專利名稱：一種dna提取試劑盒及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種DNA提取試劑盒及其應用。
背景技術(shù)：
每種微生物均有其本身特有的、穩(wěn)定的DNA組成結(jié)構(gòu)，不同種微生物間基因組序 列的差異程度代表它們之間親緣關(guān)系的遠近。測定每種微生物具有代表性的DNA數(shù)據(jù)，對 微生物鑒定工作十分重要，而微生物基因組DNA的提取是工作的基礎(chǔ)。
常規(guī)使用的SDS/酚/氯仿的基因組DNA提取方法，不僅操作復雜、耗時長，而且使 用了大量揮發(fā)性有機物，產(chǎn)生大量的有毒廢液。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種DNA提取試劑盒及其應用。 本發(fā)明提供的DNA提取試劑盒，包含試劑A、試劑B、試劑C、試劑D、試劑E和試劑 F ; 所述試劑A由NaCl和水組成；每lOOmL試劑A含有0. 7-1. 0g NaCl ;
所述試劑B由Tris (三羥甲基氨基甲烷)、異硫氰酸胍、反式_1 ， 2_環(huán)己二胺四 乙酸(cydta)和水組成；試劑B中，異硫氰酸胍的終濃度為3-5mol/L， Tris的終濃度為 30-50mmol/L，反式-l，2-環(huán)己二胺四乙酸的終濃度為4-6mmol/L ; 所述試劑C由40-60體積份硅藻土和60-40體積份溶液甲組成；溶液甲由Tris、 EDTA(己二胺四乙酸)和水組成；溶液甲中，Tris的終濃度為5-15mmol/L， EDTA的終濃度 為0. 5-2,1/L ; 所述試劑D由Tris、 EDTA、 NaCl、乙醇和水組成；試劑D中，乙醇的終濃度為 60-70% (體積百分含量)，Tris的終濃度為15_25mmol/L， EDTA的終濃度為0. 5_2mmol/L， NaCl的終濃度為350-450mmol/L ; 所述試劑E由乙醇和水組成；試劑E中，乙醇的終濃度為70-75% (體積百分含 所述試劑F由Tris、EDTA和水組成；試劑F中，Tris的終濃度為5_15mmol/L，EDTA 的終濃度為0. 5-2mmol/L。 所述試劑A可采用如下方法制備將NaCl溶于水得到試劑A ;每lOOmL試劑A含 有0. 7-0. 8g NaCl或0. 8-1. Og NaCl。 所述試劑B可采用如下方法制備將Tris溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7. 5，制 得Tris-HCl溶液；將異硫氰酸胍和反式_1，2-環(huán)己二胺四乙酸溶于水后，再加入所述 Tris-HCl溶液，得到試劑B ;試劑B中，異硫氰酸胍的終濃度為3_4mol/L或4_5mol/L， Tr i s的終濃度為30-40mmo 1 /L或40-50mmo 1/L，反式-l，2-環(huán)己二胺四乙酸的終濃度為 4_5mmol/L或5_6mmol/L。 所述試劑C可采用如下方法制備將40-45體積份硅藻土和60-55體積份溶液甲混合，或?qū)?5-60體積份硅藻土和55-40體積份溶液甲混合，得到試劑C ;溶液甲的配制方 法如下將Tris溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7. 5，制得Tris-HCl溶液；將EDTA溶于水，用鹽 酸調(diào)節(jié)pH至7. 5，制得EDTA溶液；將所述Tris-HCl溶液和所述EDTA溶液混合，得到溶液 甲；溶液甲中，Tris的終濃度為5-10mmol/L或10_15mmol/L， EDTA的終濃度為0. 5_lmmol/ L或l_2mmol/L。 所述試劑D可采用如下方法制備將Tris溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7. 5，制得 Tris-HCl溶液；將EDTA溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7. 5，制得EDTA溶液；將NaCl溶于水，加入 所述Tris-HCl溶液和所述EDTA溶液，再加入乙醇，得到試劑D ;試劑D中，乙醇的終濃度為 60-65% (體積百分含量)或65-70% (體積百分含量)，Tris的終濃度為15-20mmol/L或 20-25mmol/L，EDTA的終濃度為0. 5-lmmol/L或l-2mmol/L， NaCl的終濃度為350-400mmol/ L或400-450mmol/L。 所述試劑E可采用如下方法制備將乙醇溶于水，得到試劑E ;試劑E中，乙醇的終 濃度為70-75% (體積百分含量)。 所述試劑F的制備方法如下將Tris溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8. O，制得Tris-HCl 溶液；將EDTA溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8. 0，制得EDTA溶液；將所述Tris-HCl溶液和所述 EDTA溶液混合，得到試劑F ;試劑F中，Tris的終濃度為5-10mmol/L或10-15mmol/L， EDTA 的終濃度為0. 5-lmmol/L或l_2mmol/L。所述試劑C中，所述硅藻土的酸堿度可為5. 5-9. O，平均粒度可為18-42 iim， Si02
的質(zhì)量百分含量^ 88%;所述硅藻土的酸堿度優(yōu)選為5. 5-7. 0或7. 0-9. O，平均粒度優(yōu)選為
18-20 ii m或20-42 ii m， Si02的質(zhì)量百分含量優(yōu)選為88-92 %或92-94% 。
所述的試劑盒具體可為如下(I)或(II)或(III): 試劑盒(I)由如下試劑A、試劑B、試劑C、試劑D、試劑E和試劑F組成 所述試劑A的制備方法如下將NaCl溶于水得到試劑A ;每100mL試劑A含有0. 8g
NaCl ; 所述試劑B的制備方法如下將Tris溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7. 5，制得Tris-HCl 溶液；將異硫氰酸胍和反式-1， 2-環(huán)己二胺四乙酸溶于水后，再加入所述Tris-HCl溶液，得 到試劑B ;試劑B中，異硫氰酸胍的終濃度為4mol/L， Tris的終濃度為40mmol/L，反式-1， 2-環(huán)己二胺四乙酸的終濃度為5mmol/L ; 所述試劑C的制備方法如下將45體積份硅藻土和55體積份溶液甲混合，得到試 劑C ;溶液甲的配制方法如下將Tris溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7. 5，制得Tris-HCl溶液； 將EDTA溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7. 5，制得EDTA溶液；將所述Tris-HCl溶液和所述EDTA 溶液混合，得到溶液甲；溶液甲中，Tri s的終濃度為10mmol/L，EDTA的終濃度為lmmol/L ; 所述硅藻土的pH為7. 0、平均粒度為20 ii m、 Si02的質(zhì)量百分含量為88% ;
所述試劑D的制備方法如下將Tris溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7. 5，制得Tris-HCl 溶液；將EDTA溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7. 5，制得EDTA溶液；將NaCl溶于水，加入所述 Tris-HCl溶液和所述EDTA溶液，再加入乙醇，得到試劑D ;試劑D中，乙醇的終濃度為60% (體積百分含量)，Tris的終濃度為20mmol/L，EDTA的終濃度為lmmol/L，NaCl的終濃度為 400,1/L ; 所述試劑E的制備方法如下將乙醇溶于水，得到試劑E ;試劑E中，乙醇的終濃度
10為75% (體積百分含量)； 所述試劑F的制備方法如下將Tris溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8. O，制得Tris-HCl 溶液；將EDTA溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8. 0，制得EDTA溶液；將所述Tris-HCl溶液和所述 EDTA溶液混合，得到試劑F ;試劑F中，Tris的終濃度為10mmol/L，EDTA的終濃度為lmmo1/ L。 試劑盒(II)由如下試劑A、試劑B、試劑C、試劑D、試劑E和試劑F組成 所述試劑A的制備方法如下將NaCl溶于水得到試劑A ;每100mL試劑A含有0. 7g
