專利名稱：一種用于pcr擴(kuò)增的真菌dna快速提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物的DNA提取方法，尤其涉及一種用于PCR擴(kuò)增的真菌DNA 快速提取方法，屬于真菌分子生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著對真菌分子生物學(xué)的深入研究，在對真菌進(jìn)行分子鑒定和分類及其基因的克 隆時(shí)需要少量的真菌基因組DNA做模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。真菌細(xì)胞壁厚，多糖含量高，常用的 真菌DNA提取方法是CTAB法。CTAB法提取的DNA純度較高，但需要大量菌絲體且步驟繁瑣， 首先將真菌菌絲體研磨破壁，高溫溫育，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。另外也有一些真菌DNA提取方法的報(bào)道 但都離不開研磨破壁和酚氯仿抽提蛋白等步驟。上述方法均難以應(yīng)用于批量的真菌DNA提 取。因此急需一種更為簡便快速的方法少量提取真菌DNA用于后續(xù)的PCR擴(kuò)增，以滿足對 真菌分子鑒定的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種快速、簡便、經(jīng)濟(jì)、 低毒、易行的真菌DNA提取方法， 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的
—種用于PCR擴(kuò)增的真菌DNA快速提取方法，包括以下步驟
(1)培養(yǎng)有待提取DNA的真菌，得到真菌菌絲體；
(2)將所培養(yǎng)的真菌菌絲體置于裝有裂解液的離心管中；
(3)將離心管交替凍融； (4)離心，取上清轉(zhuǎn)入無菌離心管，加入兩倍體積的95%乙醇，顛倒混勻，液氮速 凍后，離心，棄上清，將沉淀風(fēng)干，用雙蒸水或1XTE溶液溶解，即得。 為了達(dá)到更佳的提取效果，優(yōu)選的，步驟(1)中將待提取DNA的真菌在PDA培養(yǎng)基 上進(jìn)行平板或斜面培養(yǎng)； 優(yōu)選的，步驟(2)中將真菌菌絲體置于裝有100-500 裂解液的微量離心管中； 更優(yōu)選的，將真菌菌絲體置于裝有200 裂解液的微量離心管中；其中，所述裂解液的成 份為10mM Tris-HCl， pH8. 0， ImM EDTA，250mM NaCl， 1% SDS ; 步驟(3)中所述的交替凍融優(yōu)選為將離心管放置于液氮中速凍后迅速轉(zhuǎn)入沸水 中煎煮；更優(yōu)選的，將裝有真菌菌絲體的離心管中置入液氮速凍中速凍30秒-2分鐘然后迅 速轉(zhuǎn)入沸水中煮2-10分鐘；最優(yōu)選的，將裝有真菌菌絲體的離心管中置入液氮速凍中速凍 1分鐘然后迅速轉(zhuǎn)入沸水中煮5分鐘；步驟(3)中的交替凍融次數(shù)可以為1-3次，為了達(dá)到 更好的裂解效果，交替凍融的次數(shù)最好為2次； 步驟(4)中所述的離心在o-4t:的低溫條件下進(jìn)行離心，離心轉(zhuǎn)速優(yōu)選為 8000-16000rpm，更優(yōu)選為12000rpm ;其中，第一次離心的時(shí)間優(yōu)選為1_3分鐘，更優(yōu)選為2 分鐘；，第二次離心的時(shí)間優(yōu)選為5-15分鐘，更優(yōu)選為10分鐘。
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其中，為了提高所提取的DNA的純度，步驟(4)中將沉淀風(fēng)干之前，可加入1ml的 75X乙醇洗滌沉淀，4。C，12000rpm離心lmin ; 本發(fā)明的方法完全可用于所有的真菌DNA的提取，所述的真菌包括側(cè)耳屬真 菌(Pleurotus)，細(xì)極鏈格孢菌(Alternaria te皿issima)、葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea(Moug. )Ces. &De Not.)、尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、圍小叢殼菌 (Glomerella cingulata)、果生鏈核盤菌(Moniliniafructigena Honey)、盤長孢狀剌盤孢 菌(Colletotrichum gloeosporioides)、淡紫擬青霉(Paecilomyces lilaci皿s (Thom.) Samson)等。 本發(fā)明方法較之傳統(tǒng)的CTAB法操作簡單，省去了采用液氮研磨步驟，省時(shí)省力且 減少了研磨過程中真菌DNA的損失；本發(fā)明方法采用液氮和沸水反復(fù)凍融，使裂解液中蛋 白和多糖含量比較少，無需再用苯酚和氯仿抽提，避免了有毒試劑的接觸，加入乙醇后又用 液氮處理提高了 DNA沉淀效率。本發(fā)明方法所提取的DNA完整性好，純度高，收率高，可直 接用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)，能夠高效擴(kuò)增出用于克隆和測序的目的產(chǎn)物。本發(fā)明方法大大提高 真菌DNA的提取效率，降低了真菌DNA提取的成本，從而可有效提高真菌的分子鑒定和檢測 效率，降低鑒定和檢測成本。


