用于檢測錦鯉皰疹病毒Sph基因的引物組及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，公開了一種用于檢測錦鯉皰疹病毒Sph基因的引物組及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的用于檢測錦鯉皰疹病毒Sph基因的引物組包括：具有如SEQ?ID?NO:1所示核苷酸序列的上游外部引物，具有如SEQ?ID?NO:2所示核苷酸序列的下游外部引物，具有如SEQ?ID?NO:3所示核苷酸序列的上游內(nèi)部引物和具有如SEQ?ID?NO:4所示核苷酸序列的下游內(nèi)部引物。本發(fā)明提供的引物組特異性強(qiáng)、靈敏度高，適用于LAMP法擴(kuò)增錦鯉皰疹病毒Sph基因，能夠用于制備檢測錦鯉皰疹病毒Sph基因的試劑。
【專利說明】用于檢測錦鯉皰疹病毒Sph基因的引物組及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及用于檢測錦鯉皰疹病毒Sph基因的引物組及 其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 錦鯉皰疹病毒病（Koi herpesvirus Disease，KHVD)是一種錦鯉和鯉魚的高致病 性疾病，是近幾年危害淡水魚養(yǎng)殖，特別是鯉魚養(yǎng)殖的主要水生傳染病，同時也是近幾年所 發(fā)現(xiàn)的新的水生病毒性傳染病，其傳染性和傳播性所造成的危害已被全世界重視。錦鯉皰 疹病毒病可導(dǎo)致鯉魚和錦鯉大規(guī)模死亡，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，給淡水魚養(yǎng)殖造成嚴(yán)重影 響。同時，國際貿(mào)易促進(jìn)了該疾病的傳播與擴(kuò)散，使該疾病在全世界范圍內(nèi)流行，由于目前 沒有合適的防治方法，導(dǎo)致其一旦爆發(fā)難以控制。近幾年，國際動物衛(wèi)生組織對錦鯉皰疹病 毒病的重視程度逐漸提高，并將其納入水生動物疫病手冊，許多研究人員也參與到該病的 研究工作中，以圖盡快控制該病的流行與傳播。
[0003] 錦鯉皰疹病毒病是由錦鯉皰疹病毒（Koi herpesvirus，KHV)引起的鯉魚和錦鯉的 傳染性病毒病。1997年首次在德國發(fā)現(xiàn)，1998年以色列和美國相繼發(fā)生了該病并鑒定其病 原為錦鯉皰疹病毒。錦鯉皰疹病毒（KHV)可感染各年齡段的錦鯉和鯉魚，死亡率很高，已經(jīng) 給世界上眾多國家造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，目前無有效的預(yù)防和控制措施。研究發(fā)現(xiàn)，KHV 病毒感染后的臨床癥狀與感染細(xì)菌和寄生蟲后的臨床癥狀相似，這些癥狀可能掩蓋KHV病 毒所致的危害，所以不能單一通過觀察發(fā)病魚的臨床癥狀給予決定性的判斷，需要結(jié)合其 他檢測方法共同檢測來確定。目前，檢測錦鯉皰疹病毒病的方法有電鏡檢測、ELISA、PCR、熒 光PCR等。PCR方法在我國已作為疫情檢測及診斷手段，也是0ΙΕ診斷手冊推薦的檢測方 法。為了保證檢測結(jié)果的特異性和可靠性，0ΙΕ手冊建議采用兩種不同的基因進(jìn)行PCR檢 測。針對錦鯉皰疹病毒，0ΙΕ手冊提供的PCR方法涉及DNA聚合酶基因（Sph)和胸苷激酶 基因（TK)兩個基因，操作復(fù)雜，特異性和靈敏度較低。所以，急需一種操作簡單、準(zhǔn)確檢測 KHV的方法以便于檢測錦鯉皰疹病毒，實(shí)現(xiàn)錦鯉皰疹病毒病的及時確診、控制和治療。
[0004] LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification)法，即環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增反應(yīng)，是 2000年由Notomi等發(fā)明的一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法。該方法采用特異地識別靶序列 上六個區(qū)域的四條引物（兩條外引物，兩條內(nèi)引物）及具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶， 在65°C左右進(jìn)行核酸的指數(shù)級擴(kuò)增，其擴(kuò)增效率可達(dá)到109_101(1個拷貝數(shù)量級；并且LAMP 法擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測方法種類多：焦磷酸鎂沉淀檢測（濁度檢測）、熒光顯色檢測、凝膠電泳 檢測或?qū)崟r檢測；使得該方法具有簡便、快速、準(zhǔn)確、廉價、易檢測等特點(diǎn)。