以廢水處理樣品微生物元基因組序列拼接細(xì)菌基因組的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種以廢水處理樣品微生物元基因組序列拼接細(xì)菌基因組的方法，所述方法包括如下步驟：步驟一，獲得樣品的元基因組序列；步驟二，根據(jù)群落結(jié)構(gòu)信息確定優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的分類地位；步驟三，依據(jù)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的相似菌的參考基因組序列，從元基因組序列中挑出相似序列；步驟四，對(duì)相似序列進(jìn)行拼接，添加人工接頭序列，獲得細(xì)菌的基因組草圖。本發(fā)明通過從反應(yīng)器污泥微生物元基因組序列中拼接細(xì)菌基因組，能夠不經(jīng)過分離細(xì)菌獲得培養(yǎng)物就可獲得細(xì)菌的基因組，從而可以實(shí)現(xiàn)對(duì)難以分離培養(yǎng)的細(xì)菌的基因組進(jìn)行研究，進(jìn)而獲得該細(xì)菌的代謝功能特性的方法。
【專利說明】以廢水處理樣品微生物元基因組序列拼接細(xì)菌基因組的方 法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種以廢水處理樣品微生物元基因組序列拼接 細(xì)菌基因組的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 近年來對(duì)喹啉的降解進(jìn)行了較多研究。反硝化條件下降解喹啉及其代謝途徑已 有報(bào)道。但反硝化降解喹啉過程中起關(guān)鍵作用的微生物及其發(fā)揮作用的機(jī)制卻缺乏深入 研究。前期研究發(fā)現(xiàn)，在一個(gè)運(yùn)行狀態(tài)穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)室反硝化喹啉降解生物反應(yīng)器中，變形 菌綱β亞綱的微生物成為主要的類群，其中陶厄氏屬（Thauera)和固氮弧菌屬（Azoacus) 的微生物具有明顯的優(yōu)勢(shì)。我們?cè)噲D從該反應(yīng)器中分離優(yōu)勢(shì)的陶厄氏屬（Thauera)細(xì)菌， 但是該菌株難以分離培養(yǎng)，為此，我們借鑒近年來新興的元基因組學(xué)技術(shù)，對(duì)反應(yīng)器的樣本 進(jìn)行了元基因組測(cè)序，分析了該群落樣本的功能潛勢(shì)。為了進(jìn)一步了解該反應(yīng)器中優(yōu)勢(shì) 的陶厄氏屬（Thauera)細(xì)菌的功能特性，我們從元基因組序列中拼接出了一個(gè)陶厄氏屬 (Thauera)細(xì)菌的基因組，并對(duì)其進(jìn)行了功能的注釋，為了解該細(xì)菌的功能奠定了基礎(chǔ)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種以廢水處理樣品微生物元基因 組序列拼接細(xì)菌基因組的方法。
[0004] 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0005] 本發(fā)明涉及一種以廢水處理樣品微生物元基因組序列拼接細(xì)菌基因組的方法，所 述方法包括如下步驟：
[0006] 步驟一，獲得樣品的元基因組序列；
[0007] 步驟二，根據(jù)群落結(jié)構(gòu)信息確定優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的分類地位；
[0008] 步驟三，依據(jù)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的相似菌的參考基因組序列，從元基因組序列中挑出相似 序列；
[0009] 步驟四，對(duì)相似序列進(jìn)行拼接，獲得細(xì)菌的基因組。
[0010] 優(yōu)選地，步驟一中，所述獲得樣品的元基因組序列具體為：利用高通量測(cè)序平臺(tái)獲 得樣品的元基因組序列，或者是利用454焦磷酸測(cè)序獲得樣品的元基因組序列。
[0011] 優(yōu)選地，步驟一中，所述元基因組序列為反應(yīng)器污泥微生物元基因組序列。
[0012] 優(yōu)選地，步驟一中，所述元基因組序列具體為平均長(zhǎng)度大于400bp的微生物基因 組序列。
[0013] 優(yōu)選地，步驟一中，所述獲得樣品的元基因組序列包括對(duì)測(cè)序得到的原始序列進(jìn) 行質(zhì)量控制的步驟。