NaCl ; 所述試劑B的制備方法如下將Tris溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7. 5，制得Tris-HCl 溶液；將異硫氰酸胍和反式-1， 2-環(huán)己二胺四乙酸溶于水后，再加入所述Tris-HCl溶液，得 到試劑B ;試劑B中，異硫氰酸胍的終濃度為3mol/L， Tris的終濃度為30mmol/L，反式-1， 2-環(huán)己二胺四乙酸的終濃度為4mmol/L ; 所述試劑C的制備方法如下將40體積份硅藻土和60體積份溶液甲混合，得到試 劑C ;溶液甲的配制方法如下將Tris溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7. 5，制得Tris-HCl溶液； 將EDTA溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7. 5，制得EDTA溶液；將所述Tris-HCl溶液和所述EDTA 溶液混合，得到溶液甲；溶液甲中，Tris的終濃度為5mmol/L，EDTA的終濃度為0. 5mmol/L ; 所述硅藻土的pH為5. 5、平均粒度為18 ii m、 Si02的質(zhì)量百分含量為92% ;
所述試劑D的制備方法如下將Tris溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7. 5，制得Tris-HCl 溶液；將EDTA溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7. 5，制得EDTA溶液；將NaCl溶于水，加入所述 Tris-HCl溶液和所述EDTA溶液，再加入乙醇，得到試劑D ;試劑D中，乙醇的終濃度為65% (體積百分含量)，Tris的終濃度為15mmol/L，EDTA的終濃度為0. 5mmol/L，NaCl的終濃度 為350mmol/L ; 所述試劑E的制備方法如下將乙醇溶于水，得到試劑E ;試劑E中，乙醇的終濃度 為70% (體積百分含量)； 所述試劑F的制備方法如下將Tris溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8. 0，制得Tris-HCl 溶液；將EDTA溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8. 0，制得EDTA溶液；將所述Tris-HCl溶液和所述 EDTA溶液混合，得到試劑F ;試劑F中，Tris的終濃度為5mmol/L， EDTA的終濃度為0. 5mmo1/ L ; 試劑盒(III)由如下試劑A、試劑B、試劑C、試劑D、試劑E和試劑F組成 所述試劑A的制備方法如下將NaCl溶于水得到試劑A ;每100mL試劑A含有1. 0g
NaCl ; 所述試劑B的制備方法如下將Tris溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7. 5，制得Tris-HCl 溶液；將異硫氰酸胍和反式-1， 2-環(huán)己二胺四乙酸溶于水后，再加入所述Tris-HCl溶液，得 到試劑B ;試劑B中，異硫氰酸胍的終濃度為5mol/L， Tris的終濃度為50mmol/L，反式-1， 2-環(huán)己二胺四乙酸的終濃度為6mmol/L ; 所述試劑C的制備方法如下將60體積份硅藻土和40體積份溶液甲混合，得到試 劑C ;溶液甲的配制方法如下將Tris溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7. 5，制得Tris-HCl溶液； 將EDTA溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7. 5，制得EDTA溶液；將所述Tris-HCl溶液和所述EDTA 溶液混合，得到溶液甲；溶液甲中，Tris的終濃度為15mmol/L， EDTA的終濃度為2mmol/L ;所述硅藻土的pH為9. 0、平均粒度為42 m、 Si02的質(zhì)量百分含量為94% ;
所述試劑D的制備方法如下將Tris溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7. 5，制得Tris-HCl 溶液；將EDTA溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7. 5，制得EDTA溶液；將NaCl溶于水，加入所述 Tris-HCl溶液和所述EDTA溶液，再加入乙醇，得到試劑D ;試劑D中，乙醇的終濃度為70% (體積百分含量)，Tris的終濃度為25mmol/L，EDTA的終濃度為2mmol/L，NaCl的終濃度為 450mmol/l ; 所述試劑E的制備方法如下將乙醇溶于水，得到試劑E ;試劑E中，乙醇的終濃度 為75% (體積百分含量)； 所述試劑F的制備方法如下將Tris溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8. O，制得Tris-HCl 溶液；將EDTA溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8. 0，制得EDTA溶液；將所述Tris-HCl溶液和所述 EDTA溶液混合，得到試劑F ;試劑F中，Tris的終濃度為15mmol/L， EDTA的終濃度為2mmo1/ L。 所述試劑盒可應用于提取微生物基因組DNA。 本發(fā)明還保護一種提取微生物基因組DNA的方法，是應用所述試劑盒提取微生物
基因組DNA，包括如下步驟 ①收集菌體細胞； ②加入所述試劑A，振蕩懸浮菌體，而后離心，倒去上清液，得到沉淀；
③加入所述試劑A，振蕩懸浮菌體，而后離心，倒去上清液，得到沉淀；
④加入所述試劑B，振蕩懸浮菌體，然后加入所述試劑C，振蕩混勻；
⑤靜置，而后離心，倒去上清液，得到沉淀；
⑥加入所述試劑B，振蕩懸浮，靜置，而后離心，倒去上清液；
⑦加入所述試劑D，振蕩懸浮，而后離心，倒去上清液，得到沉淀；
⑧加入所述試劑D，振蕩懸浮，而后離心，倒去上清液，得到沉淀；
⑨加入所述試劑E，振蕩懸浮，而后離心，倒去上清液，得到沉淀；
⑩干燥沉淀物； 在干燥后的沉淀物中加入所述試劑F，振蕩懸浮，水浴后離心，收集含有微生物
基因組DNA的上清液。 所述方法包括具體可如下步驟 ①取lmL 0D = 0. 4-1. 5的微生物菌液，離心收集菌體細胞； ②加入500-1000 ii 1所述試劑A，振蕩懸浮菌體，而后離心，倒去上清液，得到沉 淀； ③加入500-1000 ii 1所述試劑A，振蕩懸浮菌體，而后離心，倒去上清液，得到沉 淀； 加入700-900 ii 1所述試劑B，振蕩懸浮菌體，然后加入60-100 ii 1所述試劑C， 振蕩混勻； ⑤靜置，而后離心，倒去上清液，得到沉淀； 加入400-600 ii 1所述試劑B，振蕩懸浮，靜置，而后離心，倒去上清液，得到沉 淀； ⑦加入500-700 ii 1所述試劑D，振蕩懸浮，而后離心，倒去上清液，得到沉淀；
⑧加入500-700 y 1所述試劑D，振蕩懸浮，而后離心，倒去上清液，得到沉淀；
⑨加入500-1000 ii 1所述試劑E，振蕩懸浮，而后離心，倒去上清液，得到沉淀；
⑩干燥沉淀物； 在干燥后的沉淀物中加入50-100 iU所述試劑F，振蕩懸浮，水浴后離心，收集
含有微生物基因組DNA的上清液。 所述方法更具體可包括如下步驟 ①取lmL 0D = 0. 6-1. 0的微生物菌液，離心，收集菌體細胞； ②加入500-1000 iil所述試劑A，振蕩30_60s懸浮菌體，而后以9cm為半徑
10000-13000rpm離心3-5min，倒去上清液，得到沉淀； ③加入500-1000 iil所述試劑A，振蕩30_60s懸浮菌體，而后以9cm為半徑 10000-13000rpm離心3-5min，倒去上清液，得到沉淀； 加入700-900 ii 1所述試劑B，振蕩30_60s懸浮菌體，然后加入60-100 ii 1所述 試劑C，振蕩30-60s混勻; ⑤靜置25-35min，而后以9cm為半徑10000-13000rpm離心3-5min，倒去上清液， 得到沉淀； 加入400-600 y 1所述試劑B，振蕩30_60s懸浮，靜置10_20min，而后以9cm為 半徑10000-13000rpm離心3-5min，倒去上清液，得到沉淀； ⑦加入500-700 yl所述試劑D，振蕩10_30s懸浮，而后以9cm為半徑 10000-13000rpm離心3-5min，倒去上清液，得到沉淀； ⑧力B入500-700 yl所述試齊U D，振蕩10-30s懸浮，而后以9cm為半徑 10000-13000rpm離心3-5min，倒去上清液，得到沉淀； ⑨加入500-1000 yl所述試劑E，振蕩10_30s懸浮，而后以9cm為半徑 10000-13000rpm離心3-5min，倒去上清液，得到沉淀；