圖1采用本發(fā)明方法提取的側(cè)耳屬真菌DNA為模板，PCR擴(kuò)增rDNA-ITS片段瓊 脂糖凝膠(1.0% )電泳圖；其中泳道1-3為側(cè)耳屬剌芹側(cè)耳(Pleurotuseryngii(DC.) Gillet)菌株；泳道1-3為白黃側(cè)耳(Pleurotus geesteya皿s Singer) 3個(gè)菌株；泳道4-6 為袖珍側(cè)耳(Pleurotus eryngii (DC.) Gillet) 3個(gè)菌株；泳道7-9為虎奶菇(Pleurotus tuber-regi咖(R卿h. ex Fr.) Singer) 3個(gè)菌株；泳道10-12為阿魏側(cè)耳(Pleurotus ferulae (Lanzi)X. L.Mao)3個(gè)菌株；泳道13—15為長柄平燕(Pleurotus spodoleucus (Fr.) Qu6l. )3個(gè)菌株；泳道16-18為平燕(Pleurotus ostreatus (Jacq. ) P. Kumm. ) 3個(gè)菌株；泳 道19-24為鮑魚側(cè)耳(Pleurotus abalo皿s Y. H. Han， K. M. Chen&S. Cheng) 3個(gè)菌株；M為 DL2000DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，從上到下依次為5000、 3000、 2000、 1000、 750、 500、 250bp 。
圖2采用本發(fā)明方法提取的真菌DNA為模板，PCR擴(kuò)增rDNA-ITS片段瓊脂糖凝 膠(1.0%)電泳圖；其中泳道1-3為平燕(Pleurotus ostreatus (Jacq. ) P. Kumm. ) 3個(gè) 菌株、泳道4-6細(xì)極鏈格孢菌(Alternaria te皿issima) 3個(gè)菌株、泳道7-9為葡萄座腔 菌(Botryosphaeria dothidea (Moug. ) Ces. &De Not. )3個(gè)菌株、泳道10-12為尖孢鐮刀菌 (Fusarium oxysporum) 3個(gè)菌株、泳道13-15為圍小叢殼菌(Glomerella cingulata) 3個(gè)菌 株、泳道16-18為果生鏈核盤菌(Monilinia fructigena Honey) 3個(gè)菌株、泳道19-21為盤 長孢狀剌盤孢菌(Colletotrichum gloeosporioides) 3個(gè)菌株、泳道22-24為淡紫擬青霉 (Paecilomyces lilaci皿s (Thom.) Samson) 3個(gè)菌株，M為DL2000DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，從上到下 依次為5000、3000、2000、1000、750、500、250bp。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而 更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)
4人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式 進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
實(shí)施例1 接種側(cè)耳屬剌芹側(cè)耳(Pleurotus eryngii (DC. ) Gillet)、白黃側(cè)耳 (Pleurotusgeesteya皿s Singer)、 袖 珍 側(cè) 耳 (Pleurotus eryngii (DC. )Gillet)、 虎奶燕(Pleurotus tuber_regium(Rumph. ex Fr.) Singer)、 阿魏偵[J耳(Pleurotus ferulae (Xanzi) X丄Mao)、 長柄平燕 (Pleurotus spodoleucus (Fr. ) Qu6l.)、 平燕 (Pleurotus ostreatus (Jacq. ) P. Kumm.)、鮑魚側(cè)耳(Pleurotus abalo皿s Y. H. Han， K. M. Chen& S. Cheng) 8種各3個(gè)菌株在PDA培養(yǎng)基3(TC條件下生長一周，接種針挑取少量 的真菌菌絲體放入加有200 ii 1裂解液(10mM Tris-HCl，pH8. 0， ImM EDTA，250mM NaCl， 1% SDS ;新鮮配制)的微量離心管中；液氮速凍lmin，迅速放入沸水中煮5min，重復(fù)1次；4°C， 12000rpm離心2min，取上清轉(zhuǎn)入無菌離心管，加入兩倍體積的95%乙醇，顛倒混勻，液氮速 凍lmin，4。C， 12000rpm離心10min倒掉上清；加入lml的75%乙醇洗滌沉淀，4°C ， 12000rpm 離心lmin，倒掉上清，將沉淀風(fēng)干；加入50iU 1XTE溶解DNA， -2(TC保存?zhèn)溆谩?
