快速檢測(cè)人冠狀病毒nl63基因的專用引物和試劑盒及其使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和病毒學(xué)領(lǐng)域，更具體涉及一種用于快速檢測(cè)人冠狀病毒 NL63 (Human coronavirus NL63，HCoV-NL63)基因的專用引物和試劑盒及其使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 人冠狀病毒NL63 (Human coronavirus NL63, HCoV-NL63)屬于冠狀病毒科（family Coronaviridae)、冠狀病毒屬（genus Coronavirus)的成員，基因組為單鏈正鏈的RNA，全 長(zhǎng)約27. 5kb，與HCoV-229E同屬于冠狀病毒屬α亞組。HCoV-NL63自2004年首次從荷 蘭一名患有急性呼吸道感染兒童的鼻咽抽吸物中被分離鑒定以來(lái)，其分子流行病學(xué)研宄表 明，該病毒在多個(gè)國(guó)家和地區(qū)流行，呈全球性分布。該病毒是目前已知重要的六種人冠狀病 毒之一，其在急性呼吸道病毒感染中平均檢出率為3. 7%，主要感染嬰幼兒及免疫功能低下 或缺陷的成人。該病毒主要在冬春季流行，既能感染上呼吸道，引起發(fā)熱、咳嗽、喉炎等普通 感冒癥狀，又能感染下呼吸道，引起支氣管炎、肺炎等急性呼吸道感染，尤其與住院患者喉 氣管炎癥狀密切相關(guān)，也有老年人感染后引起死亡的報(bào)道。
[0003] 冠狀病毒廣泛的宿主嗜性、基因組不連續(xù)的復(fù)制轉(zhuǎn)錄機(jī)制以及其RNA依賴的RNA 聚合酶（RNA dependent RNA polymerase, RdRp)復(fù)制的低忠實(shí)性使其在進(jìn)化過(guò)程中極易發(fā) 生堿基的插入、缺失以及基因重組或重配，在此過(guò)程中新型別或新的冠狀病毒不斷出現(xiàn)。早 期診斷對(duì)疾病的預(yù)防和控制至關(guān)重要，而開發(fā)新的快速、靈敏、特異的分子檢測(cè)方法是早期 診斷的關(guān)鍵。目前，HCoV-NL63檢測(cè)主要依賴于傳統(tǒng)的RT-PCR法和熒光定量RT-PCR方法。 盡管上述檢測(cè)方法能夠達(dá)到對(duì)病原體確診的目的，但都或多或少存在著不足，例如檢測(cè)時(shí) 間長(zhǎng)、對(duì)檢測(cè)設(shè)備以及環(huán)境要求較高且容易造成污染。因此，研發(fā)新的簡(jiǎn)便、快速、靈敏的檢 測(cè)方法，對(duì)HC 〇V-NL63的早期診斷并及時(shí)采取預(yù)防和控制措施等具有重要意義，同時(shí)也為 HC〇V-NL63分子流行病學(xué)調(diào)查提供重要技術(shù)支持。
[0004] LAMP (Loop-mediated isothermal amplification)，即環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是近 年發(fā)展出來(lái)的一種新的用于基因檢測(cè)的快速等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，并在病毒及其它病原體的 診斷領(lǐng)域中開始應(yīng)用。它通過(guò)針對(duì)靶基因上的六個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)四種引物，通過(guò)具有鏈置換作 用的DNA聚合酶，在體外等溫條件下短時(shí)間內(nèi)即可擴(kuò)增出高拷貝的目的片段，通過(guò)直接觀 察白色沉淀或加入熒光染料即可達(dá)到快速診斷的目的。該技術(shù)與以往其它病原檢測(cè)方法相 比，具有不依賴于高技術(shù)硬件設(shè)備、但卻有高靈敏性、高特異性、快速、操作簡(jiǎn)便、成本低廉 等優(yōu)點(diǎn)，特別適用于機(jī)場(chǎng)、口岸及硬件條件不佳的基層單位對(duì)病原體進(jìn)行快速診斷。目前， 國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)LAMP方法用于檢測(cè)HCoV-NL63基因的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決上述，本發(fā)明的第一個(gè)目的是針對(duì)HC〇V-NL63核衣殼蛋白 (Nucleocapsid, N)基因設(shè)計(jì)了一組引物，該組引物通過(guò)RT-LAMP在短時(shí)間內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)對(duì) HC〇V-NL63快速確診。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種快速檢測(cè)人冠狀病毒NL63基因的試 劑盒，本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供上述的試劑盒的使用方法。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述的第一個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案：