[0014] 優(yōu)選地，步驟四中，拼接時(shí)，添加不影響蛋白編碼序列的短連接序列。
[0015] 更優(yōu)選地，所述短連接序列如SEQIDNO. 1所示。
[0016] 優(yōu)選地，步驟四中，所述細(xì)菌為樣品中含有群落細(xì)菌中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌。
[0017] 優(yōu)選地，步驟四中，所述細(xì)菌的基因組為陶厄氏屬（Thauera)細(xì)菌基因組。
[0018] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：
[0019] 本發(fā)明通過從反應(yīng)器污泥微生物元基因組序列中拼接細(xì)菌基因組，能夠不經(jīng)過分 離細(xì)菌獲得培養(yǎng)物就可獲得細(xì)菌的基因組，從而可以實(shí)現(xiàn)對(duì)難以分離培養(yǎng)的細(xì)菌的基因組 進(jìn)行研究，進(jìn)而獲得該細(xì)菌的代謝功能特性的方法，為分析群落中難以分離培養(yǎng)的細(xì)菌的 功能提供方法。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 通過閱讀參照以下附圖對(duì)非限制性實(shí)施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、 目的和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)變得更明顯：
[0021] 圖1為反應(yīng)器?；蚪M序列對(duì)已知陶厄氏囷（Thauera)基因組覆蓋度；
[0022] 其中圖中符號(hào)代表的細(xì)菌的拉丁文名稱分別為：sp.MZIT:Thauerasp.MZIT; AMXA：Thauerasp.28；AMXB：Thauerasp.27；AMXC：Thauerasp. 63；AMXD：Thauera aminoaromaticaS2 ;AMXE:Thaueralinaloolentis47Lol(DSM12138)
[0023] 圖2是從元基因組數(shù)據(jù)拼接的陶厄氏屬（Thauera)細(xì)菌基因組；圖中外圈I代表 編碼序列，內(nèi)圈2代表基因組的GC含量。
[0024] 圖3為反應(yīng)器陶厄氏屬（Thauera)基因組功能類別劃分；
[0025] 圖4為反應(yīng)器中陶厄氏屬（Thauera)細(xì)菌喹啉代謝途徑預(yù)測(cè)。

【具體實(shí)施方式】
[0026] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù) 人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù) 人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明 的保護(hù)范圍。
[0027] 實(shí)施例1
[0028] 本實(shí)施例首先建立一個(gè)喹啉降解反硝化反應(yīng)器，種子污泥來自焦化廠廢水處理系 統(tǒng)二沉池，在喹啉為唯一碳源的反硝化條件下馴化。經(jīng)過半年多時(shí)間的馴化，反應(yīng)器達(dá)到高 效穩(wěn)定的喹啉降解和硝態(tài)氮去除功能，喹啉去除率在80%左右，硝態(tài)氮去除率超過90%。
[0029] 分析穩(wěn)定狀態(tài)的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，Rhodocyclaceae科的反硝化菌Thauera、 Denitratisoma是優(yōu)勢(shì)微生物。其中，最優(yōu)勢(shì)類群Thauera的豐度在50%左右。這些類群 可能就是在反硝化條件下降解喹啉的主要的功能菌。為了 了解優(yōu)勢(shì)類群Thauera細(xì)菌的特 性，我們以元基因組學(xué)焦磷酸測(cè)序的方式獲得了反應(yīng)器微生物群落的元基因組序列。進(jìn)而 從元基因組數(shù)據(jù)中獲得優(yōu)勢(shì)的Thauera細(xì)菌的基因組。
