專利名稱：青霉素g或v、頭孢菌素g或v以及它們的衍生物的生產(chǎn)工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及β-內(nèi)酰胺的發(fā)酵生產(chǎn)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
β-內(nèi)酰胺類抗生素是抗生素化合物中最重要的一類，具有很長(zhǎng)的臨床使用歷史。在這一類中最突出的是青霉素類和頭孢菌素類。這些化合物分別由絲狀真菌產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum)和Acremoniumchrysogenum產(chǎn)生。
作為經(jīng)典的菌株改進(jìn)技術(shù)的結(jié)果，產(chǎn)黃青霉和Acremoniumchrysogenum的抗生素產(chǎn)率在過(guò)去數(shù)十年有了顯著的提高。隨著對(duì)青霉素類和頭孢菌素類的生物合成路線了解的增加和DNA重組技術(shù)的出現(xiàn)，用于生產(chǎn)菌株的改善和這些化合物的體內(nèi)衍生的新工具已經(jīng)出現(xiàn)。
大部分參與β-內(nèi)酰胺生物合成的酶已被鑒別，而且相關(guān)的基因已被克隆，如Ingolia和Queener所述，醫(yī)藥研究綜述(Med.Res.Rev.)9(1989)，245-264(生物合成路線和酶)，和Aharonowitz，Cohen和Martin所述，微生物年鑒(Ann.Rev.Microbiol.)46(1992)，461-495(基因克隆)。
在產(chǎn)黃青霉菌株中青霉素生物合成的頭兩步是由三個(gè)氨基酸L-5-氨基-5-羧基戊酸(L-α-氨基己二酸)(A)、L-半胱氨酸(C)和L-纈氨酸(V)縮合成三肽LLD-ACV，然后環(huán)化此三肽形成異青霉素N。這個(gè)化合物包含典型的β-內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)。
青霉素生物合成的頭兩步在產(chǎn)生青霉素、頭霉素和頭孢菌素的真菌和細(xì)菌中很普遍。
第三步是通過(guò)?；D(zhuǎn)移酶(AT)的作用由疏水側(cè)鏈置換L-5-氨基-5-羧基戊酸的親水D-α-氨基己二酸側(cè)鏈。如EP-A-0448180中所述，由AT催化的酶促置換反應(yīng)發(fā)生在微生物體的細(xì)胞器內(nèi)。
在頭孢菌素產(chǎn)生菌中，第三步是由差向異構(gòu)酶異構(gòu)化異青霉素N成為青霉素N，然后由擴(kuò)環(huán)酶將青霉素特有的五元環(huán)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化成頭孢菌素特有的六元環(huán)結(jié)構(gòu)。
具有工業(yè)價(jià)值的唯一直接發(fā)酵的青霉素只有青霉素V和青霉素G，其是在產(chǎn)黃青霉菌株的發(fā)酵過(guò)程中分別加入疏水性的側(cè)鏈前體苯氧基乙酸或苯基乙酸，從而由苯氧基乙酸或苯基乙酸取代天然β-內(nèi)酰胺的側(cè)鏈而產(chǎn)生。
在苯基乙酸之后，苯基丁酸和一些衍生物被引入到青霉素G的生產(chǎn)中，雖然所述的酸產(chǎn)生青霉素G的產(chǎn)率比苯基乙酸大大降低(Behrens等人，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)175(1948)，793-809；Arnstein和Grant，細(xì)菌綜述(Bacteriol.Rev.)20(1956)133-147)。
本發(fā)明令人吃驚的顯示特定的苯基丁酸衍生物可以甚至比苯基乙酸還高的效率產(chǎn)生青霉素G。
發(fā)明詳述本發(fā)明公開(kāi)了一些苯基丁酸衍生物，即其中的?；溚ㄟ^(guò)成對(duì)碳原子來(lái)延長(zhǎng)，并且其中特定的取代基位于?；湹摩?和/或ω-1位，這些苯基丁酸衍生物在N-苯乙酰基青霉烷和頭孢烯化合物的發(fā)酵生產(chǎn)中能有利地用作側(cè)鏈的前體。
