一種提取微小rna的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本實用新型涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體而言，涉及一種提取微小RNA的試劑盒，包括盒體、裝有第一磁珠液的試劑瓶、裝有第二磁珠液的試劑瓶、裝有裂解液的試劑瓶、裝有洗脫液的試劑瓶以及裝有洗滌液的試劑瓶；盒體的內(nèi)底壁上設(shè)置有泡沫墊；且泡沫墊的邊沿與盒體的內(nèi)側(cè)壁相貼；泡沫墊上設(shè)置有五個凹槽，每個凹槽內(nèi)分別設(shè)置有一個試劑瓶；第一磁珠液內(nèi)包括多個表面修飾有能夠與微小RNA配對的靶向序列或隨機序列的第一磁珠；第二磁珠液內(nèi)包括多個表面修飾有帶負(fù)電荷的親水性高分子聚合物的第二磁珠。本實用新型的這種試劑盒可更高效的提取血漿或者血清中的微小RNA，特別適合提取血漿或者血清樣品中含量較低或者低拷貝的微小RNA。
【專利說明】—種提取微小RNA的試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實用新型涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體而言，涉及一種提取微小RNA的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]微小RNA CmiRNAs)是一類長度為21?25個核糖核苷酸的非編碼內(nèi)源性小單鏈RNAs分子。1993年,Lee等首次在線蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)第一個miRNA (lin-4),能在翻譯水平通過抑制核蛋白lin-14的表達(dá)來調(diào)節(jié)線蟲的幼蟲發(fā)育進(jìn)程。隨后，科學(xué)家們應(yīng)用隨機克隆和測序、生物信息學(xué)預(yù)測的方式，發(fā)現(xiàn)miRNAs廣泛存在于靈長類、嚙齒類、鳥類、魚類、蠅類、蠕蟲類、植物、病毒中。從2002年有統(tǒng)計的200多種到2008年底的將近9000種，miRNAs的發(fā)現(xiàn)呈現(xiàn)爆發(fā)性增長，并且不斷有新物種中的miRNAs被發(fā)現(xiàn)。
[0003]人類miRNAs基因僅約占基因總數(shù)的2%_3%，但卻能調(diào)控人體內(nèi)1/3的蛋白表達(dá)，這種轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用直接影響了這些靶基因的功能，參與了生物體內(nèi)的多個系統(tǒng)的生理、病理過程。miRNAs在生物體中的作用涉及發(fā)育、老化、分泌、代謝、病毒感染、免疫反應(yīng)、腫瘤等等方面，尤其是作為癌基因或者抑癌基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用顯的尤為重要。miRNAs基礎(chǔ)與臨床研究的最終目的是要為疾病的診斷、治療、預(yù)防提供有效的方向。對多個腫瘤細(xì)胞系和正常細(xì)胞系miRNAs表達(dá)譜的分析表明，特定的miRNAs表達(dá)譜能夠標(biāo)識特定的腫瘤生物特征或病理生理過程。
[0004]有研究表明，不同類型的消化系統(tǒng)腫瘤有特定的miRNAs異常表達(dá)，和mRNA表達(dá)譜的零散不同，miRNAs在特定腫瘤中聚集成簇表達(dá)，如miR-192、miR-194、miR-215在腸源性腫瘤中成簇高表達(dá)，因此miRNAs可以作為癌癥診斷的工具。
