專利名稱：制備與篩選改變特異性蛋白酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制備并篩選在特定底物序列斷裂靶蛋白的蛋白酶的方法。蛋白酶是識別靶蛋白內(nèi)氨基酸或者氨基酸底物序列的蛋白降解酶。基于識別底物序列，蛋白酶催化了靶蛋白內(nèi)肽鍵的水解或者斷裂?；陔逆I在靶蛋白全長序列范圍內(nèi)的位置，這種靶蛋白的水解可以使其鈍化。通過蛋白質(zhì)工程可以改變蛋白酶的特異性。如果蛋白酶設(shè)計成識別靶蛋白內(nèi)底物序列或者(1)改變功能的蛋白，即通過基于催化肽鍵水解使靶蛋白鈍化，并且(2)認(rèn)定或者并未認(rèn)定，靶蛋白是特殊疾病或者多種疾病的分子介入點，那么工程蛋白酶具有通過蛋白水解-介導(dǎo)的治療效果。特別是，蛋白酶可以設(shè)計成斷裂跨膜與細(xì)胞因子結(jié)合區(qū)域之間的受體。因此，起到將蛋白受體栓在細(xì)胞表面或者環(huán)區(qū)域的莖狀區(qū)域從多肽鏈的球狀結(jié)構(gòu)功能區(qū)分開。
在一具體實施方式
中，需要斷裂的靶蛋白涉及病癥，并且在特定底物序列斷裂靶蛋白可以用于治療上述病癥。
在一具體實施方式
中，蛋白酶斷裂了涉及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的蛋白。例如，蛋白酶斷裂了在跨膜功能區(qū)域與細(xì)胞因子結(jié)合功能區(qū)域之間的腫瘤壞死因子受體。這種斷裂可以鈍化上述受體。因此，通過抑制腫瘤壞死因子(TNF)的作用可以治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
蛋白酶斷裂了與活化蛋白C相同的靶蛋白。這種斷裂可以減弱凝血級聯(lián)。因此，通過補充蛋白C的作用可以治療敗血癥。
蛋白酶斷裂了造成致腫瘤性的細(xì)胞表面分子，防止了癌癥的擴(kuò)散。例如，斷裂細(xì)胞表面分子可以鈍化其傳遞胞外信號的能力，特別是細(xì)胞增生信號。沒有這些信號，癌癥細(xì)胞通常不能增殖。因此，本發(fā)明蛋白酶可以用于治療癌癥。在此具體實施方式
的另一方面，蛋白酶可以斷裂造成癌癥擴(kuò)散的任何目標(biāo)蛋白。斷裂涉及細(xì)胞循環(huán)進(jìn)程的靶細(xì)胞，可以鈍化靶細(xì)胞允許細(xì)胞循環(huán)進(jìn)行的能力。在沒有細(xì)胞循環(huán)進(jìn)程的情況下，癌細(xì)胞就不能增殖。因此，本發(fā)明蛋白酶可以用于治療癌癥。
在本發(fā)明的另一具體實施方式
中，蛋白酶斷裂了由人類免疫缺陷病毒(HIV)、呼吸道合胞體病毒(RSV)、或者流行性感冒發(fā)現(xiàn)的膜融合蛋白，抑制了這些病毒感染細(xì)胞的能力。在沒有上述膜蛋白的情況下，這些病毒不能夠感染細(xì)胞。因此，蛋白酶可以用于治療或者預(yù)防HIV、RSV或者流行性感冒的感染。
在本發(fā)明的另一具體實施方式
中，蛋白酶斷裂了涉及炎癥的細(xì)胞因子或者受體，用于治療哮喘或者與炎癥有關(guān)的其它病癥。通過斷裂細(xì)胞因子或者受體，蛋白酶可以鈍化涉及許多炎癥過程的信號級聯(lián)。因此，本發(fā)明蛋白酶可以用于治療炎癥和相關(guān)病癥。
在本發(fā)明的另一具體實施方式
中，蛋白酶斷裂了涉及多種信號級聯(lián)的信號分子，包括負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)編程性細(xì)胞死亡的信號級聯(lián)。例如，蛋白酶斷裂了半胱天凍酶。例如，半胱天冬酶可以是半胱天冬酶-3。通過斷裂涉及信號級聯(lián)的蛋白，蛋白酶可以用于鈍化或者調(diào)節(jié)信號級聯(lián)。
在一些實施例中，工程蛋白酶可以設(shè)計成斷裂表1中的任何靶蛋白，由此鈍化此蛋白的活性。通過斷裂一種靶蛋白，蛋白酶可以用于治療與此蛋白有關(guān)的病癥。
表1 蛋白酶支架也是表2所列任何一種蛋白。
表2 工程蛋白酶 事實上蛋白酶的每個方面都可以重新設(shè)計，包括酶底物序列特異性、熱穩(wěn)定性、pH輪廓、催化效率、氧化穩(wěn)定性、和催化功能。
現(xiàn)有的蛋白酶可以用做支架，其中含有改變其底物特異性的各種變異。支架主要含有下述任一種微粒的氨基酸序列胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、凝血因子、纖維蛋白溶酶、凝血因子Xa、尿激酶型纖維蛋白酶原激活劑、組織纖維蛋白溶酶原激活劑、粒酶B、彈性蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、膜型絲氨酸蛋白酶-1(MTSP-1)、糜蛋白酶、中性白細(xì)胞彈性蛋白酶、血漿激肽釋放酶、粒酶M、補體因子絲氨酸蛋白酶、ADAMTS13、神經(jīng)肽鏈內(nèi)切酶/neprilysin、弗林蛋白酶或者其組合。優(yōu)選的支架包括粒酶B、MTSP-1、糜蛋白酶、中性白細(xì)胞彈性蛋白酶、粒酶A、血漿激肽釋放酶、尿激酶型纖維蛋白酶原激活劑、粒酶M、胰凝乳蛋白酶、凝血因子、補體因子絲氨酸蛋白酶、ADAMTS13、神經(jīng)肽鏈內(nèi)切酶/neprilysin、弗林蛋白酶和纖維蛋白溶酶。絲氨酸蛋白酶底物序列特異性的決定因子來自活性位點的S1-S4位置，在此位置蛋白酶與肽底物序列的P1-P4殘基相接觸。在一些情況下，活性位點S1-S4袋之間很少相互作用(若有的話)，由此每個袋看來似乎獨立于其它袋以外識別并結(jié)合肽底物序列的對應(yīng)殘基。因此，在未影響其它袋特異性的情況下，通?？梢愿淖円粋€袋的特異性決定因子。
例如，通過在底物序列結(jié)合袋產(chǎn)生點變異，可以改變在特定結(jié)合位點對于殘基或者特殊序列具有低特異性蛋白酶的特異性。在一些情況下，與野生型相比對于特殊序列所得的變異體位點的特異性增長了大于10倍。在另一具體實施方式
中，與野生型相比對于特殊序列所得的變異體位點的特異性增長了大于100倍。在另一具體實施方式
中，與野生型相比對于特殊序列所得的變異體位點的特異性增長了大于1000倍。
本發(fā)明還設(shè)計，使用本領(lǐng)域公知方法并參照下文詳細(xì)描述，制備并篩選了帶有各種變異的支架庫。篩選支架庫，從而確定成員底物序列的特異性。通過將成員暴露于底物肽序列，可以測定支架庫的特異性。鑒別出斷裂底物序列、帶有變異的成員?？梢詷?gòu)建帶有足夠多樣變異的支架庫，以致庫成員能夠斷裂任何底物肽序列。因此，可以制備特異于任何靶蛋白的蛋白酶。
過程 1.選擇支架 在本發(fā)明的另一具體實施方式
中，按照下述要求選擇支架蛋白酶(1)蛋白酶是人類或者哺乳動物蛋白酶公知的序列；(2)蛋白酶可以通過當(dāng)前分子生物技術(shù)操作；(3)蛋白酶可以在適當(dāng)宿主內(nèi)以相對高濃度異種表達(dá)；(4)蛋白酶在足以篩選的濃度下可以被提純成化學(xué)穩(wěn)定型。在本發(fā)明的另一具體實施方式
，變異的支架蛋白酶斷裂了細(xì)胞外出現(xiàn)的蛋白。例如，這樣的胞外蛋白是受體、信號蛋白、或者細(xì)胞因子。基于變異，殘基影響了上述兩種支架蛋白酶族的活性和特異性。優(yōu)選的是，可以獲得蛋白酶的三維結(jié)構(gòu)信息。而且，優(yōu)選的是，具有蛋白酶初始底物特異性的知識。優(yōu)選的是，蛋白酶在生命體外具有活性與穩(wěn)定性，并且可以獲得蛋白酶大分子調(diào)節(jié)劑的知識。而且，優(yōu)選的蛋白酶是斷裂與造成病癥相關(guān)靶的蛋白酶，例如鈍化病癥蛋白效應(yīng)物。
絲氨酸蛋白酶 在本發(fā)明的另一具體實施方式
中，根據(jù)基于結(jié)構(gòu)的設(shè)計方案制備出改變特異性的絲氨酸蛋白酶。每種蛋白酶具有排列在活性位點袋的一系列氨基酸，并且與底物直接接觸。在整個胰凝乳蛋白酶族中，底物與酶的主鏈相互作用是完全保守的，但是側(cè)鏈的相互作用相對多樣化。對于構(gòu)成活性位點S1-S4袋氨基酸的識別決定了此特殊袋的底物特異性。將絲氨酸蛋白酶的氨基酸與相同折疊中另一個氨基酸結(jié)合，就改變了相互之間的特異性。例如，對應(yīng)小型氨基酸的S2袋中位置99的變異就給予了P2底物位置大型疏水殘基的優(yōu)先權(quán)。采用此選擇性變異的方法，然后再通過底物庫的篩選，可以設(shè)計出對于涉及各種疾病的蛋白具有新型底物特異性的蛋白酶。
絲氨酸蛋白酶是與胰凝乳蛋白酶相同族的成員，因此絲氨酸蛋白酶具有與其相同的序列與結(jié)構(gòu)。活性位點殘基是天冬氨酸102，組氨酸57，絲氨酸195。線型氨基酸序列可以與胰凝乳蛋白酶共同排列，并且根據(jù)胰凝乳蛋白酶的β折疊編碼。插入與刪除出現(xiàn)在β折疊之間的環(huán)上，但是在整個結(jié)構(gòu)系中核心片層是保守的。絲氨酸蛋白酶以保守的β折疊方式與底物相互作用。在底物與酶之間出現(xiàn)了數(shù)目達(dá)到6個的保守氫鍵。
半胱氨酸蛋白酶 木瓜蛋白酶類半胱氨酸蛋白酶是與木瓜蛋白酶結(jié)構(gòu)相似、基于硫醇的肽鍵內(nèi)切酶族。它們形成了帶有R和L標(biāo)記(對于左右區(qū)域)的雙區(qū)域結(jié)構(gòu)蛋白，兩區(qū)域結(jié)構(gòu)組成的環(huán)構(gòu)成了底物識別裂隙。木瓜蛋白酶類半胱氨酸蛋白酶具有由氨基酸Cys25、His 159和Asn175構(gòu)成的催化三合體。與絲氨酸蛋白酶(基于底物β折疊構(gòu)象識別并蛋白分解靶蛋白)不同，此族蛋白酶不具有用于底物識別、定義明確的袋。主要的底物識別發(fā)生在P2氨基酸(與絲氨酸蛋白酶P1殘基相比)。
S2袋是最具選擇性的，并以蛋白酶底物識別位點為最佳特征。根據(jù)下述空間位置(木瓜蛋白酶編號)定義S2袋66、67、68、133、157、160和205。位置205起到了與絲氨酸蛋白酶位置189相同的作用，是在確定特異性的袋底部隱藏的殘基。
使用完全多樣化位置掃描合成組合庫(PS-SCL)，描繪許多半胱氨酸蛋白酶(人類組織蛋白酶L、V、K、S、F、B，木瓜蛋白酶和克魯?shù)鞍酌?的底物特異性。完全組合庫由P1、P2、P3和P4四肽底物構(gòu)成，其中一個位置氨基酸種類固定后，另外三個位置從20種可能的氨基酸等摩爾混合物中隨機(jī)選取，總共給出了大約160,000個四肽序列的多樣性。
總的來說，在組織蛋白酶之間P1特異性幾乎是相同的，當(dāng)耐受小型脂肪族氨基酸時，優(yōu)選的是精氨酸和賴氨酸。許多選擇性出現(xiàn)在P2位置，但是人類組織蛋白酶嚴(yán)格選擇疏水性氨基酸。有趣的是，對應(yīng)疏水性殘基的P2特異性被分為了芳香氨基酸類，例如Phe、Tyr和Trp(組織蛋白酶L、V)，以及大體積的脂肪族氨基酸，例如Val或者Leu(組織蛋白酶K、S、F)。與P2位置相比，P3位置的選擇性明顯缺少嚴(yán)格性。然而，一些蛋白酶對于脯氨酸(組織蛋白酶V、S和木瓜蛋白酶)、亮氨酸(組織蛋白酶B)、或者精氨酸(組織蛋白酶S、克魯?shù)鞍酌?表現(xiàn)出了明顯的優(yōu)先選擇。此蛋白酶在P4位置上表現(xiàn)出廣泛的選擇性，而且沒有一個氨基酸可以基于其它氨基酸被選中。
底物識別評價 為了生成帶有改變底物識別評價的變異體蛋白酶，對底物選擇性(特異性決定因子)起作用的三維結(jié)構(gòu)中的氨基酸作為誘發(fā)突變的靶。對于絲氨酸蛋白酶，族成員的許多結(jié)構(gòu)已經(jīng)定義了對擴(kuò)展底物特異性起作用的表面殘基(Wang等人，《生物化學(xué)》2001年8月28日；第40(34)期第10038-10046頁；Hopfner等人，《結(jié)構(gòu)折疊描述》1999年8月15日；第7(8)期第989-996頁；Friedrich等人，期刊《生物化學(xué)》2002年1月18日，第277(3)期第2160-2168頁；Waugh等人，《天然結(jié)構(gòu)生物學(xué)》2000年9月，第7(9)期第762-765頁)。各種蛋白酶的結(jié)構(gòu)決定因子匯集在表3中，還羅列了已確定公知擴(kuò)展特異性族成員的氨基酸子集。對于絲氨酸蛋白酶，第一序列中的下列氨基酸是特異性的決定因子195、102、57(催化三合體)；189、190、191、192和226(P1)；57、58和64之間的環(huán)、和99(P2)；192、217、218(P3)、半光氨酸168和半光氨酸180之間的環(huán)、215和97-100(P4)。
