專利名稱：用重組生物體生產(chǎn)甘油的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域和采用重組生物體生產(chǎn)所需要的化合物。更具體地講，本發(fā)明描述了分別表達(dá)或同時(shí)表達(dá)甘油-3-磷酸脫氫酶(G3PDH)和甘油-3-磷酸酶(G3P磷酸酶)的克隆基因，以提高甘油的生產(chǎn)。
背景甘油是一種工業(yè)上大量需要的化合物，用于化妝品、液體皂、食品、藥物、潤(rùn)滑劑、防凍液以及無(wú)數(shù)其它用途。甘油酯在脂肪和油脂工業(yè)中是重要的。
不是所有生物體都具有合成甘油的天然能力。然而，已知一些細(xì)菌、藻類和酵母的物種能夠產(chǎn)生甘油。細(xì)菌地衣芽孢桿菌Bacilluslicheniformis)和蕃茄乳桿菌(Lactobacillus lycpersica)合成甘油。發(fā)現(xiàn)耐鹽藻杜氏藻屬(Dunaliella)種和Asteromonas gracilis產(chǎn)生甘油以保護(hù)性抗外界高鹽濃度(Ben-Amotz等，(1982)Experientia 3849-52)。同樣，各種耐滲透酵母合成甘油作為保護(hù)性措施。大多數(shù)酵母屬(Saccharomyces)菌株在乙醇發(fā)酵期間產(chǎn)生一些甘油，并且應(yīng)用滲透脅迫可以生理性增強(qiáng)合成甘油(Albertyn等，(1994)Mol.Cell.Biol.14，4135-4144)。本世紀(jì)初，用加入諸如亞硫酸鹽或堿的導(dǎo)向劑(steeringreagent)的酵母屬培養(yǎng)物，工業(yè)上生產(chǎn)甘油。所述導(dǎo)向劑通過(guò)形成無(wú)活性復(fù)合物阻斷或抑制乙醛轉(zhuǎn)化為乙醇；因此，可利用過(guò)量的還原性相當(dāng)物(NADH)或“導(dǎo)向”二羥丙酮磷酸還原，以產(chǎn)生甘油。該方法受限于亞硫酸鹽引起的酵母生長(zhǎng)的部分抑制。該限制可以通過(guò)采用堿得到部分克服，所述堿通過(guò)不同的機(jī)理形成過(guò)量NADH相當(dāng)物。在該實(shí)踐中，所述堿啟動(dòng)Cannizarro歧化反應(yīng)以由兩個(gè)當(dāng)量的乙醛產(chǎn)生乙醇和乙酸。
已經(jīng)從糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)克隆并測(cè)序了編碼甘油-3-磷酸脫氫酶的基因(DAR1，GPD1)(Wang等，(1994)，J.Bact.1767091-7095)。將DAR1基因克隆入穿梭載體并用來(lái)轉(zhuǎn)化大腸桿菌，該基因在大腸桿菌中的表達(dá)產(chǎn)生活性酶。Wang等(同上)認(rèn)為，DAR1受細(xì)胞滲透環(huán)境的調(diào)節(jié)，但是并未提示該基因在重組生物體可以如何用來(lái)提高甘油產(chǎn)量。
已經(jīng)分離了其它甘油-3-磷酸脫氫酶。例如已經(jīng)從釀酒酵母(S.cerevisiae)克隆并測(cè)序分析了sn-甘油-3-磷酸脫氫酶(Larason等，(1993)Mol.Microbiol.，101101，(1993))。Albertyn等((1994)Mol.Cell.Biol.，144135)指出，從釀酒酵母克隆編碼甘油-3-磷酸脫氫酶的GPD1。如同Wang等一樣，Albertyn等和Larason等均認(rèn)識(shí)到該基因是滲透敏感性調(diào)節(jié)的，但是并未提示該基因可以如何用于重組生物體生產(chǎn)甘油。
正如G3DPH一樣，已經(jīng)從釀酒酵母分離甘油-3-磷酸酶，并鑒定該蛋白由GPP1和GPP2基因編碼(Norbeck等，(1996)J.Biol.Chem.，27113875)。像G3DPH編碼基因一樣，似乎GPP2是滲透誘導(dǎo)的。
沒(méi)有已知的技術(shù)指出由一起表達(dá)或分別表達(dá)G3PDH/G3P磷酸酶的重組生物體生產(chǎn)甘油。也沒(méi)有已知的技術(shù)指出由具有這兩種酶活性的任何野生型生物體生產(chǎn)甘油，所述酶活性不需要對(duì)所述細(xì)胞施與某種脅迫(鹽或滲壓劑(osmolyte))。Eustace((1987)，Can.J.Microbiol.，33112-117))指出用重組DNA技術(shù)不能實(shí)現(xiàn)甘油生產(chǎn)。這些研究者通過(guò)選擇性育種技術(shù)創(chuàng)造了雜交酵母菌株，該酵母菌株產(chǎn)生甘油的水平高于親代株；然而，G3PDH活性保持不變或略微降低。
工業(yè)上需要能夠在生理?xiàng)l件下生產(chǎn)甘油的微生物，尤其是當(dāng)甘油本身將作為更復(fù)雜分解代謝或生物合成途徑組成部分的體內(nèi)底物時(shí)，所述途徑可能受到滲透脅迫或加入的導(dǎo)向劑的干擾。
所以，上述待解決的問(wèn)題是如何通過(guò)加入或增強(qiáng)一些酶活性引導(dǎo)碳流向產(chǎn)生甘油，特別是分別催化二羥丙酮磷酸轉(zhuǎn)化為甘油-3-磷酸、然后轉(zhuǎn)化為甘油的G3PDH和G3P磷酸酶。先前已經(jīng)描述了重組生物體的該過(guò)程，并且該過(guò)程需要分離編碼這兩種酶的基因及其隨后的表達(dá)。遇到令人驚奇而未曾預(yù)料到的難題是G3P磷酸酶對(duì)宿主的毒性，該毒性要求小心控制G3P磷酸酶表達(dá)水平以避免生長(zhǎng)抑制。
發(fā)明概述本發(fā)明提供由重組生物體生產(chǎn)甘油的方法，包括(i)用包含以下一個(gè)或兩個(gè)基因的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化合適宿主細(xì)胞，所述基因?yàn)?a) 編碼甘油-3-磷酸脫氫酶的基因；(b) 編碼甘油-3-磷酸磷酸酶的基因；(ii)在存在至少一種選自單糖、寡糖、多糖、一碳底物和它們的混合物的碳源的情況下，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，由此生產(chǎn)甘油；以及(iii)回收甘油。葡萄糖是最優(yōu)選的碳源。
本發(fā)明還提供轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞以生產(chǎn)甘油，所述宿主細(xì)胞包含能夠表達(dá)甘油-3-磷酸脫氫酶和甘油-3-磷酸酶活性的表達(dá)盒。
簡(jiǎn)述生物保藏和序列表申請(qǐng)人根據(jù)國(guó)際承認(rèn)用于專利程序的微生物保存布達(dá)佩斯條約條款進(jìn)行了下列生物保藏保藏物鑒定參考國(guó)際保藏名稱 保藏日期大腸桿菌pAH21/DH5αATCC 981871996年9月26日(含有GPP2基因)大腸桿菌(pDAR1A/AA200) ATCC 982481996年11月6日(含有DAR1基因)“ATCC”是指國(guó)際性保藏機(jī)構(gòu)美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，位于12301 Padklaw Drive，Rockville，MD 20852 U.S.A.。所述名稱是所保藏材料的保藏號(hào)。
根據(jù)專利申請(qǐng)中核苷酸序列和氨基酸序列標(biāo)準(zhǔn)表示規(guī)則(Decisionof the President of the EPO的附錄I和附錄II，發(fā)表于OJ EPO的增刊第2期，12/1992)和37 C.F.R.1.821-1.825以及附錄A和B(包含核苷酸和/或氨基酸序列的申請(qǐng)說(shuō)明書要求)，申請(qǐng)人提供了23種序列。
詳述發(fā)明本發(fā)明提供在重組生物體中由發(fā)酵碳源生物生產(chǎn)甘油的方法。該方法提供可用于化妝品和制藥工業(yè)的快速、便宜和環(huán)境負(fù)責(zé)的甘油源。該方法采用含編碼甘油-3-磷酸脫氫酶(G3PDH)和/或甘油-3-磷酸酶(G3P磷酸酶)克隆的同源或異源基因的微生物。將該微生物與碳源接觸并從條件培養(yǎng)基分離甘油。所述基因可以分別或同時(shí)摻入宿主微生物以生產(chǎn)甘油。
用于本文的下列術(shù)語(yǔ)可以用來(lái)解釋權(quán)利要求書和說(shuō)明書。
術(shù)語(yǔ)“甘油-3-磷酸脫氫酶”和“G3PDH”指的是負(fù)責(zé)催化二羥丙酮磷酸(DHAP)轉(zhuǎn)化為甘油-3-磷酸(G3P)的酶活性的一種多肽。在體內(nèi)G3PDH可以是NADH、NADPH或FAD依賴性的。NADH依賴酶(EC1.1.1.8)由幾種基因編碼，包括GPD1(GenBank Z74071x2)、或GPD2(GenBank Z35169x1)、或GPD3(GenBank G984182)或DAR1(GenBankZ74071x2)。NADPH依賴酶(EC 1.1.1.94)由gpsA(GenBank U321643、(cds 197911-196892)G466764和L45246)編碼。FDA依賴酶(EC 1.1.99.5)由GUT2(GenBank Z47047x23)、或glpD(GenBank G147838)或glpABC(GenBank M20938)編碼。
術(shù)語(yǔ)“甘油-3-磷酸酶”、“sn-甘油-3-磷酸酶”、或“d，l-甘油磷酸酶”和“G3P磷酸酶”是指負(fù)責(zé)催化甘油-3-磷酸轉(zhuǎn)化為甘油的酶活性的一種多肽。G3P磷酸酶由GPP1(GenBank Z47047x125)或GPP2(GenBank U18813x11)編碼。
術(shù)語(yǔ)“甘油激酶”是指根據(jù)反應(yīng)條件負(fù)責(zé)催化甘油轉(zhuǎn)化為甘油-3-磷酸或甘油-3-磷酸轉(zhuǎn)化為甘油的酶活性的一種多肽。甘油激酶由GUT1(GenBank U11583x19)編碼。
術(shù)語(yǔ)“GPD1”、“DAR1”、“OSG1”、“D2830”和“YDL022W”彼此通用，是指編碼胞質(zhì)甘油-3-磷酸脫氫酶的基因，其特征為SEQ IDNO1所示堿基序列。
術(shù)語(yǔ)“GPD2”是指編碼胞質(zhì)甘油-3-磷酸脫氫酶的基因，其特征為SEQ ID NO2所示堿基序列。
術(shù)語(yǔ)“GUT2”和“YIL155C”彼此通用，指的是編碼線粒體甘油-3-磷酸脫氫酶的基因，其特征為SEQ ID NO3所示堿基序列。
術(shù)語(yǔ)“GPP1”、“RHR2”和“YIL053W”彼此通用，指的是編碼胞質(zhì)甘油-3-磷酸酶的基因，其特征為SEQ ID NO4所示堿基序列。
術(shù)語(yǔ)“GPP2”、“HOR2”和“YER062C”彼此通用，指的是編碼胞質(zhì)甘油-3-磷酸酶的基因，其特征為SEQ ID NO5所示堿基序列。
術(shù)語(yǔ)“GUT1”是指編碼胞質(zhì)甘油激酶的基因，且特征為SEQ IDNO6所示其堿基序列。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“功能”和“酶功能”是指在進(jìn)行特定化學(xué)反應(yīng)需要改變能量的酶催化活性。這種酶催化活性可以用于平衡反應(yīng)，在所述平衡反應(yīng)中在合適條件下完成產(chǎn)物和底物的生成。
術(shù)語(yǔ)“多肽”和“蛋白”在本文彼此通用。
術(shù)語(yǔ)“碳底物”和“碳源”指能被本發(fā)明宿主生物體代謝的碳源，特別是選自單糖、寡糖、多糖和一碳糖底物或它們的混合物的常用碳源。
