專利名稱：來自芳族新陳代謝/i的物質(zhì)的微生物制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物制備物質(zhì)的方法，所述物質(zhì)特別是按照權(quán)利要求1-23、36和37的芳族氨基酸，涉及按照權(quán)利要求24-29的基因結(jié)構(gòu)，和涉及按照權(quán)利要求30-35的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
由于例如對氨基酸的需求持續(xù)增加，故微生物制備諸如精細(xì)化學(xué)藥品的物質(zhì)，特別是芳族氨基酸，有巨大的經(jīng)濟(jì)利益。因此，例如用L-苯丙氨酸制備藥物，具體地說，也用于制備增甜劑天冬苯丙二肽酯(α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯)。需要L-色氨酸作為藥物和作為動物飼料的添加劑；對于L-酪氨酸，也同樣有作為藥物的需要，并也有作為制藥工業(yè)中的原料的需要。除了從天然材料中分離，生物技術(shù)制備也是在經(jīng)濟(jì)許可的情況下獲得希望的光學(xué)活性形式的氨基酸的很重要的方法?；蛘呤褂妹?，或者使用微生物實現(xiàn)生物技術(shù)制備。后一種微生物制備享有以下優(yōu)點即可以使用簡單和價廉的原料。雖然以各種各樣的方式控制在細(xì)胞中生物合成氨基酸，但是，人們已經(jīng)進(jìn)行大量嘗試，以增加產(chǎn)物生成。因此，例如為了切斷生物合成的調(diào)節(jié)，使用氨基酸類似物。例如，根據(jù)對苯丙氨酸類似物(GB-2,053,906)的抗性通過選擇獲得允許L-苯丙氨酸生產(chǎn)增加的大腸桿菌(E.coli)的突變體。相似的策略也產(chǎn)生棒狀桿菌屬(Corynebacterium)(JP-19037/1976和JP-39517/1978)和芽孢桿菌屬(Bacillus)(EP-0,138,526)的過量生產(chǎn)菌株。而且，已知使用重組DNA技術(shù)構(gòu)建的微生物，在所述微生物中同樣消除了生物合成的調(diào)節(jié)，具有克隆并表達(dá)的編碼不再受反饋抑制的關(guān)鍵酶的基因。作為原型，EP-0,077,196描述了一種生產(chǎn)芳族氨基酸的方法，其中在大腸桿菌中過量表達(dá)不再受反饋抑制的3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸(arabinoheptulosonate)-7-磷酸合酶(DAHP合酶)。EP-0,145,156描述了一種大腸桿菌菌株，其中為了生產(chǎn)L-苯丙氨酸，另外過量表達(dá)分支酸變位酶/預(yù)苯酚鹽脫水酶。
上述策略共有的特征是用于提高產(chǎn)量的干涉只限于對芳族氨基酸特有的生物合成途徑。然而，為了更進(jìn)一步增加產(chǎn)量，必需努力提高生產(chǎn)芳族氨基酸所需的初級代謝物磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和赤蘚糖4-磷酸(Ery4P)的供給。
PEP是糖酵解產(chǎn)物丙酮酸的活化前體；Ery4P是戊糖磷酸途徑的中間體。
已進(jìn)行不同的嘗試以使初級代謝物Ery4P的供給獲得明確的增加。在大腸桿菌中通過關(guān)閉磷酸葡糖異構(gòu)酶，使通過戊糖磷酸途徑的碳流增加；這導(dǎo)致色氨酸生成(Mascarenhas D.等，Appl.Environ.微生物57(1991)2995-99)。US-A-5,168,056公開了利用重組DNA技術(shù)使轉(zhuǎn)酮酶過量表達(dá)，這使獲得Ery4P的供給增加成為可能，從而增加了作為產(chǎn)物的L-色氨酸、L-酪氨酸或L-苯丙氨酸的生成。Draths K.M.等(J.Am.Chem.Soc.114(1992)3956-62)和Flores N.等(Nat.Biotechnol.14(1996)620-3)都證實了相同的結(jié)果。然而，如Feldmann指出，在沒有轉(zhuǎn)醛酶活性的活動發(fā)酵單胞菌(Zymomonasmobilis)菌株中僅僅增加轉(zhuǎn)酮酶活性，導(dǎo)致在細(xì)胞中戊糖磷酸途徑代謝物富集，并因此對細(xì)胞生長有負(fù)面影響(Feldmann S.D.等，Appl.Microbiol.Biotechnol.，38(1992)354-61)。該生理效應(yīng)可能是由于細(xì)胞內(nèi)景天庚酮糖-7-磷酸濃度過量造成的。本發(fā)明人也發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌tal+菌株中由于轉(zhuǎn)酮酶過量表達(dá)造成的相應(yīng)的生物質(zhì)生長抑制。
所以本發(fā)明的目的是使得生產(chǎn)物質(zhì)、特別是生產(chǎn)芳族氨基酸的的可選方法可利用，該方法的區(qū)別在于，增加細(xì)胞內(nèi)這些物質(zhì)合成的代謝物中間體的供給，而沒有由于只增加轉(zhuǎn)酮酶的活性造成的上述方法缺點。
令人驚訝的是，按照本發(fā)明，通過利用微生物制備物質(zhì)的方法達(dá)到了該目的，在所述方法中，由于在該微生物中磷酸烯醇丙酮酸(PEP)依賴性糖吸收系統(tǒng)活性存在、降低或消失，增加生產(chǎn)這些物質(zhì)的微生物中的轉(zhuǎn)醛酶活性。
該結(jié)果特別令人驚訝之處在于，轉(zhuǎn)醛酶在微生物生長和在其生產(chǎn)這些物質(zhì)時起重要作用決不是不證自明的。這特別適用于在己糖上生長的情況。因此，例如已知的酵母菌株，盡管在轉(zhuǎn)醛酶基因中有突變，但仍然能夠在葡萄糖中生長(Schaaff L.等，Eur.J.Biochem.188(1990)597-693)。所以，轉(zhuǎn)醛酶對細(xì)胞生長應(yīng)該沒有施加任何實質(zhì)影響。這有下述事實支持，即在沒有轉(zhuǎn)醛酶的情況下，也已知細(xì)菌物種能夠生長(Feldmann S.D.等，Appl.Microbiol.Biotechnol.38(1992)354-62)。
另外，與木糖和其它戊糖相比，諸如葡萄糖的己糖也可以通過與戊糖代謝途徑不同的降解途徑代謝。所以轉(zhuǎn)醛酶在葡萄糖降解上起實質(zhì)作用決不是不證自明的。
也可以注意到，在玻璃試管內(nèi)，在轉(zhuǎn)醛酶活性增加的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)細(xì)胞的提取物中檢測作為戊糖磷酸途徑的酶流的增加(Senac T.等，Appl.Environ.Microbiol.57(1991)1701-6)。然而，在該研究中選擇的實驗條件不允許任何對出現(xiàn)在活微生物中、特別是細(xì)菌中天然的代謝生理學(xué)現(xiàn)象結(jié)果的轉(zhuǎn)移。另外，可以注意到Liao J.C.等(Biotechn.Bioeng.52(1996)129-140)指出，當(dāng)轉(zhuǎn)醛酶和AroG的活性同時增加時，DAHP生成增加。該結(jié)果主要是由于AroG活性增加造成的。像由于轉(zhuǎn)醛酶活性增加，物質(zhì)產(chǎn)量增加這樣的，沒有公開或表明。所以一點也不希望在微生物中轉(zhuǎn)醛酶活性增加和用于提高物質(zhì)產(chǎn)量的Ery4P的供給之間有因果關(guān)系。根據(jù)本發(fā)明增加轉(zhuǎn)醛酶活性(過量表達(dá))使得可獲得一種可選的方法，以實現(xiàn)通過戊糖磷酸途徑的碳流的增加，并因此實現(xiàn)了所述初級代謝物Ery4P供給的增加。所以Ery4P的增加量可用于下述物質(zhì)的微生物合成，在所述物質(zhì)合成中，至少涉及一個戊糖磷酸途徑的中間體，具體地說是Ery4P。本發(fā)明人已指出，Ery4P的利用率增加，既可以在PEP依賴性糖吸收系統(tǒng)的活性存在或減少的微生物中產(chǎn)生，也可以在不存在這樣的活性的微生物中產(chǎn)生。因此，按照本發(fā)明不但可以使用仍然具有活性磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)或活性降低的磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(pts+菌株)的生物，而且可以使用關(guān)閉PTS的生物(pts-菌株)。