表3.各種絲氨酸和半胱氨酸蛋白酶的結(jié)構(gòu)決定因子及其對應(yīng)的底物特異性 粒酶B是胰凝乳蛋白酶折疊絲氨酸蛋白酶族成員，具有與粒酶族其它成員大于50％的同一性；粒酶族包括粒酶C-G、組織蛋白酶G、鼠肥大細(xì)胞蛋白酶II。粒酶B是由短α-螺旋連接兩個六鏈反向平行β桶狀結(jié)構(gòu)區(qū)域的多層結(jié)構(gòu)。其催化三合體是由Asp102、His57和Ser195構(gòu)成。根據(jù)與α胰凝乳蛋白酶比較的增加或者刪除，編號表面環(huán)；表面環(huán)代表了此結(jié)構(gòu)族最易變的區(qū)域。通過鼠粒酶B與ecotin[IEPD]、底物類結(jié)合環(huán)的大分子抑制因子復(fù)合的三維結(jié)構(gòu)確定特異性的決定因子(Waugh等人，《天然結(jié)構(gòu)生物學(xué)》)。這些特異性結(jié)構(gòu)決定因子包括Ile99、Arg192、Asn218、Tyr215、Tyr174、Leu172、Arg226和Tyr151，按照胰凝乳蛋白酶編號。有趣的是，絲氨酸酶粒族的其它成員僅僅共享粒酶B這些氨基酸中的兩個氨基酸。它們是Tyr215和Leu172，在整個結(jié)構(gòu)族中變化非常小的兩個殘基。這說明，當(dāng)粒酶序列同一性很高時，其底物特異性的差別就很大。
為了測定氨基酸對擴(kuò)展特異性的作用，將Ile99、Arg192、Asn218和Tyr174變異成氨基酸丙氨酸。經(jīng)確定，Ile99對P2特異性起作用，Asn218和Arg192對P3特異性起作用，Tyr174對P4特異性起作用。采用組合底物庫評價每個修飾的蛋白酶，從而確定變異對擴(kuò)展特異性的作用。由于蛋白酶P1特異性代表了其主要特異性，因此修飾并沒有破壞粒酶B對P1天門冬氨酸的唯一特異性，但是調(diào)節(jié)了擴(kuò)展P2到P4位點的特異性。
對于P3和P4亞位點，在Tyr174、Arg192和Asn218上的變異并沒有顯著影響其特異性(參見下文表4)。Y174A增加了在P4位置趨向Leu的活性，但是剩余的氨基酸具有很差的可選擇性。R192A和N218A都擴(kuò)展了P3的特異性。除了對谷氨酸的強(qiáng)優(yōu)先選擇外，變異中相似優(yōu)選的是Ala、Ser、Glu和Gln。對于理想的野生型底物N-乙?；?Ile-Glu-Pro-Asp-AMC(7-氨基-4-甲基香豆素)(Ac-IEPD-AMC)，變異體的總活性(kcat/Km)比野生型活性低小于10％。
在P2亞位點觀察到極顯著的效果(參見下文中表4)。在野生型粒酶B中，優(yōu)先選擇很廣泛，脯氨酸具有稍強(qiáng)的優(yōu)先選擇權(quán)。I99A將P2特異性限制在Phe和Tyr殘基。在P2位置上Phe具有比其它氨基酸平均活性強(qiáng)將近5倍的優(yōu)先選擇權(quán)。在絲氨酸蛋白酶的胰凝乳蛋白酶族中，超過12種蛋白酶在此結(jié)構(gòu)位點上具有小型殘基，天冬氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、丙氨酸或者甘氨酸。對于這種蛋白酶族，采用組合底物庫已經(jīng)評價出兩種蛋白酶(血漿激肽釋放酶和纖維蛋白溶酶)，這兩種蛋白酶對Phe和Tyr都表現(xiàn)出強(qiáng)烈的優(yōu)先選擇。上述的兩個結(jié)論說明，在位置99變異成Asn、Ser、Thr、Gly或者Ala的任何絲氨酸蛋白酶都表現(xiàn)出與血漿激肽釋放酶、纖維蛋白溶酶和I99A粒酶B變異體相同的疏水特異性。
對于P2特異性決定因子的理解可以擴(kuò)展到變異與底物優(yōu)先權(quán)的對照。將近24種胰凝乳蛋白酶折疊絲氨酸蛋白酶在位置99上具有芳香族氨基酸。采用組合底物庫已經(jīng)評價出四種這樣的蛋白酶人類粒酶B、組織型纖維蛋白溶酶原激活劑、尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑和膜型絲氨酸蛋白酶1。除了粒酶B以外的上述蛋白酶在底物P2位置上具有對絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸的優(yōu)先選擇權(quán)。
表4.粒酶B的變異體 表5.對特異性的效果 從表4和表5得知，鼠粒酶B選擇改變特異性的決定因子包括如下Ser195、Asp102、His57、Ala189、Ser190、Phe191、Arg192、Arg226、Ser58、Gly59、Ser60、Lys61、Ile62、Asn63、Ile99、Gln217、Asn218、Glu169、Ser170、Tyr171、Leu171A(注意與胰凝乳蛋白酶相比插入了一個氨基酸)、Lys172、Asn173、Tyr174、Phe175、Asp176、Lys177、Ala178、Glu180、Ile181、Tyr215、Lys97、Thr98、Ile99和Ser100。
對于半胱氨酸蛋白酶，選擇修飾的氨基酸缺少詳細(xì)的描述。S2袋是最具選擇性的并且以蛋白酶底物識別位點為最佳特征。S2袋由下述三維位置的氨基酸限定(木瓜蛋白酶編號)66、67、68、133、157、160和205。位置205起到了與絲氨酸蛋白酶位置189、一個隱藏在袋底部決定特異性殘基相似的作用。其它特異性決定因子包括下列氨基酸(根據(jù)木瓜蛋白酶編號)61和66(P3)；19、20和158(P1)。
表6.各種半胱氨酸蛋白酶的結(jié)構(gòu)決定因子和其對應(yīng)底物特異性 2.支架蛋白酶的誘發(fā)變異 為了改變特定亞位點(S1-S4)對于特定氨基酸的底物優(yōu)先選擇，可以單獨或者組合變異排列成結(jié)合袋的特異性決定因子。在本發(fā)明一具體實施方式
中，使用飽和的誘發(fā)變異技術(shù)，將排列成結(jié)合袋的殘基變異成20種可能氨基酸中的每一種氨基酸。采用Kunkle方法(分子生物學(xué)的當(dāng)前方案，John Wiley和Sons，Inc，Media Pa)，可以完成此過程。簡單地講，合成誘變的寡核苷酸引子，其中在所需的密碼子上隨機(jī)含有NNS或者NNK。將引子退火成單鏈的DNA模板，然后加入DNA聚合酶合成模板的互補鏈。連接后，將雙鏈DNA模板轉(zhuǎn)入大腸桿菌擴(kuò)增。此外，可以使用標(biāo)準(zhǔn)的商業(yè)可得的位點靶向誘發(fā)變異盒，例如QuikChange(Stratagene)，產(chǎn)生單氨基酸改變。在另一具體實施方式
中，對于位點特定氨基酸變異可以使用本領(lǐng)域公知的任何方法。
3.表達(dá)并提純變異體蛋白酶 可以采用活性或者惰性酶原形式表達(dá)蛋白酶。蛋白酶可以在異源表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，例如大腸桿菌、Pichia pastoris、S.cerevisae或者桿狀病毒的表達(dá)系統(tǒng)。蛋白可以在胞內(nèi)環(huán)境表達(dá)，也可以分泌到介質(zhì)中。為了提純變異體蛋白酶，可以使用柱層析法。蛋白酶含有在鎳柱上提純的C末端6-組氨酸尾端?；诘鞍酌傅牡入婞c，陽離子或者陰離子交換柱都是適合的。蛋白酶可以儲存在使其催化活性最小化的低PH值緩沖液中，以避免其自身降解。通過采用免疫吸附法、凝膠過濾法、或者本領(lǐng)域所用的任何其它提純方法，也可以實現(xiàn)提純。
4.合成ACC位置掃描庫 本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)定，可以采用多種方法制備本發(fā)明的肽和庫。在一實施例具體實施方式
中，通過將熒光標(biāo)記底物肽附著在固體載體上篩選庫。通過將氮-Fmoc香豆素衍生物縮合到酸易變Rink連接基團(tuán)上以提供ACC樹脂(Baches等人，<天然生物技術(shù)>2000年2月，第18(2)期第187-193頁)，可以從底物肽合成熒光離去基團(tuán)。Fmoc的去除產(chǎn)生了游離胺。天然、非天然或者修飾的氨基酸可以與通過結(jié)合附加氨基酸精心制備的游離胺結(jié)合。在完成上述肽合成后，肽-熒光部分的結(jié)合物可以從固體載體斷裂，或者結(jié)合物可以仍舊附著在固體載體上。
因此，在更優(yōu)選的具體實施方式
中，本發(fā)明提供了制備熒光肽或者含有熒光肽材料的方法。這樣的方法包括(1)提供了含有共價結(jié)合固體載體熒光部分的第一結(jié)合物；(2)將第一結(jié)合物與第一保護(hù)氨基酸部分和活化劑相接觸，由此在羧基基團(tuán)與第一結(jié)合物胺氮原子之間生成了肽鍵；(3)去保護(hù)，由此生成了含有反應(yīng)性胺部分的第二結(jié)合物；(4)將第二結(jié)合物與第二保護(hù)氨基酸和活化劑相接觸，由此在羧基基團(tuán)與反應(yīng)性胺部分之間生成了肽鍵；(5)去保護(hù)，由此生成了含有反應(yīng)性胺部分的第三結(jié)合物。
在優(yōu)選的具體實施方式
中，此方法還包括(6)將第三結(jié)合物與第三保護(hù)氨基酸和活化劑相接觸，由此在羧基基團(tuán)與反應(yīng)性胺部分之間生成了肽鍵；(7)去保護(hù)，由此生成了含有反應(yīng)性胺部分的第四結(jié)合物。
對于結(jié)合困難的氨基酸(Ile、Val等)，游離的未經(jīng)反應(yīng)的胺可以保留在載體上，并使后續(xù)合成與分析操作復(fù)雜化。在二甲基酰胺中使用乙酸硝基三唑活性酯的特殊加帽步驟有效地?；耸Ｓ嗟谋桨?。通常，出現(xiàn)在未經(jīng)提純底物序列溶液中的所得乙酸加帽香豆素不是蛋白酶的底物序列?？梢允褂眠@些方法獲得的P1-取代樹脂，制備任何ACC-熒光底物。
在更優(yōu)選的具體實施方式
中，通過使用至少2種、優(yōu)選至少6種、更優(yōu)選至少12種、更優(yōu)選至少20種氨基酸的混合物增長肽鏈，可以在任何特殊位置或者位置組合獲得多樣性。氨基酸混合物可以包括任何有效用量的特殊氨基酸，以及任何有效用量的一種或者多種不同氨基酸。在一優(yōu)選具體實施方式
中，混合物是氨基酸等動力混合物(適當(dāng)比率的混合物使所有成分具有等摩爾的反應(yīng)性)。等動力混合物是氨基酸摩爾比率基于其報道的反應(yīng)比率已經(jīng)進(jìn)行調(diào)節(jié)的混合物(Ostresh JM，Winkle JH，HamashinVT & Houghten，RA(1994)<生物聚合物>第34期第1681-1689頁)。
固體相肽合成法是制備本發(fā)明化合物肽主鏈的優(yōu)選方法，其中包括將序列的碳末端氨基酸附著在不溶的載體上，然后順序加入序列上剩余的氨基酸。固相合成技術(shù)記錄在下述文獻(xiàn)中Barrany和Merrifield，固相肽合成，<肽分析、合成>生物學(xué)第2卷第3-284頁；<肽合成的特殊方法>第A部分，Gross和Meienhofer，eds.Academic Press，紐約，1980年；Stewart等人，<固體相肽合成>第二版，Pierce Chem.Co，Rockford，III(1984年)；上述文獻(xiàn)全部內(nèi)容通過在以引述合并于本文。通過使用商業(yè)獲得的肽合成器，利用Fmoc(9-芴甲氧羰基)或者叔丁氧羰基化學(xué)性質(zhì)，可以極容易地實現(xiàn)固體相合成。
在特別優(yōu)選的具體實施方式
中，利用Fmoc合成的化學(xué)性質(zhì)實施肽合成。使用叔丁基優(yōu)選保護(hù)Asp、Ser、Thr和Tyr側(cè)鏈；使用硫-三苯甲基和硫-叔丁基硫代基優(yōu)選保護(hù)Cys殘基側(cè)鏈；使用叔丁氧羰基、Fmoc和4-甲基三苯甲基優(yōu)選保護(hù)Lys殘基側(cè)鏈。適當(dāng)保護(hù)的氨基酸試劑可以商業(yè)獲得，或者可以采用本領(lǐng)域公知的方法制備。使用多種保護(hù)性基團(tuán)，可以選擇性解鎖并且將熒光基團(tuán)與任何特別需要的側(cè)鏈結(jié)合。因此，例如，使用二氯甲烷中的TFA，實現(xiàn)叔丁氧羰基去保護(hù)。例如，使用20％(體積/體積)二甲基酰胺中的哌啶或者N-甲基吡咯烷酮，完成Fmoc去保護(hù)；例如，使用1-5％(體積/體積)水中的TFA、或者1％TFA和5％DCM中的三異丙基硅烷，完成4-甲基三苯甲基去保護(hù)。例如，使用水性的巰基乙醇(10％)完成了硫-叔丁基硫代基去保護(hù)。例如，使用TFA∶苯酚∶水∶硫代茴香醚∶乙烷二硫醇(85∶5∶5∶2.5∶2.5)，或者TFA∶苯酚∶水(95∶5∶5)，完成叔丁基、叔丁氧羰基、和硫-三苯甲基基團(tuán)的去除。
