專利名稱：通過(guò)預(yù)處理獲得高質(zhì)量酒醅微生物基因組dna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過(guò)預(yù)處理獲得高質(zhì)量酒醅微生物基因組DNA的方法，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
濃香型白酒的生產(chǎn)過(guò)程與微生物菌群的演化交替密不可分，酒醅是白酒釀造過(guò)程中微生物生長(zhǎng)基質(zhì)，主要原料包擴(kuò)高粱、糯米、小麥、玉米糠殼等根據(jù)不同工藝和傳統(tǒng)其原料成分不同，其中含有大量醇、酸、酯等白酒風(fēng)味物質(zhì)和其他淀粉、多糖、色素等物質(zhì)。微生物與窖池微生態(tài)環(huán)境相互作用并在窖池中進(jìn)行復(fù)雜的物質(zhì)能量代謝，積累了豐富多樣的代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物是濃香型白酒酒體風(fēng)味與口感形成的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，探討發(fā)酵過(guò)程中濃香型白酒酒醅微生物群落特性的差異及其變化規(guī)律對(duì)濃香型白酒生產(chǎn)有著重要的指導(dǎo)意義。運(yùn)用分子生物學(xué)相關(guān)方法進(jìn)行酒醅環(huán)境中微生物生態(tài)研究，能克服經(jīng)典培養(yǎng)方法 的不足以及引起種群丟失等局限，可以更加可靠、快速地獲得環(huán)境樣品中各種微生物的菌落指紋，確定微生物的多樣性及其分類地位，揭示和豐富生態(tài)環(huán)境的微生物資源。高質(zhì)量DNA提取是采用分子生物學(xué)方法進(jìn)行微生物種群研究的基礎(chǔ)，能否快速成功提取酒醅樣品多種微生物的DNA以及所提DNA質(zhì)量的高低直接影響整個(gè)實(shí)驗(yàn)的成敗。目前提取酒醅中微生物基因組DNA方法大多使用商品化的試劑盒。商品化的試劑盒適用范圍比較專一，存在特異性的局限。試劑盒大多針對(duì)他對(duì)某一類菌提取效果好，且在多菌種存在的酒醅中試劑盒不能保證提取豐度和效果的穩(wěn)定。雖然在PCR擴(kuò)增可通過(guò)稀釋模板濃度來(lái)降低雜質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)操作的影響，但也會(huì)影響擴(kuò)增效果，不利于后續(xù)分析(微生物的鑒定、多樣性分析等)工作的進(jìn)行。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種通過(guò)預(yù)處理獲得高質(zhì)量酒醅微生物基因組DNA的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是通過(guò)預(yù)處理獲得高質(zhì)量酒醅微生物基因組DNA的方法，包括如下步驟酒醅樣品的預(yù)處理，微生物基因組DNA的提??；其中，所述酒醅樣品的預(yù)處理包括如下步驟取酒醅樣品，加入玻璃珠，加入磷酸緩沖液，渦旋，4°C低速離心，取上清液，重復(fù)操作3飛次；合并所有上清，4°C高速離心，收集菌體沉淀。進(jìn)一步的，所述玻璃珠與酒醅樣品的質(zhì)量比為I : f 2，玻璃珠的直徑為f 2mm。進(jìn)一步的，所述酒醅樣品與磷酸緩沖液的質(zhì)量比為I : 3 5。進(jìn)一步的，所述磷酸緩沖液成分為13(Tl40mM NaCl，2 3mM KCl，l(Tl2mM Na2HPO4,I 2mM KH2PO4, pH 為 7. 0 8· O。進(jìn)一步的，所述的低速離心是指200 400g離心3 5min。進(jìn)一步的,所述的高速離心是指9000 14000rpm離心5 lOmin。進(jìn)一步的，所述的微生物基因組DNA的提取采用商品化試劑盒、SDS高鹽提取法及其衍生方法、CTAB提取法及其衍生方法中的一種。本發(fā)明還提供了上述方法在制備基因組DNA提取試劑盒中的用途。本發(fā)明方法簡(jiǎn)單快捷，易于操作，成本低廉。采用本發(fā)明方法進(jìn)行預(yù)處理后，不僅沒有影響用以提前基因組DNA的微生物的多樣性，反而使提取基因組DNA純度高，雜質(zhì)少。本發(fā)明方法適于酒醅微生物的鑒定、分類、多樣性研究等。