按照本發(fā)明的定義，物質(zhì)可以理解為例如精細(xì)化學(xué)藥品，諸如芳族氨基酸、靛藍(lán)、吲哚乙酸、己二酸、黑色素、醌和苯甲酸，也包括它們的潛在衍生物和次級產(chǎn)物，或者在一般意義上說，為戊糖磷酸途徑的中間體的次級產(chǎn)物。然而，這也應(yīng)當(dāng)包括供給4-磷酸赤蘚糖促進(jìn)其生物化學(xué)合成的所有化合物，例如吡哆醇及其衍生物。在本發(fā)明范圍內(nèi)，也認(rèn)為所有這些物質(zhì)是來自芳族新陳代謝的物質(zhì)?？梢宰⒁獾皆谠摲秶鷥?nèi)，除用于制備靛藍(lán)、己二酸和其它非天然次級產(chǎn)物的新干涉之外，還需要對產(chǎn)生該物質(zhì)的微生物做進(jìn)一步的遺傳改變。按照本發(fā)明的方法特別適合于用微生物制備物質(zhì)，所述微生物在增加所述轉(zhuǎn)醛酶活性之前，沒有從預(yù)先含有磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(pts+菌株)的菌株作為磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)關(guān)閉(pts-菌株)的菌株進(jìn)行選擇。在這方面可以注意到，未預(yù)先公開的專利說明書WO-96/34961描述了這樣一個從先前的pts+菌株中的選擇，但是在該研究中，該選擇在增加轉(zhuǎn)酮酶和轉(zhuǎn)醛酶活性之前。
關(guān)于增加轉(zhuǎn)醛酶活性，提供的優(yōu)選是增加大腸桿菌轉(zhuǎn)醛酶活性，特別是增加大腸桿菌轉(zhuǎn)醛酶B(TalB)活性。當(dāng)使用相應(yīng)的talB基因時，該基因優(yōu)選來源于大腸桿菌K12或由其衍生的菌株。然而，除此之外，任何其基因產(chǎn)物催化下述反應(yīng)的基因也是合適的，所述反應(yīng)相當(dāng)于轉(zhuǎn)醛酶催化的由7-磷酸景天庚酮糖加3-磷酸甘油醛向Ery4P和果糖-6-磷酸的轉(zhuǎn)化的反應(yīng)。
在本發(fā)明特別優(yōu)選的實施方案中，除了增加轉(zhuǎn)醛酶活性，也增加轉(zhuǎn)酮酶活性。在存在戊糖的情況下，轉(zhuǎn)酮酶基因自身的表達(dá)導(dǎo)致在戊糖磷酸途徑中累積代謝物(Feldmann S.D.，Appl.Microbiol.Biotechnol.，38(1992)354-61)。這對所述細(xì)胞有有害作用，特別是對以遞減速率生長的轉(zhuǎn)化細(xì)胞有有害作用。在葡萄糖中生長并顯示轉(zhuǎn)酮酶活性增加的大腸桿菌菌株中，本發(fā)明人也觀察到同樣的效果。然而，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)在增加轉(zhuǎn)醛酶活性的同時增加轉(zhuǎn)酮酶活性，對提供Ery4P很有利，也沒有顯示出僅過量表達(dá)轉(zhuǎn)酮酶的負(fù)面影響。由于增加轉(zhuǎn)醛酶活性，所以增加轉(zhuǎn)酮酶活性時發(fā)生的戊糖磷酸途徑代謝物的累積不能實現(xiàn)，其結(jié)果是對細(xì)胞生長的損害不僅停止，而且轉(zhuǎn)變成生長增加。因此，結(jié)果是特別是在轉(zhuǎn)醛酶活性增加的菌株中按照本發(fā)明增加轉(zhuǎn)酮酶活性，是明智的方法。
關(guān)于增加轉(zhuǎn)酮酶活性，優(yōu)選增加大腸桿菌轉(zhuǎn)酮酶活性，特別是增加大腸桿菌轉(zhuǎn)酮酶A(TktA)活性。當(dāng)使用相應(yīng)的tktA基因時，該基因優(yōu)選來源于大腸桿菌K12或由其衍生的菌株。然而，除此而外，任何其基因產(chǎn)物催化下述反應(yīng)的基因也是合適的，所述反應(yīng)對應(yīng)于轉(zhuǎn)酮酶催化的由5-磷酸核糖加5-磷酸木酮糖向7-磷酸景天庚酮糖加3-磷酸甘油醛轉(zhuǎn)化，或者由5-磷酸木酮糖加Ery4P向6-磷酸果糖加3-磷酸甘油醛轉(zhuǎn)化的反應(yīng)。
在本發(fā)明另一個特別優(yōu)選的實施方案中，除了增加轉(zhuǎn)醛酶活性或增加轉(zhuǎn)醛酶和轉(zhuǎn)酮酶的活性，也增加用于PEP不依賴性糖吸收的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性和/或使相應(yīng)的糖磷酸化的激酶的活性。在轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的情況下，將該蛋白的活性理解為是蛋白介導(dǎo)吸收速率。額外增加后面這些蛋白(即轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和所述激酶)中一種或這兩種的活性，由于增加PEP的提供量，用于同Ery4P縮合，以形成生物合成芳族化合物(即脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶(DAHP))的通用途徑的初級代謝物，使得獲得甚至更高的物質(zhì)(特別是芳族氨基酸)的產(chǎn)量成為可能。
使用易化蛋白(facilitator)作為PEP不依賴性糖吸收的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是合理的，易化蛋白是按照蛋白介導(dǎo)的易化擴(kuò)散的原理起作用的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。特別是，使用來自活動發(fā)酵單胞菌的葡糖易化蛋白(Glf)是合適的。當(dāng)使用后者時，從例如活動發(fā)酵單胞菌ATCC 10988、ATCC29191或ATCC 31821中獲得蛋白編碼基因glf。然而，下述其它細(xì)菌糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因也適合于新方法，所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)例如葡萄糖、果糖或蔗糖，并在這樣做時不使用任何PEP，例如來自大腸桿菌的GalP系統(tǒng)。一般也可以使用來自諸如釀酒酵母、(pichiastipitis)或克魯維酵母菌(Kluyveromyces lactis)的真核微生物的糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的基因(諸如HXT1至HXT7)或來自其它生物的糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因，只要這些基因在所述微生物中以功能方式表達(dá)，以及所述基因產(chǎn)物可以在前后序列中起作用，而不使用PEP轉(zhuǎn)運(yùn)糖。在氨基酸生產(chǎn)微生物(氨基酸生產(chǎn)者)中表達(dá)糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因可能特別合理。
所以，在按照所述新方法制備芳族氨基酸時，使用由活動發(fā)酵單胞菌ATCC 31821分離的易化基因glf吸收諸如葡萄糖、果糖或甘露糖是特別合適的。(Parker C.等，Mol.Microbiol.15(1995)795-802；Weisser P.等，J.Bacteriol.177(1995)3351-4)。按照本發(fā)明的方法特別適用于用微生物制備芳族氨基酸，在所述微生物中，PTS系統(tǒng)的活性降低或完全沒有。在這種情況下，不但在增加轉(zhuǎn)醛酶活性之前，而且在此之后，可以降低或關(guān)閉PTS系統(tǒng)。
特別是，為了避免由于膜蛋白的過量表達(dá)產(chǎn)生的對細(xì)胞的有害影響，應(yīng)當(dāng)優(yōu)選將glf基因以低基因拷貝數(shù)插入。因此例如對于glf基因，優(yōu)選的基因拷貝數(shù)是2-5。將glf基因插入到ptsHI-crr操縱子基因中，例如插入到ptsI基因中是特別有利的。
當(dāng)使用糖磷酸化激酶時，使用優(yōu)選的激酶己糖磷酸化激酶，特別是來自活動發(fā)酵單胞菌的葡糖激酶是合適的。當(dāng)使用后者時，該蛋白編碼基因glk得自例如活動發(fā)酵單胞菌ATCC 10988、ATCC 29191或ATCC 31821。來自細(xì)菌的己糖-磷酸化激酶的其它基因也適用于新方法，所述基因的基因產(chǎn)物(諸如果糖激酶或甘露糖激酶)在消耗ATP的同時使己糖磷酸化。此外，例如來自諸如釀酒酵母的真核微生物的激酶的基因，或以一般方式來自其它生物的糖磷酸化激酶的基因也是合適的，只要它們可以在所述微生物(具體地說是在氨基酸生產(chǎn)者中)可以以功能方式表達(dá)，并在不使用PEP使所述糖磷酸化時所述基因可以起作用。使葡萄糖磷酸化的葡糖激酶基因glk特別適合于按照所述新方法制備芳族氨基酸，所述基因從活動發(fā)酵單胞菌ATCC 29191中分離。