5.篩選特異性改變的蛋白酶 根據(jù)本領(lǐng)域公知方法識別利用本發(fā)明方法制備、蛋白酶的重要氨基酸，例如位點-靶向誘導(dǎo)變異或者活性位點殘基的飽和誘導(dǎo)變異。在后面的技術(shù)中，以單獨或者組合的方式將證實是特異性重要決定因子、構(gòu)成S1-S4袋的殘基變異成每種可能的氨基酸。參見例如，Legendre等人，《JMB》2000年第296期第87-102頁。采用ACC位置掃描庫，通過單底物動力學(xué)分析(Harris等人，《PNAS》第2000年第97期第7754-7759頁)，確定所得變異體的底物特異性。
采用誘發(fā)突變和篩選的公知方法，制備并且測定多種氨基酸取代，例如Reidhaar-Olson和Sauer(《科學(xué)》1998年第241期第53-57頁)或者Bowie和Sauer(《Proc.Natl.Acad.Sci.USA》1989年第86期第2152-2156頁)公開的內(nèi)容。簡單的講，這些作者公開了多種方法，將多肽的兩個或者多個位置同時隨機(jī)選取，選擇功能性多肽，然后將誘發(fā)變異的多肽排序，確定在每個位置上允許取代的范圍?？梢允褂闷渌椒?，其中包括噬菌體展示法(例如，Legendre等人，《JMB》2000年第296期第87-102頁；Lowman等人，《生物化學(xué)》1991年第30期第10832-10837頁；Ladner等人，美國專利No.5223409；Huse，PCT專利申請WO92/06204)和區(qū)域?qū)蛘T發(fā)變異法(Derbyshire等人，《基因》1986年第46期第145頁；Ner等人，《DNA》1988年第7期第127頁)。
上述誘導(dǎo)變異的方法可以與測定宿主細(xì)胞中克隆變異多肽活性的高處理量自動篩選方法結(jié)合使用。從宿主細(xì)胞收集編碼了具有蛋白分解活性蛋白或者其前體的變異DNA分子，再采用現(xiàn)代設(shè)備迅速排序。這些方法可以迅速確定重要多肽中單一氨基酸殘基的重要性，并且可以施用于未知結(jié)構(gòu)的多肽。
通過蛋白酶噬菌體展示篩選 在一具體實施方式
中，采用蛋白酶噬菌體展示法，利用對應(yīng)特定底物序列的各種親和力，篩選變異蛋白酶庫，如Legendre等人所述，《JMB》2000年第296期第87-102頁，和Corey等人所述，《基因》1993年6月15日，第218(1)期第129-134頁。噬菌體技術(shù)給人們提供了蛋白與編碼此蛋白基因信息的物理連接。通過將其基因融合到細(xì)菌病毒表面層蛋白，構(gòu)建重要的蛋白。當(dāng)在細(xì)菌宿主中產(chǎn)生病毒顆粒時，重要蛋白作為融合蛋白產(chǎn)生，并且在病毒表面上展示，其基因包裹在病毒的殼體顆粒中。通過結(jié)合固定靶，篩選噬菌體展示的隨機(jī)蛋白庫。挑選噬菌體庫(每種噬菌體代表單一的變異體)，尋找對靶具有增強(qiáng)親和力的噬菌體。在噬菌體表面已經(jīng)展示了絲氨酸蛋白酶，這種技術(shù)結(jié)合適當(dāng)?shù)恼T發(fā)變異技術(shù)可以用于產(chǎn)生多樣化的蛋白酶變異體庫。
選擇的靶可以是與蛋白酶治療應(yīng)用有關(guān)的靶。例如，靶序列可以存在于內(nèi)毒素、或者病毒蛋白、或者細(xì)菌壁蛋白、或者與自免疫條件有關(guān)的天然血液肽。文中所選蛋白酶可以用于治療方法，通過將此肽給藥于病體，例如通過靜脈給藥。
利用熒光性篩選 在本發(fā)明另一具體實施方式
中，使用了一種分析酶活性蛋白酶存在的方法。這樣的方法包括(1)將樣品與蛋白酶相接觸，基于蛋白酶的作用熒光部分從肽底物序列釋放出來，由此生成了發(fā)熒光的部分；(2)觀察樣品是否經(jīng)過可測的熒光變化，可測的熒光變化說明樣品中存在酶活性蛋白酶。
本發(fā)明方法可以用于分析任何充分公開的或者后來發(fā)現(xiàn)的蛋白酶。含有蛋白酶的樣品可以從任何來源或者有機(jī)體獲得。在一具體實施方式
中，樣品是來自病體的臨床樣品。在另一具體實施方式
中，蛋白酶選自天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶和絲氨酸蛋白酶。特別優(yōu)選的是，本發(fā)明方法用于分析由微生物獲得的蛋白酶，其中不限于此地包括細(xì)菌、真菌、酵母菌、病毒和原生動物。
溶液中蛋白酶活性的分析只需要，將一定量儲存溶液加入熒光蛋白酶指示劑中，再測定后續(xù)熒光的增加或者吸收光譜中激發(fā)帶的降低。還可以將溶液與熒光指示劑混合在使蛋白酶活性最佳化的“消化緩沖液”中，再進(jìn)行分析。適合分析蛋白酶活性的緩沖液對于本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知。例如，特別適合分析彈性蛋白酶活性的緩沖液由50mM磷酸鈉和1mM EDTA的PH8.9溶液構(gòu)成。使用熒光計最容易進(jìn)行測定，這種儀器為熒光基團(tuán)提供了“激發(fā)”光源，然后在特定波長下測定隨后發(fā)射的光。

具體實施例方式缺少蛋白酶的對照指示劑溶液比較提供了對蛋白酶活性的測定。通過繪制蛋白酶/指示劑組合的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中測定由公知活性蛋白酶溶液產(chǎn)生的熒光變化率，可以精確量化活性水平。
當(dāng)使用熒光計優(yōu)選完成熒光化合物的測定時，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的多種其它方法完成測定。因此，例如，當(dāng)發(fā)光基團(tuán)發(fā)射可見光時，測定只需要目測觀察響應(yīng)光源激發(fā)的熒光。測定還可以通過圖象分析系統(tǒng)完成，使用接合數(shù)字轉(zhuǎn)換器或者其它圖象獲取系統(tǒng)的攝象機(jī)。測定還可以通過過濾器采用造影法完成，例如在熒光顯微鏡下。這樣的顯微鏡可以提供由操作者簡單顯影的信號。此外，信號還可以記錄在照相軟片上，或者使用圖象分析系統(tǒng)。利用圖象分析系統(tǒng)或者光度計，信號還可以隨實時簡單量化。
因此，例如，樣品蛋白酶活性的基本分析涉及將樣品懸浮或者溶解在緩沖液中(在待測特定蛋白酶的最佳PH值條件下)，然后向緩沖液中加入熒光蛋白酶指示劑，如Harris等人所述，再使用分光熒光計監(jiān)視所得的熒光變化，參見期刊《生物化學(xué)》1998年10月16日，第273卷第42期第27364-27373頁。將分光熒光計設(shè)置在熒光基團(tuán)激發(fā)波長下激發(fā)熒光基團(tuán)，然后，在熒光基團(tuán)發(fā)射波長下測定所得的熒光。熒光蛋白酶指示劑是由蛋白酶斷裂自身使熒光發(fā)生變化的蛋白酶底物序列。
在一說明性具體實施方式
中，本發(fā)明提供了用于評價各種絲氨酸和半胱氨酸蛋白酶的庫。這種庫能夠區(qū)別對于不同氨基酸具有特異性的蛋白酶。
在另一說明性具體實施方式
中，庫提供了探測涉及血液凝固的一些絲氨酸蛋白酶的擴(kuò)展底物序列特異性，其中基于蛋白酶的優(yōu)選P1特異性，在P1位置保持賴氨酸或者精氨酸不變。
PS-SCL策略可以快速簡便地測定出蛋白溶解底物序列的特異性。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以認(rèn)定，這些方法提供了廣泛多樣的替換庫形式。例如，在P2位置固定大型疏水氨基酸，可以防止木瓜蛋白酶類蛋白酶內(nèi)部的優(yōu)選斷裂，并且可以完全地記錄下底物序列。考慮并確定對于測定底物序列特異性的任何特定酶或者方法的特殊限制，屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍。
除了分析所選擇的酶是否存在以外，本發(fā)明方法還可以用于探測、鑒別和量化樣品中的一種酶(例如，蛋白酶)。因此，在另一優(yōu)選的具體實施方式
中，篩選方法還包括(3)量化熒光部分，由此量化樣品中存在的酶(例如，蛋白酶)。樣品可以是，例如生物流體，例如血液、血清、尿液、眼淚、牛奶或者精液。
利用蛋白酶序列特異性分析篩選 在另一優(yōu)選的具體實施方式
中，這些方法用于選擇特異性斷裂靶序列的酶，優(yōu)選的是酶促活性蛋白酶。這類方法包括(1)含有內(nèi)部抑制熒光基團(tuán)的隨機(jī)肽庫，其中熒光基團(tuán)是例如O-氨基苯甲酰，并且猝光劑是例如3-硝基酷氨酸；(2)對應(yīng)靶向斷裂序列的肽底物序列，其中還含有內(nèi)部抑制的熒光基團(tuán)，熒光基團(tuán)是例如Cy3B，并且猝光劑是例如Cy5Q；(3)按1∶1比率將隨機(jī)肽庫與肽底物序列混合；(4)將混合物暴露于變異蛋白酶，然后量化Cy3B熒光與O-氨基苯甲酰熒光的比率。如果蛋白酶對靶蛋白具有選擇性，那么蛋白酶只會斷裂靶肽，而不會斷裂隨機(jī)庫，因此Cy3B熒光與O-氨基苯甲酰熒光的比率就會很高(Meldal和Breddam，《生物化學(xué)》(1991年)第195期第141-147頁；Gron等人，《生物化學(xué)》(1992年)第31期第6011-6018頁)。
在另一優(yōu)選具體實施方式
中，這些方法用于測定酶的序列特異性，優(yōu)選的是測定酶促活性蛋白酶的序列特異性。這類方法包括(1)將蛋白酶與本發(fā)明的肽庫接觸，由此熒光部分從肽序列中釋放出來，因此生成了熒發(fā)光部分；(2)測定熒發(fā)光部分；(3)確定肽序列的序列，由此確定蛋白酶肽序列特異性評價。
在上述方法的一優(yōu)選具體實施方式
中，上述方法還包括(4)量化熒光部分，由此量化蛋白酶。
此外，在上文給出的本發(fā)明每個方面與具體實施方式
中，蛋白酶基本上可以是任何重要的蛋白酶，但是優(yōu)選的是天門冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、或者絲氨酸蛋白酶。使用本發(fā)明方法分析的蛋白酶基本上可以來源于任何生物，不限于此地包括哺乳動物(例如人類)、鳥、爬行動物、昆蟲、植物、真菌等。在優(yōu)選的具體實施方式
中，蛋白酶來源于微生物，不限于此地包括細(xì)菌、真菌、酵母菌、病毒和原生動物。
6.步驟1-5的重復(fù) 本發(fā)明方法反復(fù)涉及制備在擴(kuò)展結(jié)合亞位點P2、P3和P4的每個亞位點上具有所需特異性和選擇性的變異體蛋白酶。在一些情況下，絲氨酸蛋白酶變異已經(jīng)說明，構(gòu)成活性位點(S1-S4)的每個亞位點彼此之間獨立地發(fā)揮作用，因此修飾單一亞位點的變異對相鄰亞位點特異性幾乎不產(chǎn)生影響。因此，采用逐步方式，可以實現(xiàn)整個擴(kuò)展結(jié)合位點的工程底物特異性與選擇性。
然后，由底物庫確定，利用對應(yīng)所需斷裂序列的單個肽底物，分析匹配所需特異性評價的變異蛋白酶。還可以分析變異體蛋白酶，從而確定其斷裂了全長蛋白范圍內(nèi)存在的所需序列。還可以分析靶蛋白的活性，從而證實其功能已經(jīng)被斷裂結(jié)果破壞。在用變異體蛋白酶培養(yǎng)提純的全長蛋白后，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳測定斷裂結(jié)果。
在另一具體實施方式
中，組合變異體蛋白酶，從而獲得多種蛋白酶的特異性。在一個位點產(chǎn)生特異性的支架單一殘基變異可以與相同蛋白酶支架另一個位點的另一個變異組合，生成組合特異性蛋白酶。相同支架分散位點上任何數(shù)量的變異可以用于產(chǎn)生組合特異性蛋白酶。在一具體實施方式
中，粒酶B支架位置99從異亮氨酸到丙氨酸的變異與位置218從天門冬酰胺到丙氨酸的變異組合，生成了組合特異性蛋白酶I99A/N218A粒酶B，其特性在本文中已詳細(xì)描述。