[0005]由于血清或血漿中miRNAs比較穩(wěn)定，且其具有潛在的疾病標(biāo)志物的巨大價值。對于腫瘤患者診斷具有較好的敏感性及特異性，加上取材的相對無創(chuàng)性，顯示出了其作為腫瘤標(biāo)志物的優(yōu)勢。
[0006]在相關(guān)技術(shù)中，現(xiàn)在有一些miRNAs提取試劑盒可以用于血清或血漿中miRNAs提取，例如，美國Qiagen公司的miRNeasy mini kit。但是,利用這種試劑盒其提取miRNAs的
效率較差。
實用新型內(nèi)容
[0007]本實用新型的目的在于提供一種提取微小RNA的試劑盒，以解決上述的問題。
[0008]在本實用新型的實施例中提供了一種提取微小RNA的試劑盒，包括盒體、裝有第一磁珠液的試劑瓶、裝有第二磁珠液的試劑瓶、裝有裂解液的試劑瓶、裝有洗脫液的試劑瓶以及裝有洗滌液的試劑瓶；
[0009]所述盒體的內(nèi)底壁上設(shè)置有泡沫墊；且所述泡沫墊的邊沿與所述盒體的內(nèi)側(cè)壁相貼；
[0010]所述泡沫墊上設(shè)置有五個凹槽，每個所述凹槽內(nèi)分別設(shè)置有一個所述試劑瓶；
[0011]所述第一磁珠液內(nèi)包括多個表面修飾有能夠與微小RNA配對的靶向序列或隨機序列的第一磁珠；所述第二磁珠液內(nèi)包括多個表面修飾有帶負(fù)電荷的親水性高分子聚合物的第二磁珠。
[0012]本實用新型實施例提供的提取微小RNA的試劑盒，其內(nèi)部設(shè)置了裝有第一磁珠液的試劑瓶、裝有第二磁珠液的試劑瓶、裝有裂解液的試劑瓶、裝有洗脫液的試劑瓶以及裝有洗滌液的試劑瓶；在進(jìn)行微小RNA提取的過程中，可利用裝有裂解液的試劑瓶中的裂解液將血清或者血漿樣品中被包裹的核酸(包括微小RNA)游離，在通過將含有游離核酸的樣品與第一磁珠液混合，由于第一磁珠液中含有表面修飾能夠與微小RNA配對的靶向序列或隨機序列，因此游離的微小RNA可以被第一磁珠捕獲，并吸附在第一磁珠的表面；而在利用第一磁珠捕獲微小RNA的過程中，可以在混合液中加入第二磁珠液，第二磁珠液中含有的第二磁珠起到增強磁場的作用，進(jìn)而使得第一磁珠在磁吸的過程中不被或者很少被遺失，提高了第一磁珠的獲得率。捕獲有微小RNA的第一磁珠再通過洗滌液洗滌之后，其表面所吸附的大量的雜質(zhì)(核酸雜質(zhì)以及少量的蛋白質(zhì))可被去除；最后再通過洗脫液試劑瓶中的洗脫液將表面吸附有微小RNA的第一磁珠洗脫之后，即可得到微小RNA。
[0013]通過熒光定量PCR證明，通過本實用新型的微小RNA提供的試劑盒所抽提的微小RNA其檢測所得的Ct值(熒光信號達(dá)到設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))比現(xiàn)有技術(shù)中Qiagen公司的miRNeasy mini kit所提取的微小RNA低，因此,本實用新型實施例提供的這種試劑盒可更高效的提取血漿或者血清中的微小RNA，特別適合提取血漿或者血清樣品中含量較低或者低拷貝的微小RNA。
[0014]可選的，所述盒體為一個具有開口的矩形盒體，且所述矩形盒體的開口與底壁相對；所有所述凹槽均由從所述矩形盒體的底壁到所述開口的方向延伸。
[0015]可選的，所有所述試劑瓶均為圓柱形，所有所述凹槽的橫截面均為圓形；每個所述凹槽的內(nèi)壁與其對應(yīng)設(shè)置的所述試劑瓶的外壁相貼合。
[0016]可選的，多個所述第一磁珠的平均粒徑為40_80nm。
[0017]可選的，所述第二磁珠的平均粒徑大于500nm。
[0018]本實用新型實施例還提供了一種微小RNA的提取方法，包括以下步驟:
[0019]在血清或者血漿樣品中加入所述裂解液進(jìn)行裂解，得到裂解混合物，將所述裂解混合物離心，得到上清液；
[0020]在所述上清液中加入第一磁珠液，并進(jìn)行混勻，得到第一磁珠表面捕獲有微小RNA的第一混合液；
[0021]在所述第一混合液中加入第二磁珠液，并進(jìn)行混勻，得到第二混合液；