在增加朝向Ery4P的物質(zhì)流的微生物中可以限制用于生產(chǎn)芳族氨基酸代謝物的第一個中間體的PEP的利用率。在這些情況下，減少或完全關(guān)閉在所述新陳代謝中的其它PEP消耗反應(yīng)是有利的，所述反應(yīng)諸如PEP糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)的反應(yīng)，如果存在該系統(tǒng)，則其催化PEP依賴性糖吸收。按照本發(fā)明，仍然具有活性PTS基因的微生物(pts+菌株)和pts的活性降低(在本例中也認(rèn)為是pts+)或所述pts關(guān)閉(pts-菌株)的pts突變體都可以用于進(jìn)一步改進(jìn)所述方法？?；蛘呖梢栽诿杆缴蠈崿F(xiàn)這種性質(zhì)的減少，或者通過使用遺傳方法實現(xiàn)這種性質(zhì)的減少，例如將glf和/或glk基因插入到染色體中，特別是插入到ptsI基因的基因座中，該方法同時在所述染色體中使重組DNA穩(wěn)定(分離穩(wěn)定性)，并因此意味著無需使用載體。本發(fā)明人的經(jīng)驗表明，在增加所述轉(zhuǎn)醛酶活性之前，優(yōu)選不應(yīng)發(fā)生所述PTS活性的降低或消除。
按照本發(fā)明的定義，可以將對增加活性的措施理解為適用于對增加所述轉(zhuǎn)醛酶、所述轉(zhuǎn)酮酶、所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和所述激酶的活性的所有措施。下述措施尤其適用于該目的-引入基因，例如使用載體或溫和噬菌體；-增加基因拷貝數(shù)，例如為了將按照本發(fā)明的基因以增加的拷貝數(shù)引入到所述微生物中，使用質(zhì)粒，所述增加的拷貝數(shù)是稍微(例如2-5次)增加的拷貝數(shù)至大幅(例如15-50次)增加的拷貝數(shù)；-增加基因表達(dá)，例如通過提高轉(zhuǎn)錄速率，例如通過使用諸如Ptac、Ptet或其它調(diào)節(jié)核苷酸序列的啟動子元件，和/或通過提高翻譯速率，例如通過使用共有核糖體結(jié)合位點；-增加現(xiàn)存酶的內(nèi)源活性，例如利用通過常規(guī)方法(例如使用紫外照射或激發(fā)突變的化學(xué)藥品)以隨機(jī)方式產(chǎn)生的突變，或者利用諸如缺失、插入和/或核苷酸交換的突變，所述突變是用遺傳工程方法以特異性方式產(chǎn)生；-通過改變酶的結(jié)構(gòu)增加酶的活性，例如利用使用物理、化學(xué)或分子生物學(xué)或其它微生物學(xué)方法的誘變；-用去調(diào)節(jié)的酶，例如不再受反饋抑制的酶；-引入相應(yīng)的編碼所述去調(diào)節(jié)酶的基因。
也可以使用上述方法和其它類似方法的組合增加所述活性。例如通過使用上述方法克隆所述基因，或者例如通過選擇顯示增加底物轉(zhuǎn)運(yùn)的突變體，可以增加轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的內(nèi)源或引入的活性。
最好是通過將所述一種或多種基因整合到一個或幾個基因結(jié)構(gòu)中，并將一種或多種基因的每一個以單拷貝或以增加的拷貝數(shù)引入到所述基因結(jié)構(gòu)中。按照本發(fā)明的定義，可以將基因結(jié)構(gòu)理解為一個基因或具有按照本發(fā)明的基因的任何其它核苷酸序列。合適的核苷酸序列可以是，例如質(zhì)粒、載體、染色體、噬菌體或不是環(huán)狀閉合的其它核苷酸序列。
按照本發(fā)明定義的染色體是已插入至少一個按照本發(fā)明的基因的染色體，產(chǎn)生的核酸序列帶有至少一個基因或比該染色體中天然含有的拷貝多一個基因拷貝。另一方面，例如在基因基因座內(nèi)的同源重組產(chǎn)生不必與天然形式不同的染色體。所以，如果不超過同源基因的自然數(shù)目，就認(rèn)為通過同源重組制備的染色體與本發(fā)明不一致。
按照本發(fā)明的定義，也將基因結(jié)構(gòu)理解為諸如載體、染色體和溫和噬菌體的上述基因載體的組合，在所述基因載體上分布按照本發(fā)明的基因。例如，可以用載體將兩個tal基因引入到所述細(xì)胞中，或可以將兩個tal基因插入到染色體中。另外，例如可以用噬菌體將另一個基因引入到所述細(xì)胞中。這同樣適用于按照本發(fā)明的其它基因。這些例子不是將其它基因分布組合排除在本發(fā)明之外。在任何情況下，包含在按照本發(fā)明的微生物中的基因數(shù)超過相應(yīng)基因的天然數(shù)目是決定性的。例如，為了實現(xiàn)按照本發(fā)明的活性的增加，最好glf基因數(shù)增加2-5倍。在這些濃度下沒有出現(xiàn)細(xì)胞毒性作用。然而，也可以設(shè)想將按照本發(fā)明的基因以最高達(dá)50個基因拷貝的更高拷貝數(shù)的具有同樣作用的形式引入到所述微生物中。
在所述生產(chǎn)物質(zhì)的新方法中，優(yōu)選使用另外參與合成所述物質(zhì)的一種或多種酶被去調(diào)節(jié)和/或活性增加的微生物。
這些酶特別是芳族氨基酸新陳代謝的酶，尤其是DAHP合酶、莽草激酶和分支酸變位酶/預(yù)苯酚鹽脫水酶，也是參與合成芳族新陳代謝中間體及其次級產(chǎn)物的所有其它酶。
除了按照本發(fā)明的酶，特別是去調(diào)節(jié)和過量表達(dá)DAHP合酶對制備諸如己二酸、膽汁酸和苯醌化合物以及它們的衍生物的物質(zhì)很重要。另外，為了實現(xiàn)超高水平合成例如色氨酸、酪氨酸、靛藍(lán)以及羥基苯甲酸和氨基苯甲酸和萘醌和蒽醌和它們次級產(chǎn)物的衍生物，應(yīng)當(dāng)去調(diào)節(jié)莽草激酶，并增加其活性。去調(diào)節(jié)和過量表達(dá)的分支酸變位酶/預(yù)苯酚鹽脫水酶對有效生產(chǎn)苯丙氨酸和苯丙酮酸以及它們的衍生物也額外或特別重要。然而，這也將包括其酶活性有助于下述物質(zhì)生物化學(xué)合成的所有其它酶，所述物質(zhì)是通過供給4-磷酸赤蘚糖增加其產(chǎn)量的化合物，例如吡哆醇及其衍生物?？梢宰⒁獾匠诵赂缮嬷?，為了制備靛藍(lán)、己二酸和其它非天然次級產(chǎn)物，需要對產(chǎn)生物質(zhì)的微生物做進(jìn)一步遺傳改變。
具體而言，所述新方法特別適用于制備芳族氨基酸，特別是苯丙氨酸。在后一種情況下，最好是增加去調(diào)節(jié)的DAHP合酶(例如大腸桿菌中的AroF或AroH)和/或同樣去調(diào)節(jié)的分支酸變位酶/預(yù)苯酚鹽脫水酶(PheA)的基因表達(dá)和/或酶活性。
埃希氏菌屬(Escherichia)物種，還有沙雷氏菌屬(Serratia)、芽孢桿菌屬(Corynebacterium)、棒狀桿菌屬(Brevibacterium)或短頸細(xì)菌屬的微生物，和由常規(guī)氨基酸方法可知的其它菌株，適合用作生產(chǎn)微生物。大腸桿菌特別適合。
本發(fā)明的另一個目的是提供合適的基因結(jié)構(gòu)和攜帶這些結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，這些使得能夠以特別成功的方式完成所述方法。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，現(xiàn)在可以得到新基因結(jié)構(gòu)，所述重組形式的基因結(jié)構(gòu)包括a)編碼轉(zhuǎn)醛酶的基因或編碼轉(zhuǎn)醛酶的基因和編碼轉(zhuǎn)酮酶的基因，以及b)至少一個編碼PEP不依賴性糖吸收的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、或編碼使糖磷酸化的激酶的基因。在這些基因結(jié)構(gòu)中，最好是所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因編碼易化蛋白，而所述激酶的基因編碼己糖-磷酸化激酶。具體而言，所述轉(zhuǎn)醛酶和所述轉(zhuǎn)酮酶的基因得自大腸桿菌，而所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和所述激酶的基因得自活動發(fā)酵單胞菌。
