一種扎伊爾型埃博拉病毒的恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種扎伊爾型埃博拉病毒恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包括RNA提取試劑、恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照；本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒特異性高、靈敏度高；從病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄到鏈置換擴(kuò)增全部恒定同一溫度，恒溫?cái)U(kuò)增僅需35分鐘，核酸試紙條檢測(cè)結(jié)果需1-2分鐘，全程從接受樣品到獲得結(jié)果整個(gè)檢測(cè)過(guò)程僅需1小時(shí)左右，且整個(gè)反應(yīng)過(guò)程只需一個(gè)恒溫儀器，特別適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)使用。
【專利說(shuō)明】一種扎伊爾型埃博拉病毒的恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方 法 (一）

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種針對(duì)扎伊爾型埃博拉病毒核酸的恒溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)技術(shù)，適合對(duì) 扎伊爾型埃博拉病毒的定性檢測(cè)。 (二）

【背景技術(shù)】
[0002] 埃博拉出血熱是由埃博拉病毒感染引起的一種高度接觸性烈性傳染病，感染人類 后可引起嚴(yán)重的急性出血熱，易人傳人，致死率高達(dá)70-90%。埃博拉病毒具有囊膜，基因組 不分節(jié)段，為單鏈負(fù)股RNA，屬于單負(fù)股病毒目絲狀病毒科絲狀病毒屬。埃博拉病毒含有一 個(gè)線性RNA基因組，長(zhǎng)約19Kb，含有7個(gè)基因，依次編碼核蛋白（NP)、病毒結(jié)構(gòu)蛋白（VP35， VP40)、糖蛋白（GP)、額外病毒結(jié)構(gòu)蛋白（VP30，VP24)、RNA依賴RNA聚合酶（L)。埃博拉出 血熱需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)室手段確診，常用的方法有病毒分離、電鏡觀察、常規(guī)PCR、免疫熒光、熒 光定量PCR和ELISA等。這些方法或是操作復(fù)雜，費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，或是敏感度不夠，需要特殊儀 器設(shè)備等，不能快速獲得結(jié)果，亟待需要一種快速、簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。 (三）


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明目的是提供一種準(zhǔn)確、靈敏、快速地檢測(cè)扎伊爾型埃博拉病毒核酸的恒溫 擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。
[0004] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0005] 本發(fā)明提供一種扎伊爾型埃博拉病毒恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包括如下 組成：
[0006] (I) RNA提取試劑（優(yōu)選德國(guó)QIAGEN RNA提取試劑盒（Qia-74104));
[0007] (2)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液：包括正向外圍引物、反向外圍引物、兩條探針、兩條交叉擴(kuò) 增引物、IXThermol BufTer、MgS04、dNTPs溶液、Bst DNA聚合酶、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶和無(wú)菌雙蒸 水；其中：
[0008] 所述的外圍引物分別為：
[0009] 外圍正向引物：5，-TGGTTCAAGTGCACAGTCAA-3，；
[0010] 外圍反向引物：5' -TGTCTGCTCTACGGTGATGT-3' ；
[0011] 所述兩條探針的序列分別為：
[0012] 正向5'端Biotin標(biāo)記探針：
[0013] 5' -Biotin-GCAAGGGTTGTCAGATGCG-3/ ；
[0014] 反向5'端Fitc標(biāo)記探針：
[0015] 5' -Fitc-ATAATACACCCGTGTATAAACTTGAC-3/ ；
[0016] 所述兩條擴(kuò)增交叉引物分別為：
[0017] 擴(kuò)增正向引物：
[0018] 5，-AGGGATTGGGGACTCGTGGAGGGAAGGAAAGCTGCAGTGT-3，；
