于細(xì)胞生長。通常每2-3天換液一次。然而，根據(jù)具體的飼養(yǎng)細(xì)胞和所選用的培養(yǎng)基的情況，換液間隔時(shí)間可以有所不同。培養(yǎng)數(shù)天(通常約4天)后，可觀察到最早的培養(yǎng)ICM或CICM集落，然后在此后的某個(gè)時(shí)間，通常至少約1天后，可將培養(yǎng)ICM傳代到含有成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層的其它培養(yǎng)板上。
也已發(fā)現(xiàn)，若將CICM細(xì)胞與一些相連的飼養(yǎng)細(xì)胞一起傳代至新的飼養(yǎng)層上，其傳代效率會有所提高。因此，新代細(xì)胞含有一些來自前代的飼養(yǎng)細(xì)胞。將CICM細(xì)胞與一些相連飼養(yǎng)細(xì)胞(成纖維細(xì)胞)一起傳代時(shí)，已發(fā)現(xiàn)傳代效率(可形成新集落的CICM細(xì)胞團(tuán)的百分比)有了明顯提高。
如上所述，本發(fā)明的一個(gè)重要內(nèi)容包括發(fā)現(xiàn)優(yōu)選對含有特定形態(tài)特征組合的CICM細(xì)胞進(jìn)行傳代，以及生產(chǎn)具有所需特性的培養(yǎng)ICM細(xì)胞和細(xì)胞系。具體地說，優(yōu)選具有下述形態(tài)特征的細(xì)胞(ⅰ)細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核的體積比例較小(約10/90-50/50，更優(yōu)選約10/90-30/70，最優(yōu)選約25/75)；(ⅱ)可見胞質(zhì)小泡；和(ⅲ)單個(gè)細(xì)胞較小，直徑約10-20μm、優(yōu)選小于約15μm。
在顯微鏡下觀察培養(yǎng)細(xì)胞、適當(dāng)測量并進(jìn)行適當(dāng)?shù)捏w積計(jì)算，可容易確定細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核體積比的計(jì)算值。類似地，在培養(yǎng)細(xì)胞中可很容易觀察到胞質(zhì)小泡。最后，通過測量包含于飼養(yǎng)層培養(yǎng)物上的CICM的細(xì)胞直徑可容易地測出細(xì)胞大小。
本發(fā)明人已驚奇地發(fā)現(xiàn)，對分離和增殖培養(yǎng)ICM細(xì)胞，以及生產(chǎn)具有所期望的形態(tài)和細(xì)胞標(biāo)記特性且在組織培養(yǎng)延長期間(即重復(fù)傳代后)仍保持這些特性的細(xì)胞系而言，上述形態(tài)特征是很重要的。
更具體地說，本發(fā)明是基于觀察到當(dāng)ICM或傳代的CICM細(xì)胞系開始附著于飼養(yǎng)層上時(shí)，不久(通常約2天后)就可見到一些多層集落。可是，當(dāng)細(xì)胞在體外增殖時(shí)，這些多層集落通常會開始變平形成上皮片狀細(xì)胞。與此觀察結(jié)果相關(guān)，已發(fā)現(xiàn)包含于集落多層部分的細(xì)胞是AP陽性和細(xì)胞角蛋白18陰性的，而扁平上皮樣細(xì)胞則為AP陰性和細(xì)胞角蛋白18陽性。因此上皮樣細(xì)胞與發(fā)育中胚胎的ICM表達(dá)細(xì)胞標(biāo)記有所不同。相應(yīng)地，已發(fā)現(xiàn)在飼養(yǎng)細(xì)胞層上超時(shí)培養(yǎng)的ICM逐漸顯示出與未分化的發(fā)育中胚胎的ICM不一致的形態(tài)和表達(dá)細(xì)胞標(biāo)記情況。這種情況是不合乎需要的，因?yàn)榕c發(fā)育中胚胎的未分化ICM特性相同或基本相似的CICM才有可能是全能性的，從而在嵌合和核移植(NT)技術(shù)中有所用處。
因此本發(fā)明的目標(biāo)是開發(fā)可保持或回復(fù)這些ICM細(xì)胞集落以使它們含有所期望的多層集落形態(tài)的培養(yǎng)方法。根據(jù)所描述的ICM集落的形態(tài)可以推論，應(yīng)可分離出特定細(xì)胞并用于傳代，這些分離細(xì)胞有可能會生成具有所期望的多層形態(tài)的培養(yǎng)ICM。
如上面所提到的，觀察到盡管生長的ICM細(xì)胞集落開始完全是多層的，但它們很快變平并在集落中產(chǎn)生具有兩種截然不同的細(xì)胞群體的上皮細(xì)胞片。第一類群體包含于細(xì)胞集落的外周并具有多層結(jié)構(gòu)，其中包括具有以下形態(tài)特征的細(xì)胞(ⅰ)細(xì)胞尺寸較小(直徑約為10-20μm，優(yōu)選小于15μm的細(xì)胞)；
(ⅱ)可觀察到胞質(zhì)小泡；和(ⅲ)細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核的體積比例較小(約10/90-50/50，優(yōu)選約10/90-30/70，最優(yōu)選約25/75)。
也發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞集落的外圍部分對AP活性呈著色強(qiáng)陽性。相反地，集落中間的細(xì)胞趨向于含有極少或無AP活性的扁平上皮樣細(xì)胞。