術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”和“宿主生物體”是指能夠接受外源或異源基因并表達(dá)這些基因以產(chǎn)生活性基因產(chǎn)物的微生物。
術(shù)語(yǔ)“外源基因”、“外源DNA”、“異源基因”和“異源DNA”全都是指某種生物體的天然遺傳物質(zhì)，該遺傳物質(zhì)已經(jīng)置于不同宿主生物體內(nèi)。
術(shù)語(yǔ)“重組生物體”和“轉(zhuǎn)化宿主”是指用異源或外源基因轉(zhuǎn)化的任何生物體。本發(fā)明的重組生物體表達(dá)編碼G3PDH和G3P磷酸酶的外源基因，以由合適碳底物生產(chǎn)甘油。
“基因”是指表達(dá)特定蛋白的核酸片段，包括編碼區(qū)域之前(5’非編碼區(qū))和之后(3’非編碼區(qū))的調(diào)節(jié)序列。術(shù)語(yǔ)“天然”和“野生型”基因是指發(fā)現(xiàn)于自然界、具有其自身調(diào)節(jié)序列的基因。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“編碼(encoding)”和“編碼(coding)”是指基因通過(guò)其轉(zhuǎn)錄和翻譯機(jī)制產(chǎn)生氨基酸序列的過(guò)程。編碼特定氨基酸序列的方法是指包括可能涉及不引起編碼的氨基酸變化的堿基改變的DNA序列、或涉及可能改變一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸的堿基變化但是不影響該DNA序列編碼的蛋白功能特性的DNA序列。所以本發(fā)明包括特定典型序列以外的其它序列。也設(shè)想了基本上不影響所產(chǎn)生蛋白分子功能特性的序列改變，諸如導(dǎo)致沉默變化的缺失、插入或替換。例如設(shè)想了反映遺傳密碼簡(jiǎn)并性、或在指定部位產(chǎn)生化學(xué)上相當(dāng)氨基酸的基因序列中的變化；因此，疏水氨基酸丙氨酸的密碼子可以由編碼另一疏水性較低的殘基(諸如甘氨酸)或疏水性較高的殘基(諸如纈氨酸、亮氨酸或異亮氨酸)的密碼子代。同樣，也可以預(yù)期導(dǎo)致一種負(fù)電荷殘基取代另一負(fù)電荷殘基(諸如天冬氨酸取代谷氨酸)或者一種正電荷殘基取代另一種正電荷殘基(諸如賴氨酸取代精氨酸)的變化產(chǎn)生生物學(xué)相當(dāng)?shù)漠a(chǎn)物。也可以預(yù)期，導(dǎo)致該蛋白分子N-末端和C-末端部分改變的核苷酸變化將不改變?cè)摰鞍谆钚浴?shí)際上在某些情況下，為了研究改變對(duì)該蛋白生物活性的影響，可能最好是制備該序列的突變體。以上提出的各種改變與確定所編碼產(chǎn)物生物活性的保留一樣，完全是本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)。此外，該領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明包括的序列也根據(jù)其與本文所列舉的序列在嚴(yán)格雜交條件(0.1XSSC，0.1％SDS，65℃)下的雜交能力進(jìn)行定義。
術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”是指由編碼該基因產(chǎn)物序列的基因轉(zhuǎn)錄以及翻譯成為基因產(chǎn)物。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“質(zhì)粒”、“載體”和“盒”是指常常攜帶的基因不是該細(xì)胞重要代謝的部分、并且通常是環(huán)狀雙鏈DNA分子形式的染色體外元件。這類元件可以是得自任何來(lái)源的自我復(fù)制序列、基因組整合序列、噬菌體或核苷酸序列，上述元件是線性或環(huán)形結(jié)構(gòu)的單鏈或雙鏈DNA或RNA，其中許多核苷酸序列已經(jīng)結(jié)合或重結(jié)合入一種獨(dú)特結(jié)構(gòu)中，該獨(dú)特結(jié)構(gòu)能夠?qū)?dòng)子片段和選定基因產(chǎn)物的DNA序列以及合適的3’非翻譯序列導(dǎo)入細(xì)胞?！稗D(zhuǎn)化盒”是指含有外源基因和除了該外源基因外還含有促進(jìn)特定宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的元件的特定載體?！氨磉_(dá)盒”是指含有外源基因和除了該外源基因外還含有允許所述基因在外源宿主表達(dá)提高的元件的特定載體。
術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)染”指在摻入核酸后細(xì)胞中獲得新基因。所獲得的基因可以整合到染色體DNA中或作為染色體外復(fù)制序列導(dǎo)入。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化體”是指轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的細(xì)胞。
術(shù)語(yǔ)“遺傳性改變的”指通過(guò)轉(zhuǎn)化或突變改變遺傳物質(zhì)的方法。典型酶途徑設(shè)想了通過(guò)利用發(fā)現(xiàn)于大多數(shù)微生物中的甘油生物合成途徑，在重組生物體中可以生產(chǎn)甘油。通常在ATP存在下通過(guò)己糖激酶使諸如葡萄糖的碳底物轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸。葡萄糖-磷酸異構(gòu)酶催化葡萄糖-6磷酸轉(zhuǎn)化為果糖-6磷酸，然后通過(guò)6-磷酸果糖激酶的作用轉(zhuǎn)化為果糖-1，6-二磷酸。之后醛縮酶使該二磷酸變?yōu)槎u丙酮磷酸(DHAP)。最后NADH依賴性G3PDH將DHAP轉(zhuǎn)化為甘油-3-磷酸，再后甘油-3-磷酸通過(guò)G3P磷酸酶脫磷酸為甘油(Agarwal(1990)，Ady.Biochem.Engrg.41114)。生產(chǎn)甘油的其它途徑已經(jīng)提出了由DHAP生產(chǎn)甘油的替代途徑(Wang等，(1994)J.Bact.1767091-7095)。在此提出的途徑中，通過(guò)特異性或非特異性磷酸酶可以使DHAP脫磷酸產(chǎn)生二羥基丙酮，然后二羥基丙酮通過(guò)二羥基丙酮還原酶還原成甘油。已知原核生物和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)中的二羥基丙酮還原酶，并且與合適磷酸酶一起克隆和表達(dá)這類活性可以生產(chǎn)甘油。已經(jīng)提出了由DHAP生產(chǎn)甘油的另一種替代途徑(Redkar(1995)，Experimental Mycology，19241，1995)。在該途徑中，DHAP由共同的糖酵解酶—丙糖磷酸異構(gòu)酶異構(gòu)化為甘油醛-3-磷酸。甘油醛-3-磷酸脫磷酸成為甘油醛，甘油醛然后由乙醇脫氫酶或NADP依賴性甘油脫氫酶活性還原。克隆和表達(dá)構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)的磷酸酶和脫氫酶活性使得可以進(jìn)行甘油生產(chǎn)。G3PDH和G3P磷酸酶的編碼基因本發(fā)明提供適合在宿主細(xì)胞表達(dá)G3PDH和G3P磷酸酶活性的基因。
已知編碼G3PDH的基因。例如，GPD1已經(jīng)從酵母屬分離并且具有SEQ ID NO1所示的堿基序列，該堿基序列編碼SEQ ID NO7所示的氨基酸序列(Wang等，同上)。同樣，也已經(jīng)從酵母屬分離由GPD2編碼的G3PDH活性，GPD2具有SEQ ID NO2所示的堿基序列，編碼SEQ ID NO8所示的氨基酸序列(Eriksson等，(1995)Mol.Microbiol.，1795)。
為了本發(fā)明目的，設(shè)想編碼負(fù)責(zé)G3PDH活性的多肽的任何基因都是合適的，其中所述活性能夠催化二羥丙酮磷酸(DHAP)轉(zhuǎn)化為甘油-3-磷酸(G3P)。此外，設(shè)想編碼分別對(duì)應(yīng)于基因GPD1、GPD2、GUT2、gpsA、glpD和glpABC的α亞單位的SEQ ID NO7、8、9、10、11和12所示的G3PDH氨基酸序列的任何基因在本發(fā)明中都是有功能的，其中所述氨基酸序列可以包含不改變?cè)撁腹δ艿陌被?、缺失或加入。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，從其它來(lái)源分離的G3PDH的編碼基因也將適用于本發(fā)明。例如從原核生物分離的基因包括基因庫(kù)登記號(hào)M34393、M20938、L06231、U12567、L45246、L45323、L45324、L45325、U32164、U32689和U39682。從真菌分離的基因包括基因庫(kù)登記號(hào)U30625、U30876和X56162；從昆蟲分離的基因包括基因庫(kù)登記號(hào)X61223和X14179；以及從哺乳動(dòng)物源分離的基因包括基因庫(kù)登記號(hào)U12424、M25558和X78593。
已知G3P磷酸酶的編碼基因。例如GPP2已經(jīng)從釀酒酵母分離并具有SEQ ID NO5所示的堿基序列，所述堿基序列編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO13所示(Norbeck等，(1996)，J.Biol.Chem.，27113875)。
為了本發(fā)明目的，編碼G3P磷酸酶活性的任何基因均適用于本發(fā)明方法，其中所述活性能夠催化甘油-3-磷酸轉(zhuǎn)化為甘油。此外，編碼分別對(duì)應(yīng)于基因GPP2和GPP1的SEQ ID NO13和14所示的G3P磷酸酶氨基酸序列的任何基因在本發(fā)明中都是有功能的，其中所述氨基酸序列包括包含不改變G3P磷酸酶酶功能的氨基酸取代、缺失或加入的任何氨基酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，從其它來(lái)源分離的G3P磷酸酶編碼基因也將適用于本發(fā)明。例如用一種或多種以下一般或特異性磷酸酶可以實(shí)現(xiàn)甘油-3-磷酸脫磷酸產(chǎn)生甘油，所述磷酸酶如下堿性磷酸酶(EC 3.1.3.1)[基因庫(kù)M19159、M29663、U02550或M33965]；酸性磷酸酶(EC 3.1.3.2)[基因庫(kù)U51210、U19789、U28658或L20566]；甘油-3-磷酸酶(EC 3.1.3.-)[基因庫(kù)Z38060或U18813x11]；葡萄糖-1-磷酸酶(EC 3.1.3.10)[基因庫(kù)M33807]；葡萄糖-6-磷酸酶(EC 3.1.3.9)[基因庫(kù)U00445]；果糖-1，6-二磷酸酶(EC 3.1.3.11)[基因庫(kù)X12545或J03207]或磷脂酰(phosphotidyl)甘油磷酸磷酸酶(EC 3.1.3.27)[基因庫(kù)M23546和M23628]。