下述基因結(jié)構(gòu)特別有利，所述轉(zhuǎn)醛酶的基因是大腸桿菌talB，所述轉(zhuǎn)酮酶的基因是大腸桿菌tktA，而所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因是活動發(fā)酵單胞菌glf，所述激酶的基因是活動發(fā)酵單胞菌glk。
分離合適的基因，并按照通用的方法轉(zhuǎn)化所述細(xì)胞來自大腸桿菌K12的talB和tktA的完整的核苷酸序列是已知(Yura T.等，Nucl.Acid Res.20(1992)3305-8；Sprenger G.A.，Biochim.Biophys.Acta 1216(1993)307-10；Sprenger G.A.等，J.Bacteriol.177(1995)5930-9)，并儲存在諸如Heidelberg中的EMBL的數(shù)據(jù)庫中。當(dāng)克隆大腸桿菌talB基因時，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法適用于例如用大腸桿菌K12菌株的染色體DNA特異性擴(kuò)增所述基因(Sprenger G.A.等，J.Bacteriol.177(1995)5930-9)。例如，當(dāng)克隆大腸桿菌tktA基因時，轉(zhuǎn)酮酶缺陷型突變體的同源互補(bǔ)是適合的(SprengerG.A.，Bisswanger H.等，Biochemistry and physiology ofthiamine diphosphate enzymes，VCH(1991)322-6)。
例如，當(dāng)克隆活動發(fā)酵單胞菌轉(zhuǎn)運(yùn)基因glf或活動發(fā)酵單胞菌葡糖激酶基因glk時，PCR例如適于用活動發(fā)酵單胞菌菌株ATCC 29191或ATCC 31821的染色體DNA特異性擴(kuò)增所述基因，PTS功能有缺陷并因此例如不能轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的大腸桿菌突變體的異源互補(bǔ)也是合適的(Snoep J.L.等，J.Bacteriol.174(1994)1707-8；Parker C.等，Mol.Microbiol.15(1995)795-82；Weisser P.等，J.Bacteriol.177(1995)3351-4)。在分離所述基因并在體外將其同已知低拷貝數(shù)的載體(諸如pACYC184、pACYC177、pSC101或pZY507(Weisser P.等，J.Bacteriol.177(1995)3351-4))重組后，使用化學(xué)方法、電穿孔、接合或轉(zhuǎn)導(dǎo)來轉(zhuǎn)化所述宿主細(xì)胞。
可以將分離的轉(zhuǎn)醛酶基因與在本發(fā)明正文所述內(nèi)的一個或多個基因，以任何組合一起整合到一個或幾個基因結(jié)構(gòu)內(nèi)。不考慮對基因結(jié)構(gòu)的精確定位，這產(chǎn)生了諸如talB、talB+tktA、talB+glf、talB+glk、talB+glf+glk、talB+tktA+glf、talB+tktA+glk或talB+tktA+glf+glk的組合。
包括至少一個分配給所述基因之一的調(diào)節(jié)基因序列的基因結(jié)構(gòu)是有利的。因此，最好可以在轉(zhuǎn)錄水平上，特別是通過強(qiáng)化轉(zhuǎn)錄信號實現(xiàn)調(diào)節(jié)元件的強(qiáng)化。這可以例如通過提高一個或多個啟動子的活性而實現(xiàn)，而提高一個或多個啟動子的活性通過改變位于結(jié)構(gòu)基因上游的啟動子序列，或通過用更有效的啟動子完全替換所述啟動子而實現(xiàn)。也可以通過在分配給所述基因的調(diào)節(jié)基因上施加合適的影響強(qiáng)化轉(zhuǎn)錄；然而，除此之外，例如通過提高信使RNA(mRNA)的穩(wěn)定性，也可能強(qiáng)化翻譯。
最合適的基因結(jié)構(gòu)是那些基因結(jié)構(gòu)，在這些基因結(jié)構(gòu)中插入至少一個所述基因，以使所述基因處于誘導(dǎo)型啟動子控制之下。當(dāng)在按照本發(fā)明的基因結(jié)構(gòu)上布置所述基因時，啟動子可以位于基因上游，或作為共用啟動子在幾個基因的上游定位，或者可以使用兩個方向相反的啟動子，在這兩個啟動子之間布置所述基因，使得以相反的方向讀取所述基因。在該前后序列中，例如可以將glf基因定位于相對較弱的啟動子(例如Ptet)的下游，而其它基因可以處于tac啟動子控制之下?？梢詫⒁粋€或多個DNA序列定位于包含在基因結(jié)構(gòu)中的所述基因的上游和/或下游，所述基因有或沒有上游啟動子，或有或沒有分配的調(diào)節(jié)基因。通過使用誘導(dǎo)型啟動子元件，例如lacl/Ptac，例如通過加入諸如異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的化學(xué)誘導(dǎo)劑，可能開通新功能(誘導(dǎo)酶合成)。
通過提供帶有可復(fù)制形式的本發(fā)明基因結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞也可以達(dá)到本發(fā)明的目的。
按照本發(fā)明的定義，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞理解為具有按照本發(fā)明的基因結(jié)構(gòu)的任何微生物，所述基因結(jié)構(gòu)在所述細(xì)胞中引起物質(zhì)生成增加。利用化學(xué)方法(Hanahan D.，J.Mol.Biol.166(1983)557-580)，也可以利用電穿孔、接合或轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)化所述宿主細(xì)胞。
對于所述轉(zhuǎn)化，最好使用另外參與所述物質(zhì)合成的一個或多個酶去調(diào)節(jié)和/或活性增加的宿主細(xì)胞。用包含所述相關(guān)基因的基因結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化生產(chǎn)芳族氨基酸或按照本發(fā)明的另一物質(zhì)的微生物菌株，特別是大腸桿菌。對于用所述基因結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化，最好是使用PEP依賴性糖吸收系統(tǒng)的活性(如果存在)降低或消除的宿主細(xì)胞。
具體而言，提供能夠生產(chǎn)芳族氨基酸的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，芳族氨基酸優(yōu)選是L-苯丙氨酸。
使用所述新方法和按照本發(fā)明的內(nèi)容轉(zhuǎn)化的微生物，可以用范圍廣泛的底物生產(chǎn)物質(zhì)。在本發(fā)明所述范圍內(nèi)，因此也提供微生物制備物質(zhì)的方法，在所述方法中，培養(yǎng)按照本發(fā)明轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，在所述細(xì)胞中存在一個基因結(jié)構(gòu)，所述基因結(jié)構(gòu)包含至少一個分配給一個所述基因中的調(diào)節(jié)基因系列，并在至少兩次細(xì)胞分裂后(指數(shù)生長期的開始)，在所述微生物中誘導(dǎo)酶的合成。因此，所述微生物的生產(chǎn)的增加可以獨(dú)立于其生長。
在所述新方法的特別優(yōu)選的實施方案中，使用下述轉(zhuǎn)化細(xì)胞，除了戊糖磷酸途徑的中間體以外，所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞也含有利用率增加的中心新陳代謝的其它代謝物。這些代謝物包括，例如來自糖酵解或葡糖異生作用的丙酮酸，或來自檸檬酸循環(huán)的草酰乙酸。此外，可以利用相關(guān)的化合物或其前體以通過喂養(yǎng)使細(xì)胞生長，所述化合物是丙酮酸前體或檸檬酸循環(huán)代謝物的前體，諸如延胡索酸或蘋果酸。