基于可觀察到AP活性和多層結(jié)構(gòu)，本發(fā)明人決定選擇性地僅對或基本上僅對細(xì)胞集落的外周細(xì)胞特別是細(xì)胞質(zhì)體積/細(xì)胞核的體積比例較小、其中可觀察到胞質(zhì)小泡并且細(xì)胞尺寸較小(如前文所限定)的細(xì)胞進(jìn)行傳代，以期這些培養(yǎng)細(xì)胞可產(chǎn)生具有所期望形態(tài)的額外的多層CICM細(xì)胞集落。然而，這一結(jié)果還未完全確定。相反地，這種傳代反而可能產(chǎn)生完全由扁平上皮樣細(xì)胞組成的集落；當(dāng)觀察到的上皮樣外觀和改變的細(xì)胞標(biāo)記表達(dá)情況是在體外超延長期培養(yǎng)的結(jié)果或ICM細(xì)胞傳代的結(jié)果時(shí)尤為如此。
相當(dāng)令人驚奇的是，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，對包含于多層細(xì)胞集落外圍、具有上述形態(tài)特征的細(xì)胞選擇性地傳代，產(chǎn)生了ICM多層集落。除此之外，本發(fā)明人還驚奇地發(fā)現(xiàn)這些多層集落含有與發(fā)育中胚胎的ICM同樣或基本相似地表達(dá)細(xì)胞標(biāo)記的細(xì)胞。而且，還發(fā)現(xiàn)本發(fā)明方法為理論上無限地生產(chǎn)與發(fā)育中的有蹄動物胚胎的ICM形態(tài)和表達(dá)細(xì)胞標(biāo)記相同或基本相似的CICM提供了可能。按照本發(fā)明產(chǎn)生的CICM在培養(yǎng)的延長期間即經(jīng)至少一次傳代、優(yōu)選約5-10次傳代后、更優(yōu)選約10-50次傳代后仍保持這類特性。
可通過已知的細(xì)胞分離方法對具有所需形態(tài)特征的細(xì)胞進(jìn)行選擇性傳代。舉例說，可通過物理學(xué)途徑如利用玻璃吸管或細(xì)針將構(gòu)成集落周邊的多層部分與集落中間部分分離，隨后可通過物理和/或化學(xué)和/或酶促方法進(jìn)一步分離上面產(chǎn)生的大細(xì)胞團(tuán)。例如，可利用酶如胰蛋白酶或鏈霉蛋白酶實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的分離?；蛘呖赏ㄟ^利用細(xì)胞吸管反復(fù)吸取大的細(xì)胞群或細(xì)胞塊，或使用針或剃刀片將大細(xì)胞塊切成更小塊而對細(xì)胞進(jìn)行機(jī)械分離。優(yōu)選地，這樣的化學(xué)和/或機(jī)械細(xì)胞分離可產(chǎn)生適于傳代的CICM群，即包含約5-100個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞群。
用于傳代的分離細(xì)胞優(yōu)選由包含于細(xì)胞集落的多層周邊部分(優(yōu)選具有上述形態(tài)特征)的細(xì)胞所組成。然而，在有些情況下，按本發(fā)明進(jìn)行處理后，甚至來自細(xì)胞集落內(nèi)部的細(xì)胞在傳代至新的飼養(yǎng)層上后也能產(chǎn)生多層集落。
人們認(rèn)為造成這一現(xiàn)象是由于傳代過程或由于與新的飼養(yǎng)層之間重新建立了細(xì)胞-細(xì)胞間接觸而使細(xì)胞回復(fù)到所期望的多層集落。但是，本發(fā)明人不希望被他們的觀念所束縛。
在傳代過程中，有必要將小的ICM細(xì)胞或細(xì)胞群直接與飼養(yǎng)層接觸以阻止CICM集落分化。已發(fā)現(xiàn)如果這些細(xì)胞或細(xì)胞群生長時(shí)未與飼養(yǎng)層充分接觸，將會產(chǎn)生胚狀體。這樣的胚狀體可見于圖1中，該圖是一張顯示了未與飼養(yǎng)層充分接觸時(shí)生長的培養(yǎng)ICM細(xì)胞的照片。
為促使直接接觸，可使用能保證傳代CICM細(xì)胞和飼養(yǎng)細(xì)胞層間直接細(xì)胞接觸的任何方法，該方法對CICM是非降解性的，而且對集落產(chǎn)生沒有不利影響。效率最低的方法是簡單地將小細(xì)胞塊置于飼養(yǎng)層上面。更優(yōu)選使用可確保CICM細(xì)胞和飼養(yǎng)層間更有效的細(xì)胞-細(xì)胞接觸的方法。已發(fā)現(xiàn)這樣能產(chǎn)生更多的多層CICM細(xì)胞集落。
可使用能促使CICM細(xì)胞和飼養(yǎng)細(xì)胞間形成更強(qiáng)的物理接觸的任何物理學(xué)方法，但這種方法應(yīng)不是過分破壞性的，即對產(chǎn)生所需多層類型細(xì)胞和CICM細(xì)胞系沒有不利影響。舉例來說，可提高傳代的CICM與飼養(yǎng)層間直接接觸的方法包括利用吸管將單個(gè)的細(xì)胞塊壓到飼養(yǎng)層上；將CICM細(xì)胞群置于飼養(yǎng)層下面以使該細(xì)胞夾在飼養(yǎng)層和平板底部之間；以及將細(xì)胞塊離心到飼養(yǎng)層上，如在100-5000g離心約10分鐘-5小時(shí)以使細(xì)胞塊貼到飼養(yǎng)層上。這些方法僅僅是可用于迫使CICM細(xì)胞塊與飼養(yǎng)層緊密接觸的多種方法中的幾個(gè)示例。也可換用其它方法，只要那些方法對所期望的多層CICM細(xì)胞集落的形成沒有不利影響。如前面所論述的，還發(fā)現(xiàn)通過將CICM細(xì)胞與一些相連的飼養(yǎng)細(xì)胞一起傳代到新的飼養(yǎng)集落上可以進(jìn)一步提高傳代效率。顯而易見，來自前代的一些飼養(yǎng)細(xì)胞的存在提高了產(chǎn)生新集落的CICM細(xì)胞塊的百分比。
