產(chǎn)高活性動(dòng)物蛋白水解酶的菌株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種產(chǎn)高活性動(dòng)物蛋白水解酶的 菌株及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 我國(guó)是一個(gè)動(dòng)物蛋白生產(chǎn)大國(guó)，屠宰畜禽的同時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的動(dòng)物血、內(nèi)臟、羽毛 等副產(chǎn)物，這些巨大的動(dòng)物蛋白副產(chǎn)資源如不能合理利用，不僅會(huì)引起環(huán)境污染，還會(huì)造成 嚴(yán)重的資源浪費(fèi)。
[0003] 這些動(dòng)物蛋白中蛋白質(zhì)含量較高，含多種功能性成分，且氨基酸種類均衡，微量元 素豐富。由于蛋白質(zhì)組成的特殊性，有些蛋白存在消化吸收率不高、功能性喪失等情況，故 需通過(guò)高水準(zhǔn)的深加工技術(shù)以提高動(dòng)物的消化吸收率或充分發(fā)揮其功能性成分。
[0004] 酶解法是目前處理動(dòng)物蛋白的主要方法之一。但通常動(dòng)物蛋白酶的價(jià)格較高，產(chǎn) 品不穩(wěn)定，直接導(dǎo)致后續(xù)的產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定。此外，目前現(xiàn)有的動(dòng)物蛋白酶的性能尚不能令 人滿意，主要表現(xiàn)能夠水解的動(dòng)物蛋白的種類不廣，對(duì)蛋白裂解的效率不夠高。
[0005] 因此，本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)可適用于多種動(dòng)物蛋白原料且蛋白裂解效率高的新型 動(dòng)物蛋白酶、制劑及相應(yīng)的技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的就是提供一種可適用于多種動(dòng)物蛋白原料且蛋白裂解效率高的新 型動(dòng)物蛋白酶、制劑及相應(yīng)的技術(shù)。
[0007] 在本發(fā)明的第一方面，提供了一種產(chǎn)動(dòng)物蛋白水解酶的菌株，所述菌株為表達(dá)動(dòng) 物蛋白水解酶的地衣芽孢桿菌，并且所述的動(dòng)物蛋白水解酶可酶解選自下組的動(dòng)物蛋白： 血紅蛋白、羽毛蛋白、豬肺蛋白、或其組合。
[0008] 在另一優(yōu)選例中，所述菌株的保藏號(hào)為CGMCC NO. 7287。
[0009] 在另一優(yōu)選例,所述動(dòng)物蛋白水解酶可酶解血紅蛋白、羽毛蛋白和豬肺蛋白。
[0010] 在另一優(yōu)選例，在以下測(cè)定條件下，經(jīng)所述的動(dòng)物蛋白水解酶酶解后，酶解產(chǎn)物中 小肽的含量> 80%，較佳地> 85%，更佳地> 90%，按酶解產(chǎn)物的干重計(jì)：
[0011] pH8. 5-10 (較佳地pH9. 0-9. 5)，動(dòng)物蛋白底物濃度10-12%，酶添加量為 800-1200U/g底物，溫度50-55°C，和酶解時(shí)間8-12小時(shí)。
[0012] 在另一優(yōu)選例，所述的小肽指出分子量彡1000 Da的肽。
[0013] 在另一優(yōu)選例中，用于生產(chǎn)動(dòng)物蛋白水解酶或用于制備降解動(dòng)物蛋白的制劑。
[0014] 在另一優(yōu)選例中，所述的制劑為酶制劑或活菌制劑。
[0015] 在本發(fā)明的第二方面，提供了一種生產(chǎn)動(dòng)物蛋白水解酶的方法，所述的方法包括 步驟：
[0016] (1)用本發(fā)明第一方面提供的菌株進(jìn)行發(fā)酵，得到含動(dòng)物蛋白水解酶的發(fā)酵液； 和
[0017] (2)從發(fā)酵液中分離所述的動(dòng)物蛋白水解酶。
[0018] 在另一優(yōu)選例中，步驟（1)中所述發(fā)酵在以下條件下進(jìn)行：
[0019] 發(fā)酵培養(yǎng)基的碳氮比（以碳源和有機(jī)氮源的質(zhì)量計(jì)）為1:1至5:2,優(yōu)選培養(yǎng)基碳 氮比為2:1。
[0020] 在另一優(yōu)選例中，所述的培養(yǎng)基碳源選自：淀粉（優(yōu)選可溶性）、蔗糖、乳糖、麥芽 糊精、葡萄糖及其組合。
[0021] 在另一優(yōu)選例中，所述碳源為葡萄糖。
[0022] 在另一優(yōu)選例中，所述的培養(yǎng)基的氮源選自：牛骨胨、生物氮素、植物蛋白胨、肉蛋 白胨、大豆蛋白胨及其組合。
[0023] 在另一優(yōu)選例中，所述氮源為大豆蛋白。
[0024] 在另一優(yōu)選例，在步驟（1)中的發(fā)酵條件包括：
[0025] 所述碳源的添加量為0. 1-3. Owt%，基于培養(yǎng)基總重量計(jì)。
