地衣芽孢桿菌在產(chǎn)氨肽酶中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物篩選及發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種地衣芽孢桿菌在產(chǎn)氨肽酶中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]蛋白質(zhì)控制酶解制備功能性蛋白、功能性肽和呈味基料是實現(xiàn)食物蛋白資源高值化利用的重要途徑。隨著酶解技術(shù)的成熟及蛋白質(zhì)控制酶解產(chǎn)業(yè)的高速發(fā)展，開發(fā)新型特異性蛋白酶的需求日益迫切。目前已有的商業(yè)蛋白酶種類繁多，但大多是內(nèi)切蛋白酶，僅少數(shù)是內(nèi)切蛋白酶與外切蛋白酶的復(fù)合物。內(nèi)切蛋白酶對大多數(shù)水產(chǎn)、動物蛋白有較高的水解效率，但對大?蛋白、小麥面筋蛋白、花生蛋白等植物蛋白的水解效率則不尚，存在蛋白利用率低、水解度低、苦味重等問題，加強外切蛋白酶的開發(fā)利用提高植物蛋白酶解利用效率有重要意義。氨肽酶的研究已有幾十年歷史，目前已經(jīng)商業(yè)化的氨肽酶種類極少。與從動植物中提取相比，利用微生物產(chǎn)氨肽酶得到了更多的關(guān)注，主要集中在產(chǎn)氨肽酶菌株的選育、酶的分離純化、酶學(xué)性質(zhì)研究、基因克隆及外源表達、氨肽酶的應(yīng)用等方面。從合適的菌株的篩選到最終的擴大發(fā)酵生產(chǎn)及應(yīng)用是一個漫長的過程，有很多理論基礎(chǔ)和技術(shù)難題需要解決，因此對氨肽酶相關(guān)的研究一直在繼續(xù)。
[0003]地衣芽孢桿菌有非常強的合成分泌大量水解酶類的能力，能廣泛利用各種營養(yǎng)物質(zhì)生長，蛋白的分泌量達到20_25g/L，在工業(yè)上被應(yīng)用于大量生產(chǎn)胞外酶。其中堿性蛋白酶是其主要生產(chǎn)酶類，年產(chǎn)量更是達到500噸。關(guān)于地衣芽孢桿菌產(chǎn)氨肽酶的研究及應(yīng)用卻相對較少。Rodriguez-Absi等在1978年從BaciIIus licheniformis中純化得到一種氨肽酶并對酶學(xué)性質(zhì)進行了研究。等于1989年從一株耐熱地衣芽孢桿菌中分離純化到了一種亮氨酸氨肽酶并研究了其酶學(xué)性質(zhì)。有研究者克隆了地衣芽孢桿菌的氨肽酶基因并在枯草芽孢桿菌中實現(xiàn)表達。本發(fā)明中產(chǎn)氨肽酶的地衣芽孢桿菌篩選自深海沉積物，對其液體發(fā)酵產(chǎn)氨肽酶的條件進行初步優(yōu)化的產(chǎn)氨肽酶的活力達3.6LAP.mL—1左右，對其所產(chǎn)氨肽酶的酶學(xué)性質(zhì)進行了研究，旨在為食品級氨肽酶產(chǎn)品的開發(fā)提供安全的生產(chǎn)菌種。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了解決以上現(xiàn)有技術(shù)的缺點和不足之處，本發(fā)明的首要目的在于提供一種地衣芽孢桿菌在產(chǎn)氨肽酶中的應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明的另一目的在于提供一種通過上述地衣芽孢桿菌所產(chǎn)的氨肽酶。
[0006]本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn):
[0007]—種地衣芽孢桿菌在產(chǎn)氨肽酶中的應(yīng)用，所述地衣芽孢桿菌為B a c i 11 u slicheniformis SWJS33，于2013年3月29日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為0610^0.7388。該菌株申請專利號為0吧01310214063.2。
[0008]優(yōu)選地，所述地衣芽孢桿菌在產(chǎn)氨肽酶中的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件如下:碳源5?6質(zhì)量份，氮源10?15質(zhì)量份，磷酸二氫鉀O?0.5質(zhì)量份，硫酸鎂0.1?0.3質(zhì)量份，硫酸銨O?I質(zhì)量份，氯化鈣0.5?I質(zhì)量份，氯化鈉20?50質(zhì)量份，水1000質(zhì)量份，pH7.0?7.6;裝液量10%?40%，搖床轉(zhuǎn)速150?250rpm，在25?40°C發(fā)酵36?60h。
[0009]更優(yōu)選地，所述地衣芽孢桿菌在產(chǎn)氨肽酶中的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件如下:碳源5質(zhì)量份，氮源10質(zhì)量份，磷酸二氫鉀0.5質(zhì)量份，硫酸鎂0.3質(zhì)量份，硫酸錢I質(zhì)量份，氯化|丐1質(zhì)量份，氯化鈉40質(zhì)量份，水1000質(zhì)量份，pH7.2;裝液量1 %，搖床轉(zhuǎn)速150rpm，在37 °C發(fā)酵48h。
[0010]優(yōu)選地，所述的碳源為可溶性淀粉、果糖或葡萄糖;更優(yōu)選可溶性淀粉。