一般說來，以上培養(yǎng)CICM細(xì)胞的培養(yǎng)方法適用于任何有蹄動物來源的CICM細(xì)胞。例如，最初發(fā)現(xiàn)適合培養(yǎng)豬CICM細(xì)胞的方法已發(fā)現(xiàn)也適用于牛CICM細(xì)胞。然而，可觀察到的一個(gè)區(qū)別就是來自牛胚胎的大部分細(xì)胞是AP陰性，而來自豬胚胎的那些細(xì)胞則是AP陽性的。推測牛和豬ICM在AP表達(dá)上可能存在種間差異。但這一假設(shè)尚未證實(shí)，因?yàn)楸景l(fā)明人已生產(chǎn)出一個(gè)具有弱AP陽性且以小團(tuán)塊生長的牛細(xì)胞系(見圖2)。
而且，所述牛細(xì)胞與所述豬細(xì)胞不同之處還在于其集落邊界不易區(qū)分。然而，與豬來源的細(xì)胞相似，包含于集群周邊區(qū)的牛來源細(xì)胞是AP陽性的而集落中間的細(xì)胞則趨向于喪失AP活性。這一點(diǎn)也可通過重新參考圖2而觀察到。與豬來源的CICM類似，這些細(xì)胞是細(xì)胞角蛋白18陰性的。
如實(shí)施例所示和下文更詳盡的描述，本發(fā)明的CICM在異源DNA的引入中是有用處的。具體地說，已經(jīng)獲得了基因組中包含有異源DNA(β-半乳糖苷酶DNA構(gòu)建體)的轉(zhuǎn)基因CICM細(xì)胞系。本發(fā)明人最近使用上述培養(yǎng)方法也得到了與所述的CICM細(xì)胞在形態(tài)、分化能力、內(nèi)源β-半乳糖苷酶活性水平(更高)和表達(dá)β-半乳糖苷酶DNA構(gòu)建體的能力上稍微有些不同的細(xì)胞。另外，這些細(xì)胞從開始培養(yǎng)時(shí)就是AP陰性的，而前面提到的豬CICM細(xì)胞則是在培養(yǎng)過程中隨時(shí)間推移而趨向于失去AP活性。在來自于牛的CICM中也觀察到類似的細(xì)胞并對它們進(jìn)行了增殖。盡管這些細(xì)胞沒有AP活性，它們還是呈現(xiàn)出一些與ICM細(xì)胞一致的特性。因此，它們在轉(zhuǎn)基因克隆胚胎的產(chǎn)生中、以及其它所說的CICM的應(yīng)用中也可能是有用的。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了制備具有所期望的形態(tài)和細(xì)胞標(biāo)記特征的培養(yǎng)ICM細(xì)胞和細(xì)胞系，如AP陽性和細(xì)胞角蛋白18陰性的CICM。這第二種方法也包括獲取和培養(yǎng)ICM(優(yōu)選從飼養(yǎng)層培養(yǎng)物上的有蹄動物胚泡或前胚泡期胚胎)。優(yōu)選的培養(yǎng)技術(shù)和傳代方法如上文所述。
然而，這第二種方法在事實(shí)上有所不同，其培養(yǎng)ICM細(xì)胞會表達(dá)分化抑制基因(DIgene)(更好是只在特定條件下進(jìn)行表達(dá))。為此，優(yōu)選通過在培養(yǎng)或傳代過程中的某一階段將包含一分化抑制基因的核酸序列導(dǎo)入ICM細(xì)胞而完成，更好是該分化抑制基因在誘導(dǎo)型或可調(diào)型啟動子控制下進(jìn)行表達(dá)。
如上文所提到的，DI基因指可抑制CICM細(xì)胞集落中細(xì)胞分化并且對分離具有所期望的形態(tài)特征和細(xì)胞標(biāo)記表達(dá)的CICM細(xì)胞系不會有不利影響的任何一個(gè)或多個(gè)基因?？蓪I基因(優(yōu)選以適當(dāng)?shù)拈喿x框架與可調(diào)型或誘導(dǎo)型啟動子有效連接)導(dǎo)入傳代過程中衍生CICM細(xì)胞系的胚胎細(xì)胞的核中，或者導(dǎo)入已建立好的CICM細(xì)胞系中。
可通過將DI基因(或準(zhǔn)確地說是轉(zhuǎn)基因)整合入胚胎ICM或培養(yǎng)ICM細(xì)胞或細(xì)胞系的基因組中的方式而達(dá)到上述目的。將目的DNA引入哺乳動物細(xì)胞尤其是胚胎細(xì)胞的方法在本領(lǐng)域中是已知的，包括諸如顯微注射、電穿孔、脂轉(zhuǎn)染、逆轉(zhuǎn)錄病毒插入、鈣沉淀和脂質(zhì)體插入等方法。到目前為止，顯微注射看起來是將DNA引入CICM細(xì)胞系的最有效方法。然而，我們認(rèn)為其它的方法經(jīng)適當(dāng)?shù)膬?yōu)化后也將是有效的。
適用于本發(fā)明的抑制基因包括諸如tsA58(見WO91/13150)、已知可抑制分化的其它T抗原和癌基因產(chǎn)物(見WO91/13150中的實(shí)施例)、OCT3(Okamoto等，細(xì)胞，60:461(1990),Rosner等，自然，345:686(1990))、LIF和LIF受體(Smith等，自然，336:688(1988))等。這些DI基因僅僅是可用于本發(fā)明的DI基因的一些例子。
優(yōu)選將DI基因置于誘導(dǎo)型或可調(diào)型啟動子的控制下。正如所提到的，本領(lǐng)域熟知誘導(dǎo)型啟動子的例子，包括諸如金屬硫蛋白啟動子(金屬離子誘導(dǎo)型)，以及四環(huán)素、干擾素和類固醇的應(yīng)答元件(見WO94/29442；Kimura等，細(xì)胞，44:261(1986)；Yarranton,Curr.Opm.Biotech,3:506(1992))。