下文通過一些實行實施例更加詳細(xì)地解釋了本發(fā)明。下述菌種根據(jù)布達(dá)佩斯條約的條款，保藏在德意志微生物保藏中心(DSM)DSM11210大腸桿菌AT2471/pZYTT7talDSM11209大腸桿菌AT2471/pZY557tkttalDSM11206大腸桿菌AT2471GP704glfint PTS+DSM11205大腸桿菌AT2471glfint PTS-使用的宿主細(xì)胞，即AT2471，已由Taylor和Trotter(Bacteriol.Rev.13(1967)332-353)保藏于CGSC中，保藏號為4510，并可免費(fèi)得到。
在表1中詳細(xì)描述了本專利申請范圍內(nèi)使用的所有微生物的特征和出處。
接下來的正文將表明使用的材料和方法，并以實驗實施例和比較實施例支持本發(fā)明一般方法在所述遺傳研究中，除非另有說明，否則一般在由Difco細(xì)菌培養(yǎng)用胰蛋白胨(10g/l)、Difco酵母提取物(5g/l)和NaCl(10g/l)組成的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌菌種。根據(jù)所使用的菌種的抗性特性，如果必要，向所述培養(yǎng)基中加入羧芐青霉素(20-100mg/l)和/或氯霉素(17-34mg/l)。為此，首先將羧芐青霉素全部溶解在水中，將氯霉素溶解在乙醇中，在過濾除菌后，將所述溶液加入到預(yù)先高壓滅菌的培養(yǎng)基中。向所述LB培養(yǎng)基中加入Difco細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂(1.5％)，以制備瓊脂平板。使用市售的系統(tǒng)(Quiagen，Hilden)通過堿裂解法從大腸桿菌中分離質(zhì)粒DNA。如Chen和Kuo所述(Nucl.AcidRes.21(1993)2260)從大腸桿菌和活動發(fā)酵單胞菌中分離染色體DNA。
按照生產(chǎn)商的說明(Boehringer，Mannheim，德國或Promega，Heidelberg，德國)使用限制酶、DNA聚合酶I、堿性磷酸酶、RNA酶和T4 DNA連接酶。對于限制性分析，在瓊脂糖凝膠(0.8％)中分離DNA片段，并使用市售的系統(tǒng)(Jetsorb Genomed，Bad Oeynhausen，德國)通過提取從所述瓊脂糖中分離DNA片段。
對于DNA分析，用限制酶消化染色體DNA(10μg)，通過凝膠電泳按大小對染色體DNA分級分離，并通過真空介導(dǎo)的擴(kuò)散(VacuGene系統(tǒng)，Pharmacia，弗雷堡，德國)將其轉(zhuǎn)移到尼龍膜(Nytran 13，Schleicher and Schuell，Dassel，德國)上。分離合適的DNA片段，以洋地黃毒苷-DUTP對其標(biāo)記，并將其用做探針。通過市售的標(biāo)記探測系統(tǒng)(Boehringer，Mannheim，德國)進(jìn)行標(biāo)記、雜交、清洗步驟和探測。
對于轉(zhuǎn)化，在LB培養(yǎng)基中(5ml試管)于37℃和200rpm培養(yǎng)所述細(xì)胞2.5-3小時。在光密度(620nm)大約為0.4時，將所述細(xì)胞離心下來，并將其懸浮于十分之一體積的TSS(含有10％(w/v)PEG 8000、5％(v/v)DMSO和50mM MgCl2的LB培養(yǎng)基)中。于4℃同0.1-100ng的DNA溫育30分鐘后，接著于37℃溫育1小時后，在包含合適抗生素的LB培養(yǎng)基上將所述細(xì)胞鋪平板。實施例1制備pZY557tal、pBM20tal和pZY557tkttal，作為以質(zhì)粒為基礎(chǔ)的按照本發(fā)明的基因結(jié)構(gòu)的原型和制備pZY557tat用限制酶BamHI和HindIII打開質(zhì)粒pZY507(Weisser等，1995 J.Bacteriol 1773351-3345)，并分離較大的片段(10.1KB的DNA)。用BamHI和HindIII從載體pUCBM20(Boehringer Mannheim，德國)切下一部分多克隆位點，并將其同大pZY507 BamHI/HindIII片段連接在一起，這產(chǎn)生載體pZY557，除了其它限制性切割位點之外，載體pZY557同載體pZY507相似。通過PCR由載體pGSJ451(Sprenger G.A.等，J.Bacteriol.177(1995)5930-36)擴(kuò)增talB基因。為此，使用寡核苷酸I5′CCGCATGCTGTTTAAAGAGAAATA3′(此處帶有下劃線的堿基對對應(yīng)于Sprenger G.A.等，J.Bacteriol.177(1995)5930-6所述talB序列的84至101堿基對)，所述寡核苷酸I具有限制酶SphI的切割位點，并使用市售的M13/pUC測序引物(Boehringer Mannheim，德國，第1010093號)作為寡核苷酸II。產(chǎn)生的擴(kuò)增DNA片段在每個末端包含一個SphI的切割位點，并用限制酶SphI切割。然后將該片段分別同載體pZY557和pUCBM20連接在一起，所述載體也已用SphI線性化。在用兩種連接溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌并克隆所述轉(zhuǎn)化體后，分別獲得重組質(zhì)粒pZY557tal和pBM20tal。通過PCR由載體pGSJ427(Sprenger G.A.等，Eur.J.Biochem.230(1995)525-32)擴(kuò)增tktA基因，所述基因在5′末端插入限制酶NotI的切割位點和在3′末端插入SphI酶的切割位點。在此情況下，使用寡核苷酸III5′TTAGCGGCCGCCCTTCATCATCCGATCT3′(此處帶有下劃線的堿基對對應(yīng)于Sprenger G.A.，Biochim.Biophys.Acta.1216(1993)307-10所述tktA序列的126至146堿基對)，所述寡核苷酸III具有限制酶NotI的切割位點，和使用寡核苷酸IV5′ATAGCATGCTAATTACAGCAGTTC3′(此處帶有下劃線的堿基對對應(yīng)于Sprenger G.A.，Biochim.Biophys.Acta.1216(1993)307-10所述tktA序列的2018至2036堿基對)，所述寡核苷酸IV具有SphI的切割位點。用NotI和SphI切割所得的PCR片段，并將其連接入以同樣方式處理的載體pZY557tkt，這產(chǎn)生載體pZY557tkt。然后用SphI打開pZY557tkt，并將其同包含talB的SphI-切割PCR片段連接在一起。在轉(zhuǎn)化大腸桿菌并克隆所述轉(zhuǎn)化體之后(參見上文)，獲得包含tktA基因和talB基因的質(zhì)粒，所述tktA基因和talB基因在tac啟動子的下游以相同的方向定位，并因此作為基因結(jié)構(gòu)pZY557tkttal使用。
將產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化體以甘油培養(yǎng)物(30％)的形式于-80℃在LB培養(yǎng)基中儲存。在需要時，使用前直接融化所述甘油培養(yǎng)物。實施例2增加轉(zhuǎn)醛酶活性對也增加轉(zhuǎn)酮酶活性的菌株生長的影響在無機(jī)培養(yǎng)基中研究大腸桿菌菌株AT2471、AT2471/pZY557tkt、AT2471/pZY557tal和AT2471/pZY557tkttal在葡萄糖上的生長。所述無機(jī)培養(yǎng)基包括檸檬酸鈉·3H2O(1.0g/l)、MgSO4·7H2O(0.3g/l)、KH2PO4(3.0g/l)、K2HPO4(12.0g/l)、NaCl(0.1g/l)、(NH4)2SO4(5.0g/l)、CaCl2·2H2O(15.0mg/l)、FeSO4·7H2O(0.75g/l)和L-酪氨酸(0.04g/l)。以微量元素溶液(1ml/l)的形式加入另外的無機(jī)物，所述溶液由Al2(SO4)3·18H2O(2.0g/l)、CoSO4·6H2O(0.7g/l)、CuSO4·5H2O(2.5g/l)、H3BO3(0.5g/l)、MnCl2·4H2O(20.0g/l)、Na2MoO4·2H2O(3.0g/l)、NiSO4·3H2O(2.0g/l)和ZnSO4·7H2O(15.0g/l)組成。在水中溶解維生素B1(5.0mg/l)，并通過過濾除菌后，將其加入到已高壓滅菌的培養(yǎng)基中，也加入羧芐青霉素和/或羧芐青霉素和氯霉素作為需要的arose。單獨(dú)將葡萄糖(30g/l)高壓滅菌，也將其加入到已高壓滅菌的培養(yǎng)基中。