[0022]將所述第二混合液放置在外加磁場下進(jìn)行磁吸，并將所述第二混合液中的液體除去，得到混合磁珠；
[0023]在所述混合磁珠中加入洗滌液，并使得吸附在所述混合磁珠表面雜質(zhì)溶解，再在外加磁場作用下，將溶有雜質(zhì)的洗滌液吸除；
[0024]將洗滌后的所述混合磁珠晾干后加入洗脫液，進(jìn)行震蕩混勻，在65_75°C下孵育8-12分鐘后冰浴1-3分鐘，使得吸附在第一磁珠表面的微小RNA溶解在洗脫液中，得到含有微小RNA的磁珠液；
[0025]將含有微小RNA的磁珠液中的液體與混合磁珠分離，并保存至離心管中，得到微小 RNA。[0026]通過上述的方法在提取血清或者血漿樣品中的微小RNA時，由于第一磁珠的表面修飾有能夠與微小RNA配對的隨機序列或者靶向序列；因此，在將上清液和第一磁珠液按照既定的體積比混合后，上清液中的游離微小RNA可以與第一磁珠表面的序列配對并結(jié)合，進(jìn)而被第一磁珠捕獲，得到第一混合液。更為重要的，當(dāng)?shù)谝换旌弦号c第二磁珠液混合之后，第二磁珠會對外加磁場產(chǎn)生強烈的磁場增強作用，使得吸附有大量游離的微小RNA(包括一些低拷貝微小RNA和含量極低的微小RNA)的第一磁珠在磁吸的過程中不被或者很少被遺失，提聞了第一磁珠的獲得率，進(jìn)而直接提聞了微小RNA的抽提效率。吸附有微小RNA的第一磁珠在通過洗滌以及洗脫之后則可得到微小RNA。
[0027]可選的，在所述在血清或者血漿樣品中加入裂解液進(jìn)行裂解，得到裂解混合物，將所述裂解混合物離心，得到上清液的步驟中，
[0028]所述裂解液中包括表面活性劑、異硫氰酸鹽、胍鹽、鋰鹽、RNA酶抑制劑、金屬離子螯合劑、PH值為6.5-8.5的緩沖液，或這些試劑的組合。
[0029]可選的，在所述在血清或者血漿樣品中加入裂解液進(jìn)行裂解，得到裂解混合物，將所述裂解混合物離心，得到上清液的步驟中，
[0030]所述裂解的時間為:10-20分鐘；所述離心的轉(zhuǎn)速為10000-12000轉(zhuǎn)/分鐘；所述離心的時間為5-15分鐘。
[0031]可選的，在所述步驟在所述混合磁珠中加入洗滌液，并使得吸附在所述混合磁珠表面雜質(zhì)溶解，再將溶有雜質(zhì)的洗滌液吸除；得到洗滌后的混合磁珠中；
[0032]所述洗滌液為含有有機溶液或不含有有機溶液的緩沖液體系，有機溶液可為不同比例的乙醇、異丙醇或其混合液；不含有有機溶液的緩沖液為PH值在6.5?8.5之間的緩沖液體系，較優(yōu)PH值范圍為7.5?8.5之間；不含有有機溶液的緩沖液中可含有少量非離子型表面活性劑，非離子型表面活性劑濃度不超過體積比1%。
[0033]可選的，在所述將所述洗滌后的混合磁珠晾干后加入洗脫液，進(jìn)行震蕩混勻，并在65-75°C下孵育8-12分鐘后冰浴1_3分鐘，使得吸附在第一磁珠表面的微小RNA溶解在洗脫液中，得到含有微小RNA的磁珠液的步驟中；
[0034]所述洗脫液為超純水或適合反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的各種緩沖液。。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0035]圖1示出了本實用新型實施例一提供的提取微小RNA的試劑盒的示意圖；
[0036]圖2示出了本實用新型實施例三提供的微小RNA提取方法的流程圖；
[0037]圖3示出了應(yīng)用本實用新型實施例的試劑盒手動提取血清中微小RNA的熒光定量PCR檢測結(jié)果及其與商業(yè)化試劑盒抽提效率的對比；
[0038]圖4示出了應(yīng)用本實用新型實施例的試劑盒自動高通量提取血清中微小RNA的熒光定量PCR檢測結(jié)果。
【具體實施方式】
[0039]下面通過具體的實施例子并結(jié)合附圖對本實用新型做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