圖I、未經(jīng)預(yù)處理提取獲得酒醅樣品DNA擴(kuò)增16S rDNA的瓊脂糖電泳圖；1為上層酒醅樣品；2為中層酒醅樣品；3為下層酒醅樣品；Nr為空白樣；Mr為DNA Maker。圖2、經(jīng)預(yù)處理后提取獲得酒醅樣品DNA擴(kuò)增16S rDNA的瓊脂糖電泳圖；1為上層酒醅樣品；2為中層酒醅樣品；3為下層酒醅樣品；Nr為空白樣；Mr為DNA Maker。
圖3、未經(jīng)預(yù)處理提取獲得酒醅樣品DNA擴(kuò)增16S rDNA的變性梯度凝膠電泳圖；I為上層酒醅樣品；2為中層酒醅樣品；3為下層酒醅樣品。圖4、經(jīng)預(yù)處理后提取獲得酒醅樣品DNA擴(kuò)增16S rDNA的變性梯度凝膠電泳圖；1為上層樣酒醅品；2為中層酒醅樣品；3為下層酒醅樣品。圖5、未經(jīng)預(yù)處理提取獲得酒醅樣品DNA擴(kuò)增18S rDNA的瓊脂糖電泳圖；1為50年樣品；2為100樣品；3為200樣品；4為300年樣品；Nr為空白樣；Mr為DNA Maker。圖6、經(jīng)預(yù)處理提取獲得酒醅樣品DNA擴(kuò)增18S rDNA的瓊脂糖電泳圖；I為50年樣品；2為100年樣品；3為200年樣品；4為300年樣品；Nr為空白樣；Mr為DNA Maker。圖7、未經(jīng)預(yù)處理提取獲得酒醅樣品DNA擴(kuò)增18S rDNA的變性梯度凝膠電泳圖；I為50年樣品；2為100年樣品；3為200年樣品；4為300年樣品。圖8、經(jīng)預(yù)處理提取獲得酒醅樣品DNA擴(kuò)增18S rDNA的變性梯度凝膠電泳圖；I為50年樣品；2為100年樣品；3為200年樣品；4為300年樣品。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明通過(guò)預(yù)處理獲得高質(zhì)量酒醅微生物基因組DNA的方法，包括如下步驟酒醅樣品的預(yù)處理，微生物基因組DNA的提?。黄渲?，所述酒醅樣品的預(yù)處理包括如下步驟取酒醅樣品，加入玻璃珠，加入磷酸緩沖液，渦旋，4°C低速離心，取上清液，重復(fù)操作:Γ5次(盡可能多收集菌體細(xì)胞減少菌體流失)；合并所有上清，4°C高速離心，收集菌體沉淀。進(jìn)一步的，所述玻璃珠與酒醅樣品的質(zhì)量比為I : f 2，玻璃珠的直徑為廣2mm。進(jìn)一步的，所述酒醅樣品與磷酸緩沖液的質(zhì)量比為I : 3 5。進(jìn)一步的，所述磷酸緩沖液成分為130 140mM NaCl，2 3mM KC1，10 12mMNa2HPO4,1 2mM KH2PO4, pH 為 7. 0 8· O。進(jìn)一步的，所述的低速離心是指200 400g離心3 5min。進(jìn)一步的,所述的高速離心是指9000 14000rpm離心5 lOmin。進(jìn)一步的，所述的微生物基因組DNA的提取采用商品化試劑盒、SDS (十二烷基磺酸鈉)高鹽提取法及其衍生方法、CTAB (十六烷基三甲基溴化銨)提取法及其衍生方法中的一種。本發(fā)明還提供了上述方法在制備基因組DNA提取試劑盒中的用途。
本發(fā)明中，低速離心主要是沉淀雜質(zhì)獲得菌體上清液，高速離心主要是為了讓菌體上清液中菌體細(xì)胞沉淀下來(lái)。經(jīng)發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，在20(T400g下離心3飛min，可以很好的除去樣品中的雜志，獲得菌體上清液；經(jīng)9000 HOOOrpm離心5 10min，能收集到菌體上清液中菌體細(xì)胞，同時(shí)又不會(huì)影響后續(xù)操作中菌體細(xì)胞的重懸。低溫條件(4°C)離心是防止離心過(guò)程中DNA降解。本發(fā)明中，玻璃珠在使用前最好經(jīng)滅菌處理，以盡量減少DNA提取過(guò)程中雜菌的帶入。酒醅樣品中加入玻璃珠、磷酸緩沖液后的渦旋相當(dāng)于研磨過(guò)程，主要作用是洗脫菌體。玻璃珠的直徑以f 2mm為宜，玻璃珠太大或太小均會(huì)讓樣品研磨不夠充分，不能充分洗脫菌體。低速離心主要是沉淀雜質(zhì)，玻璃珠與雜質(zhì)一起沉降在下層沉淀中，取上層菌液進(jìn)行后續(xù)操作。磷酸鹽緩沖液的效果穩(wěn)定能且保存時(shí)間長(zhǎng)，且磷酸緩沖液適于細(xì)胞的洗滌等處理，因此在本發(fā)明中選用磷酸鹽緩沖液。