一種用大型真菌菌液(質(zhì))制備高效益生菌制劑的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用大型真菌菌液(質(zhì))制備高效益生菌制劑的方法，該方法為：用農(nóng)副產(chǎn)品制備液體或固體培養(yǎng)基培養(yǎng)真菌得到菌液或菌質(zhì)；將菌液或菌質(zhì)經(jīng)物理和生物處理使多糖多肽物質(zhì)從細(xì)胞中釋放出來，加入氮源和碳源配制成益生菌培養(yǎng)基；再接種益生菌培養(yǎng)得到高效益生菌制劑。所述的真菌包括香菇、茶薪菇、羊肚菌、滑子菇、猴頭菇、牛肝菌、白靈菇、黃金菇、靈芝、云芝、蟲草菌、茯苓、竹蓀、松乳菇等藥(食)用真菌；益生菌是芽孢桿菌、酵母菌、乳酸菌、腸球菌、雙歧桿菌等中的一種或多種。本發(fā)明制備的益生菌制劑富含多糖、多肽等活性物質(zhì)，其保健與治療效果比常規(guī)益生菌制劑更好，可作為人畜胃腸道疾病的治療藥物與保健食品或飼料添加劑。
【專利說明】一種用大型真菌菌液（質(zhì)）制備高效益生菌制劑的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及益生菌制劑的制備，具體涉及一種用大型真菌菌液（質(zhì)）制備高效益 生菌制劑的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 隨著抗生素的長期使用所引起的內(nèi)源性感染和二重感染、耐藥菌株的產(chǎn)生、動物 體免疫力下降、藥物殘留及食品等一系列問題引起人們的廣泛關(guān)注，使人們對身體健康、環(huán) 境保護(hù)及食品安全的意識不斷加強(qiáng)；對養(yǎng)殖業(yè)從養(yǎng)殖到貯藏、加工、運(yùn)輸和銷售各個環(huán)節(jié)全 程質(zhì)量控制的要求也日益加劇。"無公害飼料"、"生態(tài)飼料"、"環(huán)保飼料"、"有機(jī)飼料"和"綠 色飼料"等倍受關(guān)注。尤其是微生物飼料已成為目前或?qū)淼难芯糠较蚝蜔狳c(diǎn)之一。益生 菌制劑正是這樣一種飼料添加劑。益生菌制劑是一種含有大量有益微生物，在腸道環(huán)境中 存活并進(jìn)行代謝，具有維持腸道微生態(tài)平衡，提高機(jī)體健康水平的活菌制劑。益生菌制劑治 療腸道菌群失調(diào)克服了抗生素單純殺菌或抑菌的治療取向，而是促進(jìn)正常菌群充分發(fā)揮生 物拮抗作用，將致病菌祛除，正所謂"扶正祛邪"，由此也避免了因抗生素濫用造成耐藥株的 增加和耐藥因子的擴(kuò)散等現(xiàn)實(shí)難題。益生菌制劑是融匯了動物營養(yǎng)學(xué)、飼料學(xué)和微生物學(xué) 等學(xué)科知識；結(jié)合了配合飼料工業(yè)技術(shù)、發(fā)酵工程技術(shù)和酶工程技術(shù)而誕生的。在醫(yī)藥保 健、種植業(yè)、環(huán)境凈化和養(yǎng)殖業(yè)等方面發(fā)揮了越來越重要的作用。
[0003] 微生態(tài)制劑可分為益生菌（probiotics)、益生元（prebioics)、合生元 (snybiotics)三種類型。益生菌又稱益生素，是指能促進(jìn)腸道內(nèi)菌群平衡，對宿主起到有益 作用的活菌制劑及其代謝產(chǎn)物；益生元是指能選擇性促進(jìn)宿主腸道內(nèi)一種或幾種有益菌的 繁殖，達(dá)到調(diào)整腸道菌群作用的物質(zhì)；合生元是將益生菌與益生元同時合并應(yīng)用的一類制 齊U，合生元既可發(fā)揮益生菌的生理活性，又可選擇性地增加這種益生菌的數(shù)量，使益生作用 更顯著。