[0019] 擴(kuò)增反向引物：
[0020] 5; -CCAAACCAGGTCCGGACAACAGTCCAACTTGAGTTGCCTCAG-3;；
[0021] (3)陽(yáng)性對(duì)照：含有扎伊爾型埃博拉病毒的糖蛋白DNA質(zhì)粒；
[0022] ⑷陰性對(duì)照：無(wú)菌雙蒸水。
[0023] 進(jìn)一步，本發(fā)明所述的I XThermol buffer含有摩爾濃度為20mM的Tris-HCl、 IOmM 的KClUOmM 的（NH4) 2S04、2mM 的MgSO4 以及質(zhì)量濃度為 0· 1% 的 Triton X-100，pH 8.8。
[0024] 進(jìn)一步，本發(fā)明所述陽(yáng)性對(duì)照為含有長(zhǎng)189bp的扎伊爾型埃博拉病毒糖蛋白基因 序列，序列如下：
[0025] TGGTTCAAGTGCACAGTCAAGGAAGGAAAGCTGCAGTGTCGCATCTGACAACCCTTGCCACAATCTCCA CGAGTCCCCAATCCCTCACAACCAAACCAGGTCCGGACAACAGCACCCATAATACACCCGTGTATAAACTTGACATC TCTGAGGCAACTCAAGTTGGACAACATCACCGTAGAGCAGACA。
[0026] 進(jìn)一步，本發(fā)明所述陽(yáng)性對(duì)照按如下步驟制備：
[0027] 以包含擴(kuò)增區(qū)域的埃博拉糖蛋白基因片段為模板，通過(guò)兩條外圍引物進(jìn)行PCR擴(kuò) 增獲得目的基因；利用PCR純化試劑盒（Promega)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化；將純化后的擴(kuò) 增產(chǎn)物通過(guò)T-easy質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑盒（Promega)構(gòu)建完整的含有目的基因的質(zhì)粒序列，用分 光光度計(jì)對(duì)所抽提的質(zhì)粒測(cè)A 28tl定量并稀釋至10個(gè)拷貝/ μ 1，-20°C保存。
[0028] 進(jìn)一步，本發(fā)明所述恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液組成為：兩條外圍引物各自lOpmol，兩條探 針各自 20pmol，兩條交叉引物各自 40pmol，IXThermol buffer，MgSO4 為 6mmol，dNTPs 溶 液各0. 4mmol，Bst DNA聚合酶8U，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶5U，無(wú)菌雙蒸水組成補(bǔ)足至25 μ 1。
[0029] 本發(fā)明還提供一種所述扎伊爾型埃博拉病毒恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用，所述應(yīng) 用為：
[0030] a)用試劑盒中RNA提取液從待檢測(cè)的標(biāo)本中提取RNA ;
[0031] b)將步驟a)提取得到的RNA作為模板加入到裝有恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液的PCR管中，在 58°C下擴(kuò)增反應(yīng)35分鐘；陽(yáng)性對(duì)照PCR管中加入陽(yáng)性模板，陰性對(duì)照PCR管中加入陰性模 板，所述陽(yáng)性模板為含有扎伊爾型埃博拉病毒糖蛋白基因片段的質(zhì)粒，所述陰性模板為無(wú) 菌雙蒸水；
[0032] c)將反應(yīng)后的PCR管放置到核酸試紙條防污染檢測(cè)裝置（杭州優(yōu)思達(dá)生物技術(shù) 公司3號(hào)裝置）中進(jìn)行檢測(cè)，2分鐘以后判讀結(jié)果，當(dāng)試紙條的檢測(cè)線呈陽(yáng)性時(shí)（即試紙條 T線為紅色，C線為紅色），說(shuō)明樣品中含有扎伊爾型埃博拉病毒核酸。所述核酸試紙條防 污染檢測(cè)裝置中試紙條包括在帶有不干膠的襯墊上按順序有樣品墊、有色顆粒結(jié)合物墊和 吸水濾紙墊，上述各部分在相鄰處部分重疊，纖維膜上設(shè)有檢測(cè)線和質(zhì)控線，其中有色顆粒 結(jié)合物墊上的有色顆粒有抗FitC抗體包被，檢測(cè)線上有親和素包被，質(zhì)控線上有抗FitC抗 體，有色顆粒選自膠體金顆粒、乳膠顆粒。
[0033] 在本發(fā)明提供的試劑盒中，有兩條外圍引物，兩條交叉引物和兩條檢測(cè)探針。RNA 由逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，本試劑盒中的6條寡聚核苷酸序列依靠 Bst DNA聚合酶的高 活性的鏈置換特性，使得鏈置換DNA合成不斷的自我擴(kuò)增循環(huán)。在本發(fā)明提供的扎伊爾型 埃博拉病毒核酸的恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒中，對(duì)不同的反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，如引物和探針 的濃度，Mg 2+濃度，反應(yīng)溫度等的優(yōu)化，并將本發(fā)明與核酸檢測(cè)試紙條檢測(cè)系統(tǒng)相結(jié)合，建立 了扎伊爾型埃博拉病毒核酸恒溫?cái)U(kuò)增定性檢測(cè)的方法。該試劑盒的靈敏度可在每個(gè)反應(yīng)體 系中檢出100個(gè)拷貝，可以滿足快速檢測(cè)扎伊爾型埃博拉病毒的要求。