采用下述標(biāo)準(zhǔn)鑒別靶向斷裂與鈍化的蛋白(1)蛋白涉及病癥；(2)強(qiáng)烈的證據(jù)表明，蛋白是治療病癥的重要插入點；(3)蛋白溶解斷裂此蛋白極大可能地破壞了其功能。采用下列標(biāo)準(zhǔn)鑒別靶蛋白內(nèi)部的斷裂位點(1)斷裂位點位于蛋白的裸露表面；(2)按照原子結(jié)構(gòu)或者結(jié)構(gòu)預(yù)測算法(這些區(qū)域趨于在蛋白表面呈環(huán)型或者在細(xì)胞表面受體上呈莖狀)，斷裂位點位于缺少第二結(jié)構(gòu)的區(qū)域內(nèi)(即，不含有β折疊或者α螺旋)；(3)基于其公知的功能斷裂位點位于有可能鈍化蛋白的位點上。斷裂序列可以是，例如匹配許多絲氨酸蛋白酶擴(kuò)展底物特異性的四個殘基長度，但是也可以更長些或者更短些。
在本發(fā)明另一具體實施方式
中，靶蛋白輔助催化可以用于制備特異于靶蛋白的蛋白酶。在靶蛋白輔助催化中，作為絲氨酸蛋白酶催化三合體部分的不變組氨酸變異成丙氨酸，造成了蛋白酶鈍化。靶蛋白適當(dāng)位置的組氨酸可以起到氫受體的作用，實際上發(fā)揮了與蛋白酶中變異組氨酸相同的作用，由此保留了催化活性。然而，嚴(yán)格需要在底物序列(P2或者P1’)的適當(dāng)位置放置組氨酸。蛋白酶底物序列結(jié)合位點的單一變異可以改變其特異性，造成其底物序列特異性的變化。利用少量變異，可以改變底物序列特異性。
使用上述方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以鑒別和/或制備基本同源于蛋白酶支架的多種多肽或者其等位變異體，并且保留了野生型蛋白的蛋白溶解特性。在一具體實施方式
中，這些支架含有下述任一種微粒的氨基酸序列胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、凝血因子、纖維蛋白溶酶、凝血因子Xa、尿激酶型纖維蛋白酶原激活劑、組織纖維蛋白溶酶原激活劑、粒酶B、粒酶A、糜蛋白酶、膜型絲氨酸蛋白酶-1、組織蛋白酶G、彈性蛋白酶、木瓜蛋白酶、或者克魯?shù)鞍酌浮＿@類多肽可以含有由其它氨基酸殘基構(gòu)成的靶向部分，這些氨基酸殘基構(gòu)成了獨立折疊的結(jié)合區(qū)域。這些區(qū)域包括，例如細(xì)胞因子受體的胞外配基結(jié)合區(qū)域(例如，一種或者多種纖維結(jié)合蛋白型III區(qū)域)；免疫球蛋白區(qū)域；DNA結(jié)合區(qū)域(參見，例如He等人，《自然》1995年第378期第92-96頁)；親和標(biāo)記物等。這類多肽還可以包括上文所述的其它多肽片段。
蛋白酶多肽 本發(fā)明多肽包括含有蛋白酶氨基酸序列的多肽，此蛋白酶序列出現(xiàn)在文中所述的任一支架中。本發(fā)明還包括變異體或者變異體蛋白酶，所述變異體或者變異體蛋白酶的任何殘基是從文中所述任一支架中顯示的對應(yīng)殘基變化而成的，同時編碼蛋白的變異體或者變異體蛋白酶依舊保持著蛋白酶的活性和生理功能，或者其功能片段。在優(yōu)選具體實施方式
中，如文中所述，變異出現(xiàn)在蛋白酶S1-S4區(qū)域內(nèi)。
通常，保留蛋白酶類功能的蛋白酶變異包括序列中特定位置的殘基已經(jīng)被其它氨基酸取代的任何變異體，還包括在母蛋白質(zhì)兩個殘基之間插入一個或者多個額外殘基的可能性，以及從母序列刪除一個或者多個殘基的可能性。本發(fā)明涵蓋任何氨基酸的取代、插入或者刪除。在優(yōu)選的環(huán)境中，取代可以是上述的保守取代。
本發(fā)明一方面涉及離析蛋白酶及其生物活性部分，或者其衍生物、片段、類似物或者同系物。本發(fā)明還提供了適合用做培養(yǎng)抗蛋白酶抗體免疫原的多肽片段。在另一具體實施方式
中，采用重組DNA技術(shù)制備蛋白酶。作為重組表達(dá)的替換方法，采用標(biāo)準(zhǔn)肽合成技術(shù)化學(xué)合成蛋白酶蛋白或者多肽。
蛋白酶蛋白的生物活性部分包括含有氨基酸序列的肽，此氨基酸序列同源于蛋白酶蛋白氨基酸序列或者從蛋白酶蛋白氨基酸序列獲得，并且表現(xiàn)出至少一種此蛋白酶蛋白的活性，此蛋白酶蛋白含有少于全長蛋白酶蛋白的氨基酸。通常，生物活性部分含有具有至少一種此蛋白酶蛋白活性的區(qū)域或者基序。蛋白酶蛋白的生物活性部分是，例如長度為10個、25個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、110個、120個、130個、140個、150個、160個、170個、180個、190個、200個、210個、220個、230個、240個、250個、260個、270個、280個、290個、300個或者更多氨基酸殘基的多肽。
此外，采用重組技術(shù)可以制備蛋白的其它生物活性部分，蛋白的其它區(qū)域被刪除，并且可以評價評價天然蛋白的一種或者多種功能活性。
在一具體實施方式
中，蛋白酶含有文中所述一種支架或者此支架一種變異體的氨基酸序列。蛋白酶蛋白基本同源于文中所述一種支架或者此支架的一種變異體，并且保留了此蛋白的功能活性，然而由于天然等位基因變異或者誘發(fā)變異氨基酸序列存在差異。相應(yīng)地，在另一具體實施方式
中，蛋白酶含有至少大約45％同源于文中所述一種支架或者此支架一種變異體的氨基酸序列，并且保留了文中所述一種支架或者此支架一種變異體的功能活性。在一優(yōu)選具體實施方式
中，蛋白酶含有至少大約90％同源于文中所述一種支架的氨基酸序列。在另一優(yōu)選具體實施方式
中，蛋白酶含有至少大約95％同源于文中所述一種支架的氨基酸序列。在一優(yōu)選具體實施方式
中，蛋白酶含有至少大約99％同源于文中所述一種支架的氨基酸序列。
測定兩種或者多種序列的同源性 為了確定兩個氨基酸序列或者兩個核酸的同源百分率，排列兩個序列以獲得最佳比較效果(例如，為了獲得最佳排列將第二氨基酸或者核酸序列導(dǎo)入第一氨基酸或者核酸序列的間隙中)。然后，比較對應(yīng)氨基酸位置或者核苷酸位置的氨基酸殘基或者核苷酸。當(dāng)?shù)谝恍蛄幸粋€位置被第二序列對應(yīng)位置相同的氨基酸殘基或者核苷酸占據(jù)，那么兩分子在此位置同源(即，文中所用的氨基酸或者核酸“同源”等同于氨基酸或者核酸“相同”)。
以兩序列之間的相同程度確定核酸序列的同源性。使用本領(lǐng)域公知的計算機(jī)程序確定同源性，例如GCG程序包提供的GAP軟件。參見，Needleman和Wunsch，1970年期刊《分子生物學(xué)》第48期第443-453頁。使用GCG GAP軟件，帶有針對核酸序列比較的下列設(shè)置GAP生成損失5.0和GAP擴(kuò)展損失3.0，涉及上述表現(xiàn)相同程度優(yōu)選至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、或者99％的類似核酸序列編碼區(qū)域。
名詞“序列相同”指的是，在對比的特定區(qū)域中以殘基對殘基為基礎(chǔ)兩個多核苷酸或者多肽序列相同的程度。名詞“序列相同百分比”是由下述步驟計算獲得先將最佳排列的兩個序列基于對比區(qū)域進(jìn)行比較；再確定兩個序列中出現(xiàn)相同核酸堿基的位置數(shù)量(例如，對于核酸，可以是A、T、C、G、U或者I)，獲得匹配位置的數(shù)量；將匹配位置的數(shù)量除以對比區(qū)域的總位置數(shù)量(即窗口大小)；最后，以100乘以所得結(jié)果，獲得序列相同的百分比。文中所用的名詞“基本相同”表示多核苷酸序列的特征，其中與參照序列基于對比區(qū)域相比，多核苷酸含有至少80％相同的序列，優(yōu)選的是含有至少85％相同的序列，并且經(jīng)常含有90-95％相同的序列，更經(jīng)常含有至少99％相同的序列。
嵌合體蛋白與融合蛋白 本發(fā)明還提供了蛋白酶的嵌合體蛋白或者融合蛋白。如文中所用，蛋白酶“嵌合體蛋白”或者“融合蛋白”含有可操作地連接非蛋白酶多肽的蛋白酶多肽。“蛋白酶多肽”指的是含有對應(yīng)文中所述一種支架或者此支架一種變異體氨基酸序列的多肽，而“非蛋白酶多肽”指的是含有對應(yīng)與文中所述任一種支架非同源蛋白的氨基酸序列的多肽，即蛋白與支架相區(qū)別并且蛋白可以從相同或者不同的有機(jī)體獲得。在蛋白酶融合蛋白中，蛋白酶多肽可以對應(yīng)于所有或者部分的蛋白酶蛋白。在一具體實施方式
中，蛋白酶融合蛋白含有蛋白酶蛋白的至少一個生物活性部分。在另一具體實施方式
中，蛋白酶融合蛋白含有蛋白酶蛋白的至少兩個生物活性部分。在另一具體實施方式
中，蛋白酶融合蛋白含有蛋白酶蛋白的至少三個生物活性部分。在融合蛋白內(nèi)部，名詞“可操作地連接”用于表示，蛋白酶多肽和非蛋白酶多肽相互之間框架融合。非蛋白酶多肽可以融合到蛋白酶多肽的N-末端或者C-末端。
在一具體實施方式
中，融合蛋白是GST-蛋白酶融合蛋白，其中蛋白酶序列融合到GST(谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶)序列的氮末端。這種融合蛋白可以有助于重組蛋白酶多肽的提純。
在另一具體實施方式
中，融合蛋白是Fc融合，其中蛋白酶序列融合到來自免疫球蛋白G的Fc區(qū)域氮末端。這種融合蛋白可以增加生命體內(nèi)藥效學(xué)性質(zhì)。
在另一具體實施方式
中，融合蛋白是在氮末端上含有異種信號序列的蛋白酶蛋白。在特定宿主細(xì)胞(例如，哺乳動物宿主細(xì)胞)中，通過使用異種信號序列可以增加蛋白酶的表達(dá)和/或分泌。
采用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)，可以制備本發(fā)明的嵌合體蛋白酶或者融合蛋白。例如，采用常規(guī)技術(shù)框架連接編碼不同多肽序列的DNA片段，例如通過使用平端或者交錯端界標(biāo)用于連接，先使用限制性內(nèi)切酶消化以提供適當(dāng)?shù)慕鐦?biāo)，再適當(dāng)?shù)靥钊胝承阅┒?，接著使用堿性磷酸酶處理以避免不需要的連接，最后進(jìn)行酶連接。在另一具體實施方式
中，采用常規(guī)技術(shù)可以合成融合基因，其中包括自動DNA合成。此外，采用錨定引物實施基因片段的PCR擴(kuò)增，隨后經(jīng)退火和再放大生成了嵌合體基因序列(參見，例如Ausubel等人(編輯)《分子生物學(xué)的現(xiàn)有方案》，JohnWiley& Sons，1992年)。此外，許多表達(dá)載體是已經(jīng)編碼了融合部分的商品(例如，谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶多肽)。編碼了蛋白酶的核酸可以克隆到這樣的表達(dá)載體中，以致融合部分可以與蛋白酶蛋白框架連接。
蛋白酶激動劑和對抗劑 本發(fā)明還涉及起到蛋白酶激動劑(即擬態(tài)劑)或者蛋白酶對抗劑作用的蛋白酶蛋白變異體。通過誘導(dǎo)變異可以制備蛋白酶蛋白變異體(蛋白酶蛋白的分散點變異或者截斷)。蛋白酶蛋白激動劑可以保留與天然型蛋白酶蛋白相同的生物活性或者其子集。蛋白酶蛋白的對抗劑可以抑制天然型蛋白酶蛋白的一種或者多種活性，例如作為蛋白酶蛋白斷裂相同的靶蛋白。因此，使用限定功能的變異體治療，可以激發(fā)特殊的生物作用。在一具體實施方式
中，使用具有天然型蛋白生物活性子集的變異體治療病體，對于與使用天然型蛋白酶蛋白有關(guān)的病體具有較少的副作用。
編程性細(xì)胞死亡 抑制編程性細(xì)胞死亡的方法 本發(fā)明還包括抑制編程性細(xì)胞死亡的方法。編程性細(xì)胞死亡，也被稱為程序性細(xì)胞死亡，在細(xì)胞發(fā)育、老化和多種病癥中發(fā)揮作用。在發(fā)育的生命體中，包括脊椎動物和無脊椎動物，作為正常形態(tài)發(fā)生過程的一部分，在特定時間特定位置細(xì)胞死亡。編程性細(xì)胞死亡過程是以不限于此的多種作用結(jié)果為特征的。細(xì)胞失去了其細(xì)胞連接與微絨毛，細(xì)胞質(zhì)濃縮，并且核染色質(zhì)邊緣化為許多分散物質(zhì)。作為核碎片，細(xì)胞質(zhì)濃縮物和線粒體、核糖體緊密壓縮。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膨脹并與細(xì)胞膜融合后，細(xì)胞破碎成多個膜約束泡囊，編程性細(xì)胞死亡體，通常被相臨體吞噬。由于染色質(zhì)斷裂成低核苷酸，片段成為編程性細(xì)胞死亡最后階段的特征，可以使用DNA斷裂模型作為生命體外分析，從而確定編程性細(xì)胞程序死亡的發(fā)生(Cory，《自然》1994年第367期第317-318頁)。