[0004] 目前益生菌制劑市場看，也存在菌種活性及其穩(wěn)定性不高，治療效果低的問題；為 了更好地挖掘益生菌的潛能作用，近年來國內(nèi)外在探索益生菌的作用機(jī)理研究的同時，力口 強(qiáng)高效產(chǎn)品的開發(fā)研究，包括：（1)微生物品種的篩選與組合，尋求自己的菌源（包括基因 工程菌株篩選），開發(fā)復(fù)合菌制劑（因復(fù)合菌制劑較代單一菌制劑的協(xié)同作用效果更好，更 符合實(shí)際生態(tài)環(huán)境）；（2)益生菌產(chǎn)品穩(wěn)定性的研究，在優(yōu)良菌株的篩選、高活力菌劑的發(fā) 酵工藝、菌體保護(hù)（微囊包被等）和增效劑選用等關(guān)鍵技術(shù)方面獲得突破，使在保藏及加工 處理過程中保持其菌體活性；（3)益生元的開發(fā)，探索新的益生元，以天然原料提取、酶解 或酸解等方法制備可以減少有害菌種，促進(jìn)有益菌種繁殖活動，有益于機(jī)體健康的物質(zhì)，提 高微生態(tài)制劑（合生元）的活性功能。低聚糖類物質(zhì)是益生元研究的重點(diǎn)。（4)益生菌與 其他物質(zhì)聯(lián)用：人們在制備多菌種制劑的同時，也在不斷嘗試研究開發(fā)益生菌與其他制劑 間的聯(lián)合使用，如：酶制劑、中草藥、酸化劑和特異性疫苗等的協(xié)同作用。世界上已有許多國 家大量使用益生菌制劑，其劑型有膠囊、粉劑和原液，也添加其他成分，如：酸果提取物、低 聚果糖、免疫球蛋白、發(fā)酵副產(chǎn)物及其他生物活性物質(zhì)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于對益生菌制劑的發(fā)酵基質(zhì)與工藝進(jìn)行創(chuàng)新，提供一種用大型真 菌（藥/食用真菌）菌液（質(zhì)）制備高效益生菌制劑的方法。
[0006] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0007] -種用大型真菌（藥/食用真菌）菌液（質(zhì)）制備高效益生菌制劑的方法，包括 如下步驟：
[0008] (1)用農(nóng)副產(chǎn)品制備液體或固體培養(yǎng)基培養(yǎng)大型真菌得到菌液或菌質(zhì)。
[0009] (2)將步驟（1)得到的菌液或菌質(zhì)經(jīng)物理和生物處理后，加入氮源和碳源配制成 益生菌培養(yǎng)基。
[0010] (3)將益生菌接種到步驟（2)配制的益生菌培養(yǎng)基培養(yǎng)得到高效益生菌制劑。
[0011] 步驟（1)中所述的液體或固體培養(yǎng)基優(yōu)選為以玉米漿、玉米皮、玉米粉、大米粉、 面粉、麥麩、土豆、葡萄糖、CMC等為碳源，以豆柏、棉柏、菜柏、動物蛋白、植物蛋白、硫銨等為 氮源，以酵母浸膏、硫酸鎂、硫酸鐵、硫酸錳、磷酸氫二鉀、VB1、VB6、煙酸等為生長促進(jìn)因子。
[0012] 步驟（1)中所述的大型真菌包括（但不限于）：茶薪菇、羊肚菌、滑子菇、猴頭菇、 牛肝菌、白靈菇、香菇、平菇、黃金菇、靈芝、云芝、蟲草菌、茯苓、竹蓀、松乳菇、竹黃、樟芝等 產(chǎn)多糖多肽率高或具有保健/治療胃腸道疾病功能的藥用真菌或食用真菌。
[0013] 步驟（1)中培養(yǎng)大型真菌的條件優(yōu)選為25-32°C培養(yǎng)2-5天。
[0014] 步驟（1)優(yōu)選為：以玉米漿、玉米皮、玉米粉、大米粉、面粉、麥麩、土豆、葡萄糖、 CMC等為碳源，以柏、動物蛋白（香蛹粉等）、植物蛋白（玉米蛋白等）、硫按等為氣源，以 酵母浸膏、硫酸鎂、硫酸鐵、硫酸錳、磷酸氫二鉀、VB1、VB6、煙酸等為生長促進(jìn)因子，配制成 液體培養(yǎng)基或固體培養(yǎng)基，滅菌后，接種大型真菌菌絲，25-32°C培養(yǎng)2-5天，取其培養(yǎng)物， 即真菌菌液或菌質(zhì)。