⑩干燥沉淀物； 在干燥后的沉淀物中加入50-100 ii 1所述試劑F，振蕩10-30s懸浮，40-6(TC水 浴5-10min，而后以9cm為半徑10000-13000rpm離心3min-5min，收集含有微生物基因組 DNA的上清液。 所述方法優(yōu)選包括如下步驟 ①取lmL 0D = 0. 6-0. 8或0D = 0. 8-1. 0的微生物菌液，13000rpm離心5min，收 集菌體細胞； ②加入500-700 ii 1或700-1000 y 1所述試劑A，振蕩30_45s或45_60s懸浮菌體， 而后10000-13000rpm離心3-5min，倒去上清液，得到沉淀； ③加入500-700 ii 1或700-1000 y 1所述試劑A，振蕩30_45s或45_60s懸浮菌體， 而后10000-13000rpm離心3-5min，倒去上清液，得到沉淀； 加入700-800 y 1或800-900 y 1所述試劑B，振蕩30_45s或45_60s懸浮菌體， 然后加入60-80 ii 1或80-100 ii 1所述試劑C，振蕩30-45s或45-60s混勻;
⑤靜置25-30min或30-35min，而后10000-13000rpm離心3-5min，倒去上清液，得 到沉淀； 加入400-500 y 1或500-600 y 1所述試劑B，振蕩30_45s或45_60s懸浮，靜置10-15min或15-20min，而后10000-13000rpm離心3-5min，倒去上清液，得到沉淀；⑦加入500-600 y 1或600-700 y 1所述試劑D，振蕩10_20s或20_30s懸浮，而后
10000-13000rpm離心3_5min，倒去上清液，得到沉淀； ⑧加入500-600 ii 1或600-700 ii 1所述試劑D，振蕩10_20s或20_30s懸浮，而后 10000-13000rpm離心3_5min，倒去上清液，得到沉淀； ⑨加入500-600 ii 1或600-1000 ii 1所述試劑E，振蕩10_20s或20_30s懸浮，而后 10000-13000rpm離心3_5min，倒去上清液，得到沉淀；
⑩干燥沉淀物； 在干燥后的沉淀物中加入50-60 ill或60-100 ill所述試劑F，振蕩10-20 s
或20-30s懸浮，40-55 °C或55-60。C水浴5_8min或8-10min，而后10000-13000rpm離心
3-5min，收集含有微生物基因組DNA的上清液。 所述方法具體可為如下(IV)或(V)或(VI): 所述方法(IV)包括如下步驟①取lmL OD = 0. 6的微生物菌液，13000rpm離心5min，收集菌體細胞；②加入500 ii 1所述試劑A，振蕩60s懸浮菌體，而后13000rpm離心3min，倒去上
清液，得到沉淀； ③加入500 ii 1所述試劑A，振蕩60s懸浮菌體，而后13000rpm離心3min，倒去上 清液，得到沉淀； 加入800 ii 1所述試劑B，振蕩60s懸浮菌體，然后加入80 y 1所述試劑C，振蕩 60s混勻;⑤靜置30min，而后13000rpm離心3min，倒去上清液，得到沉淀； 加入500 ii 1所述試劑B，振蕩30s懸浮，靜置15min，而后13000rpm離心3min，
倒去上清液，得到沉淀； ⑦加入600 ii 1所述試劑D，振蕩10s懸浮，而后13000rpm離心3min，倒去上清液， 得到沉淀； ⑧加入600 ii 1所述試劑D，振蕩10s懸浮，而后13000rpm離心3min，倒去上清液， 得到沉淀； ⑨加入600iil所述試劑E，振蕩10s懸浮，而后13000rpm離心3min，倒去上清液， 得到沉淀； ⑩干燥沉淀物； 在干燥后的沉淀物中加入60iil所述試劑F，振蕩10s懸浮，55t:水浴10min，而 后13000rpm離心3min，收集含有微生物基因組DNA的上清液。
所述方法(V)具體可包括如下步驟①取lmL OD = 1. 0的微生物菌液，13000rpm離心5min，收集菌體細胞；②加入1000 iil所述試劑A，振蕩30s懸浮菌體，而后10000rpm離心5min，倒去上
清液，得到沉淀； ③加入1000 iil所述試劑A，振蕩30s懸浮菌體，而后10000rpm離心5min，倒去上 清液，得到沉淀； 加入700 ii 1所述試劑B，振蕩30s懸浮菌體，然后加入100 y 1所述試劑C，振蕩30S混勻;⑤靜置35min，而后10000rpm離心5min，倒去上清液，得到沉淀；⑥加入600ii1所述試劑B，振蕩60s懸浮，靜置20min，而后10000rpm離心5min，
倒去上清液，得到沉淀； ⑦加入700iil所述試劑D，振蕩30s懸浮，而后10000rpm離心5min，倒去上清液， 得到沉淀； ⑧加入700 ii 1所述試劑D，振蕩30s懸浮，而后10000rpm離心5min，倒去上清液， 得到沉淀； ⑨加入1000 ii 1所述試劑E，振蕩30s懸浮，而后10000rpm離心5min，倒去上清液， 得到沉淀； ⑩干燥沉淀物； 在干燥后的沉淀物中加入100 ii 1所述試劑F，振蕩30s懸浮，6(TC水浴5min，而 后10000rpm離心5min，收集含有微生物基因組DNA的上清液。
所述方法(VI)具體可包括如下步驟①取lmL OD = 0. 8的微生物菌液，13000rpm離心5min，收集菌體細胞；②加入700 ii 1所述試劑A，振蕩45s懸浮菌體，而后13000rpm離心3min，倒去上
清液，得到沉淀； ③加入700 iil所述試劑A，振蕩45s懸浮菌體，而后13000rpm離心3min，倒去上 清液，得到沉淀； ④加入900ia所述試劑B，振蕩45s懸浮菌體，然后加入60ia所述試劑C，振蕩 45s混勻；⑤靜置25min，而后13000rpm離心3min，倒去上清液，得到沉淀；⑥加入400 ii 1所述試劑B，振蕩45s懸浮，靜置10min，而后13000rpm離心3min，
倒去上清液，得到沉淀； ⑦加入500iil所述試劑D，振蕩20s懸浮，而后13000rpm離心3min，倒去上清液， 得到沉淀； ⑧加入500iil所述試劑D，振蕩20s懸浮，而后13000rpm離心3min，倒去上清液， 得到沉淀； ⑨加入500iil所述試劑E，振蕩20s懸浮，而后13000rpm離心3min，倒去上清液， 得到沉淀； ⑩干燥沉淀物； 在干燥后的沉淀物中加入50iU所述試劑F，振蕩20s懸浮，4(TC水浴8min，而 后13000rpm離心3min，收集含有微生物基因組DNA的上清液。 所述方法(IV)、方法(V)和(VI)的步驟④中，所述試劑C使用前振蕩30-60s混懸 均勻， 所述方法(IV)、方法(V)和(VI)的步驟⑩中，可采用真空干燥。真空干燥能夠提 高干燥的速度，不影響下游操作，在操作時采用間隔干燥是為了防止干燥過度而影響試劑F 的洗脫效果。 本發(fā)明提供的試劑盒制備方法簡單，易于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，針對該試劑盒所提供的DNA
15提取方法，具有提取快速、操作簡單污染小等優(yōu)點，可應用于培養(yǎng)富集的微生物基因組DNA 提取及其分子生物學鑒定。


圖1為基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果；1 7分別為Marker VII、 DSM No. 7048、DSM No. 14782、DSM No. 17023、DSM No. 17261、DSM No. 18582、DSM No. 19609。
圖2為16S rDNA的PCR擴增檢測結(jié)果;1 7分別為DSM No. 7048、DSM No. 14782、 DSM No. 17023、Marker VII、DSM No. 17261、DSM No. 18582、DSM No. 19609。
具體實施例方式
以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的。 以下菌種均購自自德國菌保中心(DSMZ) :Aminobacter aminovorans (DSMNo. 7048) 、 Pannonibacter phragmitetus (DSM No. 14782) 、 Labrenzia marina(DSMNo. 17023) 、 Methylocystis rosea(DSM No. 17261)、 Tessaracoccus flavescens(DSMNo. 18582)禾口 Brooklawnia cerclae(DSM No. 19609)。
實施例1、基因組DNA提取試劑盒的制備