本發(fā)明方法通過(guò)預(yù)處理，將菌體和雜質(zhì)通過(guò)離心分離，最終獲得純凈的菌體用于 后續(xù)基因組DNA的提取。實(shí)施例I采用本發(fā)明方法提取酒醅中微生物的基因組DNA將酒醅填入新窖池中，發(fā)酵完畢后，取上、中、下層出窖酒醅為樣品。本發(fā)明方法分別稱取O. 5g酒醅樣品于50ml離心管，向離心管加入3mL磷酸緩沖液(PBS )(137mMNaCl,2. 7mM KCl, IOmM Na2HPO4, 2mM KH2PO4, ρΗ8· O)和 O. 3g 玻璃珠(直徑 2mm)，漩渦震蕩5min, 200 X g離心5min,吸取上清液,重復(fù)上述操作三次，合并上清液，4°C下12000rpm離心5min，取沉淀作為基因組DNA提取材料。提取基因組DNA采用蛋白酶K與SDS高鹽組合方法沉淀中加入ImLDNA抽提液(IOOmmoI/L Tris-HCl pH8. 0,100mmol/L EDTA, IOOmmoI/LNa3PO4,1. 5mol/L NaCl)和5μ 蛋白酶k (20mg/mL), 200r/min搖床37 下30min (—方面給蛋白酶k提供合適的反應(yīng)溫度，另外可以讓菌體重懸)，在加入500 μ L10%SDS 65 °C水浴Ih。水浴后的樣品4°C下6000 X g離心lOmin，小心吸取上清于2ml離心管，加入等體積酚氯仿異戊醇(25 24 I)抽提一次，12000rpm離心IOmin,取上清加入等體積氯仿:異戍醇(24 : l)12000rpm離心IOmin,取上清，重復(fù)兩次。上清液加入O. 6體積預(yù)冷的異丙醇_20°C沉淀lh, 12000rpm離心IOmin,小心倒掉液體。沉淀用70%乙醇洗滌數(shù)次。洗滌后的DNA用吹風(fēng)吹干后TE溶解，-20°C保存。對(duì)照方法直接稱取O. 5g酒醅作為基因組DNA提取材料，不做預(yù)處理處理直接采用蛋白酶K與SDS高鹽組合提取酒醅基因組DNA。使用核酸蛋白儀(Eppendorf公司生產(chǎn))測(cè)定得到的基因組DNA純度,根據(jù)核酸的最大吸收波長(zhǎng)為260nm，蛋白質(zhì)為280nm，在波長(zhǎng)260nm時(shí)，IOD值相當(dāng)于雙鏈DNA濃度為50 μ g/ml，單鏈寡核苷酸的含量為30 μ g/ml，可以據(jù)此來(lái)計(jì)算核酸樣品的濃度，通過(guò)測(cè)定在260nm和280nm的OD值的比值(0D260/0D280)，估計(jì)核酸的純度。純凈DNA的比值為
I.8^1. 9。若比值高于I. 9說(shuō)明DNA樣品中的RNA尚未除盡，若比值低于I. 8，若樣品中含有酚和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。表I表明，預(yù)處理后提取的酒醅微生物基因組DNA的純度更高。
表I提取得到的酒醅樣品中微生物基因組DNA的純度
OD260/280
上層酒醅樣晶中層酒醅樣品下層酒醅樣晶本發(fā)明方法 Γ88L82L82 對(duì)照方法 L46 L28 L54以提取得到的酒醅微生物基因組DNA為模板，以細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)的通用引物P2 (SEQ IDNol:5，-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3，)和 P3—GC (SEQ ID No2:5，-CGC CCGCCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3’)作為引物，擴(kuò)增16S rDNA。PCR模板量為10ng，擴(kuò)增體系為ExTaq(takara公司生產(chǎn))體系，擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性4min ;94°C變性lmin，應(yīng)用降落PCR，65°C開始退火，每?jī)奢喗档?°C，最終降至 56°C，退火 lmin ;72°C延伸 Imin ;再 94°C變性 lmin ;55°C退火 lmin ;72°C延伸 lmin,共10個(gè)循環(huán)，72°C終延伸6min。