對于所述實驗，以2ml甘油培養(yǎng)物接種搖瓶(1000ml，包含100ml無機(jī)培養(yǎng)基)，并于37℃和150rpm在定軌搖床中培養(yǎng)72小時。在光密度(620nm)達(dá)到約等于1后，通過加入15-100um IPTG誘導(dǎo)所述細(xì)胞。直到此時以固定的間隔檢測所述培養(yǎng)物的光密度。在上述條件下，宿主生物大腸桿菌AT2471的光密度在7.25小時后達(dá)到1.2。在突變體AT2471/pZY557tkt中增加所述轉(zhuǎn)酮酶活性導(dǎo)致生長速率明顯降低；該菌株在7.25小時后光密度只達(dá)到0.49，而其在實驗開始時和大腸桿菌AT2471具有相同的光密度。生長抑制效應(yīng)可能是因為合成抑制濃度的戊糖磷酸途徑的代謝中間體造成的。
在突變體AT2471/pZY557tal中增加所述轉(zhuǎn)醛酶活性也導(dǎo)致生長速率明顯降低(幾乎和在轉(zhuǎn)酮酶情況下一樣明顯)；在7.25小時后光密度達(dá)到0.52。除了增加轉(zhuǎn)酮酶活性，還增加轉(zhuǎn)醛酶活性，在7.25小時后光密度可能達(dá)到1.1，這在大腸桿菌AT2471/pZY557tkttal中實現(xiàn)。該結(jié)果使下述事實變得清楚了，即在轉(zhuǎn)酮酶活性增加的菌株中另外增加轉(zhuǎn)醛酶活性，消除了只增加轉(zhuǎn)酮酶活性的負(fù)面影響，實質(zhì)上允許非抑制生長。實施例3測定所述轉(zhuǎn)醛酶的酶活性為了測定所述轉(zhuǎn)醛酶活性，如上所述培養(yǎng)大腸桿菌AT2471、AT2471/pZY507、AT2471/pZY557tal和AT2471/pZY557tkttal細(xì)胞，但向所述培養(yǎng)基加入3-(嗎啉代)丙磺酸(MPOS，16.7g/l)，而磷酸鹽濃度降到在生長實驗中使用的磷酸鹽濃度的十分之一。為了檢查所述細(xì)胞的誘導(dǎo)，建立平行的實驗混合物，通過在7次細(xì)胞分裂(OD≈1)后加入IPTG(20μm)，誘導(dǎo)所述混合物之一。在向相關(guān)搖瓶加入誘變劑之前和在誘導(dǎo)后3小時，直接從所有混合物中取出20ml培養(yǎng)液，于4℃以6000g沉淀所述細(xì)胞10分鐘。
在50mM、pH8.5的甘氨酰甘氨酸緩沖液中洗滌收獲的細(xì)胞，所述緩沖液包括1mM二硫蘇糖醇、10mM MgCl2和0.5mM二磷酸硫胺素。利用超聲處理(裝有微端(microtip)的Branson 250超聲波儀)，以25％超聲處理循環(huán)和40瓦強(qiáng)度，對每毫升細(xì)胞懸浮液處理4分鐘，破碎沉淀中的細(xì)胞。在以18,000g于4℃離心30分鐘后，使用上清液(粗提物)檢測所述轉(zhuǎn)醛酶活性。
使用酶試驗測定所述粗提物中的轉(zhuǎn)醛酶活性，所述酶試驗與NAD的生成光耦合。為此，在總體積為1ml的包含0.8mM 6-磷酸果糖、4mM 4-磷酸赤蘚糖和0.3mM NADH的緩沖液(50mM、pH8.5的甘氨酰甘氨酸、1mM二硫蘇糖醇、10mM MgCl2和0.5mM二磷酸硫胺素)中溫育所述粗提物。所得的3-磷酸甘油醛和也加入的丙糖磷酸異構(gòu)酶(9U)和3-磷酸甘油脫氫酶(3U)反應(yīng)，生成NAD。在340nm(ε＝6.3×103l/mol.cm)下分光光度監(jiān)視NADH的OD，1μmol NADH的轉(zhuǎn)化相等于消耗1μmol6果糖-磷酸。將每分鐘1μmol NADH的轉(zhuǎn)換定義為1U。
如Bradford所述(Anal.Biochem.72(1976)248-254)，使用市售的著色劑，測定粗提物中的蛋白濃度。使用牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)。
表2顯示了在使用帶有質(zhì)粒pZY557、pZY557tal或pZY557tkttal之一的宿主菌株大腸桿菌AT2471及其突變體時酶檢測的結(jié)果。在誘導(dǎo)時，發(fā)現(xiàn)宿主菌株和所述具有載體pZY557的菌株的轉(zhuǎn)酮酶活性大約為0.65U/毫克蛋白。如大腸桿菌AT2471/pZY557所示，由于生理性生長，該值在3小時內(nèi)增加到0.8U/毫克蛋白。由于在使用的載體中不存在所述tal基因，因此預(yù)期在此實驗中進(jìn)行的誘導(dǎo)將沒有任何影響。
在平行的實驗混合物中，發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)時，大腸桿菌AT2471/pZY557tal的轉(zhuǎn)酮酶活性分別為0.53和0.61U/毫克蛋白。通過誘導(dǎo)，轉(zhuǎn)醛酶活性值達(dá)到1.06U/毫克蛋白，而在沒有誘導(dǎo)所述培養(yǎng)物時，轉(zhuǎn)醛酶活性值在3小時時只增加到0.6U/毫克蛋白。在其它實驗混合物中，在其它相同的實驗中使用大腸桿菌AT2471/pZY557tkttal；在此情況下，轉(zhuǎn)醛酶活性在誘導(dǎo)所述細(xì)胞后的前3小時內(nèi)，由0.8增加至1.16U/毫克蛋白，和對應(yīng)的使用宿主菌株的實驗相比，所述轉(zhuǎn)醛酶活性相當(dāng)于其一倍。實施例4使用菌株生產(chǎn)物質(zhì)，所述菌株除了轉(zhuǎn)醛酶活性增加外，還顯示轉(zhuǎn)酮酶活性增加使用用于生長實驗的培養(yǎng)基檢測合成效率。在光密度為1時誘導(dǎo)大腸桿菌AT2471和AT2471/pZY557tkttal的培養(yǎng)物，并將培養(yǎng)周期延長至72小時。24小時和48小時后，檢測所述培養(yǎng)物的pH值，如果需要，通過加入KOH(45％)，使其恢復(fù)到7.2的起始值。另外，在24、48和72小時后取樣(2ml)，檢測光密度以及葡萄糖和L-苯丙氨酸的濃度。
通過高壓液相層析(HPLC，Hewlett Packard，慕尼黑，德國)和熒光檢測(消光335nm，發(fā)射570nm)共同測定苯丙氨酸濃度。使用Nucleosil-120-8-C18柱(250×4.6毫米)作為固相；利用梯度洗脫所述柱(洗脫液A90％50mM磷酸，10％甲醇，pH2.5；洗脫液B20％50mM磷酸，80％甲醇，pH2.5；梯度0-8分鐘100％A，8-13分鐘0％A，13-19分鐘100％A)。將洗脫速率設(shè)定在1.0ml/分鐘；將柱溫設(shè)定在40℃。在室溫下于反應(yīng)毛細(xì)管(14米×0.35毫米)中使用鄰苯二醛進(jìn)行柱后衍生。在所述條件下發(fā)現(xiàn)L-苯丙氨酸的保留時間為6.7分鐘。
用酶測試條(strip)(Diabur，Boehringer Mannheim，德國)檢測葡萄糖濃度，并根據(jù)其結(jié)果，接著加入2ml濃縮的葡萄糖溶液(500g/l)，確保在實驗混合物中葡萄糖限制沒有提高。培養(yǎng)48小時后，誘導(dǎo)宿主菌株大腸桿菌AT2471后(苯丙氨酸)指示值達(dá)到119；此值是與未誘導(dǎo)的宿主菌株的苯丙氨酸值100相比得出。僅僅將質(zhì)粒pZY557tkttal引入到所述宿主菌株中，導(dǎo)致甚至在未誘導(dǎo)細(xì)胞中，描述苯丙氨酸濃度的該指示值增加到167。如本實驗所示，誘導(dǎo)菌株大腸桿菌AT2471/pZY557tkttal導(dǎo)致指示值進(jìn)一步增加到204。這和誘導(dǎo)的宿主菌株相比，相當(dāng)于增加71％。
該結(jié)果證明了按照本發(fā)明、在轉(zhuǎn)醛酶活性已經(jīng)增加的菌株中又增加轉(zhuǎn)酮酶活性、或在轉(zhuǎn)酮酶活性已經(jīng)增加的菌株中又增加轉(zhuǎn)醛酶活性的正面效應(yīng)，所述效應(yīng)增加了芳族化合物合成。實施例5使用轉(zhuǎn)醛酶活性增加的菌株生產(chǎn)物質(zhì)在實驗中培養(yǎng)突變體大腸桿菌AT2471/pZY557tal，所述實驗在其它方面同實施例4所述實驗相同。48小時后，誘導(dǎo)所述菌株導(dǎo)致(苯丙氨酸)指示值，與未誘導(dǎo)菌株的苯丙氨酸值100相比，為131。
該結(jié)果清楚證明增加轉(zhuǎn)醛酶活性對芳族物質(zhì)合成施加的正面效應(yīng)，尤其是在按照本發(fā)明的誘導(dǎo)之后。實施例6使用PTS-突變體生產(chǎn)物質(zhì)，在所述突變體中在引入PEP不依賴性糖吸收系統(tǒng)后，隨著轉(zhuǎn)酮酶活性增加，除了轉(zhuǎn)醛酶活性增加，還表達(dá)PEP不依賴性糖吸收系統(tǒng)。