—、各個試劑的制備 試劑A的制備方法如下將NaCl溶于水得到試劑A ;每lOOmL試劑A含有 0.8gNaCl。 試劑B的制備方法如下將Tris溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7. 5，制得 Tris-HCl (pH7. 5)溶液；將異硫氰酸胍和反式_1， 2-環(huán)己二胺四乙酸溶于水后，再加入一定 量的Tris-HCl (pH7. 5)溶液混合，得到試劑B ;試劑B中，異硫氰酸胍的終濃度為4mol/L， Tris的終濃度為40mmol/L，反式-1， 2-環(huán)己二胺四乙酸的終濃度為5mmol/L。
試劑C的制備方法如下將45體積份硅藻土和55體積份溶液甲混合，得到試劑 C ;溶液甲的配制方法如下將Tris溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7. 5，制得Tris-HCl (pH7. 5) 溶液；將EDTA溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7. 5 ，制得EDTA (pH7. 5)溶液；再取 一 定量的 Tris-HCl (pH7. 5)溶液和EDTA(pH7. 5)溶液混合，得到溶液甲；溶液甲中，Tris的終濃度為 10mmol/L， EDTA的終濃度為lmmol/L。硅藻土的pH為7. 0、平均粒度為20 y m、 Si02的質(zhì)量 百分含量為88%。 試劑D的制備方法如下將Tris溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7. 5，制得 Tris-HCl (pH7. 5)溶液；將EDTA溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7. 5，制得EDTA(pH7. 5)溶液; 將NaCl溶于水后，加入一定量的Tris-HCl (pH7. 5)溶液禾口 EDTA(pH7. 5)溶液混合，再加 入乙醇，得到試劑D;試劑D中，乙醇的終濃度為60X (體積百分含量)，Tris的終濃度為 20mmol/L， EDTA的終濃度為lmmol/L， NaCl的終濃度為400mmol/L ; 試劑E的制備方法如下將乙醇溶于水，得到試劑E ;試劑E中，乙醇的終濃度為 75% (體積百分含量)。 試劑F的制備方法如下將Tris溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8. 0，制得Tris-HCl (pH8. 0)溶液；將EDTA溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8. O，制得EDTA(pH8. 0)溶液；取 一定量的Tris-HCl (pH8. 0)溶液和EDTA(pH8. 0)溶液混合，得到試劑F ;試劑F中，Tris的 終濃度為10mmol/L， EDTA的終濃度為lmmol/L。
二、試劑盒的組成 試劑盒由試劑A、試劑B、試劑C、試劑D、試劑E和試劑F組成。
試劑A :無色透明液體；100mL/瓶；1瓶/盒；常溫保存；
試劑B :無色透明液體；100mL/瓶；1瓶/盒；常溫保存；
試劑C :黃色固體懸液；20mL/瓶；1瓶/盒；常溫保存；
試劑D :無色透明液體；100mL/瓶；1瓶/盒；常溫保存；
試劑E :無色透明液體；50mL/瓶；1瓶/盒；常溫保存；
試劑F :無色透明液體；20mL/瓶；1瓶/盒；4 °C保存。
實施例2、基因組DNA提取試劑盒的制備
—、各個試劑的制備 試劑A的制備方法如下將NaCl溶于水得到試劑A ;每100mL試劑A含有 0.7gNaCl。 試劑B的制備方法如下將Tris溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7. 5，制得 Tris-HCl (pH7. 5)溶液；將異硫氰酸胍和反式_1， 2-環(huán)己二胺四乙酸溶于水后，再加入一定 量的Tris-HCl (pH7. 5)溶液混合，得到試劑B ;試劑B中，異硫氰酸胍的終濃度為3mol/L， Tris的終濃度為30mmol/L，反式-1， 2-環(huán)己二胺四乙酸的終濃度為4mmol/L。
試劑C的制備方法如下將40體積份硅藻土和60體積份溶液甲混合，得到試劑 C ;溶液甲的配制方法如下將Tris溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7. 5，制得Tris-HCl (pH7. 5) 溶液；將EDTA溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7. 5 ，制得EDTA (pH7. 5)溶液；再取 一 定量的 Tris-HCl (pH7. 5)溶液和EDTA(pH7. 5)溶液混合，得到溶液甲；溶液甲中，Tris的終濃度為 5mmol/L， EDTA的終濃度為0. 5mmol/L。硅藻土的pH為5. 5、平均粒度為18 y m、 Si02的質(zhì) 量百分含量為92%。 試劑D的制備方法如下將Tris溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7. 5，制得 Tris-HCl (pH7. 5)溶液；將EDTA溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7. 5，制得EDTA(pH7. 5)溶液; 將NaCl溶于水后，加入一定量的Tris-HCl (pH7. 5)溶液禾口 EDTA(pH7. 5)溶液混合，再加 入乙醇，得到試劑D;試劑D中，乙醇的終濃度為65X (體積百分含量)，Tris的終濃度為 15mmol/L， EDTA的終濃度為0. 5mmol/L， NaCl的終濃度為350mmol/L ; 試劑E的制備方法如下將乙醇溶于水，得到試劑E ;試劑E中，乙醇的終濃度為 70% (體積百分含量)。 試劑F的制備方法如下將Tris溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8. 0，制得 Tris-HCl (pH8. 0)溶液；將EDTA溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8. O，制得EDTA(pH8. 0)溶液；取 一定量的Tris-HCl (pH8. 0)溶液和EDTA(pH8. 0)溶液混合，得到試劑F ;試劑F中，Tris的 終濃度為5mmol/L， EDTA的終濃度為0. 5mmol/L。
二、試劑盒的組成 試劑盒由試劑A、試劑B、試劑C、試劑D、試劑E和試劑F組成。
試劑A :無色透明液體；100mL/瓶；1瓶/盒；常溫保存；
試劑B :無色透明液體；100mL/瓶；1瓶/盒；常溫保存；
試劑C :黃色固體懸液；20mL/瓶；1瓶/盒；常溫保存；
試劑D :無色透明液體；100mL/瓶；1瓶/盒；常溫保存；
試劑E :無色透明液體；50mL/瓶；1瓶/盒；常溫保存；
試劑F :無色透明液體；20mL/瓶；1瓶/盒；4 °C保存。
實施例3、基因組DNA提取試劑盒的制備
—、各個試劑的制備 試劑A的制備方法如下將NaCl溶于水得到試劑A ;每lOOmL試劑A含有1.OgNaCl。 試劑B的制備方法如下將Tris溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7. 5，制得Tris-HCl (pH7. 5)溶液；將異硫氰酸胍和反式_1， 2-環(huán)己二胺四乙酸溶于水后，再加入一定量的Tris-HCl (pH7. 5)溶液混合，得到試劑B ;試劑B中，異硫氰酸胍的終濃度為5mol/L，Tris的終濃度為50mmol/L，反式-1， 2-環(huán)己二胺四乙酸的終濃度為6mmol/L。
