專利名稱：合成反式-羥基砜的生物轉(zhuǎn)化方法
背景技術(shù)：
青光眼是與眼內(nèi)壓升高以致功能異常有關(guān)的眼疾，可引起不可逆的視力喪失。若不治療，青光眼甚至可導(dǎo)致失明。現(xiàn)在許多眼科醫(yī)生相信，眼高壓癥，即無(wú)視覺神經(jīng)損傷或以青光眼性視野缺陷為特征的眼內(nèi)壓高的病癥是青光眼的最早表現(xiàn)。
通式I的化合物
它們的各個(gè)非對(duì)映異構(gòu)體，各個(gè)對(duì)映異構(gòu)體或它們的混合物，或眼科可以接受的它們的鹽，為美國(guó)專利4,797,413和5,157,129中的已知化合物。
其中A為碳或氮；Z為NHR或-OR；R為C1-6直鏈或支鏈烷基；R1為a)C1-5直鏈或支鏈烷基，尤其為正丙基或異丁基；b)C3-5烯基，尤其為烯丙基；c)C3-5炔基，尤其為炔丙基；d)氫；或e)C1-4烷氧基-C1-4烷基；以及X為-SO2-或-C(O)-；這些化合物已知是用于眼高壓癥局部治療的有效的碳酸酐酶抑制劑(TCAI’s)。這些化合物的合成包括將砜-酮還原成上面提到的化合物的前體反式羥基砜。不過制備它們的合成方法卻生成非對(duì)映異構(gòu)體或外消旋產(chǎn)物，因而必須分離或拆分，要得到最活潑的對(duì)映異構(gòu)體同時(shí)就要至少損失50％產(chǎn)品。
本發(fā)明提供一種新的微生物方法，將砜-酮中間體生物轉(zhuǎn)化為反式-羥基砜中間體。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及使用新的微生物轉(zhuǎn)化方法合成具有下面的結(jié)構(gòu)式的反式-羥基砜
其中A和R1的定義同上。該反式-羥基砜是目標(biāo)物、即上面通式I的碳酸酐酶抑制劑的前體。這些目標(biāo)物對(duì)于眼高壓癥和青光眼的局部治療有效。該方法包括將砜-酮底物在微生物深紅酵母(ATCC74283)或piliminae紅酵母(ATCC32762)存在下發(fā)酵，最好在染紅酵母存在下發(fā)酵。生物轉(zhuǎn)化在需氧條件下完成，以含有氮營(yíng)養(yǎng)素的碳水化合物水溶液作為發(fā)酵介質(zhì)，介質(zhì)的pH為4.5至8.0，最好為6.0，生物轉(zhuǎn)化的時(shí)間應(yīng)充分以便生成結(jié)構(gòu)式為通式II的化合物。
生成的反式-羥基砜類似物顯示的非對(duì)映異構(gòu)體過量值在95％以上。該新方法中的關(guān)鍵步驟(即控制羥基砜的非對(duì)映異構(gòu)體過量)是控制生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)介質(zhì)中的殘留砜-酮濃度。
這樣，本發(fā)明的目標(biāo)是提供合成反式-羥基砜中間體的微生物方法。
本發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明涉及合成下面結(jié)構(gòu)式的化合物
反式-羥基砜-II
其中A為碳或氮，R1為a)C1-5的直鏈或支鏈烷基，尤其是正丙基或異丁基；b)C3-5烯基，尤其是烯丙基；c)C3-5炔基，尤其是炔丙基；d)氫；或e)C1-4烷氧基-C1-4烷基，它們是下面通式I化合物，各非對(duì)映異構(gòu)體，各對(duì)映異構(gòu)體或它們的混合物，或眼科可以接受的它們的鹽的前體，
其中A為碳或氮；Z為NHR或-OR；R為C1-6直鏈或支鏈烷基；R1為a)C1-5直鏈或支鏈烷基，尤其是正丙基或異丁基；b)C3-5烯基，尤其是烯丙基；c)C3-5炔基，尤其是炔丙基；d)氫；或e)C1-4烷氧基-C1-4烷基；以及X為-SO2-或-C(O)-；本發(fā)明的新方法包括在底物化合物III的存在下用微生物piliminae紅酵母或深紅酵母進(jìn)行發(fā)酵，最好用深紅酵母進(jìn)行發(fā)酵