[0034] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果：
[0035] (1)本發(fā)明所述扎伊爾型埃博拉病毒恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒的特異性好，靈敏度高， 步驟簡(jiǎn)單，可重復(fù)性高；
[0036] (2)反應(yīng)速度快，單個(gè)樣本從樣本處理到完成檢測(cè)，僅需1小時(shí)左右；
[0037] (3)整個(gè)擴(kuò)增和檢測(cè)過(guò)程中不需要打開PCR管蓋，減少了擴(kuò)增產(chǎn)物污染的機(jī)會(huì)；整 個(gè)反應(yīng)過(guò)程不需要復(fù)雜的儀器。 (四）

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0038] 圖1為核酸檢測(cè)試紙條原理示意圖。
[0039] 圖2為本發(fā)明試劑盒用于檢測(cè)扎伊爾型埃博拉病毒的特異性，1-5依次為西尼羅 熱病毒；基孔肯雅熱病毒；登革熱病毒；陽(yáng)性對(duì)照（1〇 2拷貝/反應(yīng)）；空白對(duì)照。
[0040] 圖3為本發(fā)明試劑盒用于檢測(cè)扎伊爾型埃博拉病毒的靈敏度，1-5依次為IO4拷貝 /反應(yīng)、IO 3拷貝/反應(yīng)、IO2拷貝/反應(yīng)、IO1拷貝/反應(yīng)、空白對(duì)照。 (五）

【具體實(shí)施方式】
[0041] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于 此：
[0042] 實(shí)施例1本發(fā)明試劑盒的組成與配制
[0043] a)RNA提取試劑：德國(guó)QIAGENRNA提取試劑盒（Qia-74104);
[0044] b)扎伊爾型埃博拉病毒核酸恒溫PCR擴(kuò)增反應(yīng)液：兩條外圍引物（lOpmol)，兩條 探針（20pmol)和兩條交叉引物（40pmol)，IXThermol buffer，MgSO4 (6mmol), dNTPs 溶液 (各0.4mm〇l)，Bst DNA聚合酶（8U)，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶（5U)和無(wú)菌雙蒸水組成，總反應(yīng)液體積 為 25 μ 1 ;
[0045] 外圍正向引物：5，-TGGTTCAAGTGCACAGTCAA-3，
[0046] 外圍反向引物：5' -TGTCTGCTCTACGGTGATGT-3'
[0047] 正向5'端Biotin標(biāo)記探針：
[0048] 5' -Biotin-GCAAGGGTTGTCAGATGCG-3，
[0049] 反向5'端Fitc標(biāo)記探針：
[0050] 5' -Fitc-ATAATACACCCGTGTATAAACTTGAC-3，
[0051] 擴(kuò)增正向引物：
[0052] 5; -AGGGATTGGGGACTCGTGGAGGGAAGGAAAGCTGCAGTGT-3 ;
[0053] 擴(kuò)增反向引物：
[0054] 5; -CCAAACCAGGTCCGGACAACAGTCCAACTTGAGTTGCCTCAG-3 ;
[0055] 所述的 IXThermol buffer 含有摩爾濃度為 20mM 的 Tris-HClUOmM 的 KClUOmM 的（NH4)2S04、2mM 的 MgSO4 以及質(zhì)量濃度為 0· 1% 的 Triton X-100, pH 8. 8。
[0056] 所有的引物和探針均由上海生工生物有限公司合成。
[0057] c)陽(yáng)性對(duì)照：含有扎伊爾型埃博拉病毒糖蛋白的DNA片段，所述DNA片段長(zhǎng) 189bp，基因序列如下：
[0058] TGGTTCAAGTGCACAGTCAAGGAAGGAAAGCTGCAGTGTCGCATCTGACAACCCTTGCCACAATCTCCA CGAGTCCCCAATCCCTCACAACCAAACCAGGTCCGGACAACAGCACCCATAATACACCCGTGTATAAACTTGACATC TCTGAGGCAACTCAAGTTGGACAACATCACCGTAGAGCAGACA。
[0059] 陽(yáng)性對(duì)照按如下步驟制備：