已知甘油激酶的編碼基因。例如甘油激酶編碼基因GUT1已經(jīng)從酵母分離并測(cè)序(Pavlik等(1993)，Curr.Genet.，2421)，其堿基序列如SEQ ID NO15所示，該序列編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO15所示。該領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，盡管本質(zhì)上甘油激酶催化甘油降解，但是同一甘油激酶在合適的反應(yīng)能量條件下在甘油的合成中發(fā)揮作用，將甘油-3-磷酸轉(zhuǎn)化為甘油。存在通過(guò)甘油激酶生產(chǎn)甘油的證據(jù)。在厭氧或呼吸抑制的條件下，在存在甘油-3-P和ADP的情況下布氏錐蟲(Trypanosoma brucei)產(chǎn)生甘油。該反應(yīng)在酵解酶體區(qū)室發(fā)生(Hammond，(1985)，J. Biol.Chem.，26015646-15654)。宿主細(xì)胞通過(guò)表達(dá)G3PDH和G3P磷酸酶重組生產(chǎn)甘油的合適宿主細(xì)胞可以是或者原核生物細(xì)胞或者真核生物細(xì)胞，并且只受其表達(dá)活性酶的能力的限制。優(yōu)選的宿主細(xì)胞是那些通常用于生產(chǎn)甘油的細(xì)菌、酵母和絲狀真菌，例如檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、腸桿菌屬(Enterobacter)、梭菌屬(Clostridium)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、氣桿菌屬(Aerobacter)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、曲霉屬(Aspergillus)、酵母屬、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、接合酵母屬(Zygosaccharomyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、念珠菌屬(Candida)、漢遜酵母(Hansenula)、德巴利酵母屬(Debaryomyces)、毛霉屬(Mucor)、球擬酵母屬(Torulopsis)、甲基酵母屬(Methylobacter)、埃希氏菌屬(Escherichia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)和假單胞菌屬(Pseudomonas)。在本發(fā)明中優(yōu)選宿主細(xì)胞是大腸桿菌和酵母屬。載體和表達(dá)盒本發(fā)明提供適合克隆、轉(zhuǎn)化和表達(dá)G3PDH和G3P磷酸酶入合適宿主細(xì)胞的各種載體和轉(zhuǎn)化以及表達(dá)盒。合適的載體是那些與所用細(xì)菌相容的載體。合適的載體可以得自于例如細(xì)菌、病毒(諸如噬菌體T7或M-13衍生噬菌體)、質(zhì)粒、酵母或植物。獲得和使用這類載體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的(Sambrook等，Molecular CloningALaboratory Manual-第1、2、3卷(Cold Spring Harbor LaboratoryColdSpring Harbor，NY，1989))。
通常，上述載體或盒含有指導(dǎo)合適基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的序列、選擇標(biāo)記以及允許自我復(fù)制和染色體整合的序列。合適載體包含帶有轉(zhuǎn)錄起始控制的該基因的5’區(qū)，以及包含控制轉(zhuǎn)錄終止的該DNA片段的3’區(qū)。最優(yōu)選的是，兩種控制區(qū)得自與轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞同源的基因。這類控制區(qū)不需要得自選作生產(chǎn)宿主的特定物種的天然基因。
可用來(lái)在所需要的宿主細(xì)胞中驅(qū)動(dòng)G3PDH和G3P磷酸酶基因表達(dá)的起始控制區(qū)或啟動(dòng)子種類繁多，并是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的。實(shí)際上能夠驅(qū)動(dòng)這些基因的任何啟動(dòng)子均適合于本發(fā)明，所述啟動(dòng)子包括但不限于CYC1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO和TPI(可用于在酵母屬中表達(dá))；AOX1(用于在畢赤酵母屬中表達(dá))；以及l(fā)ac、trp、λPL、λPR、T7、tac和trc(用于在大腸桿菌中表達(dá))。
終止控制區(qū)也可以得自所述優(yōu)選宿主的各種天然基因。任選的是，終止位點(diǎn)可以是非必須的；然而假如包括其中是最優(yōu)選的。
為了有效表達(dá)上述例舉的(instant)酶，編碼該類酶的DNA通過(guò)起始密碼子可操作性連接至選定的表達(dá)控制區(qū)，這樣表達(dá)導(dǎo)致形成合適的信使RNA。轉(zhuǎn)化合適宿主并表達(dá)用于生產(chǎn)甘油的G3PDH和G3P磷酸酶一旦構(gòu)建成合適盒后，將其用來(lái)轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞。通過(guò)諸如轉(zhuǎn)化(例如用鈣透化細(xì)胞、電穿孔)或通過(guò)采用重組噬菌體病毒的轉(zhuǎn)染的已知方法，可以將含有G3PDH和/或G3P磷酸酶編碼基因的盒導(dǎo)入上述宿主細(xì)胞(Sanbrook等，同上)。
正如在一般方法和實(shí)施例中全面敘述的一樣，在本發(fā)明中AH21和DAR1盒用來(lái)轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。培養(yǎng)基和碳底物本發(fā)明中的發(fā)酵培養(yǎng)基必須含有合適的碳底物。合適的碳底物可以包括但不限于單糖(諸如葡萄糖和果糖)、寡糖(諸如乳糖或蔗糖)、多糖(諸如淀粉或纖維素)、或它們的混合物、和可再生原料的非純化混合物(諸如干酪乳清滲透物、玉米漿、甜菜糖蜜和大麥芽)。此外，所述碳底物也可以是諸如二氧化碳或甲醇的一碳底物，已經(jīng)證實(shí)所述一碳底物代謝轉(zhuǎn)化為關(guān)鍵生化中間體。
已有報(bào)道，在甲基營(yíng)養(yǎng)酵母中(Yamada等(1989)，Agric.Biol.Chem.，53(2)541-543)和在細(xì)菌中(Hunter等(1985)，Biochemistry，244148-4155)由一碳源(例如甲醇、甲醛或甲酸鹽)生產(chǎn)甘油。這些生物體可以同化從氧化狀態(tài)的甲烷到甲酸鹽范圍的一碳化合物，并且生產(chǎn)甘油。該碳同化途徑可以通過(guò)核酮糖一磷酸、通過(guò)絲氨酸或通過(guò)木酮糖一磷酸(Gottschalk，Bacterial Metabolism，第二版，Springer-Verlag紐約(1986))。所述核酮糖一磷酸途徑涉及甲酸與核酮糖-5-磷酸縮合形成果糖6碳糖，最終形成三碳產(chǎn)物—甘油醛-3-磷酸。同樣，所述絲氨酸途徑通過(guò)亞甲四氫葉酸將一碳化合物同化入糖酵解途徑。
除了一碳和二碳底物外，也已知甲基營(yíng)養(yǎng)生物體利用諸如甲胺、葡糖胺的許多其它含碳化合物和用于代謝活動(dòng)的各種氨基酸。例如，已知甲基營(yíng)養(yǎng)酵母利用甲胺碳源形成海藻糖或甘油(Bellion等(1993)，Microb.Growth Cl Compd.，[Int.Symp.]，第7期，415-32，編輯Murrell，J.Collin；Kelly，Don P.。出版商Intercept，Andover，UK)。同樣，各種念珠菌屬菌種可以代謝丙氨酸或油酸(Sulter等(1990)，Arch.Microbiol.，153(5)485-9)。因此，在本發(fā)明中所用的碳源可以包括種類繁多的含碳底物，并且只受生物體選擇的限制。
盡管上述所有碳底物和它們的混合物均適用于本發(fā)明，但是優(yōu)選的碳底物為單糖、寡糖、多糖、一碳底物或它們的混合物。更優(yōu)選的糖諸如葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、以及諸如甲醇和二氧化碳的一碳底物。作為碳底物最優(yōu)選葡萄糖。
除了合適的碳源外，發(fā)酵培養(yǎng)基必須含有合適的礦物質(zhì)、鹽、輔因子、緩沖劑以及其它組分，所述組分是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知、適合培養(yǎng)物生長(zhǎng)和促進(jìn)產(chǎn)生甘油所必須的酶途徑的。培養(yǎng)條件通常，細(xì)胞在合適培養(yǎng)基中于30℃生長(zhǎng)。優(yōu)選的生長(zhǎng)培養(yǎng)基為普通工業(yè)制備的培養(yǎng)基，諸如Luria Bertani(LB)肉湯、Sabouraud Dextrose(SD)肉湯或酵母培養(yǎng)基(YM)肉湯。也可以采用其它確定成分或合成生長(zhǎng)培養(yǎng)基，用于特定微生物生長(zhǎng)的合適培養(yǎng)基是微生物學(xué)或發(fā)酵學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。使用已知直接或間接調(diào)節(jié)分解代謝物阻抑的物質(zhì)(例如環(huán)2’3’一磷酸腺苷)也可以加入到該反應(yīng)培養(yǎng)基中。同樣，也可以與基因操作結(jié)合或作為基因操作的替代方法，使用提高甘油產(chǎn)量的已知酶活性調(diào)節(jié)物質(zhì)(例如亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽和堿)。
發(fā)酵的合適pH范圍是pH 5.0-9.0，其中初始狀態(tài)優(yōu)選pH范圍為6.0-8.0。
在有氧或無(wú)氧的條件下進(jìn)行反應(yīng)，其中優(yōu)選無(wú)氧或微需氧的條件。鑒定以及純化G3PDH知G3P磷酸酶通過(guò)酶檢測(cè)法測(cè)量蛋白G3PDH和G3P磷酸酶的表達(dá)水平。G3PDH活性檢測(cè)依賴于在DHAP轉(zhuǎn)化為G-3-P的過(guò)程中的共底物NADH的光譜性質(zhì)。NADH具有固有的紫外/可見(jiàn)光吸收，可以于340nm分光光度監(jiān)測(cè)其消耗。G3P磷酸酶活性可以通過(guò)檢測(cè)該反應(yīng)中釋放出的無(wú)機(jī)磷酸鹽的任何方法進(jìn)行檢測(cè)。最普遍使用的檢測(cè)方法采用可見(jiàn)光譜測(cè)定蘭色磷鉬酸銨復(fù)合物。鑒定和回收甘油甘油可以通過(guò)對(duì)無(wú)細(xì)胞提取物進(jìn)行高效液相層析(HPLC)和氣相層析/質(zhì)譜(GC/MS)分析法分析鑒定和定量。優(yōu)選方法采用無(wú)梯度的0.01N硫酸流動(dòng)相，在分析性離子交換柱上分析發(fā)酵培養(yǎng)基。
從發(fā)酵培養(yǎng)基回收甘油的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例如，對(duì)所述反應(yīng)混合物進(jìn)行以下序貫步驟可以從細(xì)胞培養(yǎng)基獲得甘油，所述步驟是過(guò)濾、脫水、有機(jī)溶劑提取和分級(jí)蒸餾(美國(guó)專利第2,986,495號(hào))。通過(guò)互補(bǔ)選擇轉(zhuǎn)化體在缺乏有功能的gpsA編碼的G3PDH的情況下，大腸桿菌細(xì)胞不能合成G3P，這種情況導(dǎo)致膜生物合成的阻斷。具有這種阻斷的細(xì)胞是營(yíng)養(yǎng)缺陷型的，為了合成膜磷脂需要培養(yǎng)基中存在或者甘油或者G3P。