[0030] 對(duì)喹啉降解反應(yīng)器某運(yùn)行穩(wěn)定的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取樣，并以Roche454GS-FLX平臺(tái)進(jìn) 行測(cè)序。原始序列經(jīng)過fastQC統(tǒng)計(jì)共計(jì)120萬條左右（大小800Mb左右），平均序列長(zhǎng)度 在600bp左右。經(jīng)過CD-HIT-EST程序的序列進(jìn)行聚類和454r印licatefilter軟件去除重 復(fù)的序列后，序列條數(shù)共計(jì)96萬條左右占原始序列的78 %。再經(jīng)過PRINSEQ剪切掉低質(zhì)量 末端后，序列條數(shù)共計(jì)90萬條左右占原始的73%。對(duì)序列的質(zhì)量控制環(huán)節(jié)后，每一條序列 末端的低質(zhì)量序列基本刪除，序列的平均長(zhǎng)度在600左右。
[0031] 從元基因組中將DNA序列劃分到不同菌株，將有重復(fù)區(qū)域的序列進(jìn)行組裝和 拼接，從而得到不同菌株的基因組數(shù)據(jù)。通過之前反應(yīng)器16s基因的結(jié)果，我們知道在 這個(gè)反應(yīng)器中Thauera屬的菌株與已知的ThaueraaminoaromaticS2菌株，參見Liu B,FrostegardA,ShapleighJP..Draftgenomesequencesoffivestrainsinthegenus thauera.GenomeAnnounc20131 (I) ·pii:e00052_12·doi:10. 1128/genomeA. 00052-12。 十分接近。進(jìn)一步選取了Thauera屬已經(jīng)完成基因組測(cè)序的6株菌株作為基因組比 較的參照組。這 6 株分別是Thauerasp. 28,Thauerasp. 27,Thauerasp. 63,Thauera linaloolentis47Lol=DSM1213,Thauerasp.MZlT,ThaueraaminoaromaticS2,參見 JiangK,SanseverinoJ,ChauhanA,LucasS,CopelandA,LapidusA,DelRioTG,Dalin E,TiceH,BruceD,GoodwinL,PitluckS,SimsD,BrettinT,DetterJC,HanC,Chang YJ,LarimerF,LandM,HauserL,KyrpidesNC,MikhailovaN,MoserS,JegierP,Close D,DebruynJM,WangY,LaytonAC,AllenMS,SaylerGS.Completegenomesequence ofThaueraaminoaromaticastrainMZlT.StandGenomicSci2012, 6(3):325-35. doi: 10. 4056/sigs. 2696029(反應(yīng)器中匹配的reads數(shù)最多的菌株，覆蓋率為82.I% ) (圖1)。因此我們根據(jù)這株ThaueraaminoaromaticS2基因組作為參考把質(zhì)控后序列中 的與該菌株基因組相似的序列用MUMMER軟件提取出來。具體是將反應(yīng)器序列與Thauera aminoaromaticS2 基因組進(jìn)行比對(duì)，使用程序blastn(blastall_pblastn-ele-5-m 8)找出匹配序列（比對(duì)區(qū)域400bp左右，相似性90%)，將匹配上的序列作為用于拼接和組 裝的Thauera屬基因組序列。共提取出96000條reads,作為拼接組裝Thauera屬菌株基 因組的序列文件（52Mb)。通過Rhoche454gsAssemble軟件對(duì)這些序列文件進(jìn)行拼接組裝 (contig長(zhǎng)度閾值為IOOObp，其它參數(shù)默認(rèn)），完成組裝和拼接后的Thauera屬細(xì)菌基因組， 大小為4371269bp與參照組的一致性為80%左右，GC含量64. 85%，共計(jì)2900條contig， N50為1586bp。經(jīng)過計(jì)算機(jī)在contig中添加不影響蛋白編碼序列的人工短連接序列SEQ IDNO.I(NNNNNCATTCCATTCATTAATTAATTAATGAATGAATGNNNNN)，將contig連接構(gòu)成連續(xù)的虛 擬基因組，最終完成Thauera屬細(xì)菌基因組的重建（4692877bp)(圖2)。
[0032] 實(shí)施例2