為了實(shí)現(xiàn)KHV的 簡便、準(zhǔn)確檢測，很有必要提供一種利用LAMP技術(shù)檢測錦鯉皰疹病毒的方法。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明的發(fā)明目的在于提供一種用于檢測錦鯉皰疹病毒Sph基因的引物組及其 應(yīng)用。本發(fā)明提供的用于檢測錦鯉皰疹病毒Sph基因的引物組特異性強(qiáng)、靈敏度高，可以用 于LAMP法擴(kuò)增錦鯉皰疹病毒Sph基因，能夠用于制備檢測錦鯉皰疹病毒Sph基因的試劑。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0007] 本發(fā)明提供了一種用于檢測錦鯉皰疹病毒Sph基因的引物組，該引物組包括以下 引物：
[0008] 具有如SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列的上游外部引物；
[0009] 具有如SEQ ID N0:2所示核苷酸序列的下游外部引物；
[0010] 具有如SEQ ID N0:3所示核苷酸序列的上游內(nèi)部引物；
[0011] 具有如SEQ ID N0:4所示核苷酸序列的下游內(nèi)部引物。
[0012] 錦鯉皰疹病毒Sph基因，GenBank登錄號AB375381. 1。本發(fā)明設(shè)計獲得了 10組引 物組，從10組引物組中篩選出一組特異性強(qiáng)、靈敏度高、擴(kuò)增效率高的引物組。實(shí)驗結(jié)果證 明，本發(fā)明提供的引物組能夠特異性檢測錦鯉皰疹病毒Sph基因，相比普通PCR，檢測靈敏 度高出兩個數(shù)量級，可以用于LAMP法擴(kuò)增錦鯉皰疹病毒Sph基因，能夠用于制備檢測錦鯉 皰疹病毒Sph基因的試劑。本發(fā)明將具有如SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列的上游外部引物 命名為F0P ;具有如SEQ ID N0:2所示核苷酸序列的下游外部引物命名為Β0Ρ ;具有如SEQ ID N0:3所示核苷酸序列的上游內(nèi)部引物命名為FIP;具有如SEQ ID N0:4所示核苷酸序列 的下游內(nèi)部引物命名為BIP。
[0013] 本發(fā)明提供的引物組是根據(jù)錦鯉皰疹病毒Sph基因的保守序列設(shè)計獲得的，所以 本領(lǐng)域技術(shù)人員可以推理得出利用本發(fā)明提供的引物組除了能夠擴(kuò)增檢測本發(fā)明設(shè)計引 物所對應(yīng)的錦鯉皰疹病毒Sph基因外。還能夠擴(kuò)增檢測以下兩個DNA分子中的任意一個： (1)與本發(fā)明設(shè)計引物所用的錦鯉皰疹病毒Sph基因序列雜交且編碼相同功能蛋白的DNA 分子；（2)與本發(fā)明設(shè)計引物所用的錦鯉皰疹病毒Sph基因至少具有90%以上同源性且編 碼相同功能蛋白的DNA分子。
[0014] 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增反應(yīng)分為兩個階段：第一階段為起始階段，經(jīng)過這一階段，形成了 莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)；第二階段為擴(kuò)增循環(huán)階段，以莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)為模板進(jìn)行周而復(fù)始地擴(kuò)增；第一 階段是第二階段的基礎(chǔ)。根據(jù)靶序列設(shè)計的上游外部引物、下游外部引物、上游內(nèi)部引物和 下游內(nèi)部引物直接決定了環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增的特異性和靈敏度。環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增反應(yīng)中還可 以加入環(huán)引物，環(huán)引物能夠在第二階段時與莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)結(jié)合啟動鏈置換合成，進(jìn)一步完善 擴(kuò)增反應(yīng)，例如，進(jìn)一步提高擴(kuò)增的速度和效率，本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易想到在本發(fā)明提供 的引物組的基礎(chǔ)上再加入環(huán)引物，這也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0015] 本發(fā)明還提供了一種引物組在制備檢測錦鯉皰疹病毒Sph基因的試劑中的應(yīng)用， 該引物組包括以下引物：