[0015] 步驟（2)中所述的物理處理優(yōu)選為打漿或粉碎破碎、高溫提取等；所述的生物處 理為生物酶解。經(jīng)物理和生物處理的目的是使多糖多肽等活性物質(zhì)釋放出來，有利于益生 菌利用，促進(jìn)益生菌生長繁殖及活性提高。其中，大型真菌菌絲培養(yǎng)的液體菌質(zhì)經(jīng)打漿、高 壓均漿、復(fù)合酶（纖維素酶〇. 5?1. 5%，果膠酶1.0%?3. 0%，蛋白酶1. 5-3. 0% )酶解、 高溫^0-9(TC )超聲波浸提，提取多糖多肽等活性物質(zhì)；大型真菌菌絲培養(yǎng)的固體菌質(zhì)經(jīng) 干燥、粉碎、超微粉碎，破壞菌絲使多糖多肽等活性物質(zhì)得以釋放。
[0016] 步驟⑵中所述的碳源和氮源優(yōu)選為豆柏、面粉、麥麩、玉米漿、玉米粉、動物蛋 白、植物蛋白、葡萄糖等農(nóng)副產(chǎn)品的一種或多種；固體發(fā)酵碳源和氮源的添加量與真菌菌質(zhì) 的干質(zhì)量比優(yōu)選為1:1-5 ;液體發(fā)酵按真菌菌液容積百分比添加2-5%的碳源和氮源。
[0017] 步驟（3)中所述的益生菌是國家批準(zhǔn)允許在保健食品、飼料添加劑中可 使用的有益微生物菌種，包括（但不限于）雙岐桿菌屬（Bifidobacterium)、乳桿菌 屬（Lactobacillus)、鏈球菌屬（Streptococcus)、腸球菌屬（Enterococcus)、片球菌 屬（Pediococcus)、明串珠菌屬（Leuconostoc)、芽抱桿菌屬（Bacillus)、乳球菌屬 (Lactococcus)、丙酸桿菌屬（Propionibacterium)、擬（類）桿菌屬（Bacteroides)、酵 母菌屬（Saccharomyces)、假絲酵母（Candida)、假單胞菌（Rhodopseudmonas)、梭菌屬 (Clostridium)等屬的有關(guān)菌種。其中，在保健食品中可使用的益生菌種包括：兩岐雙岐 桿菌（Bifidobacteriumbifidum)、嬰兒雙岐桿菌（B.infantis)、長雙岐桿菌（B.longum)、短 雙岐桿菌（B. breve)、青春雙岐桿菌（B.adolescentis)、保加利亞乳桿菌（Lactobacillus. Bulgaricus)、嗜酸乳桿菌（L. acidophilus)、干酪乳桿菌干酪亞種（L. Caseisubsp. Casei)、 嗜熱鏈球菌（Streptococcusthermophilus)、布拉酵母菌（SaccharomvcesBoulardii) 等；在飼料添加劑中可使用的益生菌種包括：地衣芽孢桿菌（Bacilluslicheniformis)、 枯草芽抱桿菌（Bacillussubtilis)、納豆芽抱桿菌（Bacillusnatto)、錯樣 芽抱桿菌（Bacilluscereus)、兩歧雙歧桿菌（Bifidobacteriumbifidum)、奠腸 球菌（Straptoccusfaecium)、屎腸球菌（Enterococcuslactis)、乳酸腸球菌 (Lactobacillusacidophilus)、嗜酸性乳桿菌（Lactobacillusacidophilus)、干 釀乳桿菌（Lactobacilluscasei)、乳酸乳桿菌（Lactobacilluslactis)、植物乳桿 菌（Lactobacillusplantarum)、乳酸片球菌（Pediococcus acidilacticii)、戊糖 片球菌（Pediococcuspentosaceus)、產(chǎn) I元假絲酵母（Candidautilis)、釀酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)、沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudomonaspalustris)、保加利亞 乳桿菌（Lactobacillusbulgaricus)、丁酸梭菌（Clostridiumbutyricum)等。