試劑C的制備方法如下將60體積份硅藻土和40體積份溶液甲混合，得到試劑C ;溶液甲的配制方法如下將Tris溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7. 5，制得Tris-HCl (pH7. 5)溶液；將EDTA溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7. 5 ，制得EDTA (pH7. 5)溶液；再取 一 定量的Tris-HCl (pH7. 5)溶液和EDTA(pH7. 5)溶液混合，得到溶液甲；溶液甲中，Tris的終濃度為15mmol/L， EDTA的終濃度為2mmol/L。硅藻土的pH為9. 0、平均粒度為42 y m、 Si02的質(zhì)量百分含量為94%。 試劑D的制備方法如下將Tris溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7. 5，制得Tris-HCl (pH7. 5)溶液；將EDTA溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7. 5，制得EDTA(pH7. 5)溶液;將NaCl溶于水后，加入一定量的Tris-HCl (pH7. 5)溶液禾口 EDTA(pH7. 5)溶液混合，再加入乙醇，得到試劑D;試劑D中，乙醇的終濃度為70X (體積百分含量)，Tris的終濃度為25mmol/L， EDTA的終濃度為2mmol/L， NaCl的終濃度為450mmol/L ; 試劑E的制備方法如下將乙醇溶于水，得到試劑E ;試劑E中，乙醇的終濃度為75% (體積百分含量)。 試劑F的制備方法如下將Tris溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8. 0，制得Tris-HCl (pH8. 0)溶液；將EDTA溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8. O，制得EDTA(pH8. 0)溶液；取一定量的Tris-HCl (pH8. 0)溶液和EDTA(pH8. 0)溶液混合，得到試劑F ;試劑F中，Tris的終濃度為15mmol/L， EDTA的終濃度為2mmol/L。
二、試劑盒的組成 試劑盒由試劑A、試劑B、試劑C、試劑D、試劑E和試劑F組成。
試劑A :無色透明液體；100mL/瓶；1瓶/盒；常溫保存；
試劑B :無色透明液體；lOOmL/瓶；1瓶/盒；常溫保存；
試劑C :黃色固體懸液；20mL/瓶；1瓶/盒；常溫保存；
試劑D :無色透明液體；lOOmL/瓶；1瓶/盒；常溫保存；
試劑E :無色透明液體；50mL/瓶；1瓶/盒；常溫保存；
試劑F :無色透明液體；20mL/瓶；1瓶/盒；4t:保存。
實施例4、試劑盒的應用
18
用實施例1制備的試劑盒分別對Aminobacter aminovorans (DSM No. 7048)禾口Pannonibacter phragmitetus (DSM No. 14782)進行基因組DNA的提取。具體操作如下
①取lmL培養(yǎng)菌液(0D = 0. 6)至1. 5mL滅菌Eppendorf管中，13000rpm(離心半徑r = 9cm)離心5min收集菌體細胞； ②加入500 ill試劑A，用漩渦振蕩器振蕩60s懸浮菌體，而后用離心機13000rpm(離心半徑r = 9cm)離心3min，倒去上清液，得到沉淀;
③重復步驟②一次； 加入800 ill試劑B，用漩渦振蕩器振蕩60s懸浮菌體，然后加入80 試劑C，用漩渦振蕩器振蕩60s充分混勻；試劑C使用前振蕩30混懸均勻； ⑤在室溫下靜置30min，而后用離心機13000rpm(離心半徑r = 9cm)離心3min，倒去上清液，得到沉淀； ⑥重新加入500iil試劑B，用漩渦振蕩器振蕩30s懸浮，并于室溫下靜置15min，
而后用離心機13000rpm(離心半徑r = 9cm)離心3min，倒去上清液，得到沉淀； ⑦加入600iil試劑D，用漩渦振蕩器振蕩10s懸浮，而后用離心機13000rpm(離心
半徑r = 9cm)離心3min，倒去上清液，得到沉淀； ⑧重復步驟⑦一次； ⑨加入600iil試劑E，用漩渦振蕩器振蕩10s懸浮，而后用離心機13000rpm(離心半徑r = 9cm)離心3min，倒去上清液，得到沉淀；⑩用旋轉(zhuǎn)真空干燥儀(Concentrator 5301， E卯endorf)真空干燥(50mbar)沉淀
物，儀器每次運行4min，運行4次，每次間隔30s，直至大部分沉淀物變白； 在干燥后的沉淀物中加入60iU試劑F，用漩渦振蕩器振蕩10s懸浮，55t:水浴
10min，而后用離心機13000rpm(離心半徑r = 9cm)離心3min，用移液器收集上清液轉(zhuǎn)移至
新的1. 5ml滅菌E卯endorf管中(上清液即含有微生物基因組DNA)。 取2.5iU上清液用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳，選用購自天根生化科技(北京)
有限公司的DNA分子量標品Marker VII作參比，電泳檢測結(jié)果見圖l，取0. 5 yl作為模板
進行16S rDNA的PCR擴增，PCR擴增產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果見圖2，余下放_201:冰箱保存。 實施例5、試劑盒的應用 用實施例2制備的試劑盒分別對Labrenzia marina (DSM No. 17023)和Methylocystis rosea (DSM No. 17261)進行基因組DNA的提取。具體操作如下
①取lmL培養(yǎng)菌液(OD = 1. 0)至1. 5mL滅菌Eppendorf管中，13000rpm(離心半徑r = 9cm)離心5min收集菌體細胞； ②加入lOOOiU試劑A，用漩渦振蕩器振蕩30s懸浮菌體，而后用離心機10000rpm(離心半徑r = 9cm)離心5min，倒去上清液，得到沉淀;
③重復步驟②一次； 加入700 ii 1試劑B，用漩渦振蕩器振蕩30s懸浮菌體，然后加入100 y 1試劑C，用漩渦振蕩器振蕩30s充分混勻；試劑C使用前振蕩60s混懸均勻； ⑤在室溫下靜置35min，而后用離心機10000rpm(離心半徑r = 9cm)離心5min，倒去上清液，得到沉淀； ⑥重新加入600 1試劑B，用漩渦振蕩器振蕩60s懸浮，并于室溫下靜置20min，
19而后用離心機10000rpm(離心半徑r = 9cm)離心5min，倒去上清液，得到沉淀； ⑦加入700iil試劑D，用漩渦振蕩器振蕩30s懸浮，而后用離心機10000rpm(離心
半徑r = 9cm)離心5min，倒去上清液，得到沉淀； ⑧重復步驟⑦一次； ⑨加入1000 ill試劑E，用漩渦振蕩器振蕩30s懸浮，而后用離心機10000rpm(離心半徑r = 9cm)離心5min，倒去上清液，得到沉淀； ⑩用旋轉(zhuǎn)真空干燥儀(Concentrator 5301，E卯endorf)真空干燥(100mbar)沉淀
物，儀器每次運行4min，運行4次，每次間隔30s，直至大部分沉淀物變白； 在干燥后的沉淀物中加入100 iU試劑F，用漩渦振蕩器振蕩30s懸浮，6(TC水
浴5min，而后用離心機10000rpm(離心半徑r = 9cm)離心5min，用移液器收集上清液轉(zhuǎn)移
至新的1. 5ml滅菌E卯endorf管中(上清液即含有微生物基因組DNA)。 取2.5iU上清液用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳，選用購自天根生化科技(北京)
有限公司的DNA分子量標品Marker VII作參比，電泳檢測結(jié)果見圖l，取0. 5 yl作為模板
進行16S rDNA的PCR擴增，PCR擴增產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果見圖2，余下放_201:冰箱保存。 實施例6、試劑盒的應用 用實施例3制備的試劑盒分別對Tessaracoccus f lavescens (DSM No. 18582)和Brooklawnia cerclae(DSM No. 19609)進行基因組DNA的提取。具體操作如下
①取lmL培養(yǎng)菌液(0D = 0. 8)至1. 5mL滅菌Eppendorf管中，13000rpm(離心半徑r = 9cm)離心5min收集菌體細胞； ②加入700 iU試劑A，用漩渦振蕩器振蕩45s懸浮菌體，而后用離心機13000rpm(離心半徑r = 9cm)離心3min，倒去上清液，得到沉淀;
③重復步驟②一次； 加入900 iil試劑B，用漩渦振蕩器振蕩45s懸浮菌體，然后加入60 iU試劑C，用漩渦振蕩器振蕩45s充分混勻；試劑C使用前振蕩45s混懸均勻； ⑤在室溫下靜置25min，而后用離心機13000rpm(離心半徑r = 9cm)離心3min，倒去上清液，得到沉淀； ⑥重新加入400iil試劑B，用漩渦振蕩器振蕩45s懸浮，并于室溫下靜置10min，
而后用離心機13000rpm(離心半徑r = 9cm)離心3min，倒去上清液，得到沉淀； ⑦加入500iil試劑D，用漩渦振蕩器振蕩20s懸浮，而后用離心機13000rpm(離心
半徑r = 9cm)離心3min，倒去上清液，得到沉淀； ⑧重復步驟⑦一次； ⑨加入500iil試劑E，用漩渦振蕩器振蕩20s懸浮，而后用離心機13000rpm(離心半徑r = 9cm)離心3min，倒去上清液，得到沉淀； ⑩用旋轉(zhuǎn)真空干燥儀(Concentrator 5301， Eppendorf)真空干燥(80mbar)沉淀
物，儀器每次運行4min，運行4次，每次間隔30s，直至大部分沉淀物變白； 在干燥后的沉淀物中加入50 ii 1試劑F，用漩渦振蕩器振蕩20s懸浮，4(TC水浴