[0016] 具有如SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列的上游外部引物；
[0017] 具有如SEQ ID N0:2所示核苷酸序列的下游外部引物；
[0018] 具有如SEQ ID N0:3所示核苷酸序列的上游內(nèi)部引物；
[0019] 具有如SEQ ID N0:4所示核苷酸序列的下游內(nèi)部引物。
[0020] 本發(fā)明還提供了一種檢測錦鯉皰疹病毒Sph基因的試劑盒，該試劑盒包括一種引 物組，該引物組包括以下引物：
[0021] 具有如SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列的上游外部引物；
[0022] 具有如SEQ ID N0:2所示核苷酸序列的下游外部引物；
[0023] 具有如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的上游內(nèi)部引物；
[0024] 具有如SEQ ID N0:4所示核苷酸序列的下游內(nèi)部引物。
[0025] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的試劑盒中的上游外部引物的濃度為0. 05 μ mol/L? 0. 5ymol/L。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的試劑盒中的上游外部引物的濃度為 0·2 μ mol/L〇
[0026] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的試劑盒中的下游外部引物的濃度為0. 05 μ mol/L? 0. 5ymol/L。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的試劑盒中的下游外部引物的濃度為 0·2 μ mol/L〇
[0027] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的試劑盒中的上游內(nèi)部引物的濃度為0. 8 μ mo 1/L? 2. 0 μ mol/L。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的試劑盒中的上游內(nèi)部引物的濃度為 L 6 μ mol/L〇
[0028] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的試劑盒中的下游內(nèi)部引物的濃度為0. 8 μ mo 1/L? 2. 0 μ mol/L。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的試劑盒中的下游內(nèi)部引物的濃度為 L 6 μ mol/L〇
[0029] 本發(fā)明還提供了一種利用本發(fā)明提供的引物組擴(kuò)增錦鯉皰疹病毒Sph基因的方 法，包括：
[0030] 獲得待測生物樣品，以具有如SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列的上游外部引物、具有 如SEQ ID N0:2所示核苷酸序列的下游外部引物、具有如SEQ ID N0:3所示核苷酸序列的 上游內(nèi)部引物和具有如SEQ ID N0:4所示核苷酸序列的下游內(nèi)部引物擴(kuò)增待測生物樣品；
[0031] 該引物組包括以下引物：
[0032] 具有如SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列的上游外部引物；
[0033] 具有如SEQ ID N0:2所示核苷酸序列的下游外部引物；
[0034] 具有如SEQ ID N0:3所示核苷酸序列的上游內(nèi)部引物；
[0035] 具有如SEQ ID N0:4所示核苷酸序列的下游內(nèi)部引物。
[0036] 本發(fā)明提供的擴(kuò)增錦鯉皰疹病毒Sph基因的方法以本發(fā)明提供的引物組為引物， 采用LAMP法進(jìn)行擴(kuò)增，操作簡單，提高了擴(kuò)增反應(yīng)的特異性和靈敏度，所得擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定 方便，更有利于靈敏、快速、準(zhǔn)確地檢測生物樣品中是否含有錦鯉皰疹病毒Sph基因。