如Weisser P.等所述(J.Bacteriol.177(1995)3351-54)，使用PCR(Mullis K.B.等，Meth.Enzymol.155(1987)335-50)獲得所述glf基因?？梢缘玫皆摶虻耐暾塑账嵝蛄?Barnell W.O.等，J.Bacteriol. 172(1990)7227-40)。用質(zhì)粒pZY600作為模板擴(kuò)增所述glf基因(Weisser P.等，J.Bacteriol.177(1995)3351-54)。
為了將所述glf基因整合到編碼大腸桿菌PTS系統(tǒng)元件的基因中，用BglII消化質(zhì)粒pPTS1(參見表1)，并對其用克列諾片段處理。唯一的切割位點位于ptsI基因中。從質(zhì)粒pBM20glfglk分離作為BamHI-KpnI片段的glf基因，并同樣對其用克列諾片段處理。通過平端連接獲得具有與ptsHI基因相同方向的glf的克隆。從所得的質(zhì)粒pPTSglf中獲得具有ptsH基因的3′區(qū)和包含整合的glf和crr的ptsI的4.6kb的PstI片段。將該片段連接入載體pGP704的EcoRV切割位點。因為該載體只能在λpir菌株中復(fù)制，所以由轉(zhuǎn)化體將所述載體整合到染色體中，如果這些轉(zhuǎn)化體能在羧芐青霉素中生長，則所述轉(zhuǎn)化體不含有該噬菌體。通過DNA印跡分析(Miller V.L.等，J.Bateriol.170(1988)2575-83)檢查所述整合。所得的轉(zhuǎn)化體除了包括glf基因，還包括完整的PTS基因。
可以第二次同源交換中重組所述載體部分，導(dǎo)致羧芐青霉素抗性喪失。因為在這種情況下，通過插入glf基因間斷pts基因，所以在這些突變體中沒有以功能方式表達(dá)所述PTS。如下選擇所需的PTS-突變體在沒有抗生素的LB培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)仍然是PTS+的轉(zhuǎn)化突變體幾次后，將等分的細(xì)胞懸浮液在包含100μg/l磷霉素(phosphomycin)的LB板上倒平板。PTS突變體能夠在這些平板上生長。在包含或者磷霉素或者20μg/l的羧芐青霉素的LB平板上將生長的克隆劃線接種。從在磷霉素平板上仍顯示生長、但在羧芐青霉素平板上不能生長的克隆中分離染色體DNA。通過DNA分析證實了，glf基因整合到編碼PTS系統(tǒng)的基因中。以PTS-缺陷的表型鑒別對應(yīng)的突變體。選擇一個克隆作為宿主生物大腸桿菌 AT2471glfintPTS-，并將其用于用質(zhì)粒pZY557tal(參見上文)的轉(zhuǎn)化。按照實施例4和5所述實驗條件，在兩個平行混合物中，在每種情況下培養(yǎng)PTS陰性突變體大腸桿菌AT2471glfintPTS-/pZY557tal和對應(yīng)的宿主菌株AT2471glfintPTS-，并在每種情況下大約7次分裂后，誘導(dǎo)一種混合物的細(xì)胞。
所述誘導(dǎo)將所述宿主菌株的合成效率降低到56，所述宿主菌株在沒有誘導(dǎo)時最初的指示值是100。通過對比，在轉(zhuǎn)化菌株AT2471glfintPTS-/pZY557tal的培養(yǎng)物中，所述誘導(dǎo)將苯丙氨酸指示值從73增加到103，并因此高于所述宿主菌株的起始值。
該結(jié)果證實，僅僅增加轉(zhuǎn)醛酶活性，甚至在那些微生物中對苯丙氨酸合成有正面效應(yīng)，在所述微生物中PTS系統(tǒng)活性減少，或者該系統(tǒng)完全關(guān)閉，同時已將PEP不依賴性糖吸收系統(tǒng)整合到其中。實施例7用PTS-突變體生產(chǎn)物質(zhì)，在所述突變體中除了增加轉(zhuǎn)醛酶活性，在引入PEP不依賴性糖吸收系統(tǒng)之前，隨著轉(zhuǎn)醛酶活性增加，還表達(dá)PEP不依賴性糖吸收系統(tǒng)如實施例1所述得到大腸桿菌AT2471/pZY557tal。接著在該菌株中將glf基因整合到編碼大腸桿菌PTS系統(tǒng)元件的基因中。如實施例6所述完成該整合。使用實施例4和5所述實驗條件，培養(yǎng)這些PTS陰性大腸桿菌AT2471glfintPTS-/pZY557tal突變體。發(fā)現(xiàn)衍生突變體的生物合成效率相當(dāng)于實施例6所述菌株的合成效率。實施例8在發(fā)酵容器中使用轉(zhuǎn)醛酶活性增加的菌株和除了其轉(zhuǎn)醛酶活性增加、轉(zhuǎn)酮酶活性也增加的菌株生產(chǎn)物質(zhì)。
在發(fā)酵容器(反應(yīng)體積15升)中培養(yǎng)突變體大腸桿菌AT2471、大腸桿菌AT2471/pZY557tal和大腸桿菌AT2471/pZY557tkttal。為此，使用兩個具有實施例2所述無機(jī)培養(yǎng)基(250ml)的搖瓶(2000ml)預(yù)培養(yǎng)。在該方法中，降低葡萄糖濃度至5.0g/l。用2ml甘油培養(yǎng)基接種所述搖瓶，并在定軌搖床上于37℃和150rpm培養(yǎng)所述搖瓶，直至光密度(600nm)達(dá)到3。
使用所述預(yù)培養(yǎng)物接種4.5升生產(chǎn)培養(yǎng)基。所述培養(yǎng)基包括MgSO4·7H2O(0.3g/l)、KH2PO4(3.0g/l)、NaCl(0.1g/l)、(NH4)2SO4(5.0g/l)、CaCl2·2H2O(15.0mg/l)、FeSO4·7H2O(0.75g/l)和L-酪氨酸(0.24g/l)。以微量元素溶液的形式(1.5ml/l)加入另外的無機(jī)物，所述溶液由Al2(SO4)3·18H2O(2.0g/l)、CoSO4·6H2O(0.7g/l)、CuSO4·5H2O(2.5g/l)、H3BO3(0.5g/l)、MnCl4·4H2O(20.0g/l)、Na2MoO4·2H2O(3.0g/l)、NiSO4·3H2O(2.0g/l)和ZnSO4·7H2O(15.0g/l)組成。將維生素B1(75.0mg/l)溶解在水中，并在過濾除菌后，將其加入到已高壓滅菌的培養(yǎng)基中。單獨(dú)將葡萄糖(15g/l)高壓滅菌，并也將其加入到已高壓滅菌的所述培養(yǎng)基中。通過加入NH4OH(25％)，將培養(yǎng)基的pH值控制在7，通過控制攪拌速度、供給的空氣體積和發(fā)酵容器內(nèi)壓力將氧分壓值控制在20％。通過加入葡萄糖溶液(700g/l)，將培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度值控制在5g/l左右。根據(jù)發(fā)酵時間，以可變濃度向葡萄糖溶液中加入L-酪氨酸，以避免L-酪氨酸限制。
在進(jìn)行細(xì)胞誘導(dǎo)的實驗中，按照本發(fā)明在6小時后通過加入50μMIPTG進(jìn)行細(xì)胞誘導(dǎo)。在誘導(dǎo)36小時后，僅僅通過引入pZY557tal質(zhì)粒使(苯丙氨酸)指示值達(dá)到120；此值是與未誘導(dǎo)的宿主菌株大腸桿菌AT2471的(苯丙氨酸)指示值100相比得出。通過按照本發(fā)明誘導(dǎo)，該值可以進(jìn)一步升到153。通過單獨(dú)引入pZY557tkttal質(zhì)粒，并因此除了增加轉(zhuǎn)醛酶活性，還增加轉(zhuǎn)酮酶活性，與所述宿主菌株相比，(苯丙氨酸)指示值可以達(dá)到130。本實驗進(jìn)一步顯示，誘導(dǎo)菌株大腸桿菌AT2471/pZY557tkttal能夠進(jìn)一步將(苯丙氨酸)指示值增加到250。這同未誘導(dǎo)的菌株相比，相當(dāng)于增加了92％。
權(quán)利要求
1.微生物制備物質(zhì)的方法，其中在生產(chǎn)這些物質(zhì)的微生物中增加轉(zhuǎn)醛酶活性，而在所述微生物中磷酸烯醇丙酮酸(PEP)依賴性糖吸收系統(tǒng)的活性存在、降低或消失。
2.按照權(quán)利要求1的方法，其特征在于，在下述微生物中實現(xiàn)物質(zhì)制備，所述微生物在增加轉(zhuǎn)醛酶活性之前，沒有從先前帶有磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(pts+菌株)的菌株中將所述微生物作為磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)關(guān)閉的菌株(pts-菌株)進(jìn)行選擇。