8min，而后用離心機13000rpm(離心半徑r = 9cm)離心3min，用移液器收集上清液轉(zhuǎn)移至
新的1. 5ml滅菌E卯endorf管中(上清液即含有微生物基因組DNA)。 取2.5iU上清液用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳，選用購自天根生化科技(北京)
20有限公司的DNA分子量標品Marker VII作參比，電泳檢測結(jié)果見圖l，取0. 5 作為模板進行16S rDNA的PCR擴增，PCR擴增產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果見圖2，余下放_201:冰箱保存。
權(quán)利要求
一種DNA提取試劑盒，包含試劑A、試劑B、試劑C、試劑D、試劑E和試劑F；所述試劑A由NaCl和水組成；每100mL試劑A含有0.7-1.0g NaCl；所述試劑B由Tris、異硫氰酸胍、反式-1，2-環(huán)己二胺四乙酸和水組成；試劑B中，異硫氰酸胍的終濃度為3-5mol/L，Tris的終濃度為30-50mmol/L，反式-1，2-環(huán)己二胺四乙酸的終濃度為4-6mmol/L；所述試劑C由40-60體積份硅藻土和60-40體積份溶液甲組成；溶液甲由Tris、EDTA和水組成；溶液甲中，Tris的終濃度為5-15mmol/L，EDTA的終濃度為0.5-2mmol/L；所述試劑D由Tris、EDTA、NaCl、乙醇和水組成；試劑D中，乙醇的終濃度為60-70％(體積百分含量)，Tris的終濃度為15-25mmol/L，EDTA的終濃度為0.5-2mmol/L，NaCl的終濃度為350-450mmol/L；所述試劑E由乙醇和水組成；試劑E中，乙醇的終濃度為70-75％(體積百分含量)；所述試劑F由Tris、EDTA和水組成；試劑F中，Tris的終濃度為5-15mmol/L，EDTA的終濃度為0.5-2mmol/L。
2. 如權(quán)利要求l所述的試劑盒，其特征在于所述試劑A的制備方法如下將NaCl溶于水得到試劑A ;每100mL試劑A含有0. 7-0. 8g NaCl或0. 8-1. 0g NaCl ;所述試劑B的制備方法如下將Tris溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7. 5，制得Tris-HCl 溶液；將異硫氰酸胍和反式-l，2-環(huán)己二胺四乙酸溶于水后，再加入所述Tris-HCl溶 液，得到試劑B ;試劑B中，異硫氰酸胍的終濃度為3-4mol/L或4-5mol/L， Tris的終濃度 為30-40mmol/L或40-50mmol/L，反式_1， 2-環(huán)己二胺四乙酸的終濃度為4-5mmol/L或 5-6mmol/L ;所述試劑C的制備方法如下將40-45體積份硅藻土和60-55體積份溶液甲混合，或?qū)?45-60體積份硅藻土和55-40體積份溶液甲混合，得到試劑C ;溶液甲的配制方法如下將 Tris溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7. 5，制得Tris-HCl溶液；將EDTA溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至 7. 5，制得EDTA溶液；將所述Tris-HCl溶液和所述EDTA溶液混合，得到溶液甲；溶液甲中， Tris的終濃度為5-10mmol/L或10-15mmol/L， EDTA的終濃度為0. 5-lmmol/L或l-2mmo1/ L ;所述試劑D的制備方法如下將Tris溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7. 5，制得Tris-HCl 溶液；將EDTA溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7. 5，制得EDTA溶液；將NaCl溶于水，加入所 述Tris-HCl溶液和所述EDTA溶液，再加入乙醇，得到試劑D ;試劑D中，乙醇的終濃度為 60-65% (體積百分含量)或65-70% (體積百分含量)，Tris的終濃度為15-20mmol/L或 20-25mmol/L，EDTA的終濃度為0. 5-lmmol/L或l-2mmol/L， NaCl的終濃度為350-400mmo1/ L或400-450mmol/L ;所述試劑E的制備方法如下將乙醇溶于水，得到試劑E ;試劑E中，乙醇的終濃度為 70-75% (體積百分含量)；所述試劑F的制備方法如下將Tris溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8. 0，制得Tris-HCl溶 液；將EDTA溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8. 0，制得EDTA溶液；將所述Tris-HCl溶液和所述 EDTA溶液混合，得到試劑F ;試劑F中，Tris的終濃度為5-10mmol/L或10-15mmol/L， EDTA 的終濃度為0. 5-lmmol/L或l-2mmol/L。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于所述試劑C中，所述硅藻土的酸堿度 為5. 5-9. O，平均粒度為18-42 m， Si02的質(zhì)量百分含量》88% ;所述硅藻土的酸堿度優(yōu)選 為5. 5-7. 0或7. 0-9. 0，平均粒度優(yōu)選為18-20 y m或20-42 y m， Si02的質(zhì)量百分含量優(yōu)選 為88-92 %或92-94%。
4. 如權(quán)利要求1至3中任一所述的試劑盒，其特征在于所述的試劑盒為如下(I)或 (II)或(III):所述試劑盒(I)由試劑A、試劑B、試劑C、試劑D、試劑E和試劑F組成 所述試劑A的制備方法如下將NaCl溶于水得到試劑A;每100mL試劑A含有 0.8gNaCl ;所述試劑B的制備方法如下將Tris溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7. 5，制得Tris-HCl溶 液；將異硫氰酸胍和反式-1， 2-環(huán)己二胺四乙酸溶于水后，再加入所述Tris-HCl溶液，得 到試劑B ;試劑B中，異硫氰酸胍的終濃度為4mol/L， Tris的終濃度為40mmol/L，反式-1， 2-環(huán)己二胺四乙酸的終濃度為5mmol/L ;所述試劑C的制備方法如下將45體積份硅藻土和55體積份溶液甲混合，得到試劑 C ;溶液甲的配制方法如下將Tris溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7. 5，制得Tris-HCl溶液；將 EDTA溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7. 5，制得EDTA溶液；將所述Tris-HCl溶液和所述EDTA溶 液混合，得到溶液甲；溶液甲中，Tris的終濃度為10mmol/L， EDTA的終濃度為lmmol/L ;所 述硅藻土的pH為7. 0、平均粒度為20 ii m、 Si02的質(zhì)量百分含量為88% ;所述試劑D的制備方法如下將Tris溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7. 5，制得Tris-HCl 溶液；將EDTA溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7. 5，制得EDTA溶液；將NaCl溶于水，加入所述 Tris-HCl溶液和所述EDTA溶液，再加入乙醇，得到試劑D ;試劑D中，乙醇的終濃度為60% (體積百分含量)，Tris的終濃度為20mmol/L，EDTA的終濃度為lmmol/L，NaCl的終濃度為 400,1/L ;所述試劑E的制備方法如下將乙醇溶于水，得到試劑E ;試劑E中，乙醇的終濃度為75% (體積百分含量)；所述試劑F的制備方法如下將Tris溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8. 0，制得Tris-HCl溶 液；將EDTA溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8. 0，制得EDTA溶液；將所述Tri s-HCl溶液和所述 EDTA溶液混合，得到試劑F ;試劑F中，Tris的終濃度為10mmol/L，EDTA的終濃度為lmmol/ L ;所述試劑盒(II)由試劑A、試劑B、試劑C、試劑D、試劑E和試劑F組成 所述試劑A的制備方法如下將NaCl溶于水得到試劑A;每100mL試劑A含有 0.7gNaCl ;所述試劑B的制備方法如下將Tris溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7. 