[0037] 在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的擴(kuò)增錦鯉皰疹病毒Sph基因的方法中用 于檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的方法為熒光顯色法、濁度檢測法或凝膠電泳檢測法。
[0038] 在本發(fā)明的另外一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的擴(kuò)增錦鯉皰疹病毒Sph基因的方法 中用于檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的方法具體為熒光顯色法。
[0039] 當(dāng)環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增的反應(yīng)體系中含有鈣黃綠素時，可通過熒光顯色進(jìn)行結(jié)果判 斷：如果環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增所得擴(kuò)增產(chǎn)物顯示為綠色，代表待測生物樣品中含有錦鯉皰疹病 毒Sph基因；如果環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增所得擴(kuò)增產(chǎn)物顯示為橙色，待測生物樣品中不含有錦鯉 皰疹病毒Sph基因。
[0040] 在本發(fā)明的另外一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的擴(kuò)增錦鯉皰疹病毒Sph基因的方法 中用于檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的方法具體為濁度檢測法。
[0041] 在環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增反應(yīng)過程中會產(chǎn)生一種焦磷酸鎂的衍生物副產(chǎn)物，隨著環(huán)介導(dǎo) 等溫擴(kuò)增反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，焦磷酸鎂衍生物的生成量也會逐漸增加，焦磷酸鎂衍生物 為白色沉淀，使得擴(kuò)增產(chǎn)物呈現(xiàn)出白色渾濁。因此，如果環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增產(chǎn)物中生成白色沉 淀代表待測生物樣品中含有錦鯉皰疹病毒Sph基因；如果環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增產(chǎn)物中沒有生成 白色沉淀，則說明待測生物樣本中不含有錦鯉皰疹病毒Sph基因。因此，通過觀察反應(yīng)產(chǎn)物 白色渾濁的有無即可驗證是否待測生物樣品中是否含有錦鯉皰疹病毒Sph基因。因為環(huán)介 導(dǎo)等溫擴(kuò)增反應(yīng)中焦磷酸鎂衍生物沉淀的形成量與反應(yīng)所產(chǎn)生的DNA量之間呈線性關(guān)系， 因此可以通過濁度儀實(shí)時檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，如果濁度儀生成濁度變化曲線代表待測生物樣品 中含有錦鯉皰疹病毒Sph基因基因；如果濁度儀沒有響應(yīng)，則代表待測生物樣品中不含錦 鯉皰疹病毒Sph基因。同時，也可根據(jù)濁度變化曲線對生物樣品中所含有的錦鯉皰疹病毒 Sph基因進(jìn)行定量分析。
[0042] 在本發(fā)明的另外一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的擴(kuò)增錦鯉皰疹病毒Sph基因的方法 中用于檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的方法具體為凝膠電泳檢測法。
[0043] 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增產(chǎn)物是一系列具有不同莖長度的莖環(huán)結(jié)構(gòu)DNA和帶有許多環(huán)的 類似花椰菜結(jié)構(gòu)的DNA混合物，因為擴(kuò)增產(chǎn)物中含有一個或多個重復(fù)單元，所以各個擴(kuò)增 產(chǎn)物之間的長度差可以看作一個常數(shù)，當(dāng)用凝膠電泳分析時，一個待測生物樣品所得的擴(kuò) 增產(chǎn)物所對應(yīng)的電泳泳道呈現(xiàn)梯狀條帶。如果擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳顯示梯狀條帶， 代表待測生物樣品中含有錦鯉皰疹病毒Sph基因；如果擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳不顯示 梯狀條帶，則說明待測生物樣品中不含錦鯉皰疹病毒Sph基因。