[0040]實施例一
[0041]請結(jié)合圖1，在本實用新型的實施例中提供了一種提取微小RNA的試劑盒，包括盒體101、裝有第一磁珠液的試劑瓶102、裝有第二磁珠液的試劑瓶103、裝有裂解液的試劑瓶104、裝有洗脫液的試劑瓶105以及裝有洗滌液的試劑瓶106 ；
[0042]盒體101的內(nèi)底壁上設(shè)置有泡沫墊107 ;且泡沫墊107的邊沿與盒體101的內(nèi)側(cè)
壁相貼；
[0043]泡沫墊107上設(shè)置有五個凹槽，裝有第一磁珠液的試劑瓶102、裝有第二磁珠液的試劑瓶103、裝有裂解液的試劑瓶104、裝有洗脫液的試劑瓶105以及裝有洗滌液的試劑瓶106分別設(shè)置在五個凹槽上；
[0044]第一磁珠液內(nèi)包括多個表面修飾能夠與微小RNA配對的靶向序列或隨機序列的第一磁珠；第二磁珠液內(nèi)包括多個表面修飾有帶負(fù)電荷的親水性高分子聚合物的第二磁珠。
[0045]本實用新型實施例提供的提取微小RNA的試劑盒，其內(nèi)部設(shè)置了裝有第一磁珠液的試劑瓶102、裝有第二磁珠液的試劑瓶103、裝有裂解液的試劑瓶104、裝有洗脫液的試劑瓶105以及裝有洗滌液的試劑瓶106 ;在進(jìn)行微小RNA提取的過程中，可利用裝有裂解液的試劑瓶104中的裂解液將血清或者血漿樣品中被包裹的核酸(包括微小RNA)游離，在通過將含有游離核酸的樣品與第一磁珠液混合，由于第一磁珠液中含有表面修飾能夠與微小RNA配對的靶向序列或隨機序列，因此游離的微小RNA可以被第一磁珠捕獲，并吸附在第一磁珠的表面；而在利用第一磁珠捕獲微小RNA的過程中，可以在混合液中加入第二磁珠液，第二磁珠液中含有的第二磁珠起到增強磁場的作用，進(jìn)而使得第一磁珠在磁吸的過程中不被或者很少被遺失，提高了第一磁珠的獲得率。捕獲有微小RNA的第一磁珠再通過洗滌液洗滌之后，其表面所吸附的大量的雜質(zhì)(核酸雜質(zhì)以及少量的蛋白質(zhì))可被去除；最后再通過洗脫液試劑瓶中的洗脫液將表面吸附有微小RNA的第一磁珠洗脫之后，即可得到微小RNA。
[0046]通過熒光定量PCR證明，通過本實用新型的微小RNA提供的試劑盒所抽提的微小RNA其檢測所得的Ct值(熒光信號達(dá)到設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))比現(xiàn)有技術(shù)中Qiagen公司的miRNeasy mini kit所提取的微小RNA低。因此,本實用新型實施例提供的這種試劑盒可更高效的提取血漿或者血清中的微小RNA，特別適合提取血漿或者血清樣品中含量較低或者低拷貝的微小RNA。
[0047]為了使得本實用新型實施例一的提取微小RNA的試劑盒得到更好的應(yīng)用，更加有效應(yīng)用到生物【技術(shù)領(lǐng)域】中，本實用新型還在上述實施例一的基礎(chǔ)之上提供了實施例二，實施例二是在上述實施例一的試劑盒的基礎(chǔ)上做出的詳細(xì)的闡述和解釋，請參考圖1:
[0048]實施例二
[0049]在本實施例中，為了便于在盒體101內(nèi)設(shè)置泡沫墊107和多個試劑瓶:優(yōu)選的，盒體101為一個具有開口的矩形盒體，且矩形盒體的開口與底壁相對；所有凹槽均由從矩形盒體的底壁到開口的方向延伸。
[0050]另外，為了能夠便于試劑瓶放置在其對應(yīng)的凹槽上，其還為了防止在運輸?shù)倪^程中，盒體101倒伏之后試劑瓶易于與凹槽脫離，進(jìn)而造成試劑瓶破碎等意外現(xiàn)象的發(fā)生，優(yōu)選的，所有試劑瓶均為圓柱形，所有凹槽的橫截面均為圓形；每個凹槽的內(nèi)壁與其對應(yīng)設(shè)置的試劑瓶的外壁相貼合。