5，制得Tris-HCl溶 液；將異硫氰酸胍和反式-1， 2-環(huán)己二胺四乙酸溶于水后，再加入所述Tris-HCl溶液，得 到試劑B ;試劑B中，異硫氰酸胍的終濃度為3mol/L， Tris的終濃度為30mmol/L，反式-1， 2-環(huán)己二胺四乙酸的終濃度為4mmol/L ;所述試劑C的制備方法如下將40體積份硅藻土和60體積份溶液甲混合，得到試劑 C ;溶液甲的配制方法如下將Tris溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7. 5，制得Tris-HCl溶液；將 EDTA溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7. 5，制得EDTA溶液；將所述Tris-HCl溶液和所述EDTA溶液混合，得到溶液甲；溶液甲中，Tris的終濃度為5mmol/L，EDTA的終濃度為0. 5mmol/L ;所 述硅藻土的pH為5. 5、平均粒度為18 ii m、 Si02的質(zhì)量百分含量為92% ;所述試劑D的制備方法如下將Tris溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7. 5，制得Tris-HCl 溶液；將EDTA溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7. 5，制得EDTA溶液；將NaCl溶于水，加入所述 Tris-HCl溶液和所述EDTA溶液，再加入乙醇，得到試劑D ;試劑D中，乙醇的終濃度為65% (體積百分含量)，Tris的終濃度為15mmol/L，EDTA的終濃度為0. 5mmol/L，NaCl的終濃度 為350mmol/L ;所述試劑E的制備方法如下將乙醇溶于水，得到試劑E ;試劑E中，乙醇的終濃度為 70% (體積百分含量)；所述試劑F的制備方法如下將Tris溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8. 0，制得Tris-HCl溶 液；將EDTA溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8. 0，制得EDTA溶液；將所述Tris-HCl溶液和所述 EDTA溶液混合，得到試劑F ;試劑F中，Tris的終濃度為5mmol/L， EDTA的終濃度為0. 5mmo1/ L ;所述試劑盒(III)由試劑A、試劑B、試劑C、試劑D、試劑E和試劑F組成 所述試劑A的制備方法如下將NaCl溶于水得到試劑A;每100mL試劑A含有 1. 0gNaCl ;所述試劑B的制備方法如下將Tris溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7. 5，制得Tris-HCl溶 液；將異硫氰酸胍和反式-1， 2-環(huán)己二胺四乙酸溶于水后，再加入所述Tris-HCl溶液，得 到試劑B ;試劑B中，異硫氰酸胍的終濃度為5mol/L， Tris的終濃度為50mmol/L，反式-1， 2-環(huán)己二胺四乙酸的終濃度為6mmol/L ;所述試劑C的制備方法如下將60體積份硅藻土和40體積份溶液甲混合，得到試劑 C ;溶液甲的配制方法如下將Tris溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7. 5，制得Tris-HCl溶液；將 EDTA溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7. 5，制得EDTA溶液；將所述Tris-HCl溶液和所述EDTA溶 液混合，得到溶液甲；溶液甲中，Tris的終濃度為15mmol/L， EDTA的終濃度為2mmol/L ;所 述硅藻土的pH為9. 0、平均粒度為42 ii m、 Si02的質(zhì)量百分含量為94% ;所述試劑D的制備方法如下將Tris溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7. 5，制得Tris-HCl 溶液；將EDTA溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7. 5，制得EDTA溶液；將NaCl溶于水，加入所述 Tris-HCl溶液和所述EDTA溶液，再加入乙醇，得到試劑D ;試劑D中，乙醇的終濃度為70% (體積百分含量)，Tris的終濃度為25mmol/L，EDTA的終濃度為2mmol/L，NaCl的終濃度為 450mmol/l ;所述試劑E的制備方法如下將乙醇溶于水，得到試劑E ;試劑E中，乙醇的終濃度為 75% (體積百分含量)；所述試劑F的制備方法如下將Tris溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8. 0，制得Tris-HCl溶 液；將EDTA溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8. 0，制得EDTA溶液；將所述Tris-HCl溶液和所述 EDTA溶液混合，得到試劑F ;試劑F中，Tris的終濃度為15mmol/L， EDTA的終濃度為2mmo1/ L。
5. 權(quán)利要求1至4中任一所述試劑盒在提取微生物基因組DNA中的應用。
6. 應用權(quán)利要求1至4中任一所述試劑盒提取微生物基因組DNA的方法，包括如下步驟① 收集菌體細胞；② 加入所述試劑A，振蕩懸浮菌體，而后離心，倒去上清液，得到沉淀；③ 加入所述試劑A，振蕩懸浮菌體，而后離心，倒去上清液，得到沉淀；④ 加入所述試劑B，振蕩懸浮菌體，然后加入所述試劑C，振蕩混勻；⑤ 靜置，而后離心，倒去上清液，得到沉淀；⑥ 加入所述試劑B，振蕩懸浮，靜置，而后離心，倒去上清液；⑦ 加入所述試劑D，振蕩懸浮，而后離心，倒去上清液，得到沉淀；⑧ 加入所述試劑D，振蕩懸浮，而后離心，倒去上清液，得到沉淀；⑨ 加入所述試劑E，振蕩懸浮，而后離心，倒去上清液，得到沉淀；⑩ 干燥沉淀物；(D)在干燥后的沉淀物中加入所述試劑F，振蕩懸浮，水浴后離心，收集含有微生物基因 組DNA的上清液。
7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述方法包括如下步驟① 取lmL 0D = 0. 4-1. 5的微生物菌液，離心收集菌體細胞；② 加入500-1000 iU所述試劑A，振蕩懸浮菌體，而后離心，倒去上清液，得到沉淀；③ 加入500-1000 iU所述試劑A，振蕩懸浮菌體，而后離心，倒去上清液，得到沉淀； 加入700-900 ii 1所述試劑B，振蕩懸浮菌體，然后加入60-100 y 1所述試劑C，振蕩混勻；⑤靜置，而后離心，倒去上清液，得到沉淀； 加入400-600 iU所述試劑B，振蕩懸浮，靜置，而后離心，倒去上清液，得到沉淀；⑦ 加入500-700 iU所述試劑D，振蕩懸浮，而后離心，倒去上清液，得到沉淀；⑧ 加入500-700 iU所述試劑D，振蕩懸浮，而后離心，倒去上清液，得到沉淀；⑨ 加入500-1000 iU所述試劑E，振蕩懸浮，而后離心，倒去上清液，得到沉淀；⑩ 干燥沉淀物； 在干燥后的沉淀物中加入50-100 iU所述試劑F，振蕩懸浮，水浴后離心，收集含有 微生物基因組DNA的上清液。
8. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述方法包括如下步驟① 取lmL 0D = 0. 6-1. 0的微生物菌液，離心，收集菌體細胞；② 加入500-1000 yl所述試劑A，振蕩30-60s懸浮菌體，而后以9cm為半徑 10000-13000rpm離心3-5min，倒去上清液，得到沉淀；③ 加入500-1000 yl所述試劑A，振蕩30-60s懸浮菌體，而后以9cm為半徑 10000-13000rpm離心3-5min，倒去上清液，得到沉淀； 加入700-900 ii 1所述試劑B，振蕩30-60s懸浮菌體，然后加入60-100 y 1所述試劑 C，振蕩30-60s混勻; 靜置25-35min，而后以9cm為半徑10000-13000rpm離心3-5min，倒去上清液，得到 沉淀； 加入400-600 ii 1所述試劑B，振蕩30-60s懸浮，靜置10-20min，而后以9cm為半徑 10000-13000rpm離心3-5min，倒去上清液，得到沉淀；⑦加入500-700 iil所述試劑D，振蕩10-30s懸浮，而后以9cm為半徑10000-13000rpm離心3-5min，倒去上清液，得到沉淀；⑧ 加入500-700 iil所述試劑D，振蕩10-30s懸浮，而后以9cm為半徑10000-13000rpm 離心3-5min，倒去上清液，得到沉淀；⑨ 加入500-1000 ii 1所述試劑E，振蕩10-30s懸浮，而后以9cm為半徑10000-13000rpm 離心3-5min，倒去上清液，得到沉淀；⑩ 干燥沉淀物； 在干燥后的沉淀物中加入50-100 iil所述試劑F，振蕩10-30s懸浮，40-6(TC水浴 5-10min，而后以9cm為半徑10000-13000rpm離心3min-5min，收集含有微生物基因組DNA 的上清液。