[0026] 所用的氮源添加量為0. 1-3. Owt%，基于培養(yǎng)基總重量計(jì)；
[0027] 所述的碳氮比為2:1。
[0028] 在另一優(yōu)選例中，所述的發(fā)酵液是含菌體的發(fā)酵液。
[0029] 在另一優(yōu)選例中，所述發(fā)酵液是通過(guò)包括以下步驟的方法制備：
[0030] 將所述菌株接種至培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，得到種子液；
[0031] 將所述種子液接種入發(fā)酵罐，形成發(fā)酵體系；和
[0032] 對(duì)所述發(fā)酵體系進(jìn)行培養(yǎng)，得到發(fā)酵后的發(fā)酵液。
[0033] 在另一優(yōu)選例中，在發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，在以下條件下培養(yǎng)：培養(yǎng)溫度37±3°C，發(fā)酵起 始 pH6. 5-8. 0 (較佳地 7. 2±0. 3);和 / 或
[0034] 在培養(yǎng)或發(fā)酵時(shí)，當(dāng)碳氮比為1 :1_4 :1，較佳地碳氮比為（1. 5-2. 5) :1。
[0035] 在本發(fā)明的第三方面，提供了一種對(duì)動(dòng)物蛋白進(jìn)行水解的方法，所述方法包括步 驟：
[0036] 在本發(fā)明的第一方面所述菌株的存在下，和/或在本發(fā)明的第一方面所述菌株產(chǎn) 生的動(dòng)物蛋白水解酶的存在下，對(duì)動(dòng)物蛋白進(jìn)行水解，從而形成水解產(chǎn)物。
[0037] 在另一優(yōu)選例中，所述水解在pH8. 0-10條件下進(jìn)行。
[0038] 在另一優(yōu)選例中，所述動(dòng)物蛋白包括血紅蛋白、羽毛蛋白、豬肺蛋白或其組合。
[0039] 在另一優(yōu)選例中，所述的酶解條件為底物濃度為5%_20%(以干物質(zhì)計(jì)），酶添加量 為 200-1500U/g (以干物質(zhì)計(jì)），溫度為 37°C _60°C，時(shí)間為 6h-12h，pH 為 7. 0-11. 0。
[0040] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實(shí)施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附圖說(shuō)明】
[0041] 圖1顯示了本發(fā)明的菌株的形態(tài)，其中所述菌種為地衣芽孢桿菌，其細(xì)胞形態(tài)和 排列呈桿狀、單生，菌落扁平，邊緣不整齊，革蘭氏陽(yáng)性菌。
[0042] 圖2顯示了不同碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響。
[0043] 圖3顯示了不同氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響。
[0044] 圖4顯示了不同碳氮比對(duì)產(chǎn)酶的影響。
[0045] 圖5顯示了不同初始pH對(duì)產(chǎn)酶的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0046] 發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，首次從環(huán)境（含動(dòng)物蛋白的污水與污泥）中篩選 到一株對(duì)動(dòng)物蛋白具有優(yōu)良降解效果的菌株，并經(jīng)過(guò)進(jìn)一步誘變處理，最終篩選到一株對(duì) 動(dòng)物蛋白有優(yōu)異降解效果的地衣芽孢桿菌，該菌株并命名為地衣芽孢桿菌Z5。性能測(cè)試表 明，該地衣芽孢桿菌Z5的遺傳穩(wěn)定性好，產(chǎn)酶量高，安全性高，產(chǎn)品穩(wěn)定，制備工藝簡(jiǎn)便。對(duì) 于多種常見(jiàn)的動(dòng)物蛋白原料的測(cè)試表明，經(jīng)本發(fā)明菌株所產(chǎn)的動(dòng)物蛋白酶降解后，小肽含 量可高達(dá)90%以上，具有極高的應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明可有助利用動(dòng)物蛋白生產(chǎn)功能性蛋白肽。 在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
[0047] 菌株
[0048] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"本發(fā)明菌株"、"本發(fā)明地衣芽孢桿菌Z5"、"本發(fā)明工程菌"、"本 發(fā)明的保藏菌株"可互換使用，指保藏于CGMCC的保藏號(hào)為CGMCC No. 7287菌株或由該菌株 得到的衍生菌株，其中包括經(jīng)傳代培養(yǎng)得到的菌株。
[0049] 本發(fā)明菌株是如下獲得的：