砜-酮-III其中R2為a)C1-5直鏈或支鏈烷基，尤其是正丙基或異丁基；b)C3-5烯基，尤其是烯丙基；c)C3-5炔基，尤其是炔丙基；d)氫；或e)C1-4烷氧基-C1-4烷基發(fā)酵在營(yíng)養(yǎng)素的介質(zhì)中在需氧條件下進(jìn)行，直至有顯著量的化合物II生成，使用常規(guī)方法分離生成的化合物。結(jié)構(gòu)式I的化合物用于治療青光眼。
本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案包括在含有可吸收的氮源和碳源及底物化合物III的營(yíng)養(yǎng)素介質(zhì)中培養(yǎng)微生物深紅酵母，ATCC74283，其中通式II的化合物是通式I化合物，它的各個(gè)非對(duì)映異構(gòu)體、各個(gè)對(duì)映異構(gòu)體或它們的混合物，或眼科可以接受的它們的鹽的前體，在通式II中，
A為碳或氮，R1為a)C1-5直鏈或支鏈烷基，尤其是正丙基或異丁基；b)C3-5烯基，尤其是烯丙基；c)C3-5炔基，尤其是炔丙基；d)氫；或
e)C1-4烷氧基-C1-4烷基
在通式I中A為碳或氮；Z為NHR或-OR；R為C1-6直鏈或支鏈烷基；R1為a)C1-5直鏈或支鏈烷基，尤其是正丙基或異丁基；b)C3-5烯基，尤其是烯丙基；c)C3-5炔基，尤其是炔丙基；d)氫；或e)C1-4烷氧基-C1-4烷基；以及X為-SO2-或-C(O)-；
在通式III中，R2為a)C1-5直鏈或支鏈烷基，尤其是正丙基或異丁基；b)C3-5烯基，尤其是烯丙基；c)C3-5炔基，尤其是炔丙基；d)氫；或e)C1-4烷氧基-C1-4烷基，
培養(yǎng)在需氧條件下進(jìn)行，直至生成顯著量的化合物II，分離生成的化合物II，培養(yǎng)時(shí)將底物溶在以體積百分?jǐn)?shù)大約1％至15％乙醇、甲醇或DMSO中，底物的含量為大約1g/L至3g/L，培養(yǎng)溫度為大約20℃至50℃，pH為大約4.5至8.0。
底物化合物III可以按照以下的非限制性方法制備3(R)-羥基己酸甲酯3-酮己酸甲酯(44.7g，310mmol)用甲醇(75mL)和0.2N HCl(2mL)稀釋。加入Et2NH2+Ru2Cl5(BINAP)2(200mg)，反應(yīng)混合物在100磅/平方英寸的氫氣壓下于60℃加熱2小時(shí)。加入甲苯(100mL)，將混合物濃縮，得75g油狀物。
3(R)-甲苯磺酰氧基己酸甲酯3(R)-羥基己酸甲酯(310mmol)粗品溶在吡啶(100mL)中，加入對(duì)甲苯磺酰氯(59g，310mmol)。反應(yīng)混合物先于5℃攪拌24小時(shí)，再于15℃攪拌16小時(shí)。緩慢加水(5mL)破壞過量的試劑，加水時(shí)間超過1小時(shí)。混合物傾入20％甲苯/己烷(600mL)中，并用水洗滌(3×250mL)。有機(jī)層濃縮，得83g油狀產(chǎn)物，純度為95％。
3(S)-(2-噻吩硫代)己酸甲酯在-20℃將正丁基鋰(1.64M，97.6mL，160mmol)加到噻吩(15.g，180mmol)與四氫呋喃(100mL)的混合物中。攪拌30分鐘后分次加入硫(5.23g)。1小時(shí)后加脫氧的甲酰胺(100mL)，接著加3(R)-甲苯磺酰氧基己酸甲酯(40g，33.3mmol)。反應(yīng)混合物室溫?cái)嚢?4小時(shí)，然后用乙酸乙酯(100mL)和水(50mL)稀釋。分離的水層用乙酸乙酯(100mL)反萃取。合并有機(jī)層，濃縮后得到黃色油狀產(chǎn)物23.9g。按3-酮己酸甲酯計(jì)算，總收率為74％。