[0044] 在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的擴(kuò)增錦鯉皰疹病毒Sph基因的方法中， 擴(kuò)增的體系包括以下組分：
[0045]
[?Ι) Ο.ΝμιηοΙ ,? . 2.0μιι?(.)Ι /[. Ι?Π* U.Kunu)l /1... 2.0μιηοΙ /1.. ΓΟΙ1 O.OSiimoi η.-- ().5umo\ /\. iiOi* ().()5μηιοΙ /1..?（).5'umol /1, tiN ] [:,s O.Knimoi ·· 2.0minol /L Λ?";>? fA ( Hetainc ) 0.1 mmol I... - i .Ommol L. Tris-1 l(..'l(pl !8.S) 5rmm)l .'L ?50mmol ./L KCI 5inmol /1.. 50irmiol /L (NIh)，SO, 5mmoi /1. - 50mmol /L MgS04 5mmol /L ~ 50mmol /L Tween20 0.CH% ~ 1.0% (體積百分含量） 你 DNA 聚合酶 0.02U~L ~ 21Ι/μ[ 模板 1,7ng/pL ~ 68ng4iL。
[0046] 在本發(fā)明的另外一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的擴(kuò)增錦鯉皰疹病毒Sph基因的方法 中，擴(kuò)增的體系包括以下組分：
[0047] FIP ?.6μηιοΙ /L BIP i.6umol /L FOP 0.2umol /L r BOP 0.2iimol /L dNTPs 1,4mmol /L 甜菜減（Betaine ) 0,8mmol /L Tris-HCI(pH8.8) 20mmol /L KC1 lOmmol /L SO, lOmmol /L MgS〇4 8mmol /1. Tween20 0.1% (體積百分含量） Bs/ DNA 聚合酶 0.32U/pL 模板 6.8ng/u.L〇
[0048] 在本發(fā)明的另外一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的擴(kuò)增錦鯉皰疹病毒Sph基因的方法 中，當(dāng)采用熒光顯色法檢測擴(kuò)增產(chǎn)物時，擴(kuò)增的體系中還包括2%?4%的鈣黃綠素。
[0049] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的擴(kuò)增錦鯉皰疹病毒Sph基因的方法中，環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增的 反應(yīng)程序為：61°C?65°C，30min?60min ;4°C，保存。
[0050] 本發(fā)明還提供了一種利用本發(fā)明提供的引物組檢測錦鯉皰疹病毒Sph基因的方 法，包括：
[0051] 獲得待測生物樣品，以具有如SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列的上游外部引物、具有 如SEQ ID N0:2所示核苷酸序列的下游外部引物、具有如SEQ ID N0:3所示核苷酸序列的 上游內(nèi)部引物和具有如SEQ ID N0:4所示核苷酸序列的下游內(nèi)部引物擴(kuò)增待測生物樣品， 得擴(kuò)增產(chǎn)物；檢測所得擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)檢測結(jié)果判斷待測生物樣品中是否含有錦鯉皰疹病 毒Sph基因；
[0052] 該引物組包括以下引物：
[0053] 具有如SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列的上游外部引物；
[0054] 具有如SEQ ID N0:2所示核苷酸序列的下游外部引物；
[0055] 具有如SEQ ID N0:3所示核苷酸序列的上游內(nèi)部引物；
[0056] 具有如SEQ ID N0:4所示核苷酸序列的下游內(nèi)部引物。
