一種染色鑒別泡菜生花真菌性病原菌的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種染色鑒別泡菜生花真菌性病原菌的方法。在泡菜生產(chǎn)過程中常常因無法分辨生花病害菌和正常有益發(fā)酵菌而影響泡菜正常發(fā)酵，導(dǎo)致泡菜變質(zhì)發(fā)臭。而真菌性病原菌是生花病害常見的危害菌和重要污染指標(biāo)，本發(fā)明通過染色方法對真菌性病原微生物進行鑒定從而使生花病害菌和正常發(fā)酵菌得以區(qū)分，本發(fā)明方法具有實驗簡單、成本低廉、易操作實施、重復(fù)性好等優(yōu)點。
【專利說明】一種染色鑒別泡菜生花真菌性病原菌的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于食品【技術(shù)領(lǐng)域】，具體是提供一種簡單且準(zhǔn)確的利用染色鑒別泡菜生花真菌性病原菌的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]泡菜是指將蔬菜經(jīng)過預(yù)處理后直接浸泡在一定濃度的食鹽溶液中通過自身所含微生物或人工接種的乳酸菌進行乳酸發(fā)酵并伴隨著酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵而形成的有特殊風(fēng)味的發(fā)酵制品泡菜的制作方法簡單成本低廉風(fēng)味獨特口感好是大眾所喜歡的腌制菜之一同時泡菜還有抗菌、凈腸、預(yù)防動脈硬化、減肥和抗衰老等作用。
[0003]泡菜中的微生物有多種，其中乳酸菌對泡菜品質(zhì)起著決定性的作用，而其他雜菌(如腸桿菌霉菌等)會破壞泡菜的品質(zhì)，這些腐敗菌產(chǎn)生的毒素和亞硝酸鹽等會危害人的健康?！吧ā辈『褪桥莶松a(chǎn)過程中最常見的病害之一?！吧ā币步挟a(chǎn)膜，俗稱“臭風(fēng)”，常出現(xiàn)在啤酒、醬油、果汁、葡萄酒及泡菜的生產(chǎn)過程中。泡菜在發(fā)酵過程中，表面飄浮一層白色膜狀物質(zhì)，并使泡菜帶有不愉快氣味，發(fā)酵時間延長，且容易引發(fā)一系列其它變質(zhì)現(xiàn)象。生產(chǎn)現(xiàn)場調(diào)查表明:泡菜“生花”對泡菜風(fēng)味影響很大，泡菜會散發(fā)一種令人不愉悅的氣味，而且會產(chǎn)生澀味，口感比正常發(fā)酵泡菜差很多。
[0004]目前，國內(nèi)外還沒有學(xué)者對泡菜“生花”進行比較系統(tǒng)的研究。人們對泡菜“生花”的認識主要還停留在生產(chǎn)過程中遇到的“生花”現(xiàn)象，引起泡菜“生花”的病原菌以及其作用機理尚未見詳細報道。食品的品質(zhì)很大程度上與所含微生物的數(shù)量有關(guān)，其所含有害微生物越多，品質(zhì)越差，對人體健康越有危害大部分微生物是病原微生物，與人類的發(fā)病和傳播有密切關(guān)系，在食品制造中，應(yīng)盡量減少有害微生物的數(shù)量。在實際生產(chǎn)中，鑒別生花泡菜的方法只能依靠工人的生產(chǎn)經(jīng)驗人工進行病害泡菜的挑選和分離。真菌性病原菌是生花病害常見的危害菌和重要污染指標(biāo)。
[0005]因此提供一種簡單且準(zhǔn)確的鑒別泡菜生花真菌性病原菌的方法具有非常重要意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明通過觀察疑似“生花”真菌性病原菌的細胞核和子囊孢子染色的結(jié)果，對該病害微生物進行鑒定。技術(shù)方案分為細胞核的染色鑒定和子囊孢子的染色鑒定兩部分，具體為一種染色鑒別泡菜生花病害微生物的方法，包括細胞核的染色鑒定和子囊孢子的染色鑒定;