結(jié)果見圖I、圖2，預(yù)處理后提取的基因組DNA樣品的擴(kuò)增 產(chǎn)物條帶明亮，帶型佳，表明擴(kuò)增效果好。同時(shí)將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Dcode系統(tǒng)(Bi0-Rad公司生產(chǎn)的變性梯度凝膠電泳系統(tǒng))進(jìn)行變性梯度凝膠電泳(DGGE)，尿素和甲酰胺濃度為3(T50%，200V電壓下電泳210min，SYBR(賽伯公司生產(chǎn)的染色劑)染色30min。結(jié)果見圖3、圖4。經(jīng)預(yù)處理后提取的基因組DNA樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶明顯比未做處理提取的基因組DNA樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶更加清晰明亮，條帶數(shù)目多，能用于單一條帶切膠回收進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，說(shuō)明獲得的基因組DNA能很好反映酒醅中細(xì)菌微生物多樣性，此外，經(jīng)過(guò)預(yù)處理并沒有影響用于提取基因組DNA的微生物的多樣性。實(shí)施例2采用本發(fā)明方法提取酒醅中微生物的基因組DNA將酒醅分別填入50、100、200、300年窖齡的濃香型白酒釀造窖池發(fā)酵，發(fā)酵完畢后取出窖酒醅為樣品。分別稱取O. 5g出窖酒醅樣品于50ml離心管，向離心管加入3mL磷酸緩沖液(PBS)(137mM NaCl, 2. 7mM KCl, IOmM Na2HPO4, 2mM KH2PO4,ρΗ8· O)和 O. 3g 玻璃珠(2mm)，漩渦震蕩5min, 200 X g離心5min,吸取上清液,重復(fù)上述操作三次，合并上清液，4°C下12000rpm離心5min，取沉淀?；蚪MDNA提取采用蛋白酶k與CTAB組合方法沉淀加入ImLCTAB抽提液(2%CTAB, 5moI/LNaCLUmoI/LTris-hcI (ρΗ=8)、0· 5mol/LEDTA)和 20 μ L 巰基乙醇，65 °C恒溫混勻儀振蕩30min,加入5μ I蛋白酶k (20mg/mL), 55°C恒溫混勻儀振蕩30min,室溫5000rpm離心IOmin,收集的上清加入等體積酹氯仿異戍醇(25 : 24 : I)抽提一次，12000rpm離心IOmin,取上清加入等體積氯仿異戍醇(24 : : I) 12000rpm離心IOmin,取上清，重復(fù)兩次。上清液加入O. 6體積預(yù)冷的異丙醇_20°C沉淀lh, 12000rpm離心IOmin,小心倒掉液體。沉淀用70%乙醇洗滌數(shù)次。洗滌后的DNA用吹風(fēng)吹干后TE溶解。對(duì)照方法直接稱取O. 5g酒醅作為基因組DNA提取材料，不做預(yù)處理直接采用蛋白酶k與CTAB組合提取酒醅基因組DNA。使用核酸蛋白儀(Eppendorf公司生產(chǎn))測(cè)定得到的基因組DNA純度。結(jié)果見表2，結(jié)果顯示本發(fā)明提取獲得DNA純度高，且質(zhì)量穩(wěn)定。表I提取得到的酒醅樣品中微生物基因組DNA的純度
OD260/280
50年窖齡 100年窖齡 200年窖齡 300年窖齡 本發(fā)明方法 LB2L88L85L81
對(duì)照方法 L43L62L21L39 以提取得到的DNA為模板，引物為真菌18S rDNA通用引物NS3-GC (SEQ IDNo3:5，-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GGC AAG TCT GGT GCCAGC AGC C-3，)和 YM951r (SEQ ID No4:5，_TTG GCA AAT GCT TTC GC-3，)，擴(kuò)增 18S rDNA。PCR模板量為10ng，擴(kuò)增體系為ExTaq體系，擴(kuò)增條件為95°C預(yù)變性4min ;93°C變性lmin，應(yīng)用降落PCR，55°C開始退火，每?jī)奢喗档?°C，最終降至45°C ;退火lmin，72°C延伸3min ;再93°C變性lmin ;45°C退火lmin ;72°C延伸3min，共5個(gè)循環(huán)，72°C終延伸6min。結(jié)果見圖5和圖6。未處理提取的基因組DNA樣品的PCR產(chǎn)物的條帶較暗，而預(yù)處理后提取的基因組DNA的樣品PCR產(chǎn)物的條帶清晰明亮，擴(kuò)增效果明顯好于未處理提取的基因組DNA樣品。采用伯樂Dcode系統(tǒng)進(jìn)行變性梯度凝膠電泳，變性濃度為10 50%，200V電壓下電泳240min，SYBR染色30min，結(jié)果見圖7、圖8。未處理樣品DGGE凝膠圖譜條帶暗，且條帶數(shù)目少。而預(yù)處理后提取的基因組DNA樣品擴(kuò)增產(chǎn)物DGGE凝膠圖譜中的條帶清晰明亮，能很好反映不同窖齡窖池酒醅中真菌的群落變化情況，可切膠回收用于后續(xù)研究。
