專利名稱：固定化復合外肽酶蛋白質(zhì)全水解及脫苦方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)酶工程領(lǐng)域，涉及可用于食品、保健品及藥品制造的一種采用固定化復合外肽酶完全水解蛋白質(zhì)、或進一步降解部分水解物并脫除其水解苦味的方法。
現(xiàn)有技術(shù)氨基酸及蛋白質(zhì)水解物是廣泛用于食品、保健品、制藥及其它輕化工工業(yè)的重要產(chǎn)品，氨基酸可用發(fā)酵法和蛋白質(zhì)完全水解法來生產(chǎn)。發(fā)酵法是能單獨生產(chǎn)一種或幾種氨基酸，不適于以營養(yǎng)為目的的多種氨基酸混合物的制造。蛋白質(zhì)完全水解是生產(chǎn)多種氨基酸混合物的一種有效方法。目前蛋白質(zhì)完全水解主要是采用酸法或堿法，即高溫、高壓條件下，用酸或堿催化蛋白質(zhì)水解，產(chǎn)生游離氨基酸混合物。酸堿法的效率較高，但采用酸作為催化劑時，在水解過程中有幾種氨基酸被破壞掉，不能得到蛋白質(zhì)的完全水解物。采用堿作為催化劑，在水解過程中也同樣有部分氨基酸被壞掉，而且還會發(fā)生消旋化，大量氨基酸喪失其生物活性。不可能得到真正的蛋白質(zhì)的完全水解物，當然也不是理想的蛋白質(zhì)完全水解方法。
Hill，R.L.andSchmidt，W.R.，J.Biol，Chem.237，389-395(1961)報導過用木瓜蛋白酶，并結(jié)合使用羧肽酶、亮氨酸氨肽酶及二肽酶等對蛋白質(zhì)進行完全水解的方法。得到的氨基酸混合液的組成與理論值基本相同。但在這個方法中羧肽酶和氨肽酶都是以游離態(tài)形式參加反應酶無法回收，不能重復使用，成本較高，難于工業(yè)化應用。
蛋白質(zhì)部分水解物在食品和制藥工業(yè)中有著重要的用途，采用酶法水解制備的多肽產(chǎn)物往往有特征性苦味而限制了它的用途。Vmetsu，H.etal.J.Agric.FoodChem.31，50-56(1983)Minagama，H..J.FoodSci.54.1225-1229(1989)分別報到了采用羧肽酶和氨肽酶進一步降解具有苦味的多肽，以便脫除蛋白質(zhì)水解物苦味的方法。
Thibault，P.A.andMomsan，P.F.FR2625651(1988)公開了一種利用酵母細胞壁上的羧肽酶與苦味肽反應消除苦味的方法。這些方法均是利用外肽酶進一步降解含有苦味的多肽，破壞苦味多肽結(jié)構(gòu)以消除蛋白質(zhì)水解物的苦味。但是外肽酶，包括羧肽酶和氨肽酶的來源十分有限，價格較高，雖然有效，也無法投入工業(yè)化應用。另外由于單種外肽酶專一性的限制，完全水解和水解產(chǎn)物的脫苦效果往往也不十分理想。
發(fā)明目的本發(fā)明利用固定化復合外肽酶(包括羧肽酶和氨肽酶)水解蛋白質(zhì)，或進一步降解蛋白質(zhì)部分水解物，制造蛋白質(zhì)完全水解物并脫去其苦味。本發(fā)明的目的是利用復合外肽酶之間的協(xié)同作用，更有效地進行蛋白質(zhì)完全水解并脫去其苦味。由于采用固定化酶技術(shù)，降低了使用成本，本技術(shù)可望用于工業(yè)化目的。
本發(fā)明包括如下內(nèi)容及方案先制備一種復合外肽酶，包括羧肽酶和氨肽酶。方法可采用先提取出單個外肽酶，后按一定比例混合起來;也可直接從動物、植物及微生物材料中提取多種外肽酶的復合物。在把上述外肽酶復合物固定化在一種載體上，制成固定化復合外肽酶。可用于固定化的載體有瓊脂糖凝膠、活性炭、硅膠、多孔玻璃、離子交換纖維素、離子交換樹脂及其它天然大分子材料?？捎糜诠潭ɑ姆椒ㄓ形椒?、偶聯(lián)法和交聯(lián)法。
然后再用固定化復合外肽酶水解蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)部分水解物，結(jié)合使用內(nèi)肽酶、或固定化內(nèi)肽酶和二肽酶，可從多肽端釋放出游離氨基酸。分離游離氨基酸，并循環(huán)用固定化復合外肽酶處理，就可完全水解蛋白質(zhì)。
用固定化復合外肽酶處理有苦味的蛋白質(zhì)水解物，可脫除蛋白質(zhì)水解物的苦味。固定化復合外肽酶反應可采用攪拌反應器，也可采用柱床反應器。