[0051]此外，在本實施例中，為了增大第一磁珠的比表面積，進(jìn)而具有更好的捕獲微小RNA的效果，優(yōu)選的,第一磁珠的平均粒徑為40-80nm。而第二磁珠主要起到磁場增強的作用，因此，其粒徑應(yīng)設(shè)置加大，優(yōu)選的，以其平均粒徑大于500nm為佳。
[0052]接下來，本實用新型實施例還提供了一種利用上述實施例的試劑盒提取微小RNA的方法；請參考實施例二以及圖2:
[0053]實施例三
[0054]本實施例具體包括以下步驟:
[0055]步驟101:在血清或者血漿樣品中加入裂解液進(jìn)行裂解，得到裂解混合物，將裂解混合物離心，得到上清液；
[0056]此步驟為將樣品進(jìn)行裂解的過程，通過加入的裂解液，樣品中被包裹的的核酸可被釋放出來，通過離心之后，大顆粒的雜質(zhì)則形成沉淀，而微小RNA則包含在上清液中，以進(jìn)行后續(xù)的分離。
[0057]另外，在上述步驟中，為了提高裂解效率，使得樣品中的微小RNA盡可能的釋放完全，優(yōu)選的，裂解液中包括表面活性劑、異硫氰酸鹽、胍鹽、鋰鹽、RNA酶抑制劑、pH值為
6.5-8.5的緩沖液，或這些試劑的組合。
[0058]并且，優(yōu)選的裂解的時間為:10-20分鐘；離心的轉(zhuǎn)速為10000-12000轉(zhuǎn)/分鐘；離心的時間為5-15分鐘。在上述條件下，裂解的效果更好，大量的微小RNA以及含量以及的微小RNA或者低拷貝的微小RNA均會游離，進(jìn)而會被第一磁珠更好的吸附。
[0059]步驟102:在上清液中加入第一磁珠液，并進(jìn)行混勻，得到第一磁珠表面捕獲有微小RNA的第一混合液；
[0060]在步驟102中，第一磁珠液中的第一磁珠可以將上清液中的微小RNA捕獲，進(jìn)而使得上清液中大量的微小RNA特異性的結(jié)合在第一磁珠的表面，而為了提高結(jié)合的效率，優(yōu)選的，第一磁珠占第一磁珠液的0.5-1.5%，在第一混合液中，第一磁珠液與上清液的體積為:1:2.5-1:20。
[0061]步驟103:在第一混合液中加入第二磁珠液，并進(jìn)行混勻，得到第二混合液；
[0062]在該步驟中，所加入的第二磁珠液，其主要起到磁場增強的作用，進(jìn)而使得第一磁珠獲得率提高。優(yōu)選的，其中，按照重量百分?jǐn)?shù)計，在第二磁珠液中，第二磁珠占第二磁珠液的0.5-1.5%，在第二混合液中，第二磁珠液與第一磁珠液的體積比為:1:5-1:20 ;而且為了增大第一磁珠的比表面積，進(jìn)而具有更好的捕獲微小RNA的效果，優(yōu)選的，第一磁珠的平均粒徑為40-80nm。而第二磁珠主要起到磁場增強的作用，因此，其粒徑應(yīng)設(shè)置加大，優(yōu)選的，以其平均粒徑大于500nm為佳。
[0063]步驟104:將第二混合液放置在外加磁場下進(jìn)行磁吸，并將第二混合液中的液體除去，得到混合磁珠；
[0064]在該步驟中，其主要目的是為了將磁珠和第二混合液中的液體分離，在外加磁場的作用下，所有的磁珠均會被吸附進(jìn)而偏向一側(cè)，而此時，則可將第二混合液中的液體通過移液槍吸出。
[0065]步驟105:在混合磁珠中加入洗滌液，并使得吸附在混合磁珠表面雜質(zhì)溶解，再將溶有雜質(zhì)的洗滌液吸除；
[0066]得到混合磁珠之后，需要將混合磁珠上吸附的一些核酸雜質(zhì)或者少量的蛋白質(zhì)以及其他雜質(zhì)洗滌，進(jìn)而提高所提取的微小RNA的純度，而洗滌液可以將第一磁珠吸附的雜質(zhì)溶解，進(jìn)而得到除雜的效果，優(yōu)選的，洗滌液可為不同比例的乙醇、異丙醇或乙醇和異丙醇的混合液。上述試劑作為高效的有機溶劑，可以將第一磁珠表面吸附的雜質(zhì)溶解，進(jìn)而得到提出微小RNA的效果，更優(yōu)選的，洗滌的次數(shù)可以為多次。
[0067]步驟106:將洗滌后的混合磁珠晾干后加入洗脫液，進(jìn)行震蕩混勻，使得吸附在第一磁珠表面的微小RNA溶解在洗脫液中，得到含有微小RNA的磁珠液；