[0050] (a)對(duì)從可能存在動(dòng)物蛋白酶菌株的環(huán)境（如含動(dòng)物蛋白的生產(chǎn)污泥與污水）取 一定量的樣本，于富集培養(yǎng)基中進(jìn)行富集，然后對(duì)富集液進(jìn)行稀釋，通過(guò)涂布進(jìn)行分離，得 到各種不同的單菌落。
[0051] (b)對(duì)獲得的各種單菌落進(jìn)行初篩，得到酶活性較高的菌株。
[0052] (C)對(duì)初篩所獲得的菌株，進(jìn)一步制備其發(fā)酵產(chǎn)物，制得粗酶液后，測(cè)定酶活，進(jìn)一 步選取酶活性高的菌株。
[0053] ⑷對(duì)于步驟（C)中選出的菌株，進(jìn)一步進(jìn)行誘變處理，并測(cè)定誘變處理后菌株的 酶活性，最終確定誘變后酶活性效果優(yōu)異的菌株，作為工程菌。
[0054] 在本發(fā)明中，經(jīng)過(guò)上述方法，成功地篩選到一株動(dòng)物蛋白酶活性優(yōu)異的菌株，即本 發(fā)明的地衣芽孢桿菌Z5。
[0055] 對(duì)本發(fā)明的所述地衣芽孢桿菌Z5進(jìn)行的研究表明，
[0056] 本發(fā)明菌株為地衣芽孢桿菌。如圖1所示，其細(xì)胞形態(tài)和排列呈桿狀、單生，菌落 扁平，邊緣不整齊，屬于革蘭氏陽(yáng)性菌。
[0057] 對(duì)該地衣芽孢桿菌的特性進(jìn)行的研究表明，該菌株的一些主要特性如下：
[0058] 最適培養(yǎng)溫度37 ± 3°C，發(fā)酵起始pH6. 5-8. 0 (較佳地7. 2 ± 0. 3)，碳源和氮源無(wú)特 別偏好，其中葡萄糖為優(yōu)選的碳源，大豆蛋白胨為優(yōu)選的氮源。
[0059] 此外，在培養(yǎng)或發(fā)酵時(shí)，當(dāng)碳氮比為1 :1_4 :1時(shí)，所得到的動(dòng)物蛋白酶的酶活較 高，尤其是當(dāng)碳氮比為（1.5-2. 5): 1時(shí)，酶活最高。
[0060] 對(duì)于所制備的本發(fā)明動(dòng)物蛋白酶，其合適酶解pH為7-11，酶解溫度為37°c-60°c。
[0061] 用于培養(yǎng)本發(fā)明菌株的培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)源沒(méi)有特別的限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以 根據(jù)公知的技術(shù)來(lái)選擇合適的碳源、氮源和其他營(yíng)養(yǎng)源。例如，碳源可以是淀粉、糊精、葡萄 糖、果糖、蔗糖、甘油、肌醇、甘露醇等。氮源可以是胨、大豆蛋白胨、大豆粉、黃豆餅粉、肉膏、 蛋白粉、麥皮、米糖、酵母粉、玉米漿、銨鹽以及其他有機(jī)物或無(wú)機(jī)含氮化合物。另外，培養(yǎng)基 中還可適當(dāng)加入一些無(wú)機(jī)鹽類，如氯化鈉、磷酸鹽（如磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀等）、硫酸 錳、硫酸銨、硫酸鎂、碳酸鈣等金屬鹽。通?？刹捎酶鞣N已知的常規(guī)培養(yǎng)基，如LB瓊脂培養(yǎng) 基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、葡萄糖酵母膏瓊脂培養(yǎng)基和牛肉浸汁瓊脂培養(yǎng)基等對(duì)本發(fā)明菌株進(jìn) 行斜面固體培養(yǎng)并4°C環(huán)境下進(jìn)行初步保藏。
[0062] 對(duì)于本發(fā)明菌株而言，可以選用本領(lǐng)域常用的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。在具體實(shí)施方案 中，一些代表性的培養(yǎng)基包括（但并不限于）：
[0063] (1)富集培養(yǎng)基（g/L):葡萄糖8. 0,氯化鈉3. 0,血紅蛋白10, ρΗ7· 2。
[0064] (2)酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（g/L):酪蛋白10.0,牛肉浸粉3.0,氯化鈉5.0,磷酸氫二 鉀2. 0,瓊脂15. 0,溴百里香芬蘭0· 05, ρΗ7· 2。
[0065] (3)種子培養(yǎng)基（g/L):葡萄糖6.0,蛋白胨5.0,酵母膏5.0,氯化鈉5.0, ρΗ7· 2。
[0066] (4)初始發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L):葡萄糖5. 0,大豆蛋白胨10. 0,尿素3. 0,氯化鈉2. 0， 磷酸二氫鉀1.0, PH7. 2。
[0067] 然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明并不局限于本文中列舉的這些具體培養(yǎng) 基配方。
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