[0060] 以包含擴(kuò)增區(qū)域的埃博拉糖蛋白基因片段為模板，通過(guò)兩條外圍引物進(jìn)行PCR擴(kuò) 增獲得目的基因；利用PCR純化試劑盒對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化；將純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物通 過(guò)T-easy質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑盒構(gòu)建完整的含有目的基因的質(zhì)粒序列，用分光光度計(jì)對(duì)所抽提 的質(zhì)粒測(cè)A 28tl定量并稀釋至10個(gè)拷貝/ μ 1，-20°C保存。
[0061] d)陰性對(duì)照：無(wú)菌雙蒸水。
[0062] 實(shí)施例2用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)扎伊爾型埃博拉病毒核酸的具體方法
[0063] a)用扎伊爾型埃博拉病毒恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒中RNA提取液從待檢測(cè)的標(biāo)本中 提取RNA (疑似病例提取核酸需在生物安全3級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行）作為標(biāo)本RNA。
[0064] b)取標(biāo)本RNA作為模板加入到裝有扎伊爾型埃博拉病毒恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液的PCR管 中，其中標(biāo)本RNA 5 μ 1，反應(yīng)液20 μ 1，58 °C擴(kuò)增反應(yīng)35分鐘；陽(yáng)性和陰性對(duì)照PCR管中分 別加入陽(yáng)性模板和陰性模板。
[0065] c)將反應(yīng)后的PCR管放置到核酸試紙條防污染檢測(cè)裝置（杭州優(yōu)思達(dá)生物技術(shù)公 司3號(hào)裝置）中進(jìn)行檢測(cè)，2分鐘以后判讀結(jié)果。當(dāng)樣本中含有扎伊爾型埃博拉病毒核酸 時(shí)，試紙條的檢測(cè)線上呈陽(yáng)性。
[0066] 反復(fù)重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著性差異，說(shuō)明本試劑盒的不同批次間的檢測(cè) 結(jié)果具有可比性，具有良好的重復(fù)性。上述實(shí)施例說(shuō)明，用本發(fā)明的試劑盒來(lái)檢測(cè)重復(fù)性 好，且對(duì)樣本的檢測(cè)僅僅需要1個(gè)小時(shí)左右就能完成，大大縮短檢測(cè)時(shí)間。
[0067] 實(shí)施例3用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)扎伊爾型埃博拉病毒的特異性
[0068] 按照實(shí)施例2的方法檢測(cè)西尼羅病毒核酸RNA ;基孔肯雅熱病毒RNA ;登革熱病毒 核酸RNA ;埃博拉病毒檢測(cè)試劑盒陽(yáng)性對(duì)照品，其結(jié)果如圖2。從圖2測(cè)試結(jié)果可見，用本發(fā) 明試劑盒檢測(cè)扎伊爾型埃博拉病毒核酸具有很強(qiáng)的特異性。
[0069] 實(shí)施例4用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)扎伊爾型埃博拉病毒核酸的靈敏度
[0070] 對(duì)扎伊爾型埃博拉病毒的質(zhì)粒DNA進(jìn)行定量，分別稀釋至濃度為IO4拷貝/微升、 IO3拷貝/微升、IO2拷貝/微升、IO1拷貝/微升，采用實(shí)施例2中所述方法來(lái)確定本發(fā)明試 劑盒用于檢測(cè)扎伊爾型埃博拉病毒核酸的靈敏度。結(jié)果如圖3所示，圖中1-4分別表示IO 4 拷貝/微升、IO3拷貝/微升、IO2拷貝/微升、10拷貝/微升，5是陰性對(duì)照，可以發(fā)現(xiàn)該試 劑盒可在每個(gè)反應(yīng)體系中檢出100個(gè)拷貝，具有很高的靈敏度，可以滿足快速檢測(cè)扎伊爾 型埃博拉病毒的要求。
【權(quán)利要求】
1. 一種扎伊爾型埃博拉病毒恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括下列組 成： (I)RNA提取試劑； ⑵恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液：包括正向外圍引物、反向外圍引物、兩條探針、兩條擴(kuò)增交叉引 物、IX Thermol Buffer, MgSO4, dNTPs溶液，Bst DNA聚合酶，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶和無(wú)菌雙蒸水； 所述正向外圍引物為# -TGGITCAAGTGCACAGTCAA-3'; 反向外圍引物為-TGTCTGCTCTACGGTGATGT-3'; 所述兩條探針的序列分別為： 正向 5' 端 Biotin 標(biāo)記探針 5' -Biotin-GCAAGGGITGTCAGATGCG-3'; 反向 3 ' 端 FitC 標(biāo)記探針 5' -Fitc-ATAATACACCCGTGTATAAAC TTGAC-3'； 所述兩條擴(kuò)增交叉引物分別為： 擴(kuò)增正向引物： 5' -AGGGATTGGGGACTCGTGGAGGGAAGGAAAGCTGCAGTGT-3'； 擴(kuò)增反向引物： 5' -CCAAACCAGGTCCGGACAACAGTCCAACTTGAGTTGCCTCAG-3'； (3) 陽(yáng)性對(duì)照：含有扎伊爾型埃博拉病毒的糖蛋白DNA質(zhì)粒； (4) 陰性對(duì)照：無(wú)菌雙蒸水。