[0033] 在RAST平臺(tái)完成了拼接的Thauera基因組的人工注釋。該菌基因組中代謝途 徑的分類見圖3。Thauera屬的細(xì)菌利用反硝化途徑降解一些芳香族化合物經(jīng)常被報(bào)道， 在多株Thauera屬菌株的基因組中反硝化途徑中的基因也多次被發(fā)現(xiàn)。在我們拼接注釋 的Thauera屬菌株基因組中也確定了完整的反硝化途徑基因簇。在經(jīng)過RAST注釋后的 基因組中，位于contig00018上6977到7237bp的基因?yàn)榉聪趸緩竭€原基因簇。位于 Contig00199的95到1303bp的基因?yàn)橐谎趸€原酶（EC1. 7. 99. 6)。作為微生物降 解芳香族化合物為C02的常見中間產(chǎn)物，苯甲酰輔酶A在Thauera屬細(xì)菌中也是存在的，這 條代謝通路包括了由ATP驅(qū)動(dòng)的苯環(huán)2電子還原反應(yīng),該反應(yīng)利用ferredoxin作為電子 供體，由苯甲酰輔酶A還原酶催化。在注釋的Thauera基因組中，contig00366的2237到 1989bp確定為 4-hydroxybenzoyl-CoAthioesterase(EC3. 1. 2. 23)。
[0034] 表格1陶厄氏菌（Thauera)基因組芳香族化合物代謝途徑中的酶
[0035]

【權(quán)利要求】
1. 以廢水處理樣品微生物元基因組序列拼接細(xì)菌基因組的方法，其特征在于，所述方 法包括如下步驟： 步驟一，獲得樣品的元基因組序列； 步驟二，根據(jù)群落結(jié)構(gòu)信息確定優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的分類地位； 步驟三，依據(jù)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的相似菌的參考基因組序列，從元基因組序列中挑出相似序 列； 步驟四，對(duì)相似序列進(jìn)行拼接，獲得細(xì)菌的基因組。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的以廢水處理樣品微生物元基因組序列拼接細(xì)菌基因組的方 法，其特征在于，步驟一中，所述獲得樣品的元基因組序列具體為：利用高通量測(cè)序平臺(tái)獲 得樣品的元基因組序列，或者是利用454焦磷酸測(cè)序獲得樣品的元基因組序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的以廢水處理樣品微生物元基因組序列拼接細(xì)菌基因組的方 法，其特征在于，步驟一中，所述元基因組序列為反應(yīng)器污泥微生物元基因組序列。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的以廢水處理樣品微生物元基因組序列拼接細(xì)菌基因組的方 法，其特征在于，步驟一中，所述元基因組序列具體為平均長(zhǎng)度大于400bp的微生物基因組 序列。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的以廢水處理樣品微生物元基因組序列拼接細(xì)菌基因組的方 法，其特征在于，步驟一中，所述獲得樣品的元基因組序列包括對(duì)測(cè)序得到的原始序列進(jìn)行 質(zhì)量控制的步驟。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的以廢水處理樣品微生物元基因組序列拼接細(xì)菌基因組的方 法，其特征在于，步驟四中，拼接時(shí)，添加不影響蛋白編碼序列的短連接序列。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的以廢水處理樣品微生物元基因組序列拼接細(xì)菌基因組的方 法，其特征在于，所述短連接序列如SEQ ID NO. 1所示。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的以廢水處理樣品微生物元基因組序列拼接細(xì)菌基因組的方 法，其特征在于，步驟四中，所述細(xì)菌為樣品中含有群落細(xì)菌中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的以廢水處理樣品微生物元基因組序列拼接細(xì)菌基因組的方 法，其特征在于，所述細(xì)菌的基因組為陶厄氏屬（Thauera)細(xì)菌基因組。
【文檔編號(hào)】C12R1/01GK104278091SQ201410503190
【公開日】2015年1月14日 申請(qǐng)日期:2014年9月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月26日
【發(fā)明者】張曉君, 吳國(guó)軍, 王蕓, 姚翔宇, 張夢(mèng)暉 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)