一種克隆的異源野生型gpsA基因能夠互補(bǔ)染色體gpsA突變，以允許于缺乏甘油或G3P的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)(Wang等(1994)，J.Bact.1767091-7095)。-基于該互補(bǔ)策略，gpsA缺陷細(xì)胞只能生長(zhǎng)于葡萄糖培養(yǎng)基上，假如gpsA缺陷細(xì)胞具有質(zhì)粒編碼的gpsA，就可以允許基于由DHAP合成G3P進(jìn)行選擇。在培養(yǎng)過(guò)程中失去重組gpsA質(zhì)粒的細(xì)胞不能合成G3P，而且隨后的細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制。所述互補(bǔ)G3PDH活性不僅可以由gpsA表達(dá)，也可以由表達(dá)G3PDH活性的其它克隆基因(諸如GPD1、GPD2、GPD3、GUT2、glpD和glpABC)表達(dá)。在gpsA缺陷大腸桿菌菌株諸如BB20中可以保持這些互補(bǔ)活性(Cronan等(1974)，J.Bact.，118598)，緩和采用抗生素選擇的需要，并且在大規(guī)模的發(fā)酵中降低其過(guò)高的成本。
為了在釀酒酵母滲透調(diào)節(jié)突變體中表達(dá)和選擇，可以采用有關(guān)的策略(Larsson等(1993)，Mol.Microbiol.，101101-1111)。這些osgl突變體在低水勢(shì)下不能生長(zhǎng)，并且顯示甘油生產(chǎn)能力降低和G3PDH活性下降。該osgl鹽敏感性缺陷可以由克隆并表達(dá)的G3PDH基因補(bǔ)償。因此，合成甘油的能力同時(shí)可以用作所需產(chǎn)生甘油的細(xì)胞的選擇標(biāo)記。
實(shí)施例一般方法磷酸化、連接和轉(zhuǎn)化的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。適合用于以下實(shí)施例的技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)于Sambrook等，Molecular CloningALaboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)。
適合細(xì)菌培養(yǎng)物的保持和生長(zhǎng)的材料和方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。適合用于以下實(shí)施例的技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)于Manual of Methods forGeneral Bacteriology(Phillipp Gerhardt，R.G.E.Murray，Ralph N.Costilow，Eugene W.Nester，Willis A.Wood，Noel R.Krieg和G.BriggsPhillips，編輯)，美國(guó)微生物協(xié)會(huì)，華盛頓(1994)，或發(fā)現(xiàn)于BiotechnologyA Textbook of Industrial Microbiology(Thomas D.Brock，第二版(1989)，Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA)。所有用于細(xì)菌細(xì)胞生長(zhǎng)和保持的試劑和材料均從Aldrich Chemicals(Milwaukee，WI)、DIFCO Laboratories(Detroit，MI)、GIBCO/BRL(Gaithersburg，MD)或Sigma化學(xué)公司(St.Louis，MO)獲得，除非另外具體說(shuō)明。
縮寫的意義如下“h”指小時(shí)，“min”指分鐘，“sec”指秒，“d”指天，“mL”指毫升，“L”指升。細(xì)胞株以下大腸桿菌菌株用于轉(zhuǎn)化和表達(dá)G3PDH和G3P磷酸酶。從大腸桿菌遺傳保藏中心或由Life Technologies(Gaithersburg，MD)獲得菌株。
AA200(garB10 fhuA22 ompF627 fadL701 relA1 pit-10 spoT1 tpi-1phoM510 mcrB1)(Anderson等，(1970)，J.Gen.Microbiol.，62329)。
BB20(tonA22 ΔphoA8 fadL701 relA1 glpR2 glpD3 pit-10 gpsA20spoT1 T2R)(Cronan等，J.Bact.，118598)。
DH5α(deoR endA1 gyrA96 hsdR17 recA1 relA1 supE44 thi-1Δ(lacZYA-argFV169)phi80lacZΔM15F)(Woodcock等，(1989)，Nucl.Acids Res.，173469)。鑒定甘油通過(guò)HPLC和/或GC監(jiān)測(cè)葡萄糖轉(zhuǎn)化為甘油。采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)和層析領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得的材料進(jìn)行分析。一種合適方法采用UV(210nm)和RI檢測(cè)，使用Waters Maxima 820 HPLC系統(tǒng)。將樣品注射入裝備有Shodex SH-1011P前置柱(6mm×50mm)的Shodex SH-1011柱(8mm×300mm；Waters，Milford，MA)，溫度控制于50℃，采用0.01N H2SO4作流速為0.5mL/分鐘的流動(dòng)相。當(dāng)需要定量分析時(shí)，將樣品注射入裝備有Shodex SH-1011P前置柱(6mm×50mm)的Shodex SH-1011柱(8mm×300mm；Waters，Milford，MA)，溫度控制于50℃，采用0.01N H2SO4作流速為0.69mL/分鐘的流動(dòng)相。當(dāng)需要定量分析時(shí)，用已知量三甲基乙酸作外標(biāo)制備樣品。通常，甘油(RI檢測(cè))和葡萄糖(RI檢測(cè))的保留時(shí)間分別是17.03分鐘和12.66分鐘。
也通過(guò)GC/MS分析甘油。采用DB-WAX柱(30m，0.32mm ID.，0.25um薄膜厚度，J&W Scientific，F(xiàn)olsom，CA)，氣相層析和質(zhì)譜分析法檢測(cè)和定量甘油，按以下條件進(jìn)行注射器分流注射器，1∶15；樣品體積1uL；溫度分布型初始溫度150℃保持30秒，40℃/min至180℃，20℃/min至240℃，保持2.5分鐘。檢測(cè)EI質(zhì)譜分析法(HewlettPackard 5971，San Fernando，CA)，定量SIM采用離子61m/z和64m/z作為靶離子用于甘油和甘油-d8，以及用離子43m/z作甘油的鑒定離子(qualifierion)。甘油-d8用作內(nèi)標(biāo)。鑒別甘油-3-磷酸酶GPP通過(guò)在pH為6.5的bis-Tris或MES和鎂緩沖液中溫育所述提取物和有機(jī)磷酸鹽底物，進(jìn)行酶活性檢測(cè)。所用底物不是1-α-甘油磷酸，就是d，l-α-甘油磷酸。在該檢測(cè)中所述試劑的終濃度是緩沖劑(20mM，bis-Tris或50mM MES)；MgCl2(10Mm)；以及底物(20mM)。如果樣品中的總蛋白較低并且用酸猝滅不發(fā)生可見(jiàn)的沉淀，則方便地在比色杯中檢測(cè)樣品。該方法包括在含有20mM底物(50μL，200mM)、50mM MES、10mM MgCl2、pH6.5緩沖液的比色杯中溫育酶樣品。該最終磷酸酶檢測(cè)體積為0.5mL。將該含酶樣品加入到上述反應(yīng)混合物中；混合比色杯中內(nèi)容物，然后將該比色杯置于循環(huán)的水浴中，于37℃保持5-120分鐘，時(shí)間長(zhǎng)度取決于酶樣品中的磷酸酶活性是否在范圍2-0.02U/mL內(nèi)。通過(guò)加入酸性鉬酸鹽試劑(0.4mL)猝滅該酶反應(yīng)。在加入FiskeSubbaRaw試劑(0.1mL)和蒸餾水(1.5mL)后，混合上述溶液，并讓其顯色。10分鐘后，讓其發(fā)生完全顯色，采用Cary 219 UV/可見(jiàn)光分光光度計(jì)于660nm讀樣品的吸光度。將釋放的有機(jī)磷酸鹽的量與標(biāo)準(zhǔn)曲線相比，該標(biāo)準(zhǔn)曲線是通過(guò)采用無(wú)機(jī)磷原液(0.65mM)和制備無(wú)機(jī)磷酸鹽終濃度范圍為0.026-0.130μmol/mL的6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品制作的。分光光度檢測(cè)法檢測(cè)甘油-3-磷酸脫氫酶(G3PDH)活性下列方法用作Bell等發(fā)表方法((1975)，J.Biol.Chem.，2507153-8)的如下改良法。該方法包括溫育比色杯中的酶樣品，比色杯中含有0.2mM NADH、2.0mM二羥丙酮磷酸(DHAP)和具有5mM DTT的pH7.5的0.1M Tris/HCl緩沖液中的酶，總體積為1.0mL，溫度為30℃。設(shè)定分光光度計(jì)以于340nm固定波長(zhǎng)監(jiān)測(cè)吸光度變化。以只含緩沖液的比色杯作為該儀器的空白。在將所述酶加到比色杯中后，進(jìn)行吸光度讀數(shù)。加入第一種底物NADH(50uL 4mM NADH；吸光度應(yīng)增加大約1.25AU)以確定本底速率。應(yīng)觀測(cè)該本底速率至少3分鐘。然后加入第二種底物DHAP(50uL 40mM DHAP)，監(jiān)測(cè)吸光度隨時(shí)間的變化至少3分鐘以確定總速率。從總速率減去本底速率確定G3PDH活性。質(zhì)粒構(gòu)建和菌株構(gòu)建克隆和表達(dá)甘油-3-磷酸酶以提高大腸桿菌中的甘油生產(chǎn)由ATCC獲得釀酒酵母染色體Vλ克隆6592(基因庫(kù)，登記號(hào)U18813x11)。通過(guò)用合成引物(SEQ ID NO16和SEQ ID NO17)于5’端摻入BamHI-RBS-XbaI位點(diǎn)和于3’端摻入SamI位點(diǎn)，從靶DNAλ克隆進(jìn)行克隆，從而克隆甘油-3-磷酸磷酸酶(GPP2)基因。所述產(chǎn)物品在SrfI位點(diǎn)亞克隆到pCR-Script(Stratagene，Madison，WI)，以產(chǎn)生含有GPP2的質(zhì)粒pAH15。為了從pCR-Script SK+中的lac啟動(dòng)子表達(dá)，質(zhì)粒pAH15含有無(wú)活性取向的GPP2基因。將得自含有GPP2基因的pAH15的BamHI-SmaI片段插入到pBlueScriptII SK+，以產(chǎn)生質(zhì)粒pAH19。為了從所述lac啟動(dòng)子表達(dá)，pAH19含有正確取向的GPP2基因。將得自含有GPP2基因的pAH19的XbaI-PstI片段插入到pPHOX2中，以產(chǎn)生質(zhì)粒pAH21。pAH21/DH5α是表達(dá)質(zhì)粒。用于在大腸桿菌過(guò)量表達(dá)DAR1的質(zhì)粒采用合成引物(SEQ ID NO18和SEQ ID NO19)，通過(guò)由釀酒酵母基因組DNA PCR克隆分離DAR1。成功的PCR克隆使NcoI位點(diǎn)置于DAR1的5’端，其中在NcoI中的ATG是DAR1起始密碼子蛋氨酸。在DAR1的3’端，在翻譯終止子之后導(dǎo)入BamHI位點(diǎn)。用NcoI+BamHI消化所述PCR片段，并克隆到表達(dá)質(zhì)粒pTrc99A(Pharmacia，Piscataway，NJ)中的相同位點(diǎn)，以產(chǎn)生pDAR1A。