轉(zhuǎn)移基因被整合入胚胎或培養(yǎng)ICM細(xì)胞或細(xì)胞系中，并在飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)物上建立起由此得到的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞后，通過誘導(dǎo)特定的誘導(dǎo)型啟動子可啟動DI基因。這通常是通過調(diào)整培養(yǎng)條件來完成。例如，如果該啟動子是金屬硫蛋白啟動子，則可通過加入含有適當(dāng)?shù)目烧T導(dǎo)(啟動)該啟動子的金屬離子的培養(yǎng)基而進(jìn)行誘導(dǎo)。因而，在誘導(dǎo)條件下培養(yǎng)時(shí)，該培養(yǎng)ICM細(xì)胞在組織培養(yǎng)物中應(yīng)持續(xù)或長期保持所期望的CICM細(xì)胞形態(tài)和基因表達(dá)特征。更具體地說，所述細(xì)胞應(yīng)該具有所期望的多層細(xì)胞集落形態(tài)，并與發(fā)育中胚胎的ICM表達(dá)細(xì)胞標(biāo)記相同或基本相似，即通常這些細(xì)胞是AP陽性和細(xì)胞角蛋白(細(xì)胞角蛋白18)陰性。因此，應(yīng)可以將諸如ICM細(xì)胞集落分化為AP陰性和細(xì)胞角蛋白18陽性的扁平上皮細(xì)胞片(當(dāng)ICM在常規(guī)條件下培養(yǎng)時(shí)可觀察到這些現(xiàn)象)之類的問題減到最小或甚至消除。而且這也可以避免ICM細(xì)胞在傳代期間和維持培養(yǎng)期間發(fā)生分化。
用上述方法得到的培養(yǎng)ICM細(xì)胞和細(xì)胞系有許多用途。最特別的是，可將這些CICM細(xì)胞系用于產(chǎn)生具有全部或部分CICM遺傳組成的后代。
通過將CICM細(xì)胞直接注射入受體胚胎的囊胚腔中或?qū)⑵渑c前胚泡期胚胎相結(jié)合，可獲得嵌合后代。隨后將由此產(chǎn)生的嵌合胚胎植入雌性受體中。由此獲得的后代在所有器官系統(tǒng)包括生殖器官的生殖細(xì)胞都應(yīng)具有CICM的遺傳組成。因此，嵌合動物能將CICM遺傳信息傳遞給隨后的各代后代。而且導(dǎo)入的CICM可能在它們的基因組中引入了一個(gè)或多個(gè)目的基因，從而有可能獲得表達(dá)目的基因的嵌合后代。舉例說，可將能提供強(qiáng)化牲畜特性的基因如編碼激素的基因、提供疾病抗性的基因(如淋巴因子、病毒抗性基因、細(xì)菌抗性基因)、提高乳汁產(chǎn)量的基因、改變脂肪百分比的基因、增加體重的基因及其它強(qiáng)化特性的基因?qū)隒ICM中。同樣，也可導(dǎo)入編碼所需基因產(chǎn)物的基因，例如編碼產(chǎn)物對人類治療或異體移植有用的基因。
也可將本發(fā)明的CICM細(xì)胞用于核移植過程中，以獲得核移植的胚胎、胎兒和后代。核移植技術(shù)在本領(lǐng)域中是已知的，并且在本發(fā)明的背景中述及的許多參考文章中都有描述。特別可參見以下文獻(xiàn)Campbell等，Theriogenology,43:181(1995)；Colles等，Mol.Reprod.Dev.,38:264-267(1994)；Keefer等，Biol.Reprod.,50:935-939(1994)；Sims等，美國國家科學(xué)院院報(bào)，91:6143(1994)；Stice等，Theriogenology,43:301(1994)；Sims等，美國國家科學(xué)院院報(bào)，90:6143-6147(1993)；WO94/26884；WO94/24274和WO90/03432，這些文獻(xiàn)全文引入本文作為參考。同樣，如果此CICM參與發(fā)育成胎兒生殖細(xì)胞，那么它的遺傳信息就能被傳遞給隨后的各代動物。類似地，可對CICM細(xì)胞進(jìn)行遺傳加工以在其基因組中整合入一個(gè)或多個(gè)所需基因，如可加強(qiáng)牲畜特性的基因，或編碼所需基因產(chǎn)物，如人類治療用或其它多肽的基因。
更進(jìn)一步的是，可將核移植所產(chǎn)生的或來自嵌合胎兒或后代的分化細(xì)胞、組織或器官用于移植療法中。例如，來源于含有抗排斥作用基因的CICM細(xì)胞的核移植或嵌合胎兒可提供一個(gè)在補(bǔ)充或取代人造血干細(xì)胞方面有用處的造血細(xì)胞源。這有可能對免疫損傷的病人如愛滋病人或其它會影響造血干細(xì)胞的疾病患者是有用的。此外，干細(xì)胞可能在亨廷頓病(Huntington′s)、帕金森(Pakinson′s)病和阿爾茨海默病的治療中有用處。還有，胰腺細(xì)胞可能在糖尿病的治療中有用處。進(jìn)一步移植的肝細(xì)胞可能在肝疾病的治療中有用處?；蛘撸锌赡芸梢詫⑼暾彳浀钠鞴購膩碓从谝驯贿z傳學(xué)改變之CICM的有蹄動物中移植到人體內(nèi)(見Durling等，Curr.Omp.Immunol.,6:765(1994))，此文已在此全部引入作為參考。
除上述作用之外，本發(fā)明的CICM細(xì)胞系還可用做分化的體外模型，尤其是用于參與早期發(fā)育調(diào)節(jié)的基因的研究中。
以上只是按照本發(fā)明的方法所獲得的CICM細(xì)胞系的可能應(yīng)用中的一些范例。
本發(fā)明將在以下實(shí)施例中進(jìn)一步描述。