5.6-二氫-6(S)-(丙基)-4H-噻吩并〔2，3b〕噻喃-4-酮3(S)-(2-噻吩硫代)己酸甲酯(125g，513mmol)與乙酸(150mL)和濃鹽酸(150mL)混合后于100℃加熱96小時(shí)。混合物用甲苯(2×300mL)萃取。合并有機(jī)層，洗滌，濃縮，得暗棕色油狀物，該油狀物溶于甲苯(1200mL)中。混合物冷卻至0℃，加三氟乙酸酐(126g，600mmol)。45分鐘后混合物用水(2×200mL)洗，濃縮，得151g油狀物，不經(jīng)純化，直接用于下步反應(yīng)。
5，6-二氫-6(S)-(丙基)-4H-噻吩并〔2，3b〕噻喃-4-酮-7，7-二氧化物。
5，6-二氫-6(S)-(3-丙基)-4H-噻吩并〔2，3b〕噻喃-4-酮(4.25g，20mmol)溶于乙酸乙酯(80mL)中。加入鎢酸鈉(660mg，2mmol)，30％過氧化氫(8.2mL，80mmol)和10滴硫酸。24小時(shí)后反應(yīng)混合物用乙酸乙酯(100mL)稀釋，用10％Na2SO3溶液洗滌，用飽和的NaHCO3溶液洗滌。有機(jī)層濃縮，用乙醇研磨，得到4.5g產(chǎn)物(95％)。
微生物生物純的piliminae紅酵母樣品從夏威夷pilimanae果蠅幼蟲中分離得到，現(xiàn)在按照布達(dá)佩斯條約可以從ATCC的永久培養(yǎng)物中心得到，12301 Parklawn Drive，馬里蘭的Rockville，登記號(hào)為ATCC32762。生物純的深紅酵母樣品目前可以從ATCC的永久培養(yǎng)物中心得到，12301Parklawn Drive，馬里蘭州Rockville，登記號(hào)為ATCC74283。授予專利權(quán)后，對(duì)于公眾使用微生物的任何限制都將永遠(yuǎn)取消。深紅酵母ATCC74283從污染的酸乳各中分離得到。
本發(fā)明一般使用的分析方法當(dāng)然是非限制性的，現(xiàn)描述如下分析方法生物量測(cè)定用光密度和細(xì)胞干重測(cè)定生物量。用Hewlett Packard 8451A型二級(jí)管陣列分光光度計(jì)在660nm波長(zhǎng)測(cè)定光密度。細(xì)胞干重用HA型Millipore濾膜測(cè)定，濾孔為0.45μm。
葡萄糖葡萄糖用液相色譜監(jiān)測(cè)，液相色譜上裝有Macintosh經(jīng)典計(jì)算機(jī)用于控制和收集數(shù)據(jù)，裝有折射率檢測(cè)器A1-2Dynamax自動(dòng)進(jìn)樣器，分析型HP泵，壓力組件和Biorad Aminex HPX87H離子排阻柱(300×78mm)，于60℃加熱。洗脫劑為0.005M硫酸，流速為0.7mL/分肉湯萃取全部肉湯用等體積乙酸乙酯萃取?；旌衔镌谡袷幤魃险袷?分鐘后在Beckman TJ-6離心機(jī)上于2000rpm離心10分鐘。得到的上層清液干燥，再用甲醇混懸，作薄層色譜分析或HPLC分析。
薄層色譜使用Kiesel預(yù)涂的硅膠60薄層色譜板F254。流動(dòng)相由94％二氯甲烷、5％甲醇和1％氫氧化銨組成。樣品點(diǎn)在板上，吹干。板的一邊浸到流動(dòng)相中，直至溶劑爬到離板上沿1英寸處。