一方面，本發(fā)明提供了治療或者預(yù)防編程性相關(guān)病癥的方法，其中將有效治療用量的蛋白酶抑制劑給藥于病體，從而抑制編程性細(xì)胞程序死亡。病體可以是，例如任何哺乳動物，例如人類、靈長類動物(例如，人類)、小鼠、大鼠、狗、貓、奶牛、馬、或者豬。名詞“有效治療”指的是足以改善編程性細(xì)胞死亡相關(guān)病癥的蛋白酶抑制劑用量。
編程性相關(guān)病癥包括，例如，包括AIDS和HIV的免疫缺陷疾病、衰老癥、神經(jīng)退化癥、退化癥、缺血性和再灌注細(xì)胞死亡、急性局部缺血損傷、不育癥、創(chuàng)傷愈合等。
測定編程性細(xì)胞死亡的許多方法，包括文中所述的方法，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知，且不限于此地包括采用凝膠電泳形成DNA梯型的典型方法、通過電子顯微鏡形態(tài)學(xué)檢測的典型方法。測定編程性細(xì)胞死亡更現(xiàn)代更容易操作的方法是流式細(xì)胞法。流式細(xì)胞法可以迅速定量地測定編程性細(xì)胞死亡。已經(jīng)公開了測定細(xì)胞內(nèi)編程性細(xì)胞死亡的多種不同流式細(xì)胞法(Darzynkiewicz等人，《流式細(xì)胞法》1992年第13期，第795-808頁)。大部分的這些方法通過使用各種DNA染劑(即，亞丙基(PI)、4′，6二脒基-2-苯吲哚鹽酸(DAPI)、煙酸己可堿)染色，測定細(xì)胞內(nèi)編程性細(xì)胞死亡的變化；然而，還開發(fā)了一些使用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)化酶(TUNNEL)或者切口平移分析技術(shù)(Gorczyca等人，《癌癥研究》1993年第53期第1945-1951頁)。最近，快速流動細(xì)胞染色法已經(jīng)商業(yè)可得，此方法使用了膜聯(lián)蛋白V，測定暴露在細(xì)胞表面作為編程性細(xì)胞死亡標(biāo)記的磷脂酰絲氨酸。最先進(jìn)的流式細(xì)胞分析法測定作為細(xì)胞經(jīng)歷編程性細(xì)胞死亡早期標(biāo)記的半胱天冬酶-3的活性，并且實施此分析的試劑盒已經(jīng)商業(yè)可得(Nicholson等人，《自然》1995年第376期第37-43頁)。
可以將本發(fā)明蛋白酶給藥斷裂半胱天冬酶-3，由此抑制其活性。在優(yōu)選的具體實施方式
中，將本發(fā)明蛋白酶給藥斷裂半胱天冬酶-3。本發(fā)明蛋白酶還可以斷裂涉及編程性細(xì)胞死亡的其它蛋白，例如人類細(xì)胞色素c、人類抗惡性貧血因子-1、人類半胱天冬酶-7、人類半胱天冬酶-6、人類半胱天冬酶-2、人類BAD、人類BID、人類BAX、人類PARP、或者人類p53。通過斷裂這些蛋白酶，本發(fā)明蛋白酶由此使其鈍化。通過上述方式本發(fā)明蛋白酶可以用于抑制編程性細(xì)胞死亡。
在另一方面，通過將細(xì)胞與用量足以抑制編程性細(xì)胞死亡的本發(fā)明蛋白酶相接觸，抑制細(xì)胞的編程性細(xì)胞死亡。暴露于本發(fā)明蛋白酶、即與本發(fā)明蛋白酶接觸的細(xì)胞群體可以是任何數(shù)量的細(xì)胞，即一個或者多個細(xì)胞，并且可以從生命體外、生命體內(nèi)獲得或者取自活體材料。細(xì)胞可以與蛋白酶蛋白相接觸，或者由編碼蛋白酶的多核苷酸轉(zhuǎn)染。
誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡的方法 本發(fā)明還可以包括誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡的方法。在一方面，通過將用量足以誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡的本發(fā)明蛋白酶給藥，可以誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡。病體可以是，例如任何哺乳動物，例如人類、靈長類動物(例如，人類)、小鼠、大鼠、狗、貓、奶牛、馬、或者豬。在各個方面病體易感染癌癥或者自免疫疾病。
本發(fā)明蛋白酶可以與抗血管原化合物共同給藥?？寡茉衔锏膶嵗幌抻诖说匕ɡ野彼峒っ敢种苿⒈砥づ缮L因子抑制劑、成纖維細(xì)胞生長因子抑制劑、血小板派生生長因子抑制劑、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)抑制劑、整聯(lián)蛋白阻斷劑、干擾素α、可誘導(dǎo)干擾素蛋白10、白介素-12、聚硫酸戊聚糖、環(huán)氧合酶抑制劑、非類固醇抗炎藥(NSAID)、環(huán)氧合酶-2抑制劑、羧氨基三唑、四氫皮質(zhì)醇、考布他汀A-4、角鯊胺、O-(氯乙酰甲酰)夫馬菌素醇、沙立度胺、血管他丁、內(nèi)皮他丁、肌原蛋白-1、血管內(nèi)皮生長因子抗體、血小板因子4或者血小板反應(yīng)素。
在一些具體實施方式
中，本發(fā)明蛋白酶還可以與化學(xué)治療化合物共同給藥。化學(xué)治療化合物的實例不限于此地包括紫杉醇、紅豆杉醇、洛伐它丁、minosine、三苯氧胺、吉西他濱、5-氟尿嘧啶(5FU)、氨甲喋呤(MTX)、多西他奇、長春新堿、長春滅瘟堿、諾考達(dá)唑、替尼泊苷、依托泊苷、阿霉素、epothilone、新霉酰胺、喜樹堿、道諾霉素、放線菌素D、米托蒽醌、安吖啶、表柔比星、或者伊達(dá)比星。
在另一方面，通過將細(xì)胞與用量足以誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡的本發(fā)明蛋白酶相接觸，誘導(dǎo)細(xì)胞的編程性細(xì)胞死亡。暴露于本發(fā)明蛋白酶、即與本發(fā)明蛋白酶接觸的細(xì)胞群體可以是任何數(shù)量的細(xì)胞，即一個或者多個細(xì)胞，并且可以從生命體外、生命體內(nèi)獲得或者取自活體材料。細(xì)胞可以與蛋白酶蛋白相接觸，或者由編碼蛋白酶的多核苷酸轉(zhuǎn)染。
一些疾病癥狀涉及受累細(xì)胞中缺陷型減量調(diào)節(jié)編程性細(xì)胞死亡的發(fā)展。例如，瘤形成至少部分歸因于抗編程性細(xì)胞死亡的狀態(tài)，在此狀態(tài)下細(xì)胞增生信號不適當(dāng)?shù)爻^了細(xì)胞死亡信號。此外，一些DNA病毒，例如愛波斯坦-巴爾病毒、非洲豬熱病毒和腺病毒，寄生在宿主細(xì)胞結(jié)構(gòu)中促使其自身復(fù)制。同時，調(diào)節(jié)編程性細(xì)胞死亡抑制細(xì)胞死亡，并且促使靶細(xì)胞復(fù)制病毒。此外，某些疾病癥狀，例如淋巴增生癥狀、包括抗藥物癌癥的癌癥、關(guān)節(jié)炎、炎癥、自免疫疾病等都是由細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)的減量調(diào)節(jié)造成的。針對這類病癥，需要促進(jìn)編程性細(xì)胞死亡機(jī)理。
實施例 實施例1.I99A粒酶B的制備和存儲 如上文所述制備野生型鼠粒酶B結(jié)構(gòu)(Harris等人，期刊《生物化學(xué)》1998年第273期第27364-27373頁)。向pPICZαA質(zhì)粒導(dǎo)入下列點變異N218A、N218T、N218V、I99A、I99F、I99R、Y174A、Y174V。通過使用引子排序5’AOX和3’AOX區(qū)域證實每個變異，然后轉(zhuǎn)入X33細(xì)胞，再使用Zeocin(Invitrogen，La JollaCA)選擇。對每個變異體的表達(dá)與提純與用于野生型鼠粒酶B的前述方法相同(Harris等人，期刊《生物化學(xué)》1998年第273期第27364-27373頁)。
采用位點靶向誘導(dǎo)變異的QuikChange(Stratagene)法，變異蛋白酶鼠粒酶B，將位置99上的異亮氨酸改變成丙氨酸。導(dǎo)入I99A變異的DNA引子是CCA GCG TAT AAT TCT AAG ACA GCCTCC AAT GAC ATC ATG CTG(序列編號3)反向引子CAG CATGAT GTC ATT GGA GGC TGT CTT AGA ATT ATA CGC TGG(序列編號5)。進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，其中包括野生型雙鏈DNA、重疊變異的兩個引子、反應(yīng)緩沖液、三磷酸脫氧核糖核苷聚合酶和DNA聚合酶。在退火與擴(kuò)增的30次循環(huán)后，停止反應(yīng)。加入酶DpnI以消化含有修飾堿基對的野生型DNA，然后將所得的切口DNA鏈轉(zhuǎn)入細(xì)菌。使用Zeocin選擇確保只有正向克隆生長。通過排列粒酶B的基因證實變異。采用相同的方案，選擇適當(dāng)變化的誘變引子，制備剩余的粒酶B變異體。
采用公開的方案(Invitrogen)將含有變異體粒酶B蛋白酶的DNA轉(zhuǎn)入畢赤酵母屬pastoria的X33細(xì)胞，然后使用Zeocin選擇正向轉(zhuǎn)化細(xì)胞。接著，將克隆轉(zhuǎn)移到1升培養(yǎng)液中，培養(yǎng)到細(xì)胞密度大于OD600＝1.0。然后，加入0.5％甲醇誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，靜置超過72小時。為了提純變異體蛋白酶，離心培養(yǎng)物后收集上清液。基于重力負(fù)載使上清液流過SP-瓊脂糖快速流式陽離子交換柱。柱體是由50mM 2-(N-嗎啉代)乙磺酸、PH6.0、100mM氯化鈉的溶液清洗，更嚴(yán)格地使用50mM 2-(N-嗎啉代)乙磺酸、pH6.0和250mM氯化鈉的溶液清洗。此蛋白是由50mM 2-(N-嗎啉代)乙磺酸、PH6.0、1M氯化鈉的溶液洗提，并且由50mM 2-(N-嗎啉代)乙磺酸、pH6.0、2M氯化鈉和0.5氫氧化鈉的溶液柱清洗。所得蛋白酶的純度小于90％。將最后所得的蛋白酶交換并濃縮到50mM 2-(N-嗎啉代)乙磺酸、PH6.0、100mM氯化鈉的溶液中，在4℃下儲存。
此外，提純后，在280nm下定量測定每個變異體的吸光率，然后如前所述使用野生型ecotin或者M(jìn)84D ecotin滴定，接著，交換到50mM 2-(N-嗎啉代)乙磺酸、PH6.0和100mM氯化鈉的緩沖液中，在4℃下儲存。
實施例2.ACC位置掃描庫的合成與篩選 ACC-樹脂的合成 使用9-芴甲氧羰基氯(Fmoc-Cl)處理7-氨基香豆素-4-乙酸，制備7-Fmoc-氨基香豆素-4-乙酸。將7-氨基香豆素-4-乙酸(10.0克，45.6毫摩爾)和水(228毫升)混合。然后，加入小部分的碳酸氫鈉(3.92克，45.6毫摩爾)，接著，加入丙酮(228毫升)。使用冰浴冷卻溶液，在一小時攪拌過程中加入9-芴甲氧羰基氯(10.7克，41.5毫摩爾)。移開冰浴，過夜攪拌溶液。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除丙酮后，過濾收集所得的粘性固體，再多次使用部分己烷清洗。使用7-Fmoc-氨基香豆素-4-乙酸縮合Rink酰胺AM樹脂，制備ACC-樹脂。將Rink酰胺AM樹脂(21克，17毫摩爾)溶解在200毫升二甲基酰胺(DMF)中。攪拌混合物30分鐘，使用過濾器套管過濾，然后，加入含有20％哌啶的二甲基酰胺(200毫升)。攪拌25分鐘后，過濾樹脂并用二甲基酰胺清洗三次(每次200毫升)。接著，加入7-Fmoc-氨基香豆素-4-乙酸(15克，34毫摩爾)、1-羥基苯并三唑(4.6克，34毫摩爾)、二甲基酰胺(150毫升)，隨后加入二異丙基碳化二亞胺(DICI)(5.3毫升，34毫摩爾)。過夜混合所得混合物，過濾，清洗(二甲基酰胺，清洗三次每次200毫升；四氫呋喃，清洗三次每次200毫升；甲醇，清洗三次每次200毫升)，再經(jīng)五氧化二磷干燥。通過9-芴甲氧羰基(Fmoc)分析測定出，所得樹脂的取代水平是0.58毫摩爾/克(大于95％)。