[0018] 步驟（3)中的益生菌可單一使用或多種聯(lián)合使用；聯(lián)合使用時，先接種需氧菌需 氧條件下培養(yǎng)（30_38°C )12-24h，后接種厭氧菌厭氧條件下培養(yǎng)（30-38°C )12-24h。
[0019] 本發(fā)明的生產(chǎn)工藝為二次處理三步發(fā)酵工藝。第一次配制培養(yǎng)基并進(jìn)行大型真菌 菌絲接種發(fā)酵，為第一次處理第一次發(fā)酵；其菌質(zhì)/菌液加工配制益生菌培養(yǎng)基，對復(fù)合益 生菌菌種中的耗氧益生菌和厭氧益生菌分先后二步接種發(fā)酵，即第二次處理和第二、三步 發(fā)酵。通過該生產(chǎn)工藝培養(yǎng)的益生菌制劑比常規(guī)益生菌制劑活性更強(qiáng)，應(yīng)用效果更好，多菌 復(fù)合發(fā)酵的比單一菌種效果好。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了大型真菌發(fā)酵的菌液（質(zhì)）中的多糖多肽等 功能物質(zhì)可為益生菌的促進(jìn)因子（益生元），促進(jìn)益生菌的生長繁殖，增強(qiáng)在腸道內(nèi)的定植 能力和抗?。ú【┠芰?。
[0020] 一種高效益生菌制劑通過上述方法制備得到。本發(fā)明制備的益生菌制劑，生物活 性（益生菌、生物酶、活性多糖、多肽、核苷、三萜等）高，藥理效應(yīng)（提高免疫、疾病預(yù)防與 治療等）強(qiáng)，生產(chǎn)的保健食品益生菌制劑可作為人腸道保健品；生產(chǎn)飼料級微生物添加劑 菌種制劑可用于動物腸道疾病的預(yù)防與治療及動物保健促生長劑。
[0021] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果：
[0022] (1)本發(fā)明將大型真菌發(fā)酵制劑與益生菌制劑有機(jī)地結(jié)合，及藥（食）真菌的藥用 菌質(zhì)/菌液，作為益生菌的培養(yǎng)物與促進(jìn)劑，大大提高制劑的生物活性與保健治療效果。
[0023] (2)藥/食用真菌菌質(zhì)/菌液中含有大量多糖多肽物質(zhì)，試驗(yàn)證明對益生菌的生長 繁殖與定植有促進(jìn)作用，成為新的益生元；為開發(fā)新的益生元提供廣闊的來源。
[0024] (3)本發(fā)明采用培養(yǎng)基二次處理三步發(fā)酵（用豆柏、玉米漿或粉、麥麩、面粉等農(nóng) 副產(chǎn)品制備大型真菌培養(yǎng)基，并接種大型真菌發(fā)酵，生產(chǎn)菌質(zhì)或菌液；用大型真菌菌質(zhì)或菌 液配制益生菌培養(yǎng)基，先后二次接種好氧性益生菌和厭氧性益生菌分二步發(fā)酵），制備高活 性復(fù)合微生態(tài)制劑，工藝簡便，效果好。
[0025] (4)本發(fā)明開發(fā)的高效益生菌制劑（合生元）可用于醫(yī)療保健、食品與飼料添加 齊U、及獸藥制劑，保健與治療效果好，且生產(chǎn)原料來源廣泛，生產(chǎn)工藝簡便，具有廣泛的開發(fā) 應(yīng)用前景。

【具體實(shí)施方式】
[0026] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的描述。應(yīng)理解，下面的實(shí)施例僅用 于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本 領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0027] 本發(fā)明中，采用培養(yǎng)基二次處理三步發(fā)酵，制備高活性復(fù)合微生態(tài)制劑，可用于醫(yī) 療保健、食品與飼料添加劑及獸藥制劑，保健與治療效果好。