高效液相色譜HPLC用Rainin系統(tǒng)在室溫下完成，配備有Macintosh經(jīng)典計(jì)算機(jī)以便控制和獲得數(shù)據(jù)，Dynamax吸收檢測(cè)器UV-M，A1-2 Dynamax自動(dòng)進(jìn)樣器，兩個(gè)分析型HP泵，裝有Zorbax RX-C8柱(4.6×250nm)的壓力系統(tǒng)。使用2種洗脫劑，甲醇和水(0.1％v/v H3PO4)，組合流速為1.5mL/分，UV檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm。由30/70的甲醇/酸化水(v/v)在15分鐘內(nèi)變至70/30的甲醇/酸化水(v/v)的梯度洗脫。在70/30(v/v)保持5分鐘，然后至30/70(v/v)平衡5分鐘。這樣，分別在9.5分時(shí)分離收集順式-羥基砜，10分時(shí)分離收集反式-羥基砜，12.8分時(shí)分離收集砜-酮。
實(shí)施例1培養(yǎng)方法在篩分或振蕩燒瓶培養(yǎng)的過程中生成反式-羥基砜，深紅酵母ATCC74283細(xì)胞最初由Sabouraud葡萄糖(Difco)斜面培養(yǎng)液或后來(lái)由冷凍甘油懸浮液(1mL)接種到含50mL Sabouraud葡萄糖肉湯的250mLErlenmeyer燒瓶中。Sabouraud葡萄糖肉湯是可以買到的商品，由10g/LDifco新胨(neopeptone)和20g/L Bacto葡萄糖構(gòu)成。燒瓶在28℃培育24小時(shí)，同時(shí)在每分鐘220轉(zhuǎn)速度下攪動(dòng)，以便得到作用接種物必須的充分的生物量。將接種物轉(zhuǎn)移(5％/25mL)到含500mL Sabouraud葡萄糖肉湯的2升Erlenmeyer燒瓶中。然后將培養(yǎng)物在28℃培育42小時(shí)，同時(shí)在每分鐘180轉(zhuǎn)速下攪動(dòng)。細(xì)胞離心分離，用pH6.0的MES緩沖液洗滌，加砜-酮之前再懸浮到pH6.0的MES緩沖液中。
在23升的發(fā)酵罐中進(jìn)行生物反應(yīng)器的培養(yǎng)，發(fā)酵罐用含深紅酵母ATCC74283的Sabouraud葡萄糖肉湯的2升燒瓶接種并象前面描述的那樣培養(yǎng)42小時(shí)。發(fā)酵罐參數(shù)如下溫度28℃，攪拌速度每分鐘200轉(zhuǎn)(最低設(shè)定速度)，通入空氣的速度為10L/分，反壓力為0.6磅/平方英寸。通過攪拌，控制溶解的氧氣壓在40％的最小值。當(dāng)吸氧速度降到5mmoles/升/小時(shí)以下時(shí)，在無(wú)菌條件下收獲細(xì)胞。
反應(yīng)參數(shù)最佳生物轉(zhuǎn)化參數(shù)是這樣一些參數(shù)，其中使用3-〔N-嗎啉代〕丙磺酸(MOPS)或2-〔N-嗎啉代〕乙磺酸(MES)緩沖液(0.5M)，溫度為大約20℃至40℃，pH范圍為大約4.5至8.0，產(chǎn)生的生物轉(zhuǎn)化速率為大約0.011g/g CDW/小時(shí)至大約0.150g/g CDW/小時(shí)。溫度范圍為大約20℃至大約50℃，最好是大約30℃至大約35℃。為溶解砜-酮底物使用的溶劑為乙醇、甲醇或DMSO，最好是DMSO，用量分別為1％至15％v/v，最好是1％至3％。底物的量為大約1至3g/L，最好是1.5g/L，這樣反式-羥基砜的回收率可達(dá)66％，非對(duì)映異構(gòu)體過量可達(dá)95％；令細(xì)胞老化大約16小時(shí)至60小時(shí)，最好為大約40小時(shí)至60小時(shí)，對(duì)應(yīng)于氧的吸收速度降到低于5mmoles/L/小時(shí)。