[0057] 本發(fā)明提供了一種用于檢測錦鯉皰疹病毒Sph基因的引物組及其應(yīng)用。本發(fā)明 提供的用于檢測錦鯉皰疹病毒Sph基因的引物組包括：具有如SEQ ID NO: 1所示核苷酸序 列的上游外部引物，具有如SEQ ID N0:2所示核苷酸序列的下游外部引物，具有如SEQ ID N0:3所示核苷酸序列的上游內(nèi)部引物和具有如SEQ ID N0:4所示核苷酸序列的下游內(nèi)部引 物。本發(fā)明提供的引物組為根據(jù)錦鯉皰疹病毒Sph基因設(shè)計獲得的，特異性強(qiáng)、靈敏度高， 適用于LAMP法擴(kuò)增錦鯉皰疹病毒Sph基因，能夠用于制備檢測錦鯉皰疹病毒Sph基因的試 齊U。實(shí)驗結(jié)果證實(shí)，本發(fā)明提供的引物組能夠特異性擴(kuò)增錦鯉皰疹病毒Sph基因，相比普通 PCR，檢測靈敏度高出兩個數(shù)量級，可以用于LAMP法擴(kuò)增錦鯉皰疹病毒Sph基因，能夠用于 制備檢測錦鯉皰疹病毒Sph基因的試劑。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0058] 圖1示實(shí)施例1引物篩選結(jié)果所得擴(kuò)增曲線，曲線1代表第1組引物組所對應(yīng)的 擴(kuò)增曲線；曲線2代表第2組引物組所對應(yīng)的擴(kuò)增曲線；曲線3代表第3組引物組所對應(yīng)的 擴(kuò)增曲線；曲線4代表第4組引物組所對應(yīng)的擴(kuò)增曲線；曲線5代表第5組引物組所對應(yīng)的 擴(kuò)增曲線；曲線6代表第6組引物組所對應(yīng)的擴(kuò)增曲線；曲線7代表第7組引物組所對應(yīng)的 擴(kuò)增曲線；
[0059] 圖2示實(shí)施例2的擴(kuò)增產(chǎn)物檢測結(jié)果，1號反應(yīng)管代表實(shí)驗組1，擴(kuò)增產(chǎn)物為綠色； 2號反應(yīng)管代表實(shí)驗組2,擴(kuò)增產(chǎn)物為綠色；3號反應(yīng)管代表空白對照組，擴(kuò)增產(chǎn)物為淺橙 色；
[0060] 圖3示實(shí)施例3的擴(kuò)增產(chǎn)物檢測結(jié)果，1號反應(yīng)管代表空白對照組，擴(kuò)增產(chǎn)物為淺 橙色；2號反應(yīng)管代表實(shí)驗組1，擴(kuò)增產(chǎn)物為綠色；3號反應(yīng)管代表實(shí)驗組2,擴(kuò)增產(chǎn)物為綠 色；
[0061] 圖4示實(shí)施例4的擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測結(jié)果，1號反應(yīng)管代表實(shí)驗組1，擴(kuò)增產(chǎn)物為綠 色；2號反應(yīng)管代表實(shí)驗組2,擴(kuò)增產(chǎn)物為綠色；3號反應(yīng)管代表空白對照組，擴(kuò)增產(chǎn)物為淺 橙色；
[0062] 圖5示實(shí)施例5中LAMP法第一次擴(kuò)增實(shí)驗結(jié)果，其中樣品1示2. 66 X 101(lcopies/ yL 的模板；樣品 2 示 2.66X 109copies/yL 的模板；樣品 3 示 2.66X 108copies/yL 的 模板；樣品4不2· 66X 107copies/ μ L的模板；樣品5不2· 66X 106copies/ μ L的模板；樣 品6示2. 66 X 105copies/μ L的模板；樣品7示2. 66 X 104copies/μ L的模板；樣品8示 2. 66 X 103copies/ μ L的模板；Α為藍(lán)色；Β為紅色；C為綠色；
[0063] 圖6示實(shí)施例5中LAMP法第二次擴(kuò)增實(shí)驗結(jié)果，其中樣品1示2. 66 X 101(lcopies/ yL 的模板；樣品 2 示 2.66X 109copies/yL 的模板；樣品 3 示 2.66X 108copies/yL 的 模板；樣品4不2· 66X 107copies/ μ L的模板；樣品5不2· 66X 106copies/ μ L的模板；樣 品6示2. 66 X 105copies/μ L的模板；樣品7示2. 66 X 104copies/μ L的模板；樣品8示 2. 66 X 103copies/ μ L的模板；Α為藍(lán)色；Β為紅色；C為綠色；
[0064] 圖7示實(shí)施例5中LAMP法第三次擴(kuò)增實(shí)驗結(jié)果，其中樣品1示2· 66X 101Qcopies/ yL 的模板；樣品 2 示 2.66X 109copies/yL 的模板；樣品 3 示 2.66X 108copies/yL 的 模板；樣品4不2· 66X 107copies/ μ L的模板；樣品5不2· 66X 106copies/ μ L的模板；樣 品6示2. 66 X 105copies/μ L的模板；樣品7示2. 66 X 104copies/μ L的模板；樣品8示 2. 66 X 103copies/ μ L的模板；Α為藍(lán)色；Β為紅色；C為綠色；