[0028] 實(shí)施例1不同種大型真菌菌絲發(fā)酵菌質(zhì)/菌液活性成分比較
[0029] 1、材料
[0030] 大型真菌菌種：茶薪菇、羊肚菌、滑子菇、猴頭菇、牛肝菌、白靈菇、香菇、平菇、黃金 菇、靈芝、云芝、蟲草菌、茯苓、竹蓀、松乳菇等斜面菌種由湖南民康生物技術(shù)研究所保存。
[0031] 液體培養(yǎng)基：玉米楽I. 5g，硝酸銨0. 15g，羧甲基纖維素鈉0. 4g，葡萄糖I. 5g， K2HPO4O. 02g、MgSO4 ? 7H200. 05g、蒸餾水定容至 lOOmL，pH6. 5。
[0032] 固體培養(yǎng)基：固體基質(zhì)（麩皮40 %、玉米皮30 %、豆柏10 %、膨化玉米10%、 油糠 10%)，營養(yǎng)液（玉米漿 0? 5%，葡萄糖 1 %，（NH4)2NO3O. 3 %、K2HPO4O. 05 %、 MgSO4* 7H200. 1%，余量為水，pH6.0-6.5)為固體基質(zhì)質(zhì)量的55%，121°C滅菌20min。
[0033] 2、方法
[0034] 將上述各大型真菌按容積（液體）或質(zhì)量（固體）的10-15%分別接種到液體培 養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基中，于26-32°C發(fā)酵培養(yǎng)，液體發(fā)酵培養(yǎng)2-3天，固體發(fā)酵培養(yǎng)3-5天，取 菌液和菌質(zhì)，測定多糖與多肽含量。
[0035] (1)多糖測定方法：多糖含量=總糖含量-還原糖含量；
[0036] 總糖含量測定：采用硫酸-苯酚法；
[0037] 還原糖含量測定：采用3, 5-二硝基水鹽酸（DNS)比色法。
[0038] (2)多肽測定方法=Folin-酚試劑法。
[0039] 3、結(jié)果
[0040] 表1不同大型真菌發(fā)酵菌質(zhì)/菌液中多糖多肽含量的測定 [0041]

【權(quán)利要求】
1. 一種用大型真菌菌液或菌質(zhì)制備高效益生菌制劑的方法，其特征在于包括如下步 驟： (1) 用農(nóng)副產(chǎn)品制備液體或固體培養(yǎng)基培養(yǎng)大型真菌得到菌液或菌質(zhì)； (2) 將步驟（1)得到的菌液或菌質(zhì)經(jīng)物理和生物處理后，加入氮源和碳源配制成益生 菌培養(yǎng)基； (3) 將益生菌接種到步驟（2)配制的益生菌培養(yǎng)基培養(yǎng)得到高效益生菌制劑。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用大型真菌菌液或菌質(zhì)制備高效益生菌制劑的方法，其特征 在于：步驟（1)中所述的大型真菌包括：茶薪菇、羊肚菌、滑子菇、猴頭菇、牛肝菌、白靈菇、 香菇、平菇、黃金菇、靈芝、云芝、蟲草菌、茯苓、竹蓀、松乳菇、竹黃、樟芝。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用大型真菌菌液或菌質(zhì)制備高效益生菌制劑的方法，其特征 在于：步驟（1)為：以玉米漿、玉米皮、玉米粉、大米粉、面粉、麥麩、土豆、葡萄糖和CMC中的 一種或多種為碳源，以豆柏、動物蛋白、植物蛋白和硫銨中的一種或多種為氮源，以酵母浸 膏、硫酸鎂、硫酸鐵、硫酸錳、磷酸氫二鉀、VB1、VB6和煙酸中的一種或多種為生長促進(jìn)因子， 配制成液體培養(yǎng)基或固體培養(yǎng)基，滅菌后，接種大型真菌菌絲，25-32°C培養(yǎng)2-5天。