P1-多樣庫合成 將單個P1-取代的Fmoc-氨基酸ACC-樹脂(大約25毫克，0.013毫摩爾)加入MultiChem96孔反應(yīng)裝置的孔中。向含有樹脂的孔中加入二甲基酰胺(0.5毫升)作為溶劑。經(jīng)過過濾，加入含有20％哌啶的二甲基酰胺溶液(0.5毫升)，接著再攪拌30分鐘。過濾反應(yīng)單元的孔，再用二甲基酰胺清洗(清洗三次，每次0.5毫升)。為了引入隨機(jī)的P2位置，使用二異丙基碳化二亞胺(390微升，2.5毫摩爾)和含有1-羥基苯并三唑(340毫克，2.5毫摩爾)的二甲基酰胺(10毫升)預(yù)活化Fmoc-氨基酸的等動力混合物[4.8毫摩爾，每孔10等份；Fmoc-氨基酸，摩爾％Fmoc-Ala-OH，3.4；Fmoc-Arg(Pbf)-OH 6.5；Fmoc-Asn(Trt)-OH，5.3；Fmoc-Asp(O-t-Bu)OH，3.5；Fmoc-Glu(O-t-Bu)-OH，3.6；Fmoc-Gln(Trt)-OH，5.3；Fmoc-Gly-OH，2.9；FmocHis(Trt)-OH，3.5；Fmoc-Ile-OH，17.4；Fmoc-Leu-OH，4.9；Fmoc-Lys(Boc)-OH，6.2；Fmoc-Nle-OH，3.8；Fmoc-Phe-OH，2.5；Fmoc-Pro-OH，4.3；Fmoc-Ser(O-t-Bu)-OH，2.8；Fmoc-Thr(O-t-Bu)-OH，4.8；Fmoc-Trp(Boc)-OH，3.8；Fmoc-Tyr(O-t-Bu)-OH，4.1；Fmoc-Val-OH，11.3]。向每個孔加入上述溶液(0.5毫升)。搖擺反應(yīng)單元3小時，過濾，然后用二甲基酰胺清洗(三次，每次0.5毫升)。以相同的方式插入隨機(jī)的P3和P4位置。去除P4氨基酸的Fmoc，然后用二甲基酰胺清洗樹脂(三次，每次0.5毫升)，再使用乙醇加帽溶液(150微升，2.5毫摩爾)、1-羥基苯并三唑(340毫克，2.5毫摩爾)、含有二異丙基碳化二亞胺(390微升，2.5毫摩爾)的二甲基酰胺(10毫升)處理。經(jīng)過4小時搖擺后，使用二甲基酰胺(三次清洗，每次0.5毫升)和二氯甲烷(三次清洗，每次0.5毫升)清洗樹脂，然后使用95∶2.5∶2.5的TFA/TIS/H2O溶液處理。經(jīng)過一個小時培養(yǎng)，打開反應(yīng)單元，將其放入96深孔滴定平板中，然后用額外的斷裂溶液清洗孔(二次，每次0.5毫升)。濃縮收集板，使用乙醇(0.5毫升)稀釋含有底物孔中的材料，然后再濃縮，并重復(fù)兩遍。使用CH3CN/H2O混合物冷凍脫水每個孔的內(nèi)涵物?；趩我坏孜锂a(chǎn)量每個孔的底物總量保守估計是0.0063毫摩爾(50％)。
P1-固定庫的合成 采用所述方法，可以合成多克用量的P1-取代ACC-樹脂。將Fmoc-氨基酸-取代的ACC樹脂放入96孔反應(yīng)單元的57個孔中由選擇19個氨基酸(刪除半胱氨酸并且用蛋氨酸取代正白氨酸)的第二固定位置(P4、P3、P2)表示子文庫。除了對于P2、P3、P4子文庫，將單個氨基酸(5等量Fmoc-氨基酸單體，5等量二異丙基碳化二亞胺，5等量含有1-羥基苯并三唑的二甲基酰胺)、而不是等動力混合物插入空間設(shè)定的P2、P3、或P4位置外，底物的合成、加帽與斷裂與文中上一部分所述的內(nèi)容相同。
如上所述制備完全多樣性的組合庫和P1-固定組合庫。將庫的等份試樣加入96孔平板直至250微摩爾濃度。在粒酶活性緩沖液(50毫摩爾羥乙基哌嗪乙磺酸鈉、PH8.0、100毫摩爾氯化鈉、0.01％吐溫-20)中稀釋變異體蛋白酶直至50納摩爾到1微摩爾之間的濃度。利用對應(yīng)Ac-IEPD-AMC的初始活性調(diào)節(jié)變異體蛋白酶濃度至大約等同于50納摩爾野生型鼠粒酶B的濃度。在30℃下使用最大光譜德耳塔熒光儀(Spectra-Max Deltaflourimeter公司名詞)，測定P1-Asp庫的酶活性，并持續(xù)一小時。分別在3 80納米和460納米處測定激發(fā)與發(fā)射。
實施例3.單獨動力學(xué)測定I99A粒酶B 使用最大光譜德耳塔熒光儀，實施單個動力學(xué)測定。在分析緩沖液中將每種蛋白酶稀釋到50納摩爾-1微摩爾的濃度。使用MeSO將所有ACC底物稀釋到5-500微摩爾，同時將AMC底物稀釋到20-2000微摩爾。每次分析物含有小于50％的MeSO。分別在380納米和460納米的激發(fā)與發(fā)射波長，每隔15秒測定酶活性，總共持續(xù)10分鐘。在1％二甲亞砜中實施所有的分析。
這種方法可以用于篩選I99A粒酶B。在位置掃描的組合底物庫中評價I99A粒酶，從而確定變異效果。如上所述制備這樣的組合底物庫，然后，將底物庫的等份試樣加入96孔平板中直至250微摩爾的最終濃度。使用粒酶活性緩沖液(50毫摩爾羥乙基哌嗪乙磺酸鈉、PH8.0、100毫摩爾氯化鈉、0.01％吐溫-20)稀釋變異體蛋白酶直至50納摩爾-1微摩爾。利用對應(yīng)Ac-IEPD-AMC的初始活性調(diào)節(jié)變異體蛋白酶濃度至大約等于50納摩爾野生型鼠粒酶B的濃度。在30℃下使用最大光譜德耳塔熒光儀，測定P1-Asp庫的酶活性，并持續(xù)一小時。分別在380納米和460納米處測定激發(fā)與發(fā)射。將粒酶B變異體的評價與野生型評價進(jìn)行比較，從而確定之間的差別。例如，對于I99A變異體，在P2氨基酸的特異性明顯差別于野生型的特異性。野生型具有廣泛的選擇性并且對于脯氨酸具有稍強(qiáng)的優(yōu)先選擇性，而變異體對于疏水殘基、例如苯丙氨酸和酪氨酸具有強(qiáng)烈的優(yōu)先選擇性。變異體蛋白酶的選擇性也發(fā)生了改變。野生型毫無目的地選擇P2亞位點，水解在此位點含有任何氨基酸的底物。而I99A蛋白酶具有極強(qiáng)的選擇性。在P2位置上，苯丙氨酸的優(yōu)選選擇程度比任何其它氨基酸高得多(參見上文所列的表5)。
實施例4.腫瘤壞死因子與腫瘤壞死因子受體的蛋白水解與斷裂 受體斷裂 將新鮮離析的中性白細(xì)胞(PMN)再次懸浮在1×107細(xì)胞/毫升含有0.2％胎兒牛血清(FCS)的RPMI1640溶液中，接著使用特異于腫瘤壞死因子受體1或者腫瘤壞死因子受體2莖部區(qū)域的各種濃度蛋白酶培養(yǎng)。在37℃下培養(yǎng)40分鐘后，加入蛋白酶抑制劑停止反應(yīng)，然后，使用酶聯(lián)免疫吸附測定法(Roche)，定量分析釋放到介質(zhì)中腫瘤壞死因子受體的含量。
腫瘤壞死因子的斷裂 使用各種濃度蛋白酶培養(yǎng)125I—腫瘤壞死因子(40,000cpm)，然后將樣品放入十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)樣品緩沖液中煮沸，再在12％聚丙烯酰胺凝膠上測定。在-70℃下干燥凝膠并暴露于X光照片(Kodak)。
腫瘤壞死因子結(jié)合分析 使用上述各種濃度的蛋白酶培養(yǎng)125I—腫瘤壞死因子或者中性白細(xì)胞。利用閃爍現(xiàn)象定量測定暴露于對應(yīng)正常中性白細(xì)胞蛋白酶的125I—腫瘤壞死因子結(jié)合，或者暴露于蛋白酶對應(yīng)中性白細(xì)胞的正常125I—腫瘤壞死因子結(jié)合。然后，通過真空抽吸清洗細(xì)胞三次，接著將30微升閃爍液(Wallac)加入每個孔中。最后，使用Wallac Microbeta閃爍計數(shù)器記錄閃爍次數(shù)(由下列文獻(xiàn)改編van Kessel等人，期刊《免疫學(xué)》1991年第147期第3862-3868頁和Porteau等人，期刊《生物化學(xué)》1991年第266期第18846-18853頁)。
實施例5利用蛋白酶噬菌體展示選擇能夠斷裂肽序列特異靶的酶 構(gòu)建噬菌粒，以致其(1)運載M13噬菌體形態(tài)形成的所有基因；(2)運載與復(fù)制噬菌體源相互作用引發(fā)生成單鏈DNA的包裝信號；(3)運載斷裂的復(fù)制噬菌體源；(4)運載抗氨必西林基因。
無效的噬菌體源復(fù)制與完整的質(zhì)粒源復(fù)制的組合有利于在作為質(zhì)粒(作為RF，復(fù)制型，DNA)而不是噬菌體的宿主細(xì)菌中載體的增殖。因此，可以在不殺死宿主的情況下持續(xù)復(fù)制。此外，擁有質(zhì)粒源意味著，可以獨立地復(fù)制有效噬菌體類增殖的噬菌粒。由于抗氨必西林基因，載體可以擴(kuò)增，從而增加噬菌粒DNA進(jìn)入噬菌體顆粒的包裝。
使用標(biāo)準(zhǔn)的克隆方法(Sidhu，《酶學(xué)方法》2000年，第328卷第333頁)，可以構(gòu)建蛋白酶基因與M13外殼蛋白基因3或者基因8的融合。然后，將編碼蛋白酶基因變異體的組合庫展示在M13表面，作為與M13外殼蛋白p3或者p8的融合，并且針對重要靶斷裂對應(yīng)的固定含醛肽進(jìn)行面位顯示。醛部分可以抑制蛋白酶斷裂易斷開鍵的能力，然而，醛部分并不干擾肽對蛋白酶的識別。具有對應(yīng)固定靶肽特異性、展示變異體蛋白酶的噬菌體可以與涂布靶肽的平板結(jié)合，而非特異性噬菌體會被清洗掉。通過連續(xù)淘洗循環(huán)，可以離析對應(yīng)靶序列具有增強(qiáng)特異性的蛋白酶。然后，可以在不含醛條件下合成靶序列，并且可以測定離析噬菌體對肽的特異性水解。
實施例6.庫的合成與熒光篩選 A.P1-多樣庫 A(1)合成 將單個P1-取代的Fmoc-氨基酸ACC-樹脂(大約25毫克，0.013毫摩爾)加入MultiChem96孔反應(yīng)裝置的孔中。向含有樹脂的孔加入二甲基酰胺(0.5毫升)作為溶劑。然后，加入含有20％哌啶的二甲基酰胺溶液(0.5毫升)，接著再攪拌30分鐘。過濾反應(yīng)單元的孔，再用二甲基酰胺清洗(清洗三次，每次0.5毫升)。為了引入隨機(jī)的P2位置，使用二異丙基碳化二亞胺(390微升，2.5毫摩爾)和含有1-羥基苯并三唑(340毫克，2.5毫摩爾)的二甲基酰胺(10毫升)預(yù)活化Fmoc-氨基酸的等動力混合物[4.8毫摩爾，每孔10等份；Fmoc-氨基酸，摩爾％Fmoc-Ala-OH，3.4；Fmoc-Arg(Pbf)-OH 6.5；Fmoc-Asn(Trt)-OH，5.3；Fmoc-Asp(O-t-Bu)OH，3.5；Fmoc-Glu(O-t-Bu)-OH，3.6；Fmoc-Gln(Trt)-OH，5.3；Fmoc-Gly-OH，2.9；FmocHis(Trt)-OH，3.5；Fmoc-Ile-OH，17.4；Fmoc-Leu-OH，4.9；Fmoc-Lys(Boc)-OH，6.2；Fmoc-Nle-OH，3.8；Fmoc-Phe-OH，2.5；Fmoc-Pro-OH，4.3；Fmoc-Ser(O-t-Bu)-OH，2.8；Fmoc-Thr(O-t-Bu)-OH，4.8；Fmoc-Trp(Boc)-OH，3.8；Fmoc-Tyr(O-t-Bu)-OH，4.1；Fmoc-Val-OH，11.3]。向每個孔加入上述溶液(0.5毫升)。搖擺反應(yīng)單元3小時，過濾，然后用二甲基酰胺清洗(三次，每次0.5毫升)。以相同的方式插入隨機(jī)的P3和P4位置。去除P4氨基酸的Fmoc，然后用二甲基酰胺清洗樹脂(三次，每次0.5毫升)，再使用乙醇加帽溶液(150微升，2.5毫摩爾)、1-羥基苯并三唑(340毫克，2.5毫摩爾)、含有二異丙基碳化二亞胺(390微升，2.5毫摩爾)的二甲基酰胺(10毫升)處理。經(jīng)過4小時搖擺后，使用二甲基酰胺(三次清洗，每次0.5毫升)和二氯甲烷(三次清洗，每次0.5毫升)清洗樹脂，然后使用95∶2.5∶2.5的TFA/TIS/H2O溶液處理。經(jīng)過一個小時培養(yǎng)，打開反應(yīng)單元，將其放入96深孔滴定平板中，然后用額外的斷裂溶液清洗孔(二次，每次0.5毫升)。濃縮收集板，使用乙醇(0.5毫升)稀釋含有底物的孔，然后再濃縮，并重復(fù)兩遍。使用CH3CN與H2O混合物冷凍脫水每個孔的內(nèi)涵物?；趩我坏孜锂a(chǎn)量每個孔的底物總量保守估計是0.0063毫摩爾(50％)。
A(2)庫的酶公析 通過在280納米測定吸光率確定蛋白水解酶的濃度(Gill，S.C等人，《分析生物化學(xué)》第182期第319-326頁)。使用MUGB和MUTMAC，通過活性位點的滴定定量測定出催化活性的凝血因子、胰蛋白酶、uPA、tPA和胰凝乳蛋白酶的比率(Jameson，GW等人，期刊《生物化學(xué)》1973年第131期第107-117頁)。