[0065] 圖8示實(shí)施例5中普通PCR法擴(kuò)增的實(shí)驗結(jié)果，其中其中泳道1示 2. 66 X 101Qcopies/μ L 的模板；泳道 2 示 2. 66 X 109copies/μ L 的模板；泳道 3 示 2. 66 X 108copies/μ L 的模板；泳道 4 示 2. 66 X 107copies/μ L 的模板；泳道 5 示 2. 66 X 106copies/μ L 的模板；泳道 6 示 2. 66 X 105copies/μ L 的模板；泳道 7 示 2. 66 X 104copies/μ L 的模板；泳道 8 示 2. 66 X 103copies/μ L 的模板；
[0066] 圖9示實(shí)施例6中第一次擴(kuò)增實(shí)驗中不同的模板LAMP擴(kuò)增所得擴(kuò)增曲線的柱狀 圖；樣品1示模板1所得擴(kuò)增曲線；樣品2示模板2所得擴(kuò)增曲線；樣品3代表模板3所得 擴(kuò)增曲線；樣品4代表模板4所得擴(kuò)增曲線；樣品5代表空白對照組;A為藍(lán)色；B為紅色； C為綠色；
[0067] 圖10示實(shí)施例6第二次擴(kuò)增實(shí)驗中不同的模板LAMP擴(kuò)增所得擴(kuò)增曲線的柱狀 圖；樣品1示模板2所得擴(kuò)增曲線；樣品2示模板3所得擴(kuò)增曲線；樣品3代表模板1所得 擴(kuò)增曲線；樣品4代表模板4所得擴(kuò)增曲線；樣品5代表空白對照組;A為藍(lán)色；B為紅色； C為綠色；
[0068] 圖11示實(shí)施例6第三次擴(kuò)增實(shí)驗中不同的模板LAMP擴(kuò)增所得擴(kuò)增曲線的柱狀 圖；樣品1示模板2所得擴(kuò)增曲線；樣品2示模板1所得擴(kuò)增曲線；樣品3代表模板3所得 擴(kuò)增曲線；樣品4代表模板4所得擴(kuò)增曲線；樣品5代表空白對照組;A為藍(lán)色；B為紅色； C為綠色；
[0069] 圖12示實(shí)施例7中PCR法擴(kuò)增實(shí)驗的檢測結(jié)果；Μ為DNA分子量Marker ; 1代表 陽性對照；2代表陰性對照；3代表皮膚黏液生物樣品；4代表腦生物樣品；5代表心臟生物 樣品；6代表血液生物樣品；7代表腎臟生物樣品；8代表肌肉生物樣品；
[0070] 圖13示實(shí)施例7中LAMP法擴(kuò)增實(shí)驗的檢測結(jié)果；樣品1代表陽性對照；樣品2代 表陰性對照；樣品3代表肌肉生物樣品；樣品4代表血液生物樣品；樣品5代表腎臟生物樣 品；樣品6代表腦生物樣品；樣品7代表皮膚黏液生物樣品；樣品8代表心臟生物樣品；A為 藍(lán)色；B為紅色；C為綠色；
[0071] 圖14示實(shí)施例8中利用試劑盒擴(kuò)增模板時，所得擴(kuò)增曲線的柱狀圖；樣品1示陰 性對照所得擴(kuò)增曲線；樣品2示模板所得擴(kuò)增曲線；A為藍(lán)色；B為紅色；C為綠色；
[0072] 圖15示本發(fā)明實(shí)施例9的檢測結(jié)果，1號反應(yīng)管代表空白對照組，擴(kuò)增產(chǎn)物為淺橙 色；2號反應(yīng)管代表待測樣品，擴(kuò)增產(chǎn)物為綠色；3號反應(yīng)管代表陽性對照組，擴(kuò)增產(chǎn)物為綠 色；
[0073] 圖16示實(shí)施例10的檢測結(jié)果，1號反應(yīng)管代表陽性對照組，1號反應(yīng)管中含有白 色渾濁沉淀物；2號反應(yīng)管代表待測樣品，2號反應(yīng)管中含有白色渾濁沉淀物；3號反應(yīng)管代 表空白對照組，3號反應(yīng)管澄清。
【具體實(shí)施方式】
[0074] 本發(fā)明公開了一種用于檢測錦鯉皰疹病毒Sph基因的引物組及其應(yīng)用。本領(lǐng)域技 術(shù)人員可以參考本文內(nèi)容，獲得該引物組，實(shí)現(xiàn)其應(yīng)用，特別需要指出的是，所有類似的替 換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明內(nèi)。本發(fā)明的 制備方法已經(jīng)通過較佳的實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神 和范圍內(nèi)對本文制備方法進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0075] 本發(fā)明提供的用于檢測錦鯉皰疹病毒Sph基因的引物組及其應(yīng)用中所用到的試 劑和原料均可由市場購得。