[0068]優(yōu)選的，震蕩混勻之后，在65_75°C下孵育8_12分鐘后冰浴1_3分鐘，可使得大量的吸附在第一磁珠表面的微小RNA溶解在洗脫液中，得到含有微小RNA的磁珠液。
[0069]在將混合磁珠洗滌之后，需要將第一磁珠上特異性吸附的微小RNA洗脫，進(jìn)而得到抽提產(chǎn)品，在本實施例中，具體使用洗脫液將第一磁珠上的微小RNA進(jìn)行洗脫，此外，洗脫液可以是超純水，也可以是適合反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的緩沖溶液。
[0070]將混合磁珠晾干后在65_75°C下孵育8-12分鐘后冰浴1_3分鐘，此時，被特異吸附的微小RNA溶解在洗脫液中，進(jìn)而會得到含有微小RNA的磁珠液(即微小RNA與磁珠分離的液體)。
[0071]步驟107:將含有微小RNA的磁珠液中的液體與混合磁珠分離，并保存至離心管中，得到微小RNA。
[0072]優(yōu)選的，為了順利實現(xiàn)磁珠和液體的分離，步驟107可以按照以下操作進(jìn)行:將含有微小RNA的磁珠液放置在外加磁場下進(jìn)行磁吸，并將含有微小RNA的磁珠液中的液體吸取后保存至離心管中，得到微小RNA。
[0073]再次通過磁吸的方式，使得磁珠與含有微小RNA的磁珠液中的液體分離，進(jìn)而得到微小RNA。得到的微小RNA可以在低溫下保存，或者直接進(jìn)行后續(xù)反轉(zhuǎn)錄的操作。
[0074]此外，在上述步驟中，第一磁珠的表面修飾有大量含有10_30nt的poly A的隨機序列或靶向序列；或者修飾有含有10-30nt的poly dT，使用前與過量的含有10_30nt的poly A的隨機序列或祀向序列預(yù)雜交,封閉磁珠與mRNA的雜交位點，同時增強序列的延展性，降低位阻效應(yīng)，進(jìn)而使得游離的微小RNA結(jié)合。
[0075]需要指出的是，本實用新型還針對上述的提取方法還提供了以下具體的實施例，請參考以下內(nèi)容:
[0076]實施例四
[0077]1、將裝有表面修飾有含有10_30nt的poly dT的第一磁珠的第一磁珠液試劑瓶緩慢顛倒混勻5-10次，隨后將10 μ I小磁珠懸液與200 μ I的裂解液放入新的離心管中；
[0078]2、在新的離心管中加入含有12_18nt的poly A的靶向序列，其構(gòu)成的整體序列為:SEQ ID NO:1:5’ -poly A (15nt)-TGTAGGCCAG - 3，；
[0079]3、將加入靶向序列的離心管輕彈混勻后，室溫孵育10-15分鐘，隨后在外加磁場作用下將磁珠與緩沖液分離；
[0080]4、將緩沖液移除后再加入200-500 μ I的新鮮裂解液,得到備用裂解液和備用第
一磁珠;
[0081]5、將200 μ I血清或血漿樣品與200 μ I的備用裂解液在離心管內(nèi)充分作用15分鐘后，在10000-12000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速下，離心5-15分鐘，得到上清液；
[0082]6、取50 μ I上清液并加入含有備用第一磁珠的懸液的離心管中，記錄樣品對應(yīng)的編號;
[0083]7、將第二磁珠液試劑瓶緩慢顛倒混勻5-10次，隨后在每個編號的離心管中加入10 μ I第二磁珠懸液；
[0084]8、將離心管手動或利用混勻儀顛倒混勻10-15分鐘，隨后將離心管放入外加磁場中，磁吸2分鐘后吸走管內(nèi)溶液,移除外加磁場；
[0085]9、在離心管中加入800 μ I洗滌液，手動或利用混勻儀顛倒混勻5分鐘，再將離心管放入外加磁場中，磁吸2分鐘后吸走管內(nèi)溶液，移除外加磁場。(為了提高洗滌的效果，此
步驟重復(fù)一次)。