將來自PS-SCL的底物溶解在二甲亞砜中。將大約1.0×10-9摩爾的每種P1-Lys、P1-Arg、或者P1-Leu子庫(361種化合物)加入96孔顯微熒光板(Dynex Technologies，Chantilly，Va)的57個孔中，直至0.1微摩爾的最終濃度。將大約1.0×10-10摩爾的每種P1-多樣子庫(6859種化合物)加入96孔平板的20個孔中，直至每種化合物0.01微摩爾的最終濃度。加入酶(0.02-100納摩爾)引發(fā)水解反應(yīng)，然后，使用Perkin Elmer LS50B發(fā)光分光計進(jìn)行熒光監(jiān)測，在380納米下監(jiān)測激發(fā)光，在450或者460納米下監(jiān)測發(fā)射光。在25℃含有50毫摩爾三羥甲基氨基甲烷、100毫摩爾氯化鈉、0.5毫摩爾氯化鈣、0.01％吐溫-20和1％二甲亞砜(來自底物)的PH8.0緩沖液中，實施絲氨酸蛋白酶分析。在25℃含有100毫摩爾乙酸鈉、100毫摩爾氯化鈉、5毫摩爾二硫蘇糖醇、1毫摩爾EDTA、0.01％布里杰-35和1％二甲亞砜(來自底物)的PH5.5緩沖液中，實施半胱氨酸蛋白酶分析。
B.使用137.180底物序列的P1-多樣庫評價蛋白酶 為了測定所有氨基酸附著底物序列P1位點的可能性，構(gòu)建P1-多樣四肽庫。P1-多樣庫由20個孔組成，其中只有P1位置選取所有的氨基酸并系統(tǒng)保持不變，排除半胱氨酸并且包括正白氨酸。P2、P3、P4位置是由所有氨基酸的等摩爾混合物構(gòu)成，每個孔中共計6859種底物序列。評價一些絲氨酸與半胱氨酸蛋白酶，從而測定此庫對識別最佳P1氨基酸的實用性。胰凝乳蛋白酶對大型疏水氨基酸表現(xiàn)出預(yù)期的特異性。胰蛋白酶與凝血因子對P1-堿性氨基酸表現(xiàn)出優(yōu)先選擇性(Lys＞Arg)。粒酶B，具有P1-Asp特異性唯一公知的哺乳動物絲氨酸蛋白酶，與所有其它氨基酸相比對天門冬胺酸表現(xiàn)出顯著的優(yōu)先選擇性，其中也包括其它酸性氨基酸，Glu。人類中性白細(xì)胞彈性酶的P1評價對于丙氨酸和纈氨酸具有標(biāo)準(zhǔn)的優(yōu)先選擇性。盡管對于精氨酸具有適中的優(yōu)選選擇性，半胱氨酸蛋白酶、木瓜蛋白酶、克魯?shù)鞍酌副憩F(xiàn)出廣泛的P1底物序列特異性，并且眾所周知。
實施例7.篩選單個底物的斷裂 由底物庫測定出，使用對應(yīng)所需斷裂序列的單個肽底物，分析匹配所需特異性評價的變異體蛋白酶。使用最大光譜德耳塔熒光儀(分子設(shè)備)，進(jìn)行單個動力學(xué)測試。將每個蛋白酶在測定緩沖液中稀釋到5-500微摩爾濃度。使用MeSO稀釋所有ACC底物到5-500微摩爾濃度，同時將AMC底物稀釋到20-2000微摩爾濃度。每個分析物含有小于5％的MeSO。分別在380納米和460納米的激發(fā)與發(fā)射波長，每隔15秒測定酶活性，總共持續(xù)10分鐘。在1％二甲亞砜中實施所有的分析。
實施例8.篩選全長蛋白的斷裂 分析變異體蛋白酶，確定其斷裂了全長蛋白范圍內(nèi)所需的序列，并且分析靶蛋白的活性，證實其功能已經(jīng)被斷裂結(jié)果所破壞。使用變異體蛋白酶培養(yǎng)提純的全長蛋白后，采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法監(jiān)測斷裂結(jié)果。使用標(biāo)準(zhǔn)的庫馬西藍(lán)染色，或者使用放射性標(biāo)記蛋白通過放射自顯影，或者使用適當(dāng)?shù)目贵w通過蛋白質(zhì)印跡，顯影此蛋白。此外，如果靶蛋白是細(xì)胞表面受體，表達(dá)靶蛋白的細(xì)胞可以暴露于變異體蛋白酶。通過溶解細(xì)胞，然后利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離此蛋白，接著使用蛋白質(zhì)印跡顯影，測定斷裂結(jié)果。此外，采用酶聯(lián)免疫吸附測定法，可以定量分析由蛋白溶解釋放的可溶受體。
使用上述這些技術(shù)測定腫瘤壞死因子受體1和2(TNF-R1和TNF-R2)。將新鮮離析的中性白細(xì)胞(PMN)再次懸浮在1×107細(xì)胞/毫升含有0.2％胎兒牛血清(FCS)的RPMI1640溶液中，接著使用特異于腫瘤壞死因子受體1或者腫瘤壞死因子受體2莖部區(qū)域的各種濃度蛋白酶培養(yǎng)。在37℃下培養(yǎng)40分鐘后，加入蛋白酶抑制劑停止反應(yīng)，然后，使用酶聯(lián)免疫吸附測定法(Roche)，定量分析釋放到介質(zhì)中腫瘤壞死因子受體的含量。
盡管本發(fā)明已經(jīng)公開了制備并使用能夠斷裂靶多肽序列酶的方法，很顯然，在不超出本發(fā)明保護(hù)范圍的情況下可以做出各種改進(jìn)與修飾。
腫瘤壞死因子的斷裂 使用各種濃度蛋白酶培養(yǎng)125I-腫瘤壞死因子(40,000cpm)，然后將樣品放入十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)樣品緩沖液中煮沸，再在12％聚丙烯酰胺凝膠上測定。在-70℃下干燥凝膠并暴露于X光照片(Kodak)。
腫瘤壞死因子結(jié)合分析 使用上述各種濃度的蛋白酶培養(yǎng)125I-腫瘤壞死因子或者中性白細(xì)胞。利用閃爍現(xiàn)象定量測定暴露于對應(yīng)正常中性白細(xì)胞蛋白酶的125I-腫瘤壞死因子結(jié)合，或者暴露于蛋白酶對應(yīng)中性白細(xì)胞的正常125I-腫瘤壞死因子結(jié)合。然后，通過真空抽吸清洗細(xì)胞三次，接著將30微升閃爍液(Wallac)加入每個孔中。最后，使用Wallac Microbeta閃爍計數(shù)器記錄閃爍次數(shù)(由下列文獻(xiàn)改編van Kessel等人，期刊《免疫學(xué)》1991年第147期第3862-3868頁和Porteau等人，期刊《生物化學(xué)》1991年第266期第18846-18853頁)。
實施例9.鑒別靶蛋白并斷裂其中的位點 采用下述標(biāo)準(zhǔn)鑒別靶向斷裂與鈍化的蛋白(1)蛋白涉及病癥；(2)強(qiáng)烈的證據(jù)表明，蛋白是治療病癥的重要插入點；(3)蛋白溶解斷裂此蛋白極大可能地破壞了其功能。采用下列標(biāo)準(zhǔn)鑒別靶蛋白內(nèi)部的斷裂位點(1)斷裂位點位于蛋白的裸露表面；(2)按照原子結(jié)構(gòu)或者結(jié)構(gòu)預(yù)測算法(這些區(qū)域趨于在蛋白表面呈環(huán)型或者在細(xì)胞表面受體上呈莖狀)，斷裂位點位于缺少第二結(jié)構(gòu)的區(qū)域內(nèi)(即，不含有β折疊或者α螺旋)；(3)基于其公知的功能斷裂位點位于有可能鈍化蛋白的位點上。斷裂序列可以是，例如匹配許多絲氨酸蛋白酶擴(kuò)展底物特異性的四個殘基長度，但是也可以更長些或者更短些。
腫瘤壞死因子和腫瘤壞死因子受體 腫瘤壞死因子(TNF)是主要由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的前炎性細(xì)胞因子。通過與兩個表面結(jié)合受體的相互作用-腫瘤壞死因子受體p55(TNF-R1)和腫瘤壞死因子受體p57(TNF-R2)，腫瘤壞死因子引發(fā)了信號傳導(dǎo)。腫瘤壞死因子在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)病理生理學(xué)中發(fā)揮核心作用，并在患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人的滑膜與滑液中發(fā)現(xiàn)高濃度的腫瘤壞死因子。腫瘤壞死因子信號作用導(dǎo)致了其它前炎性細(xì)胞因子(Il-1、Il-6，GM-CSF)的生成，誘導(dǎo)產(chǎn)生了金屬蛋白酶，例如膠原蛋白酶和基質(zhì)降解酶，增加了破骨細(xì)胞活性并促進(jìn)了破骨細(xì)胞的增生；所有這些效果導(dǎo)致了滑膜炎、組織與骨骼的破壞。兩種類型的腫瘤壞死因子受體以可溶形式從細(xì)胞表面脫離，保留了其糖基結(jié)合能力。在生命體內(nèi)或者生命體外這些可溶的腫瘤壞死因子受體可以使腫瘤壞死因子的活性失效，因此可以認(rèn)定為是減弱細(xì)胞壞死因子信號的天然抑制劑。
血管內(nèi)皮生長因子 血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是在胚胎形成與成人生活過程中正常生成的內(nèi)皮細(xì)胞特異性促分裂素。血管內(nèi)皮生長因子是各種正常與病理過程中血管生成的重要介質(zhì)，其中包括腫瘤發(fā)生。腫瘤血管生成是腫瘤發(fā)展成可以轉(zhuǎn)移階段的重要過程。已經(jīng)鑒別出三種對于血管內(nèi)皮生長因子具有高親和力的同類受體VEGFR-1/Flt-1、VEGF-2/KDR和VEGFR-3/Flt-4。血管內(nèi)皮生長因子受體是在血管發(fā)育過程中起到信號分子作用的細(xì)胞表面受體酪氨酸激酶。
表皮生長因子受體和HER-2 受體酪胺酸激酶的ErbB族包括四個成員表皮生長因子(Her-1)、ErbB2(Her-2)、ErbB3(Her-3)和ErbB4(Her-4)。所有成員對正常細(xì)胞生長至關(guān)重要，并且都參與了正常的細(xì)胞功能。ErbB受體、特別是表皮細(xì)胞因子受體和ErbB2，通常在人類癌癥某些普通形式下解除管制。由于多種機(jī)理出現(xiàn)ErbB信號的失調(diào)，其中包括基因擴(kuò)增，增加受體轉(zhuǎn)錄的變異，或者增加受體活性的變異。通過與內(nèi)皮生長因子(EGF)的結(jié)合激活了ErbB受體，通過促分裂素-激活的蛋白激酶(MAPK)與活性/磷酸肌醇3-激酶(PI3-激酶)通路向下游發(fā)出信號，最終導(dǎo)致細(xì)胞增生、分化與血管生成。
潛在的蛋白水解斷裂位點 上述蛋白的蛋白水解斷裂位點匯集在表7中。
表7.所選疾病相關(guān)蛋白的斷裂序列 實施例11.粒酶BI99A/N218A變異體的斷裂評價

圖1顯示了半胱天冬酶-3的序列，半胱天冬酶-3是涉及一些細(xì)胞類型編程性細(xì)胞死亡通路的蛋白。野生型粒酶B分別在殘基175和176的天冬氨酸與絲氨酸之間斷裂了半胱天冬酶-3。粒酶B在位置99和218的變異將其特異性改變成分別在殘基263和264的天冬氨酸與丙氨酸之間斷裂。
圖2展示了聚焦在由I99A/N218A粒酶B在半胱天冬酶-3殘基260-265(序列編號2)斷裂的惰性序列結(jié)晶模型。在PS-SCL庫中P2、P3、P4位置上帶有各種殘基的情況下，變異粒酶B的特異性匯集在表3A中。通過野生型和N218A/I99A粒酶B分析形式為P4-P3-P2-Asp-AMC的PS-SCL庫；使用氨基酸繪制每個位置的底物特異性。與野生型的脯氨酸相比，變異體對于P2位置的苯丙氨酸表現(xiàn)出強(qiáng)出5倍的優(yōu)先選擇性。而且，變異體在P4位置接納了大型疏水氨基酸，包括苯丙氨酸和亮氨酸；而野生型通常只接納異亮氨酸和纈氨酸。
圖4展示了NH2-FSFDAT-COOH(序列編號2)斷裂的MALDI質(zhì)譜圖；NH2-FSFDAT-COOH(序列編號2)是半胱天冬酶鈍化序列，由半胱天冬酶殘基260-265組成。使用100納摩爾野生型粒酶B或者1微摩爾I99A/N218A培養(yǎng)鈍化序列18個小時。第一張照片展示了單獨肽的分子量。所顯示的是代表未斷裂肽準(zhǔn)確分子量的峰值。第二張照片展示了此肽與野生型粒酶B的混合結(jié)果。峰值再次表示未斷裂肽的準(zhǔn)確分子量，說明野生型粒酶B未能斷裂此肽。第三張照片展示了此肽與N218A/I99A變異體粒酶B的混合結(jié)果。在此照片中，峰值已經(jīng)轉(zhuǎn)而代表538.04的斷裂產(chǎn)物，代表了對于斷裂肽適當(dāng)尺寸(538Da)的斷裂產(chǎn)物。變異體粒酶B有效地斷裂了此肽。