實(shí)施例1按下述通用方法從前胚泡和胚泡期豬胚胎中生產(chǎn)CICM細(xì)胞系。首先，從12-16日齡的鼠胎兒中獲取胚胎成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)物。無菌切除其頭、肝、心臟和消化道后，將胚胎切碎并在已預(yù)熱好的胰蛋白酶EDTA溶液(0.05％胰蛋白酶/0.02％EDTA；GIBCO,Grand Island,NY)中37℃保溫30分鐘。將成纖維細(xì)胞鋪于組織培養(yǎng)板中，并在補(bǔ)充有10％胎牛血清(FCS)(Hyclone,Logen,UT)、青霉素(100IU/ml)和鏈霉素(50ug/ml)的α-MEM培養(yǎng)基(Bio Whittaker,Walkersville,MD)中培養(yǎng)。傳代3-4天后，將35×10 Nunc培養(yǎng)板(Baxter Scientific,McGaw Park,IL)中的胚胎成纖維細(xì)胞經(jīng)配制于補(bǔ)充α-MEM培養(yǎng)基的絲裂霉素C(10ug/ml,Sigma)處理至少3小時(shí)。成纖維細(xì)胞是在37℃，空氣中含5％CO2的潮濕氣氛下培養(yǎng)和維持的。僅將具有厚且長滿的單層細(xì)胞的培養(yǎng)平板用于培養(yǎng)CICM細(xì)胞系。對于獲取和增殖未分化CICM細(xì)胞系來說，飼養(yǎng)層的特性是一個(gè)重要因素。
從死后或外科剖腹術(shù)中的豬生殖道中外科手術(shù)式地收集豬胚胎。胚泡期胚胎的ICM或者用切割針從滋養(yǎng)層細(xì)胞中部分分離，并用胰蛋白酶或鏈霉蛋白酶消化，或者任由其以完整形式存在。將ICM和至少一部分滋養(yǎng)外胚層直接鋪到經(jīng)裂霉素C阻斷的成纖維細(xì)胞上，常用一玻璃吸管來起始ICM和成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層之間的接觸。在含有補(bǔ)充了10％胎牛血清(FCS)和0.1mM β-巰基乙醇(Sigma)的α-MEM的生長培養(yǎng)基中維持CICM細(xì)胞系。每2-3天更換生長培養(yǎng)基一次。培養(yǎng)至第4天可觀察到初始集落，并可在第5天后的任何時(shí)間對其傳代。只分離具備以下三個(gè)形態(tài)特征的細(xì)胞用于傳代細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核的體積比例較小、具有胞質(zhì)小泡和單個(gè)細(xì)胞通常較小(直徑小于15μm)。這些細(xì)胞常常分離自與飼養(yǎng)層保持直接接觸的集落的多層部分。在傳代到新的飼養(yǎng)層上后，符合上述標(biāo)準(zhǔn)的集群部分常為AP陽性和細(xì)胞角蛋白陰性的。
當(dāng)此ICM或傳代的CICM細(xì)胞開始附著到飼養(yǎng)層上時(shí)，經(jīng)兩天培養(yǎng)后可見由小細(xì)胞組成的多層集落，如圖3所示。這些多層集落是AP陽性和細(xì)胞角蛋白陰性的(見圖4和圖5)。但是，有些集落開始形成上皮樣細(xì)胞片。此上皮樣細(xì)胞是AP陰性和細(xì)胞角蛋白陽性的(圖6和7)。此外，在體外增殖時(shí)，多層集落經(jīng)常開始變平成為上皮細(xì)胞片(圖8)。
本發(fā)明人觀察到，正在生長的多層集落開始變扁平，集落內(nèi)形成具有兩種截然不同的細(xì)胞群體的上皮細(xì)胞片。第一種細(xì)胞群體位于集落的周邊區(qū)域，集落的這一部分是多層的，而且單個(gè)細(xì)胞較小并具有胞質(zhì)小泡(圖8)。這一區(qū)域?qū)P活性的著色也呈陽性。集落的另一區(qū)域包含扁平上皮樣細(xì)胞群體。這些細(xì)胞趨向于位于集落中間。在顯微鏡下觀察該集落時(shí)，能看到這一細(xì)胞群體中的單個(gè)細(xì)胞和細(xì)胞邊界(圖8)。同樣，這些細(xì)胞具有極小的或根本沒有AP活性。
推測為了維持所需的多層型細(xì)胞，優(yōu)選選擇性地僅對周邊的細(xì)胞進(jìn)行傳代以產(chǎn)生額外的多層集群。
利用玻璃吸管、剃刀或針切出集落的多層部分(周邊細(xì)胞)很可能可以完成上述工作?？赏ㄟ^機(jī)械分離或利用胰蛋白酶(0.05％胰蛋白酶/0.2％EDTA)與機(jī)械分離相結(jié)合的方法對大塊細(xì)胞進(jìn)一步破碎。機(jī)械分離是通過用小孔徑吸管反復(fù)上下吹吸細(xì)胞大團(tuán)塊來進(jìn)行?；蛘呖衫冕樆蛱甑镀瑢⒋髩K細(xì)胞切成小塊。令人驚奇的是，通過所有這些方法所獲得的CICM塊(5-100個(gè)細(xì)胞)隨后可傳代到新的飼養(yǎng)層上從而產(chǎn)生具有所需多層形態(tài)的培養(yǎng)物。在有些情況下，經(jīng)過上述同樣方式處理，甚至來自集落內(nèi)部的細(xì)胞在傳代到新的飼養(yǎng)層上后也能產(chǎn)生多層集落。估計(jì)這是由于傳代過程或由于與新飼養(yǎng)層之間重新建立了細(xì)胞與細(xì)胞的接觸，從而使這些細(xì)胞回復(fù)到多層集落狀態(tài)。