為了在DAR1的5’端產(chǎn)生更好的核塘體結(jié)合位點(diǎn)，將通過(guò)退火合成引物(SEQ ID NO20和SEQ ID NO21)獲得的SpeI-RBS-NcoI接頭插入到pDAR1A的NcoI位點(diǎn)，以產(chǎn)生pAH40。為了從pTrc99A(Pharmacia，Piscataway，NJ)的trc啟動(dòng)子表達(dá)，質(zhì)粒pAH40含有正確取向的新的RBS和DAR1基因。將得自pDAR1A的NcoI-BamHI片段和通過(guò)退火合成引物(SEQ ID NO22和SEQ ID NO23)獲得的第二組SpeI-RBS-NcoI接頭插入到pBC-SK+(Stratagene，Madison，WI)的SpeI-BamHI位點(diǎn)，以產(chǎn)生質(zhì)粒pAH42。質(zhì)粒pAH42含有氯霉素抗性基因。構(gòu)建用于DAR1和GPP2的表達(dá)盒采用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法，從上述各個(gè)DAR1和GPP2亞克隆裝配用于DAR1和GPP2的表達(dá)盒。將得自含有核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)和GPP2基因的pAH19的BamHI-PstI片段插入到pAH40，以產(chǎn)生pAH43。將得自含有RBS和GPP2基因的pAH19的BamHI-PstI片段插入到pAH42，以產(chǎn)生pAH45。
對(duì)GPP2的5’端的核糖體結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行如下修飾。通過(guò)將合成引物GATCCAGGAAACAGA(SEQ ID NO24)和CTAGTCTGTTTCCTG(SEQ ID NO25)退火到得自含GGP2基因的pAH19的XbaI-PstI片段而獲得的BamHI-RBS-SpeI接頭插入到pAH40的BamHI-PstI位點(diǎn)，以產(chǎn)生pAH48。質(zhì)粒pAH48含有DAR1基因、修飾后的RBS、和為了從pTrc99A(Pharmacia，Piscataway，NJ)的trc啟動(dòng)子表達(dá)而正確取向的GPP2基因。轉(zhuǎn)化大腸桿菌采用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)將本文所述的所有質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中。通過(guò)其DNARFLP圖型證實(shí)轉(zhuǎn)化體。
實(shí)施例1由用G3PDH基因轉(zhuǎn)化的大腸桿菌生產(chǎn)甘油培養(yǎng)基采用用pDAR1A轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞，用合成培養(yǎng)基無(wú)氧或有氧生產(chǎn)甘油。該培養(yǎng)基每升含有6.0g Na2HPO4、3.0g KH2PO4、1.0gNH4Cl、0.5g NaCl、1mL 20％MgSO4·7H2O、8.0g葡萄糖、40mg水解酪蛋白氨基酸、0.5ml 1％鹽酸硫胺素、100mg氨芐青霉素。生長(zhǎng)條件帶有pDAR1A或pTrc99A載體的菌株AA200生長(zhǎng)于有氧條件下的50mL培養(yǎng)基中，于37℃在250mL培養(yǎng)瓶中以250rpm震蕩培養(yǎng)。在A600為0.2-0.3時(shí)，加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷使其終濃度為1mM，并繼續(xù)溫育48小時(shí)。為了無(wú)氧生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞樣品用來(lái)裝滿帶蓋的Falcon#2054管，并于37℃旋轉(zhuǎn)輕輕混合48小時(shí)。通過(guò)HPLC分析培養(yǎng)物上清液確定甘油產(chǎn)量。菌株pDAR1A/AA200在無(wú)氧條件下培養(yǎng)48小時(shí)后產(chǎn)生甘油0.38g/L，在有氧條件下產(chǎn)生甘油0.48g/L。
實(shí)施例2由用G3P磷酸酶基因(GPP2)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌生產(chǎn)甘油培養(yǎng)基在搖瓶中采用合成phoA培養(yǎng)基以證實(shí)在大腸桿菌中的GPP2表達(dá)使甘油產(chǎn)生增加。每升phoA培養(yǎng)基含有Amisoy 12g；硫酸銨0.62g；MOPS 10.5g；檸檬酸鈉1.2g；NaOH(1M)10mL；1M MgSO412mL；100X微量元素12mL；50％葡萄糖，10mL；1％硫胺素，10mL；100mg/mLL-脯氨酸，10mL；2.5mM FeCl3，5mL；混合磷酸緩沖液，2mL(5mL 0.2MNaH2PO4+9mL 0.2M KH2PO4)，pH7.0。對(duì)于每升pho培養(yǎng)基，上述100X微量元素含有ZnSO4·7H2O，0.58g；MnSO4·H2O，0.34g；CuSO4·5H2O，0.49g；CoCl2·6H2O，0.47g；H3BO3，0.12g；NaMoO4·2H2O，0.48g。搖瓶實(shí)驗(yàn)菌株pAH21/DH5α(含有GPP2基因)和pPHOX2/DH5α(對(duì)照)于37℃在250mL搖瓶中的45mL培養(yǎng)基(phoA培養(yǎng)基，50ug/mL羧芐青霉素和lug/mL維生素B12)中生長(zhǎng)。所述培養(yǎng)物在有氧條件(250rpm震搖)下生長(zhǎng)24小時(shí)。通過(guò)HPLC分析培養(yǎng)物上清液確定甘油產(chǎn)量。24小時(shí)后pAH21/DH5α的甘油產(chǎn)量為0.2g/L。
實(shí)施例3采用含GPP2和DAR1的重組大腸桿菌由D-葡萄糖生產(chǎn)甘油于37℃在搖瓶培養(yǎng)物(錐形瓶，液體體積是總體積的1/5)中進(jìn)行有氧生長(zhǎng)，以證實(shí)含DH5αpAH43的大腸桿菌產(chǎn)生的甘油增加。
通過(guò)來(lái)自用抗生素選擇的過(guò)夜LB/1％葡萄糖培養(yǎng)物的接種，在基本培養(yǎng)基/1％葡萄糖搖瓶中開始培養(yǎng)?；九囵B(yǎng)基是過(guò)濾除菌的已知成分培養(yǎng)基，終pH為6.8(HCl)，每升含有12.6g(NH4)2SO4、13.7gK2HPO4、0.2g酵母提取物(Difco)、1g NaHCO3、5mg維生素B12、5mL改良Balch’s微量元素液(其組成可以發(fā)現(xiàn)于一般和分子細(xì)菌學(xué)方法(P.Gerhardt等編輯，第158頁(yè)，美國(guó)微生物協(xié)會(huì)，華盛頓，DC(1994))。搖瓶于37℃劇烈震搖過(guò)夜溫育，之后取樣用于上清液的GC分析。24小時(shí)后pAH43/DH5α顯示的甘油產(chǎn)量為3.8g/L。
實(shí)施例4采用含GPP2和DAR1的重組大腸桿菌由D-葡萄糖生產(chǎn)甘油實(shí)施例4說(shuō)明由含GPP2和DAR1的重組大腸桿菌DH5α/pAH48生產(chǎn)葡萄糖。
按上述一般方法中所述，構(gòu)建菌株DH5α/pAH48。預(yù)培養(yǎng)為了接種到發(fā)酵運(yùn)行(fermentation run)中，進(jìn)行DH5α/pAH48預(yù)培養(yǎng)。預(yù)培養(yǎng)的組分和方案列表如下。
預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基KH2PO430.0g/L檸檬酸 2.0g/LMgSO4·7H2O 2.0g/L98％H2SO42.0mL/L檸檬酸鐵銨 0.3g/LCaCl2·2H2O 0.2g/L酵母提取物 5.0g/L微量金屬 5.0mL/L葡萄糖 10.0g/L羧芐青霉素 100.0mg/L將上述培養(yǎng)基組分一起混合，并用NH4OH將其pH調(diào)節(jié)到6.8。之后將培養(yǎng)基過(guò)濾除菌。
按照以下配方使用微量元素檸檬酸，一水合物 4.0g/LMgSO4·7H2O 3.0g/LMnSO4·H2O0.5g/LNaCl 1.0g/LFeSO4·7H2O 0.1g/LCoCl2·6H2O 0.1g/LCaCl20.1g/LZnSO4·7H2O 0.1g/LCuSO4·5H2O 10mg/LAlK(SO4)2·12H2O 10mg/LH3BO310mg/LNa2MoO4·2H2O10mg/LNiSO4·6H2O 10mg/LNa2SeO310mg/LNa2WO4·2H2O 10mg/L培養(yǎng)物開始自從50ul凍藏原液(15％甘油用作冷凍保護(hù)劑)接種到2L錐形瓶中的600mL培養(yǎng)基的種子培養(yǎng)物。培養(yǎng)物于30℃在250rpm的搖床中生長(zhǎng)大約12小時(shí)，然后用來(lái)接種發(fā)酵罐。發(fā)酵生長(zhǎng)容器15L攪拌釜發(fā)酵罐培養(yǎng)基KH2PO46.8g/L檸檬酸 2.0g/LMgSO4·7H2O 2.0g/L98％H2SO42.0mL/L檸檬酸鐵銨 0.3g/L
CaCl2·2H2O 0.2g/LMazu DF204消泡劑1.0mL/L上述組分在發(fā)酵罐容器中一并滅菌。用NH4OH將其pH調(diào)升到6.7。酵母提取物(5g/L)和微量金屬液(5mL/L)由過(guò)濾除菌的原液無(wú)菌性加入。由60％飼料加入葡萄糖使其終濃度為10g/L。以100mg/L加入羧芐青霉素。接種后體積為6L。發(fā)酵的環(huán)境條件所述溫度控制在36℃，空氣流率控制在每分鐘6標(biāo)準(zhǔn)升。托持壓力控制在0.5巴。攪拌器設(shè)定為350rpm。氨水用來(lái)控制pH于6.7。控制葡萄糖(60％葡萄糖一水合物)進(jìn)料速率以保持過(guò)量葡萄糖。結(jié)果發(fā)酵運(yùn)行的結(jié)果見(jiàn)表1。
表1EFT OD550 [葡萄糖][甘油] 產(chǎn)生的總(hr)(AU) (g/L) (g/L)進(jìn)料的總 甘油量(g)葡萄糖(g)0 0.8 9.3 256 4.7 4.02.0 49 148 5.4 0 3.6 71 2510 6.7 0.04.7 116 3312 7.4 2.17.0 157 4914.210.4 0.3 10.0 230 7016.218.1 9.7 15.5 259 10618.212.4 14.5 30520.211.8 17.4 17.7 353 11922.211.0 12.6 38224.210.8 6.5 26.6 404 17826.210.9 6.8 44228.210.4 10.3 31.5 463 21630.210.2 13.1 30.4 493 21332.210.1 8.1 28.2 512 19634.210.2 3.5 33.4 530 22336.210.1 5.8 54838.2 9.8 5.1 36.1 512 233
序列表(1)一般資料(i)申請(qǐng)人(A) 姓名E.I.DU PONT DE NEMOURS AND COMPANY(B) 街道1007 MARKET STREET(C) 城市WILMINGTON(D) 州DELAWARE(E) 國(guó)家美國(guó)(F) 郵政編碼19898(G) 電話302-892-8112(H) 傳真302-773-0164(I) 用戶電報(bào)6717325(A) 收信人GENENCOR INTERNATIONAL，INC.