反式-羥基砜II(5，6-二氫-4(S)-羥基-6(S)-丙基-4H-噻吩并-〔2，3-b〕噻喃，7，7-二氧化物)的生物轉(zhuǎn)化和分離含深紅酵母細(xì)胞的肉湯(10或50mL)用Beckman TJ-6離心機(jī)在每分鐘4000轉(zhuǎn)的速度下離心10分鐘后傾出上清液。沉積的小丸再懸浮到pH6.0的0.5M 2-〔N-嗎啉代〕乙磺酸(MES)緩沖溶液中再離心。洗滌過的細(xì)胞再懸浮到50mL MES緩沖溶液中。需要時(shí)將細(xì)胞稀釋，以便更好地分析生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)速率。將相當(dāng)于1g/L純砜-酮的粗砜-酮底物(純度為56％)的乙醇溶液(3％v/v)加到裝有洗滌過的細(xì)胞的燒瓶中。該燒瓶在32.5℃的水浴中培育并繼續(xù)振搖。用氯仿(按1∶1，v/v)或乙酸乙酯(按1∶1，v/v)萃取肉湯以便收獲產(chǎn)品，萃取液干燥，并再懸浮到甲醇中。同時(shí)用薄層色譜和高效液相色譜(HPLC)分析萃取液。反式-羥基砜、順式-羥基砜和砜酮的HPLC保留時(shí)間分別為9.5、10.0和12.8。反式-羥基砜的1HNMR(250MHz，CDCl3)如下δ7.58(d，J＝5.1Hz，1H)，7.08(d，J＝5.1Hz，1H)，4.94(t，J＝3.6Hz，1H)，3.66(m，1H)，2.6-2.1(m，3H)，1.7-1.5(m，3H)，1.01(t，J＝7.01，3H)。
使用生物反應(yīng)器培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，當(dāng)吸氧速度低于5mmoles/L/小時(shí)便可收獲細(xì)胞，離心分離和用pH6.0的0.5M MES緩沖液洗滌。將收獲的細(xì)胞再懸浮到pH6.0的0.5M MES緩沖液中，然后再放回到發(fā)酵罐中。為完成生物轉(zhuǎn)化，發(fā)酵罐的參數(shù)調(diào)至溫度32.5℃，攪拌速度為每分鐘400轉(zhuǎn)，通空氣的量為6L/分，反壓力為0.6磅/平方英寸。砜-酮(1.5g/L)溶于DMSO并加到發(fā)酵罐中(3％，v/v)。定時(shí)取樣以便用HPLC監(jiān)測(cè)生物轉(zhuǎn)化活性。收獲時(shí)應(yīng)達(dá)到1.14g/L/hr或0.126g/g CDW/hr的生物轉(zhuǎn)化速率，反式-羥基砜的終產(chǎn)率為1.04g/L-1，非對(duì)映異構(gòu)體過量值為96.4％。肉湯用乙酸乙酯(按0.5∶1，v/v)萃取，溶劑相用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。
實(shí)施例2反式-羥基砜(5，6-二氫-4(S)-羥基-6(S)-甲基-4H-噻吩并〔2，3b〕噻喃，7，7-二氧化物的生物轉(zhuǎn)化將4℃保存在Sabouraud葡萄糖瓊脂斜面上的接種ATCC74283細(xì)胞在含50ml Sabouraud葡萄糖肉湯的250ml Erlenmeyer燒瓶中培育。于28℃振搖下培育20小時(shí)后，將溶于乙醇中的砜-酮(33.3mg/ml)加到燒瓶中(每個(gè)燒瓶1ml)。將培養(yǎng)物調(diào)回原來(lái)的條件再培育24小時(shí)。使用1體積的氯仿萃取殘留的砜-酮和生成的羥基砜。TLC和HPLC分析指示砜-酮完全轉(zhuǎn)化為反式-羥基砜。用NMR分析證實(shí)反式-羥基砜的結(jié)構(gòu)δ7.6(d，1H，C2-H)，7.1(d，1H，C3-H)，4.9(m，1H，C4-H)，3.8(m，1H，C6-H)，3.5-3.0(br s，1H，OH)，2.6(m，1H，C5-H)，2.4(m，1H，C5-H)，1.5(d，3H，C6-CH3)。