2. 如權(quán)利要求1所述扎伊爾型埃博拉病毒恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述 IXThermol Buffer 含有摩爾濃度為 20mM 的 Tris-HClUOmM 的 KClUOmM 的（NH4)2S04、2mM 的MgSO4以及質(zhì)量濃度為0? 1 %的Triton X-100, pH 8. 8。
3. 如權(quán)利要求1所述扎伊爾型埃博拉病毒恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述陽(yáng)性 對(duì)照為含有長(zhǎng)189bp的扎伊爾型埃博拉病毒糖蛋白基因序列，序列如下： TGGTTCAAGTGCACAGTCAAGGAAGGAAAGCTGCAGTGTCGCATCTGACAACCCTTGCCACAATCTCCACGA GTCCCCAATCCCTCACAACCAAACCAGGTCCGGACAACAGCACCCATAATACACCCGTGTATAAACTTGACATCTCT GAGGCAACTCAAGTTGGACAACATCACCGTAGAGCAGACA。
4. 如權(quán)利要求1所述扎伊爾型埃博拉病毒恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述陽(yáng)性 對(duì)照按如下步驟制備： 以包含擴(kuò)增區(qū)域的埃博拉糖蛋白基因片段為模板，通過(guò)兩條外圍引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增 獲得目的基因；利用PCR純化試劑盒對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化；將純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò) T-easy質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑盒構(gòu)建完整的含有目的基因的質(zhì)粒序列，用分光光度計(jì)對(duì)所抽提的質(zhì) 粒測(cè)A 28tl定量并稀釋至10個(gè)拷貝/yl，-20°C保存。
5. 如權(quán)利要求1所述扎伊爾型埃博拉病毒恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述恒溫 擴(kuò)增反應(yīng)液組成為：兩條外圍引物各自lOpmol，兩條探針各自20pmol，兩條交叉引物各自 40pmol，I XThermol buffer，MgSO4 為 6mmol，dNTPs 溶液各 0? 4mmo1, Bst DNA 聚合酶 8U, AMV逆轉(zhuǎn)錄酶5U，無(wú)菌雙蒸水組成補(bǔ)足至25 ill。
6. -種權(quán)利要求1所述扎伊爾型埃博拉病毒恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用，其特征在于 所述應(yīng)用為： a)用試劑盒中RNA提取液從待檢測(cè)的標(biāo)本中提取RNA ; b) 將步驟a)提取得到的RNA作為模板加入到裝有恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液的PCR管中，在58°C 下擴(kuò)增反應(yīng)35分鐘；陽(yáng)性對(duì)照PCR管中加入標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板，陰性對(duì)照PCR管中加入標(biāo)準(zhǔn)陰 性模板，所述陽(yáng)性對(duì)照模板為含有扎伊爾型埃博拉病毒糖蛋白基因片段的質(zhì)粒，所述陰性 對(duì)照模板為無(wú)菌雙蒸水； c) 將反應(yīng)后的PCR管放置到核酸試紙條防污染檢測(cè)裝置中進(jìn)行檢測(cè)，2分鐘以后判讀 結(jié)果，當(dāng)試紙條的檢測(cè)線呈陽(yáng)性時(shí)，說(shuō)明樣品中含有扎伊爾型埃博拉病毒核酸。
【文檔編號(hào)】C12Q1/70GK104313179SQ201410503330
【公開日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2014年9月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月26日
【發(fā)明者】徐昌平, 盧亦愚, 馮燕, 陳寅, 高見 申請(qǐng)人:浙江省疾病預(yù)防控制中心