本發(fā)明還公開(kāi)了一些特定的苯基丁酸衍生物的苯氧基衍生物的用途，其用于N-苯氧乙?；嗝雇楹皖^孢烯化合物的生產(chǎn)。
特別是，本發(fā)明公開(kāi)了N-苯乙?；騈-苯氧乙?；嗝雇榛蝾^孢烯化合物的發(fā)酵生產(chǎn)工藝，其中在以ω-和/或(ω-1)-位取代的苯基鏈烷酸作為側(cè)鏈前體存在下進(jìn)行發(fā)酵，所述的ω-和/或(ω-1)-位取代的苯基鏈烷酸具有如下的結(jié)構(gòu)式1的結(jié)構(gòu)
其中- -R1和-R3選自-OH、＝O或-H，而-R1和-R3可以相同或不同，前提為-R1和-R3不能都是-H或＝O，- 如果-R1或-R3分別是-OH或-H，則-R2或-R4分別是-H，- 如果-R1或-R3分別是＝O，則-R2或-R4分別就不存在，- -R5是-OR6或-NH2，其中R6選自-H、-CH3或-CH2CH3，- m是0或1，- n是從1到15的奇數(shù)，碳鏈中任選地包含一個(gè)或多個(gè)雙鍵。
應(yīng)當(dāng)理解，苯基鏈烷酸碳鏈長(zhǎng)度的上限主要由脂肪?；沪?氧化攻擊的效率來(lái)決定。適當(dāng)?shù)?，可用鏈可長(zhǎng)達(dá)約18個(gè)碳原子，暗示n是從1到15的奇數(shù)。優(yōu)選地，n為從1到9，更優(yōu)選為從1到5的奇數(shù)。最優(yōu)選的n為1。
優(yōu)選的，-R1或-R3是＝O或-OH，暗示-R2或-R4不存在或是-H，-R3和-R4是-H，-R5是-OH，m是0或1，且n是1。更優(yōu)選的，-R1是＝O或-OH，暗示-R2不存在或是-H，-R3和-R4是-H，-R5是-OR6，其中R6是-H，m是0或1，且n是1。最優(yōu)選地，以3-苯甲?；嶙鳛閭?cè)鏈前體，即-R1是＝O，-R2不存在，-R3和-R4是-H，-R5是-OH，m是0，且n是1。
在本發(fā)明的工藝中，3-苯甲?；崾莾?yōu)選的側(cè)鏈前體，因?yàn)樵摶衔锟煞奖愕膹南鄬?duì)便宜的成分合成(Sommerville和Allen，Org.Synth.Coll.Vol.II(1943)，81-83)。
在本發(fā)明的工藝中當(dāng)使用產(chǎn)黃青霉菌株時(shí)生產(chǎn)青霉素G或V。
已表明，苯基丁酸衍生物3-苯甲酰基丙酸具有比苯基丁酸高得多的產(chǎn)生青霉素G的效率，更重要地，甚至具有比苯基乙酸高得多的效率。
本發(fā)明另外設(shè)想了在發(fā)酵過(guò)程中應(yīng)用本發(fā)明的前體生產(chǎn)頭孢菌素G或V衍生物，方法是使用重組的青霉烷或頭孢烯產(chǎn)生菌株，即重組的產(chǎn)黃青霉或Acremonium chrysogenum菌株。取決于在本發(fā)明的發(fā)酵工藝中使用的特定的重組菌株，生產(chǎn)出了不同的頭孢菌素G或V化合物。
脫乙酰氧基頭孢菌素G或V衍生物由例如重組的表達(dá)擴(kuò)環(huán)酶的產(chǎn)黃青霉菌株，即擁有包含擴(kuò)環(huán)酶基因的表達(dá)盒的產(chǎn)黃青霉菌株來(lái)生產(chǎn)(見(jiàn)EP0532341或WO95/04149公開(kāi)的表達(dá)擴(kuò)環(huán)酶的產(chǎn)黃青霉菌株)。另外，WO96/38580也與此相關(guān)，它公開(kāi)了在表達(dá)擴(kuò)環(huán)酶的產(chǎn)黃青霉菌株體內(nèi)青霉素G可被擴(kuò)環(huán)。
如果重組的表達(dá)擴(kuò)環(huán)酶的產(chǎn)黃青霉菌株擁有一個(gè)或多個(gè)包含另外的有關(guān)頭孢菌素生物合成基因的表達(dá)盒，就能生產(chǎn)除脫乙酰氧基化合物之外的其它的頭孢菌素G或V衍生物，其中這些基因編碼諸如羥化酶的基因和/或編碼乙酰轉(zhuǎn)移酶的基因。另外除脫乙酰氧基化合物之外其它的頭孢菌素G或V衍生物也可用重組表達(dá)酰基轉(zhuǎn)移酶基因的A.chrysogenum菌株來(lái)生產(chǎn)。