實(shí)施例3通過實(shí)施例，制備通式I的化合物〔5，6-二氫-6-(S)-丙基-4(S)-1-乙氨基-4H-噻吩并〔2，3-b〕噻喃-2-磺酰氨-7，7-二氧化物〕表述如下步驟1方法在裝有電磁攪拌器、熱電偶探針和氮?dú)鈱?dǎo)管的100mL園底燒瓶中將反式-羥基砜(7.32g，29.7mmol)懸浮于乙腈(38mL)中。溶液冷至0℃，分次加入硫酸(5ml，88.7mmol)。然后反應(yīng)混合物室溫?cái)嚢?。化合物冷?-5℃。在500mL的燒瓶中裝有水(34mL)和乙腈(43mL)，然后將混合物冷至0-5℃，并充分?jǐn)嚢?。再將反?yīng)混合物小心地加入，使淬火溫度保持在5℃以下。加入飽和碳酸鉀溶液(30mL)直至水層pH在7-8之間或直至不再有二氧化碳逸出。有機(jī)層濃縮成粗油狀物(14.1g)，測(cè)定的含量為42.5％(重量)。產(chǎn)率為5.99g(73％)。
步驟2方法在裝有電磁攪拌和熱電偶探針的100mL園底燒瓶中裝入氯磺酸(13.14mL)并冷至0-5℃。用30分鐘將乙酰氨基砜(6.57g)滴加到燒瓶中，以便保持內(nèi)溫度在15℃以下。黑色的反應(yīng)混合物先在33℃加熱16小時(shí)，然后在50℃加熱5小時(shí)。當(dāng)HPLC表明存留的乙酰氨基砜(相當(dāng)于磺酸和磺酰氯)少于0.5％時(shí)，混合物冷至室溫。滴加亞硫酰氯(13.14mL)。加完后，黑色的混合物加熱至45℃。16小時(shí)后磺酸的峰面積小于0.5％?；旌衔锢渲?-5℃。在1升的燒瓶中裝水(325mL)。并冷至0℃。將氯化的反應(yīng)混合物滴加到充分?jǐn)嚢璧拇慊鹑芤褐?，滴加時(shí)間不得少于30分鐘，以便保持內(nèi)溫低于5℃。混合物攪拌45分鐘后過濾。濕濾餅用冷水(10mL)洗滌并在氮?dú)饬飨赂稍?。往裝有電磁攪拌和熱電偶探針的250mL燒瓶中裝濃氨水(24mL)和四氫呋喃(43mL)?；旌衔锢渲链蠹s-10℃。在內(nèi)溫低于0℃下往里分次加粗磺酰氯的濕固體，加樣時(shí)間超過1小時(shí)。2小時(shí)后存留的磺酰氯少于1.8％。用鹽酸水溶液(大約50mL)中和過量的氨。水層用四氫呋喃洗滌2次。合并四氫呋喃層并濃縮。殘留物再懸浮到四氫呋喃中，并小心地加水。形成的結(jié)晶為棕色，水溶液保持黃色。混合物過濾，結(jié)晶真空干燥。乙酰氨基磺酰氨的產(chǎn)量為5.58g(66％)。
步驟3方法在250mL燒瓶中乙酰氨基磺酰氨(4.21g，11.5mmol)用四氫呋喃(2×100mL)蒸餾進(jìn)行干燥。燒瓶裝有電磁攪拌，熱電偶探針和氮?dú)鈱?dǎo)管。乙酰氨基磺酰氨與22.5mL四氫呋喃的懸浮液然后冷至0-5℃。往里滴加甲硼烷-四氫呋喃(51mL，51mmol)，內(nèi)溫保持在5℃以下，滴加時(shí)間45分鐘。氫氣完全逸出后(20分鐘)，溶液升溫至30-35℃。反應(yīng)完全后(3小時(shí))，混合物冷至室溫。在裝有電磁攪拌、熱電偶探針和氮?dú)鈱?dǎo)管的250mL園底燒瓶中裝硫酸(60mL)并冷至0-5℃。反應(yīng)混合物小心地計(jì)量并加到充分?jǐn)嚢璧乃崛芤褐?，?nèi)溫保持在20℃以下。加完之后混合物在室溫?cái)嚢柚敝翚錃忉尫磐辍Ｈ缓髮垦b好，在1大氣壓下蒸餾使混合物濃縮至蒸餾的內(nèi)溫高于97℃。蒸餾完畢后，混合物冷至20℃?；旌衔镉锰妓釟溻浰芤褐泻筒⒂靡宜嵋阴?100ml)萃取。有機(jī)層濃縮得3.45g 5，6-二氫-6-(S)-丙基-4(S)-1-乙氨基-4H-噻吩并〔2，3-b〕噻喃-2-磺酰氨7，7-二氧化物。
權(quán)利要求
1.制備通式II化合物的方法；
其中A為碳或氮，R1為a)C1-5的直鏈或支鏈烷基，尤其是正丙基或異丁基；b)C3-5烯基，尤其是烯丙基；c)C3-5炔基，尤其是炔丙基；d)氫；或e)C1-4烷氧基-C1-4烷基，它們是通式I的化合物，各非對(duì)映異構(gòu)體，各對(duì)映異構(gòu)體或它們的混合物，或眼科可以接受的它們的鹽的前體，