圖5展示了在SDS-PAGE凝膠上的三個單獨反應(yīng)結(jié)果。在下列條件下培養(yǎng)含有大約50微摩爾半胱天冬酶-3的三個單獨試管泳道1只含有緩沖液；泳道2野生型粒酶B；泳道3粒酶BI99A/N218A。通過加入2倍SDS樣品緩沖液終止每個反應(yīng)，然后加熱到95℃，接著在兩性離子緩沖劑凝膠上電泳。第一泳道顯示了單獨的半胱天冬酶。第二泳道顯示了帶有野生型粒酶B的半胱天冬酶。第三泳道顯示了帶有變異體粒酶B的半胱天冬酶。變異體可以斷裂半胱天冬酶的小亞單元。
I99/N218A粒酶B斷裂并鈍化了全長的半胱天冬酶-3。在未含有蛋白酶、100納摩爾野生型粒酶B、或者1微摩爾I99/N218A粒酶B的粒酶B活性緩沖液中培養(yǎng)提純的半胱天冬酶-3(2微摩爾)18小時。將10微升每個反應(yīng)稀釋到90微升半胱天冬酶-3的活性緩沖液中；通過Ac-DEVD-AMC斷裂測定半胱天冬酶-3的活性。圖6A展示了隨時間繪制的半胱天冬酶-3活性的圖形。I99A/N218A粒酶B將半胱天冬酶-3鈍化到很低的活性水平。野生型粒酶B鈍化半胱天冬酶-3，使其活性低于對照的活性；但是，不影響變異體對半胱天冬酶-3的活性。這也表現(xiàn)在圖6B中，其中半胱天冬酶-3活性的Vmax顯示了來源于圖6A的數(shù)據(jù)。在變異體粒酶B存在下Vmax幾乎是零，其中野生型只是對照Vmax的一半。
在含有半胱天冬酶-3的細(xì)胞溶胞產(chǎn)物中，變異體粒酶B還有效地抑制了半胱天冬酶-3的活性與編程性細(xì)胞死亡。在圖7A中，向細(xì)胞溶胞產(chǎn)物加入了I99A/N218A粒酶B的顯示用量后，再培養(yǎng)18小時。通過加入熒光底物(Ac-DEVD-AMC)至最終濃度200微摩爾，然后分析半胱天冬酶-3的活性。通過斷裂活化序列(序列編號4)，在低濃度下變異體激活了半胱天冬酶-3；但是，通過斷裂其鈍化序列，在高濃度下變異體抑制半胱天冬酶-3。因此，I99A/N218A粒酶B在低濃度下誘導(dǎo)了編程性細(xì)胞死亡，但是，在高濃度下抑制編程性細(xì)胞死亡。圖7A繪制了隨著I99A/N218A變異體粒酶B濃度增長下半胱天冬酶-3的活性。隨著在細(xì)胞溶解產(chǎn)物中變異體粒酶B濃度的增長，半胱天冬酶-3活性降低。
在細(xì)胞溶胞產(chǎn)物中加入100納摩爾野生型粒酶B，誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡，在含有或者不含有所示用量的I99A/N218A粒酶B條件下，通過斷裂活化序列激活半胱天冬酶-3，然后，再培養(yǎng)18小時。通過Ac-DEVD-AMC斷裂分析半胱天冬酶的活性。通過對應(yīng)由I99A/N218A粒酶B誘導(dǎo)背景半胱天冬酶-3的活性，規(guī)范數(shù)據(jù)。如圖7B所示，在增加或者不增加I99A/N218A粒酶B的濃度下，向所有樣品細(xì)胞提取物加入100納摩爾野生型粒酶B。如圖7B所示，變異體粒酶B對抗野生型粒酶B通過鈍化半胱天冬酶-3誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡的效果。圖7B展示了，在100納摩爾野生型粒酶B存在下，隨著變異體粒酶B濃度變化半胱天冬酶-3片段活性的圖形。隨著變異體粒酶B濃度的增高，半胱天冬酶-3活性降低到低于只有野生型粒酶B存在的水平。
等效方案 盡管本發(fā)明已經(jīng)詳細(xì)公開了特殊具體實施方式
，但是通過實施例方式所做的公開僅起到說明的目的，并不對本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍加以限制。本發(fā)明人認(rèn)為，在不超出本發(fā)明權(quán)利要求限定保護(hù)范圍的條件下，可以對本發(fā)明進(jìn)行各種的替換、修改與修飾。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以認(rèn)定，參照文中所述具體實施方式
的內(nèi)容，篩選方法、蛋白酶支架、或者庫類型的選擇屬于常規(guī)問題?？梢哉J(rèn)為，本發(fā)明的其它方面、優(yōu)點與修飾屬于所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種鑒別斷裂底物序列蛋白酶的方法，其中包括，生成蛋白酶序列庫，其中相對于野生型支架序列、序列庫的每個成員具有N種變異的蛋白酶支架；測定序列庫每個成員斷裂底物序列的活性；然后，將每個成員的活性與序列庫平均活性相比較；由此a，鑒別出具有最高斷裂活性的蛋白酶；其中N是正整數(shù)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中蛋白酶是絲氨酸或者半胱氨酸蛋白酶。
3.權(quán)利要求1的方法，其中N是1。
4.權(quán)利要求1的方法，其中N是1-5的正整數(shù)。
5.權(quán)利要求1的方法，其中N是5-10的正整數(shù)。
6.權(quán)利要求1的方法，其中N是10-20的正整數(shù)。
7.權(quán)利要求1的方法，其中蛋白酶支架含有下述任一種微粒的氨基酸序列胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、凝血因子、纖維蛋白溶酶、凝血因子Xa、尿激酶型纖維蛋白酶原激活劑、組織纖維蛋白溶酶原激活劑、膜型絲氨酸蛋白酶-1、粒酶B、粒酶M、彈性蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性白細(xì)胞彈性蛋白酶、血漿激肽釋放酶、尿激素型纖溶酶原激活劑、補體因子絲氨酸蛋白酶、ADAMTS13、神經(jīng)肽鏈內(nèi)切酶/neprilysin、弗林蛋白酶、克魯?shù)鞍酌浮?br> 8.權(quán)利要求1的方法，其中靶蛋白涉及病癥。
9.權(quán)利要求8的方法，其中病癥是下述的一種病癥類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、敗血癥、癌癥、艾滋病、呼吸道感染、流行性感冒、心血管疾病、和哮喘。
10.權(quán)利要求8的方法，其中靶蛋白涉及產(chǎn)生病癥的途徑。
11.權(quán)利要求1的方法，其中靶蛋白涉及編程性細(xì)胞死亡。
12.權(quán)利要求11的方法，其中靶蛋白是半胱天冬酶-3。
13.權(quán)利要求1的方法，其中與序列庫平均活性相比測定的蛋白酶活性增長了至少10倍。
14.權(quán)利要求1的方法，其中與序列庫平均活性相比測定的蛋白酶活性增長了至少100倍。
15.權(quán)利要求1的方法，其中與序列庫平均活性相比測定的蛋白酶活性增長了至少1000倍。
16.權(quán)利要求1的方法，還包括下列步驟
提供了用斷裂活性增長鑒別出的兩種或者更多種蛋白酶庫成員；將第一種支架的變異與第二種支架的變異相結(jié)合，生成第三種支架；鑒別上述結(jié)合是否產(chǎn)生了相對于底物序列增加斷裂活性的組合特異性蛋白酶。
17.一種鑒別蛋白酶特異斷裂的底物序列的方法，其中包括，生成底物序列庫，序列庫每個成員具有隨機(jī)的氨基酸序列；測定蛋白酶斷裂序列庫每個成員的程度；因此，與序列庫其它成員的平均斷裂相比，檢測出被最有效斷裂的底物序列。
18.權(quán)利要求17的方法，其中蛋白酶是絲氨酸蛋白酶。
19.權(quán)利要求17的方法，其中底物序列庫的每個成員具有4個氨基酸長度。
20.權(quán)利要求17的方法，其中底物序列庫的每個成員具有5-10個氨基酸長度。
21.權(quán)利要求17的方法，其中底物序列庫的每個成員具有15個氨基酸長度。
22.權(quán)利要求17的方法，其中底物序列庫的每個成員具有20個氨基酸長度。
23.權(quán)利要求17的方法，其中靶蛋白含有底物序列。
24.權(quán)利要求23的方法，其中靶蛋白涉及病癥。
25.權(quán)利要求24的方法，其中病癥是下述的一種病癥類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、敗血癥、癌癥、艾滋病、呼吸道感染、流行性感冒、心血管疾病、炎癥、和哮喘。
26.權(quán)利要求24的方法，其中靶蛋白涉及產(chǎn)生病癥的途徑。
27.權(quán)利要求17的方法，其中與序列庫平均活性相比、測定底物序列的斷裂效率增長了至少10倍。
28.權(quán)利要求17的方法，其中與序列庫平均活性相比、測定底物序列的斷裂效率增長了至少100倍。
29.權(quán)利要求17的方法，其中與序列庫平均活性相比、測定底物序列的斷裂效率增長了至少1000倍。
30.一種治療帶有病癥患者的方法，其中包括將帶有N種變異的野生型蛋白酶給藥患者，其中蛋白酶是以足以斷裂涉及上述病癥靶蛋白的用量給藥，其中蛋白的斷裂治療了上述病癥，并且N是正整數(shù)。
31.權(quán)利要求30的方法，其中N是1。
32.權(quán)利要求30的方法，其中N是1-5的正整數(shù)。
33.權(quán)利要求30的方法，其中N是5-10的正整數(shù)。
34.權(quán)利要求30的方法，其中N是10-20的正整數(shù)。
35.權(quán)利要求30的方法，其中病癥是下述的一種病癥類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、敗血癥、癌癥、艾滋病、呼吸道感染、流行性感冒、心血管疾病、炎癥、和哮喘。
36.權(quán)利要求30的方法，其中蛋白酶是絲氨酸蛋白酶。
37.權(quán)利要求30的方法，其中靶蛋白造成了病癥。
38.權(quán)利要求30的方法，其中患者是哺乳動物。
39.權(quán)利要求30的方法，其中患者是人類。
40.權(quán)利要求30的方法，其中靶蛋白是下述的任一種蛋白腫瘤壞死因子受體、白介素-1、白介素-1受體、白介素-2、白介素-2受體、白介素-4、白介素-4受體、白介素-5、白介素-5受體、白介素-12、白介素-12受體、白介素-13、白介素-13受體、血小板選擇蛋白、血小板選擇蛋白糖蛋白配基、P物質(zhì)、緩激肽、凝血因子IX、免疫球蛋白E、免疫球蛋白E受體、CCR5、CXCR4、糖蛋白120、糖蛋白41、CD4、血凝素、呼吸合胞體病毒融合蛋白、B7、CD28、CD2、CD3、CD4、CD40、血管內(nèi)皮生長因子、血管內(nèi)皮生長因子受體、成纖維細(xì)胞生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子受體、內(nèi)皮生長因子、內(nèi)皮生長因子受體、轉(zhuǎn)化生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子受體、CCR1、CXCR3、CCR2、Src、Akt、B細(xì)胞受體-Ab1、胰高血糖素合酶激酶-3、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶-2和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶-4。
41.一種含有與粒酶B氨基酸序列95％相同多肽的組合物，其中多肽在下述位置具有至少一種變異171、174、180、215、192、218、99、57、189、190、或者226。
42.權(quán)利要求41的組合物，其中所述變異是在99位置上由丙氨酸替換異亮氨酸。
43.權(quán)利要求41的組合物，其中所述變異是在218位置上由丙氨酸替換天冬氨酸。
44.權(quán)利要求41的組合物，其中所述變異是在99位置上由丙氨酸替換異亮氨酸，并且在218位置上由丙氨酸替換天冬氨酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了制備改變對應(yīng)其剪切目標(biāo)分子特異性蛋白酶的方法。本發(fā)明還公開了使用上述蛋白酶治療涉及靶蛋白的疾病。使用蛋白酶在特定的底物序列剪切特定靶蛋白是一種治療上述病癥的方法。
文檔編號G01N33/573GK101124484SQ200380102653
公開日2008年2月13日 申請日期2003年10月2日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月2日
發(fā)明者杰克·內(nèi)蓋耶, 克里斯·撒安斯, 桑德拉·沃·拉格斯, 查爾斯·S·克雷克 申請人:催化劑生物科學(xué)有限公司, 加利福尼亞大學(xué)董事會