本發(fā)明的主要優(yōu)點及效果(1)采用復合外肽酶，由于外肽酶之間及其與內(nèi)肽酶之間的協(xié)同作用，蛋白質(zhì)全水解效率較高。
(2)由于采用復合外肽酶，可直接利用天然復合外肽酶源，酶的制備方法簡單，酶的成本降低。
(3)采用固定化酶技術(shù)，酶可重復利用，操作成本明顯降低，酶法完全水解蛋白質(zhì)的工業(yè)化成為可能。
(4)固定化復合外肽酶用于蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的脫苦，效果十分理想，這將擴大蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物在食品及制藥工業(yè)中的用途。
實施例1新鮮牛或豬胰臟1Kg，加水4-10升，搗碎后在10-25℃下讓其自溶8-24小時。自溶胰汁在3000-10000轉(zhuǎn)/分下離心15-45分鐘。收集上清液，過濾。濾液加硫酸銨至25-70%飽和度，收集沉淀。將沉淀溶于水，透析脫鹽后得復合外肽酶溶液。
蝦殼幾丁質(zhì)50-100g，加30-50%NaOH溶液200-600毫升，在30-70℃下脫乙?；瞥?0-80%脫乙酰幾丁質(zhì)。再向上述脫乙酰幾丁質(zhì)中加入0.5-2%甲醛溶液，調(diào)節(jié)pH值至4-8，0-4℃下反應8-24小時。洗滌除去未反應的甲醛，加入100-300毫升，0.5-2%復合外肽酶溶液，0-4℃下讓其反應8-24小時。然后除去未反應的復合外肽酶，制得固定化復合外肽酶。
配制酪蛋白溶液(1-10%)，調(diào)節(jié)pH值至6-8.5。用內(nèi)肽酶(胰蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、無花果蛋白酶、米曲霉蛋白酶或枯草桿菌蛋白酶)或固定化內(nèi)肽酶部分水解酪蛋白，制成酪蛋白部分水解物。也可以用上述內(nèi)肽酶的混合物或固定化內(nèi)肽酶混合物水解酪蛋白制備酪蛋白部分水解物。
用上述固定化復合外肽酶，在柱反應器或攪拌式反應器中進一步水解上述酪蛋白部分水解物。反應條件為pH5-8，溫度30℃-60℃。可制得無苦味酪蛋白水解物，再用離子交換劑分離除去未完全水解的肽，制備出酪蛋白全水解物。
在上述無苦味酪蛋白水解物或酪蛋白全水解物基礎上添加糖，無機鹽和維生素配成保健品，食品或藥品。
實施例2新鮮豬或牛腎臟200g，加入1000毫升水搗碎后，在0-4℃下過濾，濾液加硫酸銨，收集30-80%飽和度之間所得的沉淀。所得沉淀溶于水，透析脫鹽，得復合外肽酶溶液。
其余與實施例1相同。
實施例3把羧肽酶A、羧肽酶B、羧肽酶Y和亮氨酸氨肽酶按1∶0.5-1∶0.1-0.4∶0.4-0.8比例混合，再配成復合外肽酶溶液(0.5-2%)。
其余與實施例1相同。
實施例4復合外肽酶溶液制備方法與實施例1、2、3相同。
部分脫乙酰幾丁質(zhì)制備方法同實施例1。50-100g部分脫乙酰幾丁質(zhì)，加入100-300毫升復合外肽酶溶液(0.5-2%)，調(diào)節(jié)pH值至6-8，在0-4℃下放置8-24小時，再加入戎二醛至最后濃度為0.5-2%，在0-4℃下反應8-24小時，洗滌除去未反應的酶及戎二醛，制得固定化復合外肽酶。
其余與實施例1相同。
實施例5用幾丁質(zhì)代替部分脫乙酰幾丁質(zhì)，不脫除幾丁質(zhì)上的乙酰基，直接用實施例1或?qū)嵤├?的方法進行復合外肽酶的固定化，制備固定化復合外肽酶。
其余與實施例1相同。
實施例6
直接用完全脫除乙?；蟮膸锥≠|(zhì)，即甲殼素進行復合外肽酶的固定化。固定化方法與實施例1或?qū)嵤├?所述方法相同，制備固定化復合外肽酶。
其余與實施例1相同。
實施例7用蟹殼幾丁質(zhì)代替蝦殼幾丁質(zhì)，余皆與實施例6相同。
實施例8用大豆蛋白代替酪蛋白，其余與實施例1相同。
權(quán)利要求