其中A為碳或氮；Z為NHR或-OR；R為C1-6直鏈或支鏈烷基；R1為a)C1-5直鏈或支鏈烷基，尤其是正丙基或異丁基；b)C3-5烯基，尤其是烯丙基；c)C3-5炔基，尤其是炔丙基；d)氫；或e)C1-4烷氧基-C1-4烷基；以及X為-SO2-或-C(O)-；該方法包括的步驟有，在含可吸收性氮源，碳源及底物化合物III的營(yíng)養(yǎng)性介質(zhì)中在需氧條件下培養(yǎng)微生物深紅酵母Rhodotorula rubra，ATCC74283；或piliminae酵母ATCC32762直至顯著量的化合物II生成，并分離生成的化合物，
其中R2為a)C1-5直鏈或支鏈烷基，尤其是正丙基或異丁基；b)C3-5烯基，尤其是烯丙基；c)C3-5炔基，尤其是炔丙基；d)氫；或e)C1-4烷氧基-C1-4烷基
2.權(quán)利要求1的方法，其中微生物為深紅酵母ATCC74283，底物溶于大約1％-15％(v/v)的乙醇、甲醇或DMSO，底物的量為大約1g/L至3g/L。
3.權(quán)利要求2的方法，其中底物溶于大約1％至3％(v/v)的DMSO，底物的量大約為1g/L至大約3g/L。
4.權(quán)利要求1的方法，其中溫度為大約20至50℃，pH為大約4.5至8.0。
5.權(quán)利要求1的方法，其中溫度為大約30℃至大約35℃，pH為大約5.5至大約6.5。
6.制備通式II的化合物的方法。
其中A為碳或氮，R1為a)C1-5直鏈或支鏈烷基，尤其是正丙基或異丁基；b)C3-5烯基，尤其是烯丙基；c)C3-5炔基，尤其是炔丙基；d)氫；或e)C1-4烷氧基-C1-4烷基它們是通式I的化合物，各非對(duì)映異構(gòu)體，各對(duì)映異構(gòu)體或它們的混合物，或眼科可以接受的它們的鹽的前體，
在通式I中A為碳或氮；Z為NHR或-OR；R為C1-6直鏈或支鏈烷基；R1為a)C1-5直鏈或支鏈烷基，尤其是正丙基或異丁基；b)C3-5烯基，尤其是烯丙基；c)C3-5炔基，尤其是炔丙基；d)氫；或e)C1-4烷氧基-C1-4烷基；以及X為-SO2-或-C(O)-；該方法包括在含可吸收性氮源、碳源及底物化合物III的營(yíng)養(yǎng)性介質(zhì)中培養(yǎng)微生物深紅酵母ATCC74283，
在通式III中，R2為a)C1-5直鏈或支鏈烷基，尤其是正丙基或異丁基；b)C3-5烯基，尤其是烯丙基；c)C3-5炔基，尤其是炔丙基；d)氫；或e)C1-4烷氧基-C1-4烷基，培養(yǎng)在需氧條件下進(jìn)行，直至生成顯著量的化合物II，分離生成的化合物II，培養(yǎng)時(shí)使底物溶在體積百分大約1％至15％乙醇、甲醇或DMSO中，底物的含量為大約1g/L至3g/L，培養(yǎng)溫度為大約20℃至50℃，pH為大約4.5至8.0。
7.權(quán)利要求6的方法，其中底物溶解在大約1％至大約3％(v/v)的DMSO中，底物的量為大約1g/L至3g/L，溫度為大約30℃至大約35℃，pH為大約5.5至大約6.5。
全文摘要
本發(fā)明公開了合成反式-羥基砜中間體的新的微生物轉(zhuǎn)化方法，上述中間體是局部碳酸酐酶抑制劑(TCAI)的前體。TCAI對(duì)治療青光眼和眼高壓癥有效。該生物轉(zhuǎn)化方法是在微生物深紅酵母或piliminae紅酵母存在下進(jìn)行的，并且生成顯示出非對(duì)映異構(gòu)體過量值大于95％的反式-羥基砜。
文檔編號(hào)C12P17/18GK1162980SQ95196145
公開日1997年10月22日 申請(qǐng)日期1995年9月8日 優(yōu)先權(quán)日1994年9月13日
發(fā)明者M·M·沙特朗, L·凱茲, S·A·金 申請(qǐng)人:麥克公司