(B) 街道4 CAMBRIDGE PLACE1870 SOUTH WINTON ROAD(C) 城市ROCHESTER(D) 州紐約州(E) 國(guó)家美國(guó)(F) 郵政編碼14618(ii)發(fā)明名稱用重組生物體生產(chǎn)甘油的方法(iii)序列數(shù)25(iV)計(jì)算機(jī)可讀形式(A) 媒體類型軟盤，3.5英寸(B) 計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C) 操作系統(tǒng)MICROSOFT WORD FOR WINDOWS 95(D) 軟件MICROSOFT WORD VERSION 7.0A(v)當(dāng)前申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A) 申請(qǐng)?zhí)?B) 提交日期(C) 分類(vi)在先申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A) 申請(qǐng)?zhí)?0/03602(B) 提交日期1996年11月13日(C) 分類(vii)代理律師/代理人資料(A) 姓名FLORD，LINDA AXAMETHY(B) 注冊(cè)號(hào)33，692(C) 參考/檔案號(hào)CR-9981-P1(2)SEQ ID NO1的信息(i)順序特征(A)長(zhǎng)度1380個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)順序描述SEQ ID NO1CTTTAATTTT CTTTTATCTT ACTCTCCTAC ATAAGACATC AAGAAACAAT TGTATATTGT 60ACACCCCCCC CCTCCACAAA CACAAATATT GATAATATAA AGATGTCTGC TGCTGCTGAT 120AGATTAAACT TAACTTCCGG CCACTTGAAT GCTGGTAGAA AGAGAAGTTC CTCTTCTGTT 180TCTTTGAAGG CTGCCGAAAA GCCTTTCAAG GTTACTGTGA TTGGATCTGG TAACTGGGGT 240ACTACTATTG CCAAGGTGGT TGCCGAAAAT TGTAAGGGAT ACCCAGAAGT TTTCGCTCCA 300ATAGTACAAA TGTGGGTGTT CGAAGAAGAG ATCAATGGTG AAAAATTGAC TGAAATCATA 360AATACTAGAC ATCAAAACGT GAAATACTTG CCTGGCATCA CTCTACCCGA CAATTTGGTT 420GCTAATCCAG ACTTGATTGA TTCAGTCAAG GATGTCGACA TCATCGTTTT CAACATTCCA 480CATCAATTTT TGCCCCGTAT CTGTAGCCAA TTGAAAGGTC ATGTTGATTC ACACGTCAGA 540GCTATCTCCT GTCTAAAGGG TTTTGAAGTT GGTGCTAAAG GTGTCCAATT GCTATCCTCT 600TACATCACTG AGGAACTAGG TATTCAATGT GGTGCTCTAT CTGGTGCTAA CATTGCCACC 660GAAGTCGCTC AAGAACACTG GTCTGAAACA ACAGTTGCTT ACCACATTCC AAAGGATTTC 720AGAGGCGAGG GCAAGGACGT CGACCATAAG GTTCTAAAGG CCTTGTTCCA CAGACCTTAC 780TTCCACGTTA GTGTCATCGA AGATGTTGCT GGTATCTCCA TCTGTGGTGC TTTGAAGAAC 840GTTGTTGCCT TAGGTTGTGG TTTCGTCGAA GGTCTAGGCT GGGGTAACAA CGCTTCTGCT 900GCCATCCAAA GAGTCGGTTT GGGTGAGATC ATCAGATTCG GTCAAATGTT TTTCCCAGAA 960TCTAGAGAAG AAACATACTA CCAAGAGTCT GCTGGTGTTG CTGATTTGAT CACCACCTGC1020GCTGGTGGTA GAAACGTCAA GGTTGCTAGG CTAATGGCTA CTTCTGGTAA GGACGCCTGG1080GAATGTGAAA AGGAGTTGTT GAATGGCCAA TCCGCTCAAG GTTTAATTAC CTGCAAAGAA1140GTTCACGAAT GGTTGGAAAC ATGTGGCTCT GTCGAAGACT TCCCATTATT TGAAGCCGTA1200TACCAAATCG TTTACAACAA CTACCCAATG AAGAACCTGC CGGACATGAT TGAAGAATTA1260GATCTACATG AAGATTAGAT TTATTGGAGA AAGATAACAT ATCATACTTC CCCCACTTTT1320TTCGAGGCTC TTCTATATCA TATTCATAAA TTAGCATTAT GTCATTTCTC ATAACTACTT1380(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度2946個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO2GAATTCGAGC CTGAAGTGCT GATTACCTTC AGGTAGACTT CATCTTGACC CATCAACCCC 60AGCGTCAATC CTGCAAATAC ACCACCCAGC AGCACTAGGA TGATAGAGAT AATATAGTAC 120GTGGTAACGC TTGCCTCATC ACCTACGCTA TGGCCGGAAT CGGCAACATC CCTAGAATTG 180AGTACGTGTG ATCCGGATAA CAACGGCAGT GAATATATCT TCGGTATCGT AAAGATGTGA 240TATAAGATGA TGTATACCCA ATGAGGAGCG CCTGATCGTG ACCTAGACCT TAGTGGCAAA 300AACGACATAT CTATTATAGT GGGGAGAGTT TCGTGCAAAT AACAGACGCA GCAGCAAGTA 360ACTGTGACGA TATCAACTCT TTTTTTATTA TGTAATAAGC AAACAAGCAC GAATGGGGAA 420AGCCTATGTG CAATCACCAA GGTCGTCCCT TTTTTCCCAT TTGCTAATTT AGAATTTAAA 480GAAACCAAAA GAATGAAGAA AGAAAACAAA TACTAGCCCT AACCCTGACT TCGTTTCTAT 540GATAATACCC TGCTTTAATG AACGGTATGC 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Tyr Leu Glu Lys Ala Phe Trp Glu Phe Ser Lys Ala Gln Leu85 90 95Asp Leu Val Ile Glu Ala Leu Asn Glu Arg Lys His Leu Ile Asn Thr100 105 110Ala Pro His Leu Cys Thr Val Leu Pro Ile Leu Ile Pro Ile Tyr Ser115 120 125Thr Trp Gln Val Pro Tyr Ile Tyr Met Gly Cys Lys Phe Tyr Asp Phe130 135 140Phe Gly Gly Ser Gln Asn Leu Lys Lys Ser Tyr Leu Leu Ser Lys Ser145 150 155 160Ala Thr Val Glu Lys Ala Pro Met Leu Thr Thr Asp Asn Leu Lys Ala165 170 175Ser Leu Val Tyr His Asp Gly Ser Phe Asn Asp Ser Arg Leu Asn Ala180 185 190Thr Leu Ala Ile Thr Gly Val Glu Asn Gly Ala Thr Val Leu Ile Tyr195 200 205Val Glu Val Gln Lys Leu Ile Lys Asp Pro Thr Ser Gly Lys Val Ile210 215 220Gly Ala Glu Ala Arg Asp Val Glu Thr Asn Glu Leu Val Arg Ile Asn225 230 235 240Ala Lys Cys Val Val Asn Ala Thr Gly Pro Tyr Ser Asp Ala Ile Leu245 250 255Gln Met Asp Arg Asn Pro Ser Gly Leu Pro Asp Ser Pro Leu Asn Asp260 265 270Asn Ser Lys Ile Lys Ser Thr Phe Asn Gln Ile Ser Val Met Asp Pro275 280 285Lys Met Val Ile Pro Ser Ile Gly Val His Ile Val Leu Pro Ser Phe290 295 300Tyr Ser Pro Lys Asp Met Gly Leu Leu Asp Val Arg Thr Ser Asp Gly305 310 315 320Arg Val Met Phe Phe Leu Pro Trp Gln Gly Lys Val Leu Ala Gly Thr325 330 335Thr Asp lle Pro Leu Lys Gln Val Pro Glu Asn Pro Met Pro Thr Glu340 345 350Ala Asp Ile Gln Asp Ile Leu Lys Glu Leu Gln His Tyr Ile Glu Phe355 360 365Pro Val Lys Arg Glu Asp Val Leu Ser Ala Trp Ala Gly Val Arg Pro370 375 380Leu Val Arg Asp Pro Arg Thr Ile Pro Ala Asp Gly Lys Lys Gly Ser385 390 395 400Ala Thr Gln Gly Val Val Arg Ser His Phe Leu Phe Thr Ser Asp Asn405 410 415Gly Leu Ile Thr Ile Ala Gly Gly Lys Trp Thr Thr Tyr Arg Gln Met420 425 430Ala Glu Glu Thr Val Asp Lys Val Val Glu Val Gly Gly Phe His Asn435 440 445Leu Lys Pro Cys His Thr Arg Asp Ile Lys Leu Ala Gly Ala Glu Glu450 455 460Trp Thr Gln Asn Tyr Val Ala Leu Leu Ala Gln Asn Tyr His Leu Ser465 470 475 480Ser Lys Met Ser Asn Tyr Leu Val Gln Asn Tyr Gly Thr Arg Ser Ser485 490 495Ile IIe Cys Glu Phe Phe Lys Glu Ser Met Glu Asn Lys Leu Pro Leu500 505 510Ser Leu Ala Asp Lys Glu Asn Asn Val Ile Tyr Ser Ser Glu Glu Asn515 520 525Asn Leu Val Asn Phe Asp Thr Phe Arg Tyr Pro Phe Thr Ile Gly Glu530 535 540Leu Lys Tyr Ser Met Gln Tyr Glu Tyr Cys Arg Thr Pro Leu Asp Phe545 550 555 560Leu Leu Arg Arg Thr Arg Phe Ala Phe Leu Asp Ala Lys Glu Ala Leu565 570 575Asn Ala Val His Ala Thr Val Lys Val Met Gly Asp Glu Phe Asn Trp580 585 590Ser Glu Lys Lys Arg Gln Trp Glu Leu Glu Lys Thr Val Asn Phe Ile595 600 605Gln Gly Arg Phe Gly Val610(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度339個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO10Met Asn Gln Arg Asn Ala Ser Met Thr Val Ile Gly Ala Gly Ser Tyr1 5 10 15Gly Thr Ala Leu Ala Ile Thr Leu Ala Arg Asn Gly His Glu Val Val20 25 30Leu Trp Gly His Asp Pro Glu His Ile Ala Thr Leu Glu Arg Asp Arg35 40 45Cys Asn Ala Ala Phe Leu Pro Asp Val Pro Phe Pro Asp Thr Leu His50 55 60Leu Glu Ser Asp Leu Ala Thr Ala Leu Ala Ala Ser Arg Asn Ile Leu65 70 75 80Val Val Val Pro Ser His Val Phe Gly Glu Val Leu Arg Gln Ile Lys85 90 95Pro Leu Met Arg Pro Asp Ala Arg Leu Val Trp Ala Thr Lys Gly Leu100 105 110Glu Ala Glu Thr Gly Arg Leu Leu Gln Asp Val Ala Arg Glu Ala Leu115 120 125Gly Asp Gln Ile Pro Leu Ala Val Ile Ser Gly Pro Thr Phe Ala Lys130 135 140Glu Leu Ala Ala Gly Leu Pro Thr Ala Ile Ser Leu Ala Ser Thr Asp145 150 155 160Gln Thr Phe Ala Asp Asp Leu Gln Gln Leu Leu His Cys Gly Lys Ser165 170 175Phe Arg Val Tyr Ser Asn Pro Asp Phe Ile Gly Val Gln Leu Gly Gly180 185 190Ala Val Lys Asn Val Ile Ala Ile Gly Ala Gly Met Ser Asp Gly Ile195 200 205Gly Phe Gly Ala Asn Ala Arg Thr Ala Leu Ile Thr Arg Gly Leu Ala210 215 220Glu Met Ser Arg Leu Gly Ala Ala Leu Gly Ala Asp Pro Ala Thr Phe225 230 235 240Met Gly Met Ala Gly Leu Gly Asp Leu Val Leu Thr Cys Thr Asp Asn245 250 255Gln Ser Arg Asn Arg Arg Phe Gly Met Met Leu Gly Gln Gly Met Asp260 265 270Val Gln Ser Ala Gln Glu Lys Ile Gly Gln Val Val Glu Gly Tyr Arg275 280 285Asn Thr Lys Glu Val Arg Glu Leu Ala His Arg Phe Gly Val Glu Met290 295 300Pro Ile Thr Glu Glu Ile Tyr Gln Val Leu Tyr Cys Gly Lys Asn Ala305 310 315 320Arg Glu Ala Ala Leu Thr Leu Leu Gly Arg Ala Arg Lys Asp Glu Arg325 330 335Ser Ser His(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度501個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO11Met Glu Thr Lys Asp Leu Ile Val Ile Gly Gly Gly Ile Asn Gly Ala1 5 10 15Gly