1.一種涉及可用于食品、保健品及藥品制造的無苦味酪蛋白水解物及酪蛋白全水解物的制造方法，其特征在于所述方法包括1)新鮮?；蜇i胰臟和水混合，二者的重量比為1∶(4-10)，搗碎后在10-25℃下自溶，8-24小時；這種自溶汁以3000-10000轉(zhuǎn)/分下離心15-45分鐘，上清液經(jīng)過濾后加硫酸銨至25-70%飽和度，收集沉淀，沉淀溶于水后透析脫鹽，制得復合外肽酶溶液；2)蝦殼幾丁質(zhì)在30-50%NaOH溶液中，30-70℃條件下制成20-80%脫乙酰幾丁質(zhì)。然后用0.5-2%甲醛溶液，在pH值4-8，0-4℃下處理8-24小時，洗滌除去殘存甲醛，再加入上述復合外肽酶溶液(50-100幾丁質(zhì)，100-300毫升，0.5-2%復合外肽酶溶液)，0-4℃下反應8-24小時，除去未反應的酶溶液，即制得固定化復合外肽酶；3)用內(nèi)肽酶或其混合物或固定化內(nèi)肽酶或固定化內(nèi)肽酶的混合物、水解酪蛋白，制備酪蛋白部分水解物；4)用上述固定化復合外肽酶在柱反應器或攪拌式反應器中進一步水解上述3)中的酪蛋白部分水解物，反應條件為pH5-8，溫度30℃-60℃，制備無苦味的酪蛋白水解物，再用離子交換劑分離除去未完全水解的肽，制備出酪蛋白全水解物；5)在無苦味酪蛋白水解或酪蛋白全水解物基礎上添加糖、無機鹽和維生素配成保健品、食品或藥品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1 1)所述的制得復合物外肽酶溶液，其特征在于也可用新鮮牛(或豬)的腎臟制備復合外肽酶代替胰臟制備復合外肽酶，腎臟和水的重量比為(0.2-0.3)∶(0.9-1.1)混合搗碎后在0-4℃下過濾，濾液加硫酸銨，收集40-60%飽和度之間所得的沉淀。所得沉淀溶于水，透析后得到復合外肽酶溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1 1)中所述的制得復合外肽酶溶液，其特征在于也可用羧肽酶A、羧肽酶B、羧肽酶Y和亮氨酸氨肽酶它們的比例按1∶(0.5-1)∶(0.1-0.4)∶(0.4-0.8)的重量比混合，然后再配成0.5-2%的復合外肽酶溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1 1)、2)、3)中所述的固定化復合外肽酶的方法，其特征在于也可用以下方法制得固定化復合外肽酶部分脫乙酰幾丁質(zhì)50-100g和含量為0.5-2%的復合外肽酶溶液100-300毫升混合，調(diào)節(jié)pH值至6-8，在0-4℃下放置8-24小時，然后加入戎二醛使上述混合液中戎二醛濃度為0.5-2%，在0-4℃下反應8-24小時，洗滌除去未反應的戎二醛及酶，即可得到固定化復合外肽酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1 3)中所述的酪蛋白，也可以采用大豆蛋白質(zhì)或其他蛋白質(zhì)制備蛋白質(zhì)部分水解物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、4所述的制備固定化復合外肽酶的方法，其特征在于可以用蝦殼幾丁質(zhì)代替部分脫乙酰幾丁質(zhì)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1、4所述的制備固定化復合外肽酶的方法，其特征在于可以直接用完全脫除乙?；蟮膸锥≠|(zhì)，即甲殼素進行復合外肽酶的固定化用以制備固定化復合外肽酶。
8.根據(jù)權(quán)利要求1、4所述，其特征在于還可以用蟹殼幾丁質(zhì)代替蝦殼幾丁質(zhì)。
全文摘要
一種蛋白質(zhì)完全水解物或無苦味蛋白質(zhì)水解物的制造方法。采用包括羧肽酶和氨肽酶在內(nèi)的多種外肽酶混合物或直接從胰臟或腎臟中提取的復合外肽酶，制成固定化復合肽酶，并與其它內(nèi)肽酶或固定化內(nèi)肽酶結(jié)合，將其用于蛋白質(zhì)的完全水解，或用來脫除蛋白質(zhì)水解物的苦味，可制得蛋白質(zhì)完全水解物或無苦味蛋白質(zhì)水解物。本方法簡單、操作方便、效率較高、可用于包含蛋白質(zhì)完全水解物或無苦味蛋白質(zhì)水解的食品，保健品及藥品的制造。
文檔編號A23J3/10GK1078495SQ9310378
公開日1993年11月17日 申請日期1993年4月23日 優(yōu)先權(quán)日1993年4月23日
發(fā)明者葛世軍, 張龍翔 申請人:北京大學