[0076] 為了使本【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員能夠更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合實(shí)施 例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
[0077] 實(shí)施例1特異性引物組的篩選 [0078] 引物設(shè)計：
[0079] 根據(jù)錦鯉皰疹病毒Sph基因（GenBank登錄號AB375381. 1)，利用PrimerExplorer V4 在線軟件 http://primerexplorer. jp/elamp4. 0· 0/index. html，設(shè)計合成用于檢測錦 鯉皰疹病毒的LAMP引物：通過綜合考慮堿基組成、GC含量、二級結(jié)構(gòu)的形成、Tm值、引物 之間的距離、引物末端的穩(wěn)定性等因素，設(shè)置和調(diào)整引物設(shè)計軟件參數(shù)，共設(shè)計合成獲得10 組引物，以用于LAMP引物的篩選。LAMP法所需引物中上游外部引物、下游外部引物、上游內(nèi) 部引物和下游內(nèi)部引物是必須的，也直接決定了擴(kuò)增的靈敏度和特異性。本實(shí)施例合成的 10組引物及各個引物對應(yīng)的核苷酸序列見表1。
[0080] 表1 10組引物及各個引物對應(yīng)的核苷酸序列
[0081]
【權(quán)利要求】
1. 用于檢測錦鯉皰疹病毒的引物組，其特征在于，所述引物組包括以下引物： 具有如SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列的上游外部引物； 具有如SEQ ID N0:2所示核苷酸序列的下游外部引物； 具有如SEQ ID N0:3所示核苷酸序列的上游內(nèi)部引物； 具有如SEQ ID N0:4所示核苷酸序列的下游內(nèi)部引物。
2. 如權(quán)利要求1所述的引物組在制備檢測錦鯉皰疹病毒Sph基因的試劑中的應(yīng)用。
3. -種檢測錦鯉皰疹病毒Sph基因的試劑盒，其特征在于，其包括如權(quán)利要求1所述的 引物組。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述上游外部引物的濃度為 0· 05 μ mol/L ?0· 5 μ mol/L〇
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述下游外部引物的濃度為 0· 05 μ mol/L ?0· 5 μ mol/L〇
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述上游內(nèi)部引物的濃度為0. 8 μ mol/ L ?2· 0 μ mol/L〇
7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述下游內(nèi)部引物的濃度為0. 8 μ mol/ L ?2· 0 μ mol/L〇
8. 利用如權(quán)利要求1所述的引物組擴(kuò)增錦鯉皰疹病毒Sph基因的方法，其特征在于，包 括： 獲得待測生物樣品，以具有如SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列的上游外部引物、具有如 SEQ ID N0:2所示核苷酸序列的下游外部引物、具有如SEQ ID N0:3所示核苷酸序列的上游 內(nèi)部引物和具有如SEQ ID N0:4所示核苷酸序列的下游內(nèi)部引物擴(kuò)增所述待測生物樣品。
9. 利用如權(quán)利要求1所述的引物組檢測錦鯉皰疹病毒Sph基因的方法，其特征在于，包 括： 獲得待測生物樣品，以具有如SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列的上游外部引物、具有如 SEQ ID N0:2所示核苷酸序列的下游外部引物、具有如SEQ ID N0:3所示核苷酸序列的上游 內(nèi)部引物和具有如SEQ ID N0:4所示核苷酸序列的下游內(nèi)部引物擴(kuò)增所述待測生物樣品， 得擴(kuò)增產(chǎn)物；檢測所述擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)檢測結(jié)果判斷所述待測生物樣品中是否含有錦鯉皰 疹病毒Sph基因。
【文檔編號】C12Q1/70GK104152580SQ201410381598
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月5日
【發(fā)明者】王偉利, 孟慶峰, 魏春艷, 劉韜, 姚貴哲 申請人:中華人民共和國吉林出入境檢驗檢疫局