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用大型真菌菌液或菌質(zhì)制備高效益生菌制劑的方法，其特征 在于：步驟（2)中的物理和生物處理為：大型真菌菌絲培養(yǎng)的液體菌質(zhì)經(jīng)打漿，高壓均漿， 纖維素酶、果膠酶和蛋白酶組成的復(fù)合酶酶解，50-90°C超聲波浸提；大型真菌菌絲培養(yǎng)的 固體菌質(zhì)經(jīng)干燥、粉碎、超微粉碎。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用大型真菌菌液或菌質(zhì)制備高效益生菌制劑的方法，其特 征在于：步驟（2)中所述的碳源和氮源為豆柏、面粉、麥麩、玉米漿、玉米粉、動物蛋白、植 物蛋白和葡萄糖中的一種或多種；固體發(fā)酵碳源和氮源的添加量與真菌菌質(zhì)的干質(zhì)量比為 1:1-5，液體發(fā)酵按真菌菌液容積百分比添加2-5 %的碳源和氮源。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用大型真菌菌液或菌質(zhì)制備高效益生菌制劑的方法，其特征 在于：步驟（3)中所述的益生菌是國家批準(zhǔn)允許在保健食品、飼料添加劑中可使用的有益 微生物菌種，包括雙岐桿菌屬、乳桿菌屬、鏈球菌屬、腸球菌屬、片球菌屬、明串珠菌屬、芽孢 桿菌屬、乳球菌屬、丙酸桿菌屬、擬（類）桿菌屬、梭菌屬、酵母菌屬、假絲酵母、假單胞菌的 有關(guān)菌種。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的用大型真菌菌液或菌質(zhì)制備高效益生菌制劑的方法，其特征 在于：在保健食品中可使用的益生菌種包括：兩岐雙岐桿菌、嬰兒雙岐桿菌、長雙岐桿菌、 短雙岐桿菌、青春雙岐桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌干酪亞種、嗜熱鏈球 菌、布拉酵母菌；在飼料添加劑中可使用的益生菌種包括：地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、 納豆芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿菌、兩歧雙歧桿菌、糞腸球菌、屎腸球菌、乳酸腸球菌、嗜酸性乳 桿菌、干酪乳桿菌、乳酸乳桿菌、植物乳桿菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、產(chǎn)朊假絲酵母、釀酒 酵母、沼澤紅假單胞菌、保加利亞乳桿菌、丁酸梭菌。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用大型真菌菌液或菌質(zhì)制備高效益生菌制劑的方法，其特征 在于：步驟（3)中的益生菌可單一使用或多種聯(lián)合使用；聯(lián)合使用時，先接種需氧菌需氧條 件下培養(yǎng)12_24h，后接種厭氧菌厭氧條件下培養(yǎng)12-24h。
9. 一種高效益生菌制劑，其特征在于：通過權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的方法制備得到。
10. 權(quán)利要求9所述的高效益生菌制劑在制備人或畜胃腸道疾病的治療藥物/保健食 品或者飼料添加劑中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12R1/225GK104293716SQ201410526171
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年10月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月8日
【發(fā)明者】肖兵南, 高中文, 劉瑩瑩 申請人:湖南民康生物技術(shù)研究所