我們觀察到必須將這些小塊細(xì)胞重新置于與飼養(yǎng)層直接接觸的狀態(tài)才能阻止CICM集落的分化。反之，與飼養(yǎng)層無接觸的狀態(tài)下生長的細(xì)胞則形成了胚狀體(圖1)。有幾種方法可用于重新起始培養(yǎng)細(xì)胞與飼養(yǎng)層的接觸。效率最低的方法是將細(xì)胞培養(yǎng)平板放回到培養(yǎng)箱中后，讓小團(tuán)細(xì)胞自然沉降到飼養(yǎng)層表面上。優(yōu)選的方法包括迫使CICM細(xì)胞與飼養(yǎng)層之間發(fā)生細(xì)胞與細(xì)胞接觸。由此能產(chǎn)生更多的新形成的CICM細(xì)胞集落。迫使細(xì)胞與細(xì)胞接觸的一種方法是用吸管將單個(gè)細(xì)胞團(tuán)按壓到飼養(yǎng)層頂部。另一方法是將CICM細(xì)胞團(tuán)置于飼養(yǎng)層下面以迫使這些細(xì)胞處于飼養(yǎng)層和培養(yǎng)板底部之間。還有另一種方法是通過在100-5000g對飼養(yǎng)層頂部的細(xì)胞團(tuán)離心10分鐘-5小時(shí)以迫使這些細(xì)胞貼在飼養(yǎng)層上?；旧希善仁箓鞔腃ICM細(xì)胞團(tuán)與飼養(yǎng)層緊密接觸的任何方法都會得到具有所需多層形態(tài)的CICM細(xì)胞集落的生成。此外，如前面所述，通過將CICM細(xì)胞與一些相連的飼養(yǎng)細(xì)胞一起傳代到新的飼養(yǎng)層上可進(jìn)一步提高傳代效率。
實(shí)施例2將按照實(shí)施例1所得到的CICM細(xì)胞用于插入異源DNA。具體地說，將包含有置于β-半乳糖苷酶基因和/或新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因之前的不同啟動子的線性及超螺旋DNA構(gòu)建體顯微注射到這些細(xì)胞中。所用的具體啟動子是巨細(xì)胞病毒啟動子(CMV啟動子)、磷酸甘油酸激酶啟動子(PGK啟動子)、乳腺啟動子(MAM啟動子)、reCMV啟動子和雞β-肌動蛋白啟動子。這些基因構(gòu)建體被稀釋于緩沖液(含有80mM KCl和70mMHEPES)中。然而，也可換用其它緩沖液，如Tris-EDTA。溶液中的DNA構(gòu)建體的濃度是5-10μg/ml。但0.1-100μg/ml的濃度都應(yīng)該是有效的。然后將這些DNA制備物顯微注射入按實(shí)施例1得到的培養(yǎng)CICM細(xì)胞中。
在此過程中，通過倒置顯微鏡對集落進(jìn)行觀察而對集群內(nèi)的單個(gè)CICM細(xì)胞進(jìn)行定位。此后，用一帶有DNA制備物的小注射針單獨(dú)刺穿細(xì)胞膜或附帶著刺穿核膜。針頭開口約1μm。選用這種直徑的針以避免CICM細(xì)胞裂解。此外，通過使用附著于倒置顯微鏡的顯微操作儀可簡便地進(jìn)行顯微注射操作。
將注射針管插入核內(nèi)后，注入近700拷貝的DNA到核中。隨后將微吸管移離細(xì)胞。對CICM集落中的其它細(xì)胞重復(fù)這一處理過程。在理想的情況下，每小時(shí)可顯微注射1000個(gè)細(xì)胞。
使用不同的啟動子得到的結(jié)果總結(jié)于下表中。顯微注射的CICM細(xì)胞中異源基因的表達(dá)
以上結(jié)果表明，含有任一種被檢測啟動子的載體均得到了可表達(dá)所插入的異源DNA的細(xì)胞。還觀察到幾個(gè)構(gòu)建體一起顯微注射對基因表達(dá)無任何加和效果。
圖9是含有CMVβ-半乳糖苷酶構(gòu)建體的顯微注射的豬CICM細(xì)胞的X-gal染色結(jié)果。照片中可觀察到表達(dá)β-半乳糖苷酶的細(xì)胞群。這表明β-半乳糖苷酶基因已被有效地?fù)饺氲郊?xì)胞基因組中，并在子細(xì)胞中不斷傳遞和表達(dá)。
上述結(jié)果是用豬CICM細(xì)胞得到的。此外，用類似方法，也將CMV和PGK-β-半乳糖苷酶構(gòu)建體注射到牛CICM細(xì)胞中。這兩種DNA構(gòu)建體均得到了可表達(dá)β-半乳糖苷酶的細(xì)胞。
因此，這些結(jié)果表明，可將按照本發(fā)明所培養(yǎng)的CICM成功地用于所需異源DNA的整合和表達(dá)中。同樣，這些基因表達(dá)特性可傳遞給子細(xì)胞。
實(shí)施例3在這種培養(yǎng)方法中，DI基因條件性地在CICM細(xì)胞集落中表達(dá)以阻止細(xì)胞的分化。細(xì)胞傳代和培養(yǎng)技術(shù)與實(shí)施例1中所用的相同，但CICM細(xì)胞的基因組成有所不同。具體地說，此處DI基因被導(dǎo)入到衍生CICM細(xì)胞的胚胎細(xì)胞的細(xì)胞核中，或已建好的CICM細(xì)胞系中。隨后將轉(zhuǎn)基因整合到CICM細(xì)胞的基因組中。任何已知的、可將轉(zhuǎn)基因?qū)肱咛ゼ?xì)胞的方法都可使用，包括諸如顯微注射、電穿孔、逆轉(zhuǎn)錄病毒插入、鈣沉淀和脂質(zhì)體插入等方法。
插入的轉(zhuǎn)基因在誘導(dǎo)型啟動子的控制下表達(dá)。誘導(dǎo)型啟動子包括諸如四環(huán)素(WO94/29442)、干擾素(Kimura等，1986)、類固醇和金屬硫蛋白(Yarranton,1992，綜述)等的應(yīng)答元件。相應(yīng)地，DI基因的插入的方式使其以適當(dāng)?shù)拈喿x框架與誘導(dǎo)型啟動子有效相連。
嵌合基因構(gòu)建體整合到胚胎細(xì)胞的基因組中并且建立起多層ICM細(xì)胞集落后，通過誘導(dǎo)型啟動子進(jìn)行誘導(dǎo)可促使DI基因表達(dá)。這種表達(dá)使ICM細(xì)胞集落持續(xù)地、或在組織培養(yǎng)的延長期間維持所期望的多層形態(tài)，并表達(dá)與發(fā)育中胚胎的ICM一致的基因。這樣，可將諸如細(xì)胞分化為失去AP表達(dá)并表達(dá)細(xì)胞角蛋白18的扁平上皮細(xì)胞片之類的問題減到最小，或甚至可以完全避免。這一方法也可有效用于阻止在長期培養(yǎng)期間發(fā)生的細(xì)胞分化。