[0086]10、將移走溶液的混合磁珠在空氣中晾干，然后再入洗脫液，進(jìn)行震蕩混勻，并在65-75°C下孵育8-12分鐘后冰浴1_3分鐘，使得吸附在第一磁珠表面的微小RNA溶解在洗脫液中，得到含有微小RNA的磁珠液；
[0087]11、將含有微小RNA的磁珠液放置在外加磁場下進(jìn)行磁吸，并將含有微小RNA的磁珠液中的液體吸取后保存至離心管中，得到微小RNA。
[0088]在上述步驟中，洗脫液可以為超純水或者反轉(zhuǎn)錄緩沖液；為了通過熒光定量PCR操作，以檢測微小RNA的提取效果，一般而言，洗脫液可具體為反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的緩沖液，并直接進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄的操作，以期一步法得到微小RNA的相應(yīng)cDNA片段。
[0089]具體的，可以按照以下的操作進(jìn)行:
[0090]A、將移走溶液的混合磁珠在空氣中晾干，然后再入反轉(zhuǎn)錄緩沖溶液80 μ 1，進(jìn)行震蕩混勻，并在70°C下孵育10分鐘后冰浴2分鐘，使得吸附在第一磁珠表面的微小RNA溶解在洗脫液中，得到含有微小RNA的磁珠液；
[0091]B、在含有微小RNA的磁珠液中加入反轉(zhuǎn)錄引物(序列為SEQ ID NO:2)及反轉(zhuǎn)錄酶的混合液20 μ 1，其中，SEQ ID NO: 2:
[0092]5， -CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACTGGGAC-3，
[0093]其中，20 μ I反轉(zhuǎn)錄酶混合液中含有:
[0094]
【權(quán)利要求】
1.一種提取微小RNA的試劑盒，其特征在于，包括盒體、裝有第一磁珠液的試劑瓶、裝有第二磁珠液的試劑瓶、裝有裂解液的試劑瓶、裝有洗脫液的試劑瓶以及裝有洗滌液的試劑瓶； 所述盒體的內(nèi)底壁上設(shè)置有泡沫墊；且所述泡沫墊的邊沿與所述盒體的內(nèi)側(cè)壁相貼； 所述泡沫墊上設(shè)置有五個凹槽，每個所述凹槽內(nèi)分別設(shè)置有一個所述試劑瓶； 所述第一磁珠液內(nèi)包括多個表面修飾有能夠與微小RNA配對的靶向序列或隨機序列的第一磁珠；所述第二磁珠液內(nèi)包括多個表面修飾有帶負(fù)電荷的親水性高分子聚合物的第二磁珠。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取微小RNA的試劑盒，其特征在于: 所述盒體為一個具有開口的矩形盒體，且所述矩形盒體的開口與底壁相對；所有所述凹槽均由從所述矩形盒體的底壁到所述開口的方向延伸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的提取微小RNA的試劑盒，其特征在于: 所有所述試劑瓶均為圓柱形，所有所述凹槽的橫截面均為圓形； 每個所述凹槽的內(nèi)壁與其對應(yīng)設(shè)置的所述試劑瓶的外壁相貼合。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的提取微小RNA的試劑盒，其特征在于； 所述第一磁珠的平均粒徑為40-80nm。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的提取微小RNA的試劑盒，其特征在于， 所述第二磁珠的平均粒徑大于500nm。
【文檔編號】C12N15/10GK203700343SQ201420070501
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年2月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月18日
【發(fā)明者】陳靜, 葛陽 申請人:上海締達(dá)生物科技有限公司