[0011]優(yōu)選地，所述的氮源為酵母粉、SIP酶解物或大豆蛋白胨;更優(yōu)選酵母粉。
[0012]一種通過上述地衣芽孢桿菌所產(chǎn)的氨肽酶，所述氨肽酶的最適溫度為60°C，最適pH為8.0?8.5，對N端為亮氨酸的肽鍵具有水解特異性。
[0013]相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有如下優(yōu)點及有益效果:
[0014]本發(fā)明將深海來源的菌株Bacillus licheniformis SWJS33應(yīng)用于發(fā)酵生產(chǎn)氨肽酶，其培養(yǎng)條件簡單，產(chǎn)氨肽酶活力較高，且所產(chǎn)氨肽酶有較強的底物特異性;該菌株可能成為安全的氨肽酶生產(chǎn)菌種，值得繼續(xù)加強理論研究和基礎(chǔ)應(yīng)用研究。
【附圖說明】
[0015]圖1為實施例1在不同發(fā)酵溫度下菌株SWJS33所產(chǎn)氨肽酶活性測定結(jié)果圖；
[0016]圖2為實施例2在不同裝液量條件下菌株SWJS33所產(chǎn)氨肽酶活性測定結(jié)果圖；
[0017]圖3為實施例3以不同物質(zhì)作為碳源時菌株SWJS33所產(chǎn)氨肽酶活性測定結(jié)果圖；
[0018]圖4為實施例4以不同物質(zhì)作為氮源時菌株SWJS33所產(chǎn)氨肽酶活性測定結(jié)果圖；
[0019]圖5為實施例5在不同氯化鈉濃度下菌株SWJS33所產(chǎn)氨肽酶活性測定結(jié)果圖；
[0020]圖6為菌株SWJS33所產(chǎn)氨肽酶的輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜鑒定圖；
[0021]圖7為菌株SWJS33所產(chǎn)氨肽酶在不同溫度下的活力對比圖；
[0022]圖8為菌株SWJS33所產(chǎn)氨肽酶在不同pH條件下的活力對比圖；
[0023]圖9為菌株SWJS33所產(chǎn)氨肽酶對不同底物的特異性對比圖。
【具體實施方式】
[0024]下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
[0025]以下實施例所得氨肽酶活性測定如下:將粗酶液用pH8.0的Tris-HCl緩沖溶液稀釋到合適的濃度，取80yL樣品稀釋液加入96孔板中，加20yL L-亮氨酸對硝基苯胺(L-leu-PNA)，在40°C準確反應(yīng)1min后，加入10yL無水乙醇終止反應(yīng)，測定405nm下的吸光值。以不同濃度對硝基苯胺在405nm下的吸光值繪制標準曲線。40 °C每分鐘酶解L-亮氨酸-對硝基苯胺產(chǎn)生Iymol對硝基苯胺所需的酶量即為一個酶活單位。
[0026]實施例1
[0027]本實施例的一種地衣芽抱桿菌(Bacillus licheniformis SffJ S33 ,CGMCCN0.7388)在產(chǎn)氨肽酶中的應(yīng)用，取地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis SWJS33,CGMCCN0.7388)于種子培養(yǎng)基(蛋白胨5g，酵母粉Ig，人工海水IL，pH 7.4)中培養(yǎng)，將所得菌株用于發(fā)酵的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件如下:可溶性淀粉5g，酵母粉10g，磷酸二氫鉀0.5g，硫酸鎂
0.38，硫酸錢1〖，氯化|151〖，氯化鈉40〖，去離子水11^，？!17.2;裝液量10%，搖床轉(zhuǎn)速150rpm，分別在25°C、30°C、37°C和40°C溫度下發(fā)酵48h，得到氨肽酶的粗酶液。
[0028]本實施例在不同發(fā)酵溫度下所得粗酶液的氨肽酶活性測定結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出，在37°C下發(fā)酵所得氨肽酶活力最高，溫度升高到40°C或降低到30°C，菌株產(chǎn)氨肽酶的活力都大大減少。
[0029]實施例2
[0030]本實施例的一種地衣芽抱桿菌(Bacillus licheniformis SffJ S33 ,CGMCCN0.7388)在產(chǎn)氨肽酶中的應(yīng)用，取地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis SWJS33,CGMCCN0.7388)于種子培養(yǎng)基(蛋白胨5g，酵母粉Ig，人工海水IL，pH 7.4)中培養(yǎng)，將所得菌株用于發(fā)酵的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件如下:可溶性淀粉5g，酵母粉10g，磷酸二氫鉀0.5g，硫酸鎂
0.3g，硫酸銨I g，氯化鈣I g，氯化鈉40g，去離子水IL，pH7.2;裝液量分別為10%、20%、30%和40 %，搖床轉(zhuǎn)速150rpm，在37 °C溫度下發(fā)酵48h，得到氨肽酶的粗酶液。
[0031]本實施例在不同裝液量條件下所得粗酶液的氨肽酶活性測定結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出，裝液量在10%時氨肽酶活力最高，裝液量繼續(xù)增加時，氨肽酶產(chǎn)量迅速降低。
[0032]實施例3
[0033]本實