用所提取的DNA做模板和真菌通用引物ITS1(5' -GTA GTC ATA TGC TTGTCT C-3' )/ITS4(5' -TCC GCA GGT TCA CCT ACG GA-3 ')進(jìn)行PCR擴(kuò)增，除阿魏側(cè)耳 (Pleurotus ferulae (Lanzi) X. L. Mao) —個(gè)菌株外其余全部成功擴(kuò)增到長度約為600左右 的rDNA-ITS片段(圖1)，擴(kuò)增效率為95% 。
實(shí)施例2 平燕(Pleurotus ostreatus (Jacq. ) P. Kumm.)、 細(xì)極鏈格孢菌 (Alternariate皿issima)、 葡 萄 座 腔 菌 (Botryosphaeria dothidea(Moug.) Ces. &De Not.)、尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)、圍小叢殼菌(Glomerella cingulata)、果生鏈核盤菌(Monilinia f潔tigena Honey)、芒果炭疽病菌 (Colletotrichumgloeosporioides)、淡紫擬青霉(Paecilomyces lilaci皿s (Thom.) Samson) 8種各3個(gè)菌株在PDA培養(yǎng)基3(TC條件下生長一周，接種針挑取少量的真菌菌絲體 放入加有200 ii 1裂解液(10mM Tris-HCl， pH8. 0， ImM EDTA，250mM NaCl， 1% SDS ;新鮮配 制)的微量離心管，其中對不同裂解液成分做了液氮速凍lmin，迅速放入沸水中煮5min， 重復(fù)1次；4。C， 12000rpm離心2min，取上清轉(zhuǎn)入無菌離心管，加入兩倍體積的95%乙醇，顛 倒混勻，液氮速凍lmin ;4。C，12000rpm離心10min倒掉上清；加入lml的75%乙醇洗滌沉 淀；4。C，12000rpm離心lmin，倒掉上清，沉淀風(fēng)干；加入50iU 1XTE溶解DNA， -20。C保存 備用。 用提取的DNA做模板和真菌通用引物ITS1 (5 ' -GTA GTC ATA TGC TTG TCTC-3' )/ITS4(5' -TCC GCA GGT TCA CCT ACG GA-3')進(jìn)行PCR擴(kuò)增，除細(xì)極鏈格孢菌 (Alternaria te皿issima) —個(gè)菌株外其余全部成功擴(kuò)增到長度約為600左右的rDNA-ITS 片段(圖2)，擴(kuò)增效率為95%。
權(quán)利要求
一種用于PCR擴(kuò)增的真菌DNA快速提取方法，包括以下步驟(1)培養(yǎng)有待提取DNA的真菌，得到真菌菌絲體；(2)將真菌菌絲體置于裝有裂解液的離心管中；(3)將離心管交替凍融；(4)離心，取上清轉(zhuǎn)入無菌離心管，加入兩倍體積的95％乙醇，顛倒混勻，用液氮速凍，離心，棄上清，將沉淀風(fēng)干，即得。
2. 按照權(quán)利要求l所述的真菌DNA快速提取方法，其特征在于步驟(1)中將待提取 DNA的真菌在PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行平板或斜面培養(yǎng)。
3. 按照權(quán)利要求1所述的真菌DNA快速提取方法，其特征在于步驟(2)中將真菌菌 絲體置于裝有100-500 iU裂解液的微量離心管中；優(yōu)選的，將真菌菌絲體置于裝有200 裂解液的微量離心管中其中，所述裂解液的組成成份為10mMTris-HCl， pH8. 0， ImM EDTA， 250mM NaCl， 1% SDS。