3.按照權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于，制備其合成涉及至少一個戊糖磷酸途徑的中間體的物質(zhì)。
4.按照權(quán)利要求3的方法，其特征在于，所述中間體是4-磷酸赤蘚糖(Ery4P)。
5.按照權(quán)利要求1或4的方法，其特征在于，增加大腸桿菌轉(zhuǎn)醛酶活性。
6.按照權(quán)利要求1-5之一的方法，其特征在于，增加大腸桿菌轉(zhuǎn)醛酶B(TalB)活性。
7.按照權(quán)利要求1-6之一的方法，其特征在于，額外增加轉(zhuǎn)酮酶活性。
8.按照權(quán)利要求7的方法，其特征在于，增加大腸桿菌轉(zhuǎn)酮酶活性。
9.按照權(quán)利要求7或8之一的方法，其特征在于，增加大腸桿菌轉(zhuǎn)酮酶A(TktA)活性。
10.按照權(quán)利要求1-9之一的方法，其特征在于，額外增加PEP不依賴性糖吸收系統(tǒng)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性和/或使相關(guān)糖磷酸化的激酶的活性。
11.按照權(quán)利要求10的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是易化蛋白(facilitator)。
12.按照權(quán)利要求11的方法，其特征在于，所述易化蛋白是活動發(fā)酵單胞菌葡萄糖易化蛋白(Glf)。
13.按照權(quán)利要求10-12之一的方法，其特征在于，所述激酶是己糖磷酸化激酶。
14.按照權(quán)利要求13的方法，其特征在于，所述激酶得自活動發(fā)酵單胞菌。
15.按照權(quán)利要求14的方法，其特征在于，所述激酶是活動發(fā)酵單胞菌葡糖激酶(Glk)。
16.按照權(quán)利要求10-15之一的方法，其特征在于，如果存在PEP依賴性糖吸收系統(tǒng)，則另外降低或消除其活性。
17.按照權(quán)利要求1-16之一的方法，其特征在于，a)通過引入所述基因b)和/或通過增加所述基因拷貝數(shù)c)和/或通過增加基因表達(dá)d)和/或通過增加所述酶的內(nèi)源活性e)和/或通過改變酶的結(jié)構(gòu)f)和/或通過使用去調(diào)節(jié)的酶g)和/或通過插入編碼去調(diào)節(jié)酶的基因增加至少一個下述元件，即轉(zhuǎn)醛酶、轉(zhuǎn)酮酶、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和激酶的活性。
18.按照權(quán)利要求17的方法，其特征在于，通過將一個或多個基因加入一個或幾個基因結(jié)構(gòu)中實現(xiàn)所述活性的增加，而所述一個或多個基因作為單拷貝或以增加的拷貝數(shù)引入到所述基因結(jié)構(gòu)中。
19.按照權(quán)利要求1-18之一的方法，其特征在于，使用另外參與所述物質(zhì)合成的一個或多個酶被去調(diào)節(jié)和/或顯示活性增加的微生物。
20.按照權(quán)利要求1-19的方法，其特征在于，制備的所述物質(zhì)是芳族氨基酸。
21.按照權(quán)利要求20的方法，其特征在于，所述芳族氨基酸是L-苯丙氨酸。
22.按照權(quán)利要求1-21之一的方法，其特征在于，使用的微生物屬于大腸桿菌屬、沙雷氏菌屬、芽胞桿菌屬、棒狀桿菌屬或短桿菌屬。
23.按照權(quán)利要求22的方法，其特征在于，所述微生物是大腸桿菌。
24.重組形式的基因結(jié)構(gòu)，包括a)編碼轉(zhuǎn)醛酶的基因或編碼轉(zhuǎn)醛酶的基因和編碼轉(zhuǎn)酮酶的基因，和b)至少一個編碼PEP不依賴性糖吸收的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或編碼糖磷酸化激酶的基因。
25.按照權(quán)利要求24的基因結(jié)構(gòu)，其特征在于，所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因編碼易化蛋白，而所述激酶的基因編碼己糖磷酸化激酶。
26.按照權(quán)利要求24或25的基因結(jié)構(gòu)，其特征在于，所述轉(zhuǎn)醛酶和所述轉(zhuǎn)酮酶的基因得自大腸桿菌，而所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和所述激酶的基因得自活動發(fā)酵單胞菌。
27.按照權(quán)利要求24-26的基因結(jié)構(gòu)，其特征在于，大腸桿菌轉(zhuǎn)醛酶的基因是talB，大腸桿菌轉(zhuǎn)酮酶的基因是tktA，活動發(fā)酵單胞菌轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因是glf，活動發(fā)酵單胞菌激酶的基因是glk。
28.按照權(quán)利要求24-27之一的基因結(jié)構(gòu)，其特征在于，所述基因結(jié)構(gòu)包括至少一個分配給所述基因之一的調(diào)節(jié)基因序列。
29.按照權(quán)利要求28的基因結(jié)構(gòu)，其特征在于，在所述基因結(jié)構(gòu)中至少加入一個所述基因，以使所述基因處于誘導(dǎo)型啟動子控制之下。
30.轉(zhuǎn)化細(xì)胞，帶有可復(fù)制形式的按照權(quán)利要求24-29的基因結(jié)構(gòu)。
31.按照權(quán)利要求30的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其特征在于，在所述細(xì)胞中，另外參與所述物質(zhì)合成的一個或多個酶被去調(diào)節(jié)和/或顯示活性增加。
32.按照權(quán)利要求30或31的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞。
33.按照權(quán)利要求30-32之一的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其特征在于，如果存在PEP依賴性糖吸收系統(tǒng)，那么降低或消除所述系統(tǒng)的活性。
34.按照權(quán)利要求30-33之一的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其特征在于，它能夠生產(chǎn)芳族氨基酸。
35.按照權(quán)利要求34的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其特征在于，所述芳族氨基酸是L-苯丙氨酸。
36.按照權(quán)利要求1-23之一的微生物制備物質(zhì)的方法，其特征在于，培養(yǎng)含有按照權(quán)利要求29的基因結(jié)構(gòu)、按照權(quán)利要求30-35之一的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并在最初的2次細(xì)胞分裂后進(jìn)行誘導(dǎo)。
37.按照權(quán)利要求36的方法，其特征在于，除了戊糖磷酸途徑的中間體，所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞也含有利用率增加的中心新陳代謝的其它代謝物。
全文摘要
本發(fā)明通過增加細(xì)胞內(nèi)代謝中間體(具體地說是赤蘚糖4－磷酸)的供應(yīng),使得可獲得供選擇的微生物制備物質(zhì)(特別是諸如L－苯丙氨酸的芳族氨基酸)的方法,在所述方法中,增加生產(chǎn)這些物質(zhì)的微生物中的轉(zhuǎn)醛酶活性。在本發(fā)明最佳實施方案中,又增加了轉(zhuǎn)酮酶活性,或增加了PEP依賴性糖吸收的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性和/或使相關(guān)糖磷酸化的激酶的活性。本發(fā)明也涉及基因結(jié)構(gòu),并涉及具有這些基因結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞,這使以特別成功的方式完成這些方法成為可能。
文檔編號C12R1/185GK1241214SQ97180908
公開日2000年1月12日 申請日期1997年10月17日 優(yōu)先權(quán)日1996年10月26日
發(fā)明者G·斯普倫格, R·斯維, H·薩姆, M·卡魯茨, T·松克 申請人:荷蘭加甜劑公司, 于利奇研究中心有限公司