盡管本發(fā)明已通過某些具體實(shí)施方案進(jìn)行了描述，應(yīng)理解本領(lǐng)域技術(shù)人員能對其進(jìn)行許多改進(jìn)和改變而不背離本發(fā)明的精神。因此所附權(quán)利要求涵蓋在本發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍內(nèi)的所有改進(jìn)和改變。
權(quán)利要求
1．用于產(chǎn)生培養(yǎng)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(CICM)細(xì)胞的方法，包括以下步驟(ⅰ)獲取胚泡的ICM或前胚泡期胚胎的ICM祖細(xì)胞；(ⅱ)在可保證形成多層細(xì)胞集落的條件下，于飼養(yǎng)層培養(yǎng)物上培養(yǎng)所說的ICM或ICM祖細(xì)胞；(ⅲ)從包含于培養(yǎng)ICM細(xì)胞集落內(nèi)的細(xì)胞中鑒別出具有以下特性的細(xì)胞(a)細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核的體積比例較??；(b)具有胞質(zhì)小泡；(c)相對細(xì)胞集落的其余部分來說單個(gè)細(xì)胞較??；(ⅳ)從細(xì)胞集落的余下部分中分離出一個(gè)或一群所說的鑒定好的細(xì)胞；和(ⅴ)在可使飼養(yǎng)細(xì)胞層與分離細(xì)胞或細(xì)胞群之間至少存在一些物理接觸的條件下，將所說的已分離的ICM細(xì)胞或ICM祖細(xì)胞傳代到另一飼養(yǎng)層培養(yǎng)物上。
2．按照權(quán)利要求1的方法，其中所說的在步驟(ⅰ)中獲得的ICM包括至少一部分滋養(yǎng)外胚層。
3．按照權(quán)利要求1的方法，其中的飼養(yǎng)細(xì)胞層包含成纖維細(xì)胞。
4．按照權(quán)利要求3的方法，其中所說的成纖維細(xì)胞是小鼠胚胎成纖維細(xì)胞。
5．按照權(quán)利要求4的方法，其中所說的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞是原代細(xì)胞。
6．按照權(quán)利要求3的方法，其中所說的成纖維細(xì)胞包含一厚且長滿的單層。
7．按照權(quán)利要求1的方法，其中用于促使分離的培養(yǎng)ICM細(xì)胞和飼養(yǎng)細(xì)胞層間產(chǎn)生物理接觸的方法選自由下述組成之組(ⅰ)將分離后的ICM細(xì)胞置于飼養(yǎng)細(xì)胞層上；(ⅱ)將CICM細(xì)胞群擠壓到飼養(yǎng)層上；(ⅲ)將CICM細(xì)胞群置于飼養(yǎng)細(xì)胞層和培養(yǎng)板之間；和(ⅳ)將CICM細(xì)胞或細(xì)胞群離心到飼養(yǎng)細(xì)胞層上。
8．按照權(quán)利要求1的方法，其中分離出的已鑒定好的細(xì)胞包含于多層CICM細(xì)胞集落的外圍部分。
9．按照權(quán)利要求8的方法，其中所說的分離細(xì)胞還包括一些包含于細(xì)胞集落內(nèi)部上皮樣部分的細(xì)胞。
10．按照權(quán)利要求1的方法，其中至少利用以下方法之一從集落中分離已鑒定好的細(xì)胞物理的或化學(xué)的或酶促方法。
11．按照權(quán)利要求10的方法，其中所說的物理方法包括使用玻璃吸管、皮下針或剃刀片。
12．按照權(quán)利要求11的方法，其中還包括用胰蛋白酶或鏈霉蛋白酶處理分離后的細(xì)胞。
13．按照權(quán)利要求1的方法，其中所說的分離細(xì)胞包含約5-100個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞群。
14．按照權(quán)利要求1的方法，其中重復(fù)進(jìn)行了步驟(ⅱ)至(ⅴ)。
15．按照權(quán)利要求1的方法，其中細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核比例為約10/90-50/50。
16．按照權(quán)利要求15的方法，其中所說的比例約為25/75。
17．按照權(quán)利要求1的方法，其中細(xì)胞大小為直徑約10-20μm。
18．按照權(quán)利要求2的方法，其中細(xì)胞直徑小于約15μm。
19．來源于胚泡ICM，或來源于有蹄動物胚胎前胚泡期的ICM祖細(xì)胞的培養(yǎng)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞(CICM細(xì)胞)，其中所說的培養(yǎng)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)在培養(yǎng)中保持一定的形態(tài)特征并與發(fā)育中的有蹄動物胚胎的ICM相同或基本相似地表達(dá)細(xì)胞標(biāo)記。
20．按照權(quán)利要求19的CICM，其表達(dá)堿性磷酸酯酶。
21．按照權(quán)利要求19的CICM，其不表達(dá)細(xì)胞角蛋白18。
22．按照權(quán)利要求19的CICM，其中所說的細(xì)胞在組織培養(yǎng)中呈現(xiàn)多層集落形態(tài)。
23．按照權(quán)利要求21的CICM，其中所說的多層集落形態(tài)含有一內(nèi)部上皮型部分和一多層部分，該多層部分基本上圍繞著所說的上皮樣部分。
24．按照權(quán)利要求19的CICM，其中所說的有蹄動物胚胎來源于選自豬、牛、綿羊、馬和山羊的一種有蹄動物。
25．按照權(quán)利要求24的CICM，其中所說的有蹄動物是豬。