4. 按照權(quán)利要求l所述的真菌DNA快速提取方法，其特征在于步驟(3)中所述的交 替凍融是指將離心管在液氮中速凍后迅速轉(zhuǎn)入沸水中煎煮。
5. 按照權(quán)利要求4所述的真菌DNA快速提取方法，其特征在于步驟(3)中將裝有真 菌菌絲體的離心管中置入液氮速凍中速凍30秒-2分鐘然后迅速轉(zhuǎn)入沸水中煮2-10分鐘； 優(yōu)選的，將裝有真菌菌絲體的離心管中置入液氮速凍中速凍1分鐘然后迅速轉(zhuǎn)入沸水中煮 5分鐘。
6. 按照權(quán)利要求l所述的真菌DNA快速提取方法，其特征在于步驟(3)中所述的交 替凍融的次數(shù)為1-3次，優(yōu)選為2次。
7. 按照權(quán)利要求l所述的真菌DNA快速提取方法，其特征在于步驟(4)中，所述的離 心在0-4t:的低溫條件下進(jìn)行離心，離心轉(zhuǎn)速為8000-16000rpm;優(yōu)選的，所述的離心在4t: 的低溫條件下進(jìn)行離心，離心轉(zhuǎn)速為12000rpm。
8. 按照權(quán)利要求7所述的真菌DNA快速提取方法，其特征在于步驟(4)中第一次離 心的時(shí)間為1-3分鐘，優(yōu)選為2分鐘；第二次離心的時(shí)間為5-15分鐘，優(yōu)選為10分鐘。
9. 按照權(quán)利要求1所述的真菌DNA快速提取方法，其特征在于步驟(4)中將沉淀風(fēng) 干之前，加入lml的75X乙醇洗滌沉淀，4t:，12000rpm離心1分鐘。
10. 按照權(quán)利要求1所述的真菌DNA快速提取方法，其特征在于，所述的真菌包 括側(cè)耳屬(Pleurotus)真菌，細(xì)極鏈格孢菌(Alternaria te皿issima)、葡萄座腔菌 (Botryosphaeria dothidea(Moug. )Ces. &De Not.)、尖抱嫌刀菌(Fusariumoxysporum)、 圍小叢殼菌(Glomerella cingulata)、果生鏈核盤菌(Moniliniafructigena Honey)、 盤長 包狀剌盤 包菌(Colletotrichum gloeosporioides)、淡紫擬青霉(Paecilomyces lilaci皿s (Thom. ) Samson)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于PCR擴(kuò)增的真菌DNA快速提取方法，包括以下步驟(1)培養(yǎng)真菌，得到真菌菌絲體；(2)將真菌菌絲體置于裝有裂解液的離心管中；(3)將離心管交替凍融；(4)離心，取上清，加入95％乙醇，混勻，液氮速凍，離心，棄上清，將沉淀風(fēng)干，即得。本發(fā)明方法操作簡單，省時(shí)省力且減少了研磨過程中真菌DNA的損失，無需用苯酚和氯仿抽提，避免了有毒試劑的接觸。本發(fā)明方法所提取DNA完整性好，純度高，收率高，可直接用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)，能夠高效擴(kuò)增出用于克隆和測序的目的產(chǎn)物。本發(fā)明方法提高了真菌DNA的提取效率，降低了真菌DNA提取的成本，可有效提高真菌的分子鑒定和檢測效率。
文檔編號(hào)C12R1/77GK101696411SQ20091023559
公開日2010年4月21日 申請日期2009年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月29日
發(fā)明者樸春根, 李永, 林彩麗, 汪來法, 王曦茁, 田國忠, 郭民偉 申請人:中國林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所;