Ile Ala Ala Asp Ala Ala Gly Arg Gly Leu Ser Val Leu Met Leu20 25 30Glu Ala Gln Asp Leu Ala Cys Ala Thr Ser Ser Ala Ser Ser Lys Leu35 40 45Ile His Gly Gly Leu Arg Tyr Leu Glu His Tyr Glu Phe Arg Leu Val50 55 60Ser Glu Ala Leu Ala Glu Arg Glu Val Leu Leu Lys Met Ala Pro His65 70 75 80Ile Ala Phe Pro Met Arg Phe Arg Leu Pro His Arg Pro His Leu Arg85 90 95Pro Ala Trp Met Ile Arg Ile Gly Leu Phe Met Tyr Asp His Leu Gly100 105 110Lys Arg Thr Ser Leu Pro Gly Ser Thr Gly Leu Arg Phe Gly Ala Asn115 120 125Ser Val Leu Lys Pro Glu Ile Lys Arg Gly Phe Glu Tyr Ser Asp Cys130 135 140Trp Val Asp Asp Ala Arg Leu Val Leu Ala Asn Ala Gln Met Val Val145 150 155 160Arg Lys Gly Gly Glu Val Leu Thr Arg Thr Arg Ala Thr Ser Ala Arg165 170 175Arg Glu Asn Gly Leu Trp Ile Val Glu Ala Glu Asp Ile Asp Thr Gly180 185 190Lys Lys Tyr Ser Trp Gln Ala Arg Gly Leu Val Asn Ala Thr Gly Pro195 200 205Trp Val Lys Gln Phe Phe Asp Asp Gly Met His Leu Pro Ser Pro Tyr210 215 220Gly Ile Arg Leu Ile Lys Gly Ser His Ile Val Val Pro Arg Val His225 230 235 240Thr Gln Lys Gln Ala Tyr Ile Leu Gln Asn Glu Asp Lys Arg Ile Val245 250 255Phe Val Ile Pro Trp Met Asp Glu Phe Ser Ile Ile Gly Thr Thr Asp260 265 270Val Glu Tyr Lys Gly Asp Pro Lys Ala Val Lys Ile Glu Glu Ser Glu275 280 285Ile Asn Tyr Leu Leu Asn Val Tyr Asn Thr His Phe Lys Lys Gln Leu290 295 300Ser Arg Asp Asp Ile Val Trp Thr Tyr Ser Gly Val Arg Pro Leu Cys305 310 315 320Asp Asp Glu Ser Asp Ser Pro Gln Ala Ile Thr Arg Asp Tyr Thr Leu325 330 335Asp Ile His Asp Glu Asn Gly Lys Ala Pro Leu Leu Ser Val Phe Gly340 345 350Gly Lys Leu Thr Thr Tyr Arg Lys Leu Ala Glu His Ala Leu Glu Lys355 360 365Leu Thr Pro Tyr Tyr Gln Gly Ile Gly Pro Ala Trp Thr Lys Glu Ser370 375 380Val Leu Pro Gly Gly Ala Ile Glu Gly Asp Arg Asp Asp Tyr Ala Ala385 390 395 400Arg Leu Arg Arg Arg Tyr Pro Phe Leu Thr Glu Ser Leu Ala Arg His405 410 415Tyr Ala Arg Thr Tyr Gly Ser Asn Ser Glu Leu Leu Leu Gly Asn Ala420 425 430Gly Thr Val Ser Asp Leu Gly Glu Asp Phe Gly His Glu Phe Tyr Glu435 440 445Ala Glu Leu Lys Tyr Leu Val Asp His Glu Trp Val Arg Arg Ala Asp450 455 460Asp Ala Leu Trp Arg Arg Thr Lys Gln Gly Met Trp Leu Asn Ala Asp465 470 475 480Gln Gln Ser Arg Val Ser Gln Trp Leu Val Glu Tyr Thr Gln Gln Arg485 490 495Leu Ser Leu Ala Ser500(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度542個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO12Met Lys Thr Arg Asp Ser Gln Ser Ser Asp Val Ile Ile Ile Gly Gly1 5 10 15Gly Ala Thr Gly Ala Gly Ile Ala Arg Asp Cys Ala Leu Arg Gly Leu20 25 30Arg Val Ile Leu Val Glu Arg His Asp Ile Ala Thr Gly Ala Thr Gly35 40 45Arg Asn His Gly Leu Leu His Ser Gly Ala Arg Tyr Ala Val Thr Asp50 55 60Ala Glu Ser Ala Arg Glu Cys Ile Ser Glu Asn Gln Ile Leu Lys Arg65 70 75 80Ile Ala Arg His Cys Val Glu Pro Thr Asn Gly Leu Phe Ile Thr Leu85 90 95Pro Glu Asp Asp Leu Ser Phe Gln Ala Thr Phe Ile Arg Ala Cys Glu100 105 110Glu Ala Gly Ile Ser Ala Glu Ala Ile Asp Pro Gln Gln Ala Arg Ile115 120 125Ile Glu Pro Ala Val Asn Pro Ala Leu Ile Gly Ala Val Lys Val Pro130 135 140Asp Gly Thr Val Asp Pro Phe Arg Leu Thr Ala Ala Asn Met Leu Asp145 150 155 160Ala Lys Glu His Gly Ala Val Ile Leu Thr Ala His Glu Val Thr Gly165 170 175Leu Ile Arg Glu Gly Ala Thr Val Cys Gly Val Arg Val Arg Asn His180 185 190Leu Thr Gly Glu Thr Gln Ala Leu His Ala Pro Val Val Val Asn Ala195 200 205Ala Gly Ile Trp Gly Gln His Ile Ala Glu Tyr Ala Asp Leu Arg Ile210 215 220Arg Met Phe Pro Ala Lys Gly Ser Leu Leu Ile Met Asp His Arg Ile225 230 235 240Asn Gln His Val Ile Asn Arg Cys Arg Lys Pro Ser Asp Ala Asp Ile245 250 255Leu Val Pro Gly Asp Thr Ile Ser Leu Ile Gly Thr Thr Ser Leu Arg260 265 270Ile Asp Tyr Asn Glu Ile Asp Asp Asn Arg Val Thr Ala Glu Glu Val275 280 285Asp Ile Leu Leu Arg Glu Gly Glu Lys Leu Ala Pro Val Met Ala Lys290 295 300Thr Arg Ile Leu Arg Ala Tyr Ser Gly Val Arg Pro Leu Val Ala Ser305 310 315 320Asp Asp Asp Pro Ser Gly Arg Asn Leu Ser Arg Gly Ile Val Leu Leu325 330 335Asp His Ala Glu Arg Asp Gly Leu Asp Gly Phe Ile Thr Ile Thr Gly340 345 350Gly Lys Leu Met Thr Tyr Arg Leu Met Ala Glu Trp Ala Thr Asp Ala355 360 365Val Cys Arg Lys Leu Gly Asn Thr Arg Pro Cys Thr Thr Ala Asp Leu370 375 380Ala Leu Pro Gly Ser Gln Glu Pro Ala Glu Val Thr Leu Arg Lys Val385 390 395 400Ile Ser Leu Pro Ala Pro Leu Arg Gly Ser Ala Val Tyr Arg His Gly405 410 415Asp Arg Thr Pro Ala Trp Leu Ser Glu Gly Arg Leu His Arg Ser Leu420 425 430Val Cys Glu Cys Glu Ala Val Thr Ala Gly Glu Val Gln Tyr Ala Val435 440 445Glu Asn Leu Asn Val Asn Ser Leu Leu Asp Leu Arg Arg Arg Thr Arg450 455 460Val Gly Met Gly Thr Cys Gln Gly Glu Leu Cys Ala Cys Arg Ala Ala465 470 475 480Gly Leu Leu Gln Arg Phe Asn Val Thr Thr Ser Ala Gln Ser Ile Glu485 490 495Gln Leu Ser Thr Phe Leu Asn Glu Arg Trp Lys Gly Val Gln Pro Ile500 505 510Ala Trp Gly Asp Ala Leu Arg Glu Ser Glu Phe Thr Arg Trp Val Tyr515 520 525Gln Gly Leu Cys Gly Leu Glu Lys Glu Gln Lys Asp Ala Leu530 535 540(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度250個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO13Met Gly Leu Thr Thr Lys Pro Leu Ser Leu Lys Val Asn Ala Ala Leu1 5 10 15Phe Asp Val Asp Gly Thr Ile Ile Ile Ser Gln Pro Ala Ile Ala Ala20 25 30Phe Trp Arg Asp Phe Gly Lys Asp Lys Pro Tyr Phe Asp Ala Glu His35 40 45Val Ile Gln Val Ser His Gly Trp Arg Thr Phe Asp Ala Ile Ala Lys50 55 60Phe Ala Pro Asp Phe Ala Asn Glu Glu Tyr Val Asn Lys Leu Glu Ala65 70 75 80Glu Ile Pro Val Lys Tyr Gly Glu Lys Ser Ile Glu Val Pro Gly Ala85 90 95Val Lys Leu Cys Asn Ala Leu Asn Ala Leu Pro Lys Glu Lys Trp Ala100 105 110Val Ala Thr Ser Gly Thr Arg Asp Met Ala Gln Lys Trp Phe Glu His115 120 125Leu Gly Ile Arg Arg Pro Lys Tyr Phe Ile Thr Ala Asn Asp Val Lys130 135 140Gln Gly Lys Pro His Pro Glu Pro Tyr Leu Lys Gly Arg Asn Gly Leu145 150 155 160Gly Tyr Pro Ile Asn Glu Gln Asp Pro Ser Lys Ser Lys Val Val Val165 170 175Phe Glu Asp Ala Pro Ala Gly Ile Ala Ala Gly Lys Ala Ala Gly Cys180 185 190Lys Ile Ile Gly Ile Ala Thr Thr Phe Asp Leu Asp Phe Leu Lys Glu195 200 205Lys Gly Cys Asp Ile Ile Val Lys Asn His Glu Ser Ile Arg Val Gly210 215 220Gly Tyr Asn Ala Glu Thr Asp GIu Val Glu Phe Ile Phe Asp Asp Tyr225 230 235 240Leu Tyr Ala Lys Asp Asp Leu Leu Lys Trp245 250(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度271個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO14Met Lys Arg Phe Asn Val Leu Lys Tyr Ile Arg Thr Thr Lys Ala Asn1 5 10 15Ile Gln Thr Ile Ala Met Pro Leu Thr Thr Lys Pro Leu Ser Leu Lys20 25 30Ile Asn Ala Ala Leu Phe Asp Val Asp Gly Thr Ile Ile Ile Ser Gln35 40 45Pro Ala Ile Ala Ala Phe Trp Arg Asp Phe Gly Lys Asp Lys Pro Tyr50 55 60Phe Asp Ala Glu His Val Ile His Ile Ser His Gly Trp Arg Thr Tyr65 70 75 80Asp Ala Ile Ala Lys Phe Ala Pro Asp Phe Ala Asp Glu Glu Tyr Val85 90 95Asn Lys Leu Glu Gly Glu Ile Pro Glu Lys Tyr Gly Glu His Ser Ile100 105 110Glu Val Pro Gly Ala Val Lys Leu Cys Asn Ala Leu Asn Ala Leu Pro115 120 125Lys Glu Lys Trp Ala Val Ala Thr Ser Gly Thr Arg Asp Met Ala Lys130 135 140Lys Trp Phe Asp Ile Leu Lys Ile Lys Arg Pro Glu Tyr Phe Ile Thr145 150 155 160Ala Asn Asp Val Lys Gln Gly Lys Pro His Pro Glu Pro Tyr Leu Lys165 170 175Gly Arg Asn Gly Leu Gly Phe Pro Ile Asn Glu Gln Asp Pro Ser Lys180 185 190Ser Lys Val Val Val Phe Glu Asp Ala Pro Ala Gly Ile Ala Ala Gly195 200 205Lys Ala Ala Gly Cys Lys Ile Val Gly Ile Ala Thr Thr Phe Asp Leu210 215 220Asp Phe Leu Lys Glu Lys Gly Cys Asp Ile Ile Val Lys Asn His Glu225 230 235 240Ser Ile Arg Val Gly Glu Tyr Asn Ala Glu Thr Asp Glu Val Glu Leu245 250 255Ile Phe Asp Asp Tyr Leu Tyr Ala Lys Asp