[0007]所述細胞核的染色鑒定步驟為:菌懸液涂片一干燥一石油醚脫蠟一乙醇溶液沖洗—蘇木精液染色32?40min —水洗11?15min —酸水或酸乙醇分色一乙醇或水沖洗數(shù)小時一置堿水或堿乙醇中變藍一1.2?1.5%伊紅溶液復(fù)染一各級乙醇脫水一二甲苯透明一鏡檢；
[0008]其中，制片脫蠟后用乙醇溶液沖洗，先用無水乙醇沖洗，再分別用濃度遞減的乙醇溶液沖洗，直至用蒸餾水沖洗；分色和堿液變藍過程使用酸液和堿液來完成；復(fù)染后，用濃度從低到高直至無水乙醇進行脫水。
[0009]所述子囊孢子的染色鑒定步驟為:將疑似菌接種于孟加拉紅液體培養(yǎng)基一30?40°C恒溫培養(yǎng)25?36h —連續(xù)轉(zhuǎn)接2次一再轉(zhuǎn)接到肉汁蛋白胨培養(yǎng)基中一25?28°C恒溫培養(yǎng)4?7d —取菌懸液涂片一干燥一飽和孔雀綠水溶液染色12?15min —水洗一0.5%番紅復(fù)染35s?40s —水洗一干燥一鏡檢一低倍鏡一高倍鏡一油鏡；
[0010]觀察芽孢染色結(jié)果，染色后，菌體呈微紅色，若有芽孢則芽孢呈綠色。
[0011]本發(fā)明通過對疑似生花真菌性病原菌的細胞核和子囊孢子進行染色的結(jié)果與已確認生花病害微生物進行比較，以此來對其進行鑒定。本發(fā)明方法具有實驗簡單、成本低廉、易操作實施、重復(fù)性好等優(yōu)點。

【具體實施方式】
[0012]以下將結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。
[0013]實施例1
[0014]試驗原料和試劑
[0015]I)泡菜疑似菌:從泡菜中分離出“生花”細菌性病原疑似菌5株，編號為B1、B2、B3、B4、B5，分離出來的菌落表面粗糙，外圍為白色整齊絲狀，中心為紅色，邊緣整齊，中央稍凸起直徑6?8_ ；
[0016]2) Ehrlich蘇木精液:用25ml乙醇及1ml醋酸將2g蘇木精溶解，然后加10ml甘油，再加入其余75ml乙醇，將1g鉀明礬溶于10ml水中，加熱溶解，再將鉀明礬溶液緩慢加到蘇木精溶液中，并不時攪拌，混合后在光亮處放置3周左右，溶液呈紅色；
[0017]3)乙醇、石油醚、酸、堿等常用化學(xué)試劑。
[0018]試驗步驟:
[0019]菌懸液涂片一干燥一石油醚脫蠟一乙醇溶液沖洗一蘇木精液染色32min —水洗Ilmin —酸水或酸乙醇分色一乙醇或水沖洗數(shù)小時一置堿水或堿乙醇中變藍一1.2%伊紅溶液復(fù)染一各級乙醇脫水一二甲苯透明一鏡檢；
[0020]鑒定結(jié)果:
[0021]對B2、B3> B4, B5進行細胞核染色，以釀酒酵母為對照，結(jié)果顯示B2、B3> B4, B5均有細胞核，均為真菌。
[0022]實施例2
[0023]試驗原料和試劑
[0024]I)泡菜疑似菌:從泡菜中分離出“生花”細菌性病原疑似菌5株，編號為B1、B2、B3、B4、B5，分離出來的菌落表面粗糙，外圍為白色整齊絲狀，中心為紅色，邊緣整齊，中央稍凸起直徑6?8_ ；
[0025]2)孟加拉紅培養(yǎng)基:蛋白胨5.0g,葡萄糖10.0g,磷酸二氫鉀1.0g,無水硫酸鎂
0.5g，瓊脂20.0g，孟加拉紅0.033g，氯霉素0.lg，蒸餾水1000ml，121°C滅菌20min ；