本發(fā)明的工藝通過(guò)于合適的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵合適的青霉烷或頭孢烯產(chǎn)生菌株，即上述的真菌來(lái)進(jìn)行。所用的發(fā)酵條件在本發(fā)明中并不關(guān)鍵，只要發(fā)酵在結(jié)構(gòu)式1的苯基或苯氧丁酸衍生物作為側(cè)鏈的前體存在下進(jìn)行。例如可使用公開(kāi)于EP 0532341中的發(fā)酵條件。
在發(fā)酵工藝之后，發(fā)酵產(chǎn)生的青霉素G或V或者頭孢菌素G或V衍生物可用熟練技術(shù)人員了解的任何合適的技術(shù)從發(fā)酵液中回收。
任選地，青霉素G或V或者頭孢菌素G或V衍生物可通過(guò)脫酰基形成相應(yīng)的脫?；嗝顾丶?-氨基青霉烷酸(6-APA)，或脫酰基頭孢菌素如7-氨基去乙酰氧基頭孢烷酸(7-ADCA)、7-氨基去乙酰基頭孢烷酸(7-ADAC)或7-氨基頭孢烷酸(7-ACA)?？梢杂萌魏魏线m的方法脫酰基化。優(yōu)選的，脫?；鞘褂眠m當(dāng)?shù)拿竿ㄟ^(guò)一步酶催化過(guò)程完成。用于青霉素G或頭孢菌素G衍生物的脫?；暮线m的酶有來(lái)自于大腸桿菌或A.faecalis的酰基轉(zhuǎn)移酶，用于青霉素V或頭孢菌素V化合物的脫?；暮线m的酶是來(lái)自于真菌諸如鐮孢霉(Fusarium)的酰基轉(zhuǎn)移酶。為了重復(fù)利用酶，優(yōu)選地使用固定化酶。
在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，于存在3-苯甲?；猁}作為側(cè)鏈前體的合適的培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)黃青霉。分離菌體后所得的發(fā)酵液用HPLC和/或質(zhì)子NMR分析青霉素的存在。顯示青霉素G是發(fā)酵液中存在的唯一的青霉素。另外，令人驚奇的發(fā)現(xiàn)3-苯甲?；猁}比苯基乙酸鹽產(chǎn)生青霉素G的效率更高。
實(shí)施例1以3-苯甲酰基丙酸作為側(cè)鏈前體生產(chǎn)青霉素G菌株產(chǎn)黃青霉Wisconsin 54-1255(ATCC 28089)溶液前體溶液10％(w/v)前體，用1MKOH調(diào)節(jié)pH至6.5，使用前過(guò)濾除菌。生長(zhǎng)條件通過(guò)在搖瓶中產(chǎn)黃青霉Wisconsin 54-1255菌株的二級(jí)發(fā)酵制備青霉素。在種子階段，加入2×108個(gè)孢子至50ml/500ml種子培養(yǎng)基搖瓶中開(kāi)始發(fā)酵，培養(yǎng)基組成如下(單位g/l)葡萄糖，30；硫酸銨，10；磷酸二氫鉀，10；微量元素溶液I(七水硫酸鎂，25；七水硫酸鐵，10；五水硫酸銅，0.5；七水硫酸鋅，2；硫酸鈉，50；一水硫酸錳，2；二水氯化鈣，5)，10(ml/l)(滅菌前pH6.5)。
種子培養(yǎng)基于25-30℃培養(yǎng)48-72小時(shí)，然后用于接種10-20倍體積的生產(chǎn)培養(yǎng)基中，生產(chǎn)培養(yǎng)基組成如下(g/l)乳糖，80；麥芽糖，20；硫酸鈣，4；尿素，3；七水硫酸鎂，2；磷酸二氫鉀，7；氯化鈉，0.5；硫酸銨，6；七水硫酸鐵，0.1；微量元素溶液II(五水硫酸銅，0.5；七水硫酸鋅，2；一水硫酸錳，2；硫酸鈉，50)；(滅菌前pH5.5-6.0)。加入所選的前體(溶液1)至所示的濃度。然后再持續(xù)培養(yǎng)120小時(shí)。
測(cè)定產(chǎn)黃青霉菌株利用不同側(cè)鏈前體產(chǎn)生青霉素的能力。所用苯基乙酸、丁酸、苯基丁酸和3-苯甲?；岬慕K濃度均為0.04％和0.08％(w/v)。在生產(chǎn)階段結(jié)束后收集發(fā)酵液的過(guò)濾液，用H-NMR測(cè)定。