Asp Leu Leu Lys Trp260 265 270(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度709個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO15Met Phe Pro Ser Leu Phe Arg Leu Val Val Phe Ser Lys Arg Tyr Ile1 5 10 15Phe Arg Ser Ser Gln Arg Leu Tyr Thr Ser Leu Lys Gln Glu Gln Ser20 25 30Arg Met Ser Lys Ile Met Glu Asp Leu Arg Ser Asp Tyr Val Pro Leu35 40 45Ile Ala Ser Ile Asp Val Gly Thr Thr Ser Ser Arg Cys Ile Leu Phe50 55 60Asn Arg Trp Gly Gln Asp Val Ser Lys His Gln Ile Glu Tyr Ser Thr65 70 75 80Ser Ala Ser Lys Gly Lys Ile Gly Val Ser Gly Leu Arg Arg Pro Ser85 90 95Thr Ala Pro Ala Arg Glu Thr Pro Asn Ala Gly Asp Ile Lys Thr Ser100 105 110Gly Lys Pro Ile Phe Ser Ala Glu Gly Tyr Ala Ile Gln Glu Thr Lys115 120 125Phe Leu Lys Ile Glu Glu Leu Asp Leu Asp Phe His Asn Glu Pro Thr130 135 140Leu Lys Phe Pro Lys Pro Gly Trp Val Glu Cys His Pro Gln Lys Leu145 150 155 160Leu Val Asn Val Val Gln Cys Leu Ala Ser Ser Leu Leu Ser Leu Gln165 170 175Thr Ile Asn Ser Glu Arg Val Ala Asn Gly Leu Pro Pro Tyr Lys Val180 185 190Ile Cys Met Gly Ile Ala Asn Met Arg Glu Thr Thr Ile Leu Trp Ser195 200 205Arg Arg Thr Gly Lys Pro Ile Val Asn Tyr Gly Ile Val Trp Asn Asp210 215 220Thr Arg Thr Ile Lys Ile Val Arg Asp Lys Trp Gln Asn Thr Ser Val225 230 235 240Asp Arg Gln Leu Gln Leu Arg Gln Lys Thr Gly Leu Pro Leu Leu Ser245 250 255Thr Tyr Phe Ser Cys Ser Lys Leu Arg Trp Phe Leu Asp Asn Glu Pro260 265 270Leu Cys Thr Lys Ala Tyr Glu Glu Asn Asp Leu Met Phe Gly Thr Val275 280 285Asp Thr Trp Leu Ile Tyr Gln Leu Thr Lys Gln Lys Ala Phe Val Ser290 295 300Asp Val Thr Asn Ala Ser Arg Thr Gly Phe Met Asn Leu Ser Thr Leu305 310 315 320Lys Tyr Asp Asn Glu Leu Leu Glu Phe Trp Gly Ile Asp Lys Asn Leu325 330 335Ile His Met Pro Glu Ile Val Ser Ser Ser Gln Tyr Tyr Gly Asp Phe340 345 350Gly Ile Pro Asp Trp Ile Met Glu Lys Leu His Asp Ser Pro Lys Thr355 360 365Val Leu Arg Asp Leu Val Lys Arg Asn Leu Pro Ile Gln Gly Cys Leu370 375 380Gly Asp Gln Ser Ala Ser Met Val Gly Gln Leu Ala Tyr Lys Pro Gly385 390 395 400Ala Ala Lys Cys Thr Tyr Gly Thr Gly Cys Phe Leu Leu Tyr Asn Thr405 410 415Gly Thr Lys Lys Leu Ile Ser Gln His Gly Ala Leu Thr Thr Leu Ala420 425 430Phe Trp Phe Pro His Leu Gln Glu Tyr Gly Gly Gln Lys Pro Glu Leu435 440 445Ser Lys Pro His Phe Ala Leu Glu Gly Ser Val Ala Val Ala Gly Ala450 455 460Val Val Gln Trp Leu Arg Asp Asn Leu Arg Leu Ile Asp Lys Ser Glu465 470 475 480Asp Val Gly Pro Ile Ala Ser Thr Val Pro Asp Ser Gly Gly Val Val485 490 495Phe Val Pro Ala Phe Ser Gly Leu Phe Ala Pro Tyr Trp Asp Pro Asp500 505 510Ala Arg Ala Thr Ile Met Gly Met Ser Gln Phe Thr Thr Ala Ser His515 520 525Ile Ala Arg Ala Ala Val Glu Gly Val Cys Phe Gln Ala Arg Ala Ile530 535 540Leu Lys Ala Met Ser Ser Asp Ala Phe Gly Glu Gly Ser Lys Asp Arg545 550 555 560Asp Phe Leu Glu Glu Ile Ser Asp Val Thr Tyr Glu Lys Ser Pro Leu565 570 575Ser Val Leu Ala Val Asp Gly Gly Met Ser Arg Ser Asn Glu Val Met580 585 590Gln Ile Gln Ala Asp Ile Leu Gly Pro Cys Val Lys Val Arg Arg Ser595 600 605Pro Thr Ala Glu Cys Thr Ala Leu Gly Ala Ala Ile Ala Ala Asn Met610 615 620Ala Phe Lys Asp Val Asn Glu Arg Pro Leu Trp Lys Asp Leu His Asp625 630 635 640Val Lys Lys Trp Val Phe Tyr Asn Gly Met Glu Lys Asn Glu Gln Ile645 650 655Ser Pro Glu Ala His Pro Asn Leu Lys Ile Phe Arg Ser Glu Ser Asp660 665 670Asp Ala Glu Arg Arg Lys His Trp Lys Tyr Trp Glu Val Ala Val Glu675 680 685Arg Ser Lys Gly Trp Leu Lys Asp Ile Glu Gly Glu His Glu Gln Val690 695 700Leu Glu Asn Phe Gln705(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度51個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO16GCGCGGATCC AGGAGTCTAG AATTATGGGA TTGACTACTA AACCTCTATC T51(2)SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度36個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO17GATACGCCCG GGTTACCATT TCAACAGATC GTCCTT 36(2)SEQ ID NO18的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度34個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO18TTGATAATAT AACCATGGCT GCTGCTGCTG ATAG 34(2)SEQ ID NO19的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度39個(gè)堿基對(duì)
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)順序描述SEQ ID NO19GTATGATATG TTATCTTGGA TCCAATAAAT CTAATCTTC 39(2)SEQ ID NO20的信息(i)順序特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)順序描述SEQ ID NO20CATGACTAGT AAGGAGGACA ATTC 24(2)SEQ ID NO21的信息(i)順序特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)順序描述SEQ ID NO21CATGGAATTG TCCTCCTTAC TAGT 24(2)SEQ ID NO22的信息(i)順序特征(A)長(zhǎng)度19個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)順序描述SEQ ID NO22CTAGTAAGGA GGACAATTC 19(2)SEQ ID NO23的信息(i)順序特征(A)長(zhǎng)度19個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)順序描述SEQ ID NO23CATGGAATTG TCCTCCTTA 19(2)SEQ ID NO24的信息(i)順序特征(A)長(zhǎng)度15個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/dese＝“引物”(iii)假說(shuō)否(iv)反義否(xi)順序描述SEQ ID NO24GATCCAGGA ACAGA 15(2)SEQ ID NO25的信息(i)順序特征(A)長(zhǎng)度15個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“引物”(iii)假說(shuō)否(iv)反義否(xi)順序描述SEQ ID NO25CTAGTCTGTT TCCTG 1權(quán)利要求
1.由重組生物體生產(chǎn)甘油的一種方法，包括(i)用包含以下一種或兩種基因的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞(a)甘油-3-磷酸脫氫酶的編碼基因；(b)甘油-3-磷酸酶的編碼基因；(ii)在存在選自單糖、寡糖、多糖和一碳底物的至少一種碳源的情況下培養(yǎng)步驟(i)的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，由此生產(chǎn)甘油；以及(iii)回收步驟(ii)中產(chǎn)生的甘油。
2.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述表達(dá)盒包含編碼甘油-3-磷酸脫氫酶活性的基因。
3.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述表達(dá)盒包含編碼甘油-3-磷酸磷酸酶活性的基因。
4.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述表達(dá)盒包含編碼甘油-3-磷酸磷酸酶活性和甘油-3-磷酸脫氫酶活性的基因。
5.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述合適宿主細(xì)胞選自細(xì)菌、酵母和絲狀真菌。
6.按照權(quán)利要求5的方法，其中所述合適宿主細(xì)胞選自檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、腸桿菌屬(Enterobacter)、梭菌屬(Clostridium)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、氣桿菌屬(Aerobacter)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、曲霉屬(Aspergillus)、酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、接合酵母屬(Zygosaccharomyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、念珠菌屬(Candida)、漢遜酵母(Hansenula)、德巴利酵母屬(Debaryomyces)、毛霉屬(Mucor)、球擬酵母屬(Torulopsis)、甲基酵母屬(Methylobacter)、埃希氏菌屬(Escherichia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)和假單胞菌屬(Pseudomonas)。
7.按照權(quán)利要求6的方法，其中所述合適宿主細(xì)胞是大腸桿菌或酵母屬。
8.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述碳源是葡萄糖。
9.按照權(quán)利要求1的方法，其中甘油-3-磷酸脫氫酶的編碼基因?qū)?yīng)于SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11或SEQ ID NO12所示氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含不引起該酶功能特性改變的氨基酸取代、缺失或插入。
10.按照權(quán)利要求1的方法，其中編碼甘油-3-磷酸酶的基因?qū)?yīng)于SEQ ID NO13或SEQ ID NO14所示氨基酸序列，其中所述氨基酸序列可以包含不引起該酶功能改變的氨基酸取代、缺失或加入。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中甘油激酶編碼基因?qū)?yīng)于SEQ IDNO15所示氨基酸序列，而其中所述氨基酸序列可以包含不引起所述酶功能改變的氨基酸取代、缺失或加入。
12.轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，含有編碼甘油-3-磷酸脫氫酶活性的基因。
13.轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，含有編碼甘油-3-磷酸磷酸酶活性的基因。
14.通過(guò)互補(bǔ)作用選擇甘油-3-磷酸脫氫酶基因表達(dá)的方法，包括給由于所述菌株甘油-3-磷酸脫氫酶基因突變產(chǎn)生的甘油或甘油-3-磷酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株提供甘油或甘油-3-磷酸。
15.通過(guò)互補(bǔ)作用選擇甘油-3-磷酸脫氫酶基因表達(dá)的方法，包括給由于所述菌株甘油-3-磷酸脫氫酶基因突變產(chǎn)生的滲透敏感型菌株提供鹽。
16.大腸桿菌pAH 21/DH5α，含有所述GPP2基因并鑒定命名為ATCC 98187。
17.大腸桿菌pDAR1A/AA200，含有所述DAR1基因并鑒定命名為ATCC 98248。
全文摘要
提供重組生物體,該重組生物體含有編碼甘油－3－磷酸脫氫酶和/或甘油－3－磷酸酶活性的基因,所述生物體可用于由各種碳底物生產(chǎn)甘油。
文檔編號(hào)C12N1/21GK1244216SQ97181295
公開日2000年2月9日 申請(qǐng)日期1997年11月10日 優(yōu)先權(quán)日1996年11月13日
發(fā)明者B·A·布爾圖伊斯, A·A·加藤拜, S·L·海尼, A·K·H·蘇, R·D·拉雷奧 申請(qǐng)人:納幕爾杜邦公司, 詹倫卡國(guó)際有限公司