[0026]3)營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的配制:蛋白胨10.0g，牛肉粉3.0g，氯化鈉5.0g，瓊脂15.0g,蒸懼水 1000ml, 121°C滅菌 20min。
[0027]4) 5%孔雀綠水溶液:孔雀綠5.0g，蒸餾水10mL，先將孔雀綠放研缽內(nèi)研磨，加少許95%乙醇溶解，再加蒸餾水；
[0028]5)0.5%番紅乙醇溶液:番紅0.5g，95%乙醇10mL ；
[0029]6)其他常用化學(xué)試劑。
[0030]試驗步驟:
[0031]將疑似菌接種于孟加拉紅液體培養(yǎng)基一30?40°C恒溫培養(yǎng)25?36h —連續(xù)轉(zhuǎn)接2次一再轉(zhuǎn)接到肉汁蛋白胨培養(yǎng)基中一25?28°C恒溫培養(yǎng)4?7d —取菌懸液涂片一干燥—飽和孔雀綠水溶液染色12?15min —水洗一0.5%番紅復(fù)染35s?40s —水洗一干燥一鏡檢一低倍鏡一高倍鏡一油鏡
[0032]結(jié)果:
[0033]“生花”真菌性病原菌子囊孢子的檢察結(jié)果顯示，染色后子囊孢子中心呈綠色，子囊孢子豐要呈圓形、禮帽形或半多邊形。
[0034]與已知生花真菌性病原菌染色結(jié)果對照比較，綜合鑒定認為該疑似菌為生花真菌性病原菌。
【權(quán)利要求】
1.一種染色鑒別泡菜生花病害微生物的方法，其特征在于包括細胞核的染色鑒定和子囊孢子的染色鑒定； 所述細胞核的染色鑒定步驟為:菌懸液涂片一干燥一石油醚脫蠟一乙醇溶液沖洗一蘇木精液染色32?40min —水洗11?15min —酸水或酸乙醇分色一乙醇或水沖洗數(shù)小時—置堿水或堿乙醇中變藍一1.2?1.5%伊紅溶液復(fù)染一各級乙醇脫水一二甲苯透明一鏡檢； 所述子囊孢子的染色鑒定步驟為:將疑似菌接種于孟加拉紅液體培養(yǎng)基一30?40°C恒溫培養(yǎng)25?36h —連續(xù)轉(zhuǎn)接2次一再轉(zhuǎn)接到肉汁蛋白胨培養(yǎng)基中一25?28°C恒溫培養(yǎng)4?7d —取菌懸液涂片一干燥一飽和孔雀綠水溶液染色12?15min —水洗一0.5%番紅復(fù)染35s?40s —水洗一干燥一鏡檢一低倍鏡一高倍鏡一油鏡一觀察芽孢染色結(jié)果。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的染色鑒別泡菜生花病害微生物的方法，其特征在于所述細胞核的染色鑒定步驟中制片脫蠟后用乙醇溶液沖洗，先用無水乙醇沖洗，再分別用濃度遞減的乙醇溶液沖洗,直至用蒸餾水沖洗。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的染色鑒別泡菜生花病害微生物的方法，其特征在于所述細胞核的染色鑒定步驟中分色過程使用酸液來完成，堿液變藍過程使用堿液來完成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的染色鑒別泡菜生花病害微生物的方法，其特征在于所述細胞核的染色鑒定步驟中1.2?1.5%伊紅溶液復(fù)染后，用濃度從低到高直至無水乙醇進行脫水。
【文檔編號】G01N21/84GK104422609SQ201310373131
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年8月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月23日
【發(fā)明者】張政 申請人:張政