9. 如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述方法包括如下步驟① 取lmL 0D = 0. 6-0. 8或0D = 0. 8-1. 0的微生物菌液，13000rpm離心5min，收集菌 體細胞；② 加入500-700 ii 1或700-1000 y 1所述試劑A，振蕩30_45s或45_60s懸浮菌體，而后 10000-13000rpm離心3-5min，倒去上清液，得到沉淀；③ 加入500-700 ii 1或700-1000 y 1所述試劑A，振蕩30_45s或45_60s懸浮菌體，而后 10000-13000rpm離心3-5min，倒去上清液，得到沉淀； 加入700-800 ii 1或800-900 y 1所述試劑B，振蕩30_45s或45_60s懸浮菌體，然后 加入60-80 ii 1或80-100 ii 1所述試劑C，振蕩30-45s或45_60s混勻； 靜置25-30min或30-35min，而后10000-13000rpm離心3-5min，倒去上清液，得到沉淀； 加入400-500 iil或500-600 iil所述試劑B，振蕩30_45s或45_60s懸浮，靜置 10-15min或15-20min，而后10000-13000rpm離心3-5min，倒去上清液，得到沉淀；⑦ 加入500-600 iil或600-700 iil所述試劑D，振蕩10_20s或20_30s懸浮，而后 10000-13000rpm離心3-5min，倒去上清液，得到沉淀；⑧ 加入500-600 iil或600-700 iil所述試劑D，振蕩10_20s或20_30s懸浮，而后 10000-13000rpm離心3_5min，倒去上清液，得到沉淀；⑨ 加入500-600 ill或600-1000 ill所述試劑E，振蕩10_20s或20_30s懸浮，而后 10000-13000rpm離心3_5min，倒去上清液，得到沉淀；⑩ 干燥沉淀物； 在干燥后的沉淀物中加入50-60 ill或60-100 ill所述試劑F，振蕩10-20s或20-30s 懸浮，40-55。C或55-60。C水浴5_8min或8-10min，而后10000-13000rpm離心3-5min，收集 含有微生物基因組DNA的上清液。
10. 如權(quán)利要求6至9中任一所述的方法，其特征在于所述方法為如下(IV)或(V)或 (VI):所述方法(IV)包括如下步驟① 取lmL OD = 0. 6的微生物菌液，13000rpm離心5min，收集菌體細胞；② 加入500 ii 1所述試劑A，振蕩60s懸浮菌體，而后13000rpm離心3min，倒去上清液， 得到沉淀；③ 加入500 ii 1所述試劑A，振蕩60s懸浮菌體，而后13000rpm離心3min，倒去上清液，得到沉淀； 加入800 ii 1所述試劑B，振蕩60s懸浮菌體，然后加入80 ii 1所述試劑C，振蕩60s 混勻； 靜置30min，而后13000rpm離心3min，倒去上清液，得到沉淀； 加入500 ii 1所述試劑B，振蕩30s懸浮，靜置15min，而后13000rpm離心3min，倒去 上清液，得到沉淀；⑦ 加入600 ii 1所述試劑D，振蕩10s懸浮，而后13000rpm離心3min，倒去上清液，得到 沉淀；⑧ 加入600 ii 1所述試劑D，振蕩10s懸浮，而后13000rpm離心3min，倒去上清液，得到 沉淀；⑨ 加入600 ii 1所述試劑E，振蕩10s懸浮，而后13000rpm離心3min，倒去上清液，得到 沉淀；⑩ 干燥沉淀物； 在干燥后的沉淀物中加入60 ii 1所述試劑F，振蕩10s懸浮，55t:水浴10min，而后 13000rpm離心3min，收集含有微生物基因組DNA的上清液； 所述方法(V)包括如下步驟① 取lmL OD = 1. 0的微生物菌液，13000rpm離心5min，收集菌體細胞；② 加入1000 ii 1所述試劑A，振蕩30s懸浮菌體，而后10000rpm離心5min，倒去上清液， 得到沉淀；③ 加入1000 ii 1所述試劑A，振蕩30s懸浮菌體，而后10000rpm離心5min，倒去上清液， 得到沉淀； 加入700 ii 1所述試劑B，振蕩30s懸浮菌體，然后加入100 ii 1所述試劑C，振蕩30s 混勻； 靜置35min，而后10000rpm離心5min，倒去上清液，得到沉淀； 加入600 ii 1所述試劑B，振蕩60s懸浮，靜置20min，而后10000rpm離心5min，倒去 上清液，得到沉淀；⑦ 加入700 ii 1所述試劑D，振蕩30s懸浮，而后10000rpm離心5min，倒去上清液，得到 沉淀；⑧ 加入700 ii 1所述試劑D，振蕩30s懸浮，而后10000rpm離心5min，倒去上清液，得到 沉淀；⑨ 加入1000 ii 1所述試劑E，振蕩30s懸浮，而后10000rpm離心5min，倒去上清液，得 到沉淀；⑩ 干燥沉淀物； 在干燥后的沉淀物中加入100 iil所述試劑F，振蕩30s懸浮，6(TC水浴5min，而后 10000rpm離心5min，收集含有微生物基因組DNA的上清液； 所述方法(VI)包括如下步驟① 取lmL OD = 0. 8的微生物菌液，13000rpm離心5min，收集菌體細胞；② 加入700 ii 1所述試劑A，振蕩45s懸浮菌體，而后13000rpm離心3min，倒去上清液， 得到沉淀；③加入700 ii 1所述試劑A，振蕩45s懸浮菌體，而后13000rpm離心3min，倒去上清液， 得到沉淀； 加入900 1所述試劑B，振蕩45s懸浮菌體，然后加入60 y 1所述試劑C，振蕩45s 混勻；⑤靜置25min，而后13000rpm離心3min，倒去上清液，得到沉淀； 加入400 ii 1所述試劑B，振蕩45s懸浮，靜置10min，而后13000rpm離心3min，倒去 上清液，得到沉淀；⑦ 加入500 ii 1所述試劑D，振蕩20s懸浮，而后13000rpm離心3min，倒去上清液，得到 沉淀；⑧ 加入500 ii 1所述試劑D，振蕩20s懸浮，而后13000rpm離心3min，倒去上清液，得到 沉淀；⑨ 加入500 ii 1所述試劑E，振蕩20s懸浮，而后13000rpm離心3min，倒去上清液，得到 沉淀；⑩ 干燥沉淀物； 在干燥后的沉淀物中加入50 ii 1所述試劑F，振蕩20s懸浮，4(TC水浴8min，而后 13000rpm離心3min，收集含有微生物基因組DNA的上清液；所述方法(IV)、方法(V)和(VI)中步驟④中，所述試劑C使用前振蕩30-60s混懸均 勻；步驟⑩中，采用真空干燥。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種DNA提取試劑盒及其應用。本發(fā)明提供的試劑盒包含試劑A、B、C、D、E和F；A由NaCl和水組成，每100mL含0.7-1.0g NaCl；B由Tris、異硫氰酸胍、反式-1，2-環(huán)己二胺四乙酸和水組成，3-5mol/L異硫氰酸胍，30-50mmol/L Tris，4-6mmol/L反式-1，2-環(huán)己二胺四乙酸；C由40-60體積份硅藻土和60-40體積份溶液甲組成；溶液甲由Tris、EDTA和水組成，5-15mmol/L Tris的，0.5-2mmol/L EDTA；D由Tris、EDTA、NaCl和、乙醇和水組成，60-70％乙醇，15-25mmol/L Tris，0.5-2mmol/LEDTA，350-450mmol/L NaCl；E由乙醇和水組成，70-75％乙醇；F由Tris、EDTA和水組成，5-15mmol/L Tris，0.5-2mmol/L EDTA。本發(fā)明的試劑盒制備方法簡單，易于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明的方法，具有提取快速、操作簡單污染小等優(yōu)點，可用于培養(yǎng)富集的微生物基因組DNA提取及其分子生物學鑒定。
文檔編號C12Q1/68GK101792754SQ20101011287
公開日2010年8月4日 申請日期2010年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月23日
發(fā)明者吳曉磊, 池昌橋, 湯岳琴, 郭鵬 申請人:北京大學