26．按照權(quán)利要求24的CICM，其中所說的有蹄動物是牛。
27．從權(quán)利要求19的CICM中獲得的培養(yǎng)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞系。
28．按照權(quán)利要求19的CICM，其含有一個(gè)或多個(gè)可抑制所說的CICM分化的基因。
29．按照權(quán)利要求28的CICM，其中所說的基因選自下述基團(tuán)tsA58、OCT3、LIF、LIF受體、FGF-5、REX-1和其它癌基因產(chǎn)物、T抗原、細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子。
30．按照權(quán)利要求10的CICM，其含有一段已整合至其基因組中的異源DNA。
31．按照權(quán)利要求30的CICM，其中所說的異源DNA編碼選擇性標(biāo)記。
32．按照權(quán)利要求30的CICM，其中所說的異源DNA編碼所需多肽。
33．可獲得在組織培養(yǎng)延長期間呈現(xiàn)一定的形態(tài)特征并與分化的有蹄動物胚胎ICM一致或基本相似地表達(dá)細(xì)胞標(biāo)記的培養(yǎng)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞的一種方法，該方法包括(ⅰ)獲得有蹄動物ICM細(xì)胞或已建好的培養(yǎng)有蹄動物ICM細(xì)胞系；(ⅱ)將一個(gè)或多個(gè)可抑制所述ICM細(xì)胞或細(xì)胞系分化的基因(DIgene)導(dǎo)入所說的ICM細(xì)胞或已建好的培養(yǎng)ICM細(xì)胞系的核中；(ⅲ)在可抑制分化并允許形成多層細(xì)胞集落的條件下，在合適的飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)物上培養(yǎng)上述所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因有蹄動物ICM細(xì)胞或細(xì)胞系。
34．按照權(quán)利要求33的方法，其中所說的DI基因選自下述基因tsA58、OCT3、LIF、LIF受體和其它癌基因產(chǎn)物或T抗原。
35．按照權(quán)利要求33的方法，其中所說的DI基因是在一誘導(dǎo)型啟動子的控制下表達(dá)的，且培養(yǎng)條件包括可誘導(dǎo)所說啟動子的那些條件。
36．按照權(quán)利要求33的方法，其中對所說的細(xì)胞進(jìn)行了傳代。
37．按照權(quán)利要求36的方法，其中所說的傳代方法包括(ⅰ)在可允許多層細(xì)胞集落形成的條件下，于飼養(yǎng)層培養(yǎng)物上培養(yǎng)所說的ICM；(ⅱ)將顯示以下特性的細(xì)胞從培養(yǎng)ICM細(xì)胞集落中鑒定出來(a)細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核的體積比例較小；(b)具有胞質(zhì)小泡；(c)相對于細(xì)胞集落其余部分而言單個(gè)細(xì)胞較小；(ⅲ)通過合適途徑從細(xì)胞集落的其余部分中分離出所說的已鑒定好的一個(gè)或一群ICM細(xì)胞；和(ⅳ)在可使飼養(yǎng)細(xì)胞層和分離細(xì)胞或細(xì)胞群之間至少存在一些物理接觸的條件下，將上述分離的培養(yǎng)ICM細(xì)胞傳代到另一飼養(yǎng)層培養(yǎng)物上。
38．按照權(quán)利要求33的方法，其中在步驟(ⅳ)中，所述分離的傳代ICM細(xì)胞中包含一些相連的飼養(yǎng)細(xì)胞。
39．按照權(quán)利要求33的方法，其中所述有蹄動物胚胎是來自選自豬、牛、綿羊、山羊和馬的有蹄動物。
40．按照權(quán)利要求39的方法，其中所說的有蹄動物是豬。
41．按照權(quán)利要求39的方法，其中所說的有蹄動物是牛。
全文摘要
本發(fā)明提供了來自有蹄動物尤其是豬和牛的新的培養(yǎng)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞和細(xì)胞系,以及它們的制備方法。在延長培養(yǎng)期間,本發(fā)明中的培養(yǎng)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(CICM)具有與未分化的發(fā)育中胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)相似的形態(tài),還與其相同或基本相似地表達(dá)細(xì)胞標(biāo)記?？蓪愒碊NA導(dǎo)入本發(fā)明的培養(yǎng)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(CICM)細(xì)胞和細(xì)胞系中以產(chǎn)生對轉(zhuǎn)基因胚胎、胎兒和/或后代生產(chǎn)有用的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞,例如,通過核移植方法。
文檔編號C12N15/09GK1219198SQ9719475
公開日1999年6月9日 申請日期1997年3月24日 優(yōu)先權(quán)日1996年4月1日
發(fā)明者S·L·斯蒂克, P·J·戈盧克 申請人:馬薩諸塞大學(xué)馬薩諸塞州高等教育公立研究所