權(quán)利要求
1.通過(guò)預(yù)處理獲得高質(zhì)量酒醅微生物基因組DNA的方法，其特征在于包括如下步驟酒醅樣品的預(yù)處理，微生物基因組DNA的提?。黄渲?，所述酒醅樣品的預(yù)處理包括如下步驟取酒醅樣品，加入玻璃珠，加入磷酸緩沖液，渦旋，4°C低速離心，取上清液，重復(fù)操作3^5次；合并所有上清，4°C高速離心，收集菌體沉淀。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的通過(guò)預(yù)處理獲得高質(zhì)量酒醅微生物基因組DNA的方法，其特征在于所述酒醅樣品與玻璃珠的質(zhì)量比為I : f 2，玻璃珠的直徑為f 2mm。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的通過(guò)預(yù)處理獲得高質(zhì)量酒醅微生物基因組DNA的方法，其特征在于所述磷酸緩沖液與酒醅樣品的質(zhì)量比為I : 3 5。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的通過(guò)預(yù)處理獲得高質(zhì)量酒醅微生物基因組DNA的方法，其特征在于所述磷酸緩沖液成分為13(Tl40mM NaCl，2 3mM KCl，l(Tl2mM Na2HPO4, T2mMKH2PO4, pH 為 7· 0 8· O。
5.根據(jù)權(quán)利要求2 4任一項(xiàng)所述的通過(guò)預(yù)處理獲得高質(zhì)量酒醅微生物基因組DNA的方法，其特征在于所述的低速離心是指20(T400g離心3 5min。
6.根據(jù)權(quán)利要求2飛任ー項(xiàng)所述的通過(guò)預(yù)處理獲得高質(zhì)量酒醅微生物基因組DNA的方法，其特征在于所述的高速離心是指9000 14000rpm離心5 lOmin。
7.根據(jù)權(quán)利要求2飛任ー項(xiàng)所述的通過(guò)預(yù)處理獲得高質(zhì)量酒醅微生物基因組DNA的方法，其特征在于所述的微生物基因組DNA的提取采用商品化的DNA提取試劑盒、SDS高鹽提取法及其衍生方法、CTAB提取法及其衍生方法中的ー種。
8.權(quán)利要求f7所述的通過(guò)預(yù)處理獲得高質(zhì)量酒醅微生物基因組DNA的方法在制備基因組DNA提取試劑盒中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過(guò)預(yù)處理獲得高質(zhì)量酒醅微生物基因組DNA的方法，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種通過(guò)預(yù)處理獲得高質(zhì)量酒醅微生物基因組DNA的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是通過(guò)預(yù)處理獲得高質(zhì)量酒醅微生物基因組DNA的方法，包括如下步驟酒醅樣品的預(yù)處理、微生物基因組DNA的提取。采用本發(fā)明方法提取的酒醅中微生物基因組DNA純度高，雜質(zhì)少，可用于酒醅微生物的分類、多樣性研究等。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102816757SQ20121034442
公開日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2012年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月17日
發(fā)明者李德林, 許正宏, 敖宗華, 史勁松, 王松濤, 陸震鳴, 林鋒 申請(qǐng)人:瀘州品創(chuàng)科技有限公司