當(dāng)不加入前體時(shí)，培養(yǎng)基中主要累積的β-內(nèi)酰胺化合物是6-氨基青霉烷酸和異青霉素-N。當(dāng)加入苯基乙酸、苯基丁酸或3-苯甲?；?，只產(chǎn)生青霉素G(表1)。使用0.08％(w/v)3-苯甲酰基丙酸產(chǎn)生青霉素-G的產(chǎn)量最高。
表1.使用不同側(cè)鏈前體青霉素的產(chǎn)量
1通過(guò)H-NMR測(cè)定2相對(duì)于最初用0.04％(w/v)的苯基乙酸時(shí)青霉素-G的產(chǎn)量
權(quán)利要求
1.一種用于生產(chǎn)N-苯乙?；騈-苯氧乙酰基青霉烷或頭孢烯化合物的工藝，其任選地包含所述N-苯乙?；騈-苯氧乙?；嗝雇榛蝾^孢烯化合物的脫酰基過(guò)程，包括如下步驟*在含具有結(jié)構(gòu)式1的結(jié)構(gòu)的側(cè)鏈前體的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵合適的青霉烷或頭孢烯產(chǎn)生菌
其中- -R1和-R3選自-OH、＝O或-H，-R1和-R3可以相同或不同，前提為-R1和-R3不能都是-H或＝O，- 如果-R1或-R3分別是-OH或-H，則-R2或-R4分別是-H，- 如果-R1或-R3分別是＝O，則-R2或-R4分別就不存在，- -R5是-OR6或-NH2，其中R6選自-H、-CH3或-CH2CH3，- m是0或1，- n是從1到15的奇數(shù)，碳鏈中任選地包含一或多個(gè)雙鍵，和*從發(fā)酵液中回收產(chǎn)生的N-苯乙酰基或N-苯氧乙?；嗝雇榛蝾^孢烯化合物，和*任選地將N-苯乙?；騈-苯氧乙酰基青霉烷或頭孢烯化合物脫?；?，并且回收相應(yīng)的脫?；嗝雇榛蝾^孢烯化合物。
2.一種如權(quán)利要求1的生產(chǎn)N-苯乙?；嗝雇榛蝾^孢烯化合物的工藝，其中使用如結(jié)構(gòu)式1的側(cè)鏈前體進(jìn)行發(fā)酵，其中m是0。
3.如權(quán)利要求2的工藝，其使用如結(jié)構(gòu)式1的側(cè)鏈前體進(jìn)行發(fā)酵，其中R1為＝O，R3和R4為-H，R5為-OH，m是0，且n是1。
4.一種如權(quán)利要求1的生產(chǎn)N-苯氧乙?；嗝雇榛蝾^孢烯化合物的工藝，其使用如結(jié)構(gòu)式1的側(cè)鏈前體進(jìn)行發(fā)酵，其中m是1。
5.如權(quán)利要求1-4的任意一種生產(chǎn)N-苯乙?；騈-苯氧乙?；嗝雇榛衔锏墓に?，其中青霉烷或頭孢烯產(chǎn)生菌是產(chǎn)黃青霉，N-苯乙?；騈-苯氧乙?；嗝雇榛衔锸乔嗝顾谿或V。
6.如權(quán)利要求5的工藝，其中青霉素G或V經(jīng)脫?；a(chǎn)生6-APA。
7.一種如權(quán)利要求1-4的任意一種生產(chǎn)N-苯乙?；騈-苯氧乙酰基頭孢烯化合物的工藝，其中青霉烷或頭孢烯產(chǎn)生菌是重組的能表達(dá)擴(kuò)環(huán)酶的產(chǎn)黃青霉菌，N-苯乙酰基或N-苯氧乙?；^孢烯化合物是頭孢菌素G或V衍生物。
8.如權(quán)利要求7的工藝，其中頭孢菌素G或V衍生物經(jīng)脫?；a(chǎn)生7-ADCA、7-ADAC或7-ACA。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一個(gè)生產(chǎn)青霉素G或V或者頭孢菌素G或V衍生物的發(fā)酵工藝,其中用特定苯基丁酸衍生物作為側(cè)鏈的前體。在所述苯基丁酸衍生物中,酰基鏈通過(guò)成對(duì)碳原子來(lái)延長(zhǎng),特定取代基位于ω－和/或ω－1位。相應(yīng)的苯氧基丁酸衍生物用于制備青霉素V或頭孢菌素V的衍生物。任選地,將青霉素G或V或者頭孢菌素G或V的化合物脫?；瘉?lái)制備它們的脫?；鶎?duì)應(yīng)物。
文檔編號(hào)C12P37/00GK1240485SQ97180698
公開(kāi)日2000年1月5日 申請(qǐng)日期1997年12月15日 優(yōu)先權(quán)日1997年12月15日
發(fā)明者R·A·L·溫伯格 申請(qǐng)人:Dsm公司