[0007] 快速檢測(cè)人冠狀病毒（Human coronavirus)NL63基因的專用引物，該專用引物由 六條引物構(gòu)成，分別為F3、FIP和BIP、B3以及LF、LB ;F3和B3為兩條外引物，F(xiàn)IP由Fl和 F2組成和BIP由Bl和B2組成為兩條內(nèi)引物，LF和BF為兩條環(huán)引物；核苷酸序列如下所 示：
[0008] F3 ：CATTTTACATGCCTCTTTTGG
[0009] B3 ：CCTTATGAGGTCCAGTACC
[0010] FIP ：TCCAATAACCAATCTGCTCATCTTTTGATAAGGCACCATATAGGGT
[0011] BIP ：GTTCAAGAGCGTTGGCGTATAAAATGAACTTTAGGAGGCAAAT
[0012] LF ：GGGACAAGATTCCTGGGAATG
[0013] BF ：CAGGGGGCAACGTGTTG〇
[0014] 為了實(shí)現(xiàn)上述的第二個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案：
[0015] 一種快速檢測(cè)人冠狀病毒NL63基因的試劑盒，該試劑盒包括上述的專用引物以 及其他必要的檢測(cè)試劑。
[0016] 作為優(yōu)選，所述的其他必要的檢測(cè)試劑包括反應(yīng)緩沖液、目視熒光試劑和酶溶液。
[0017] 作為優(yōu)選，所述的該試劑盒由以下的成分構(gòu)成：2x反應(yīng)緩沖液12. 5 μ L，六種特異 性引物F3、Β3、FIP、BIP、LF和BF各1 μ L，六種特異性引物的核苷酸序列如權(quán)利要求1所 示，濃度分別為5 μ Μ、5 μ Μ、40 μ Μ、40 μ Μ、20 μ Μ、20 μ M ;目視熒光試劑1 μ L和酶溶液1 μ L。
[0018] 作為優(yōu)選，所述的目視熒光試劑采用鈣黃綠素。
[0019] 為了實(shí)現(xiàn)上述的第三個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案：
[0020] 一種上述的試劑盒的使用方法，該方法包括以下的步驟：
[0021] 1)利用病毒RNA提取試劑盒提取人冠狀病毒NL63基因，將其作為模板，以去離子 水作為陰性對(duì)照；
[0022] 2)將2χ反應(yīng)緩沖液12. 5yL，六種特異性引物F3、B3、FIP、BIP、LF和BF各I yL， 濃度分別為5μΜ、5μΜ、40μΜ、40μΜ、20μΜ、20μΜ ;目視熒光試劑I yL和病毒RNA模板 4. 5 μ L ;混合均勾后置于LA_500Loopamp儀中63°C恒溫反應(yīng)60min，然后80°C 5min以終止 反應(yīng)并觀察反應(yīng)管內(nèi)顏色變化，顏色由淺褐色變?yōu)榫G色，則表示含有人冠狀病毒NL63。
[0023] 本發(fā)明由于采用了上述的技術(shù)方案，針對(duì)人冠狀病毒HCoV_NL63的病毒檢測(cè)主 要通過(guò)RT-PCR法和熒光定量real-time RT-PCR法，且主要集中于有條件的生物實(shí)驗(yàn)室 進(jìn)行操作，不僅對(duì)檢測(cè)的條件要求較高，而且耗時(shí)較長(zhǎng)，也容易造成污染導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果失 敗。本發(fā)明所設(shè)計(jì)的引物組在體外等溫條件下經(jīng)過(guò)RT-LAMP反應(yīng)后短時(shí)間內(nèi)即可達(dá)到對(duì) HCoV-NL63快速確診的目的。檢測(cè)過(guò)程特異、靈敏、快速、簡(jiǎn)便，為HCoV-NL63病毒快速檢測(cè) 提供新的技術(shù)支持。
【附圖說(shuō)明】
[0024] 圖1為RT-LAMP特異性檢測(cè)情況圖；
[0025] 圖中相對(duì)應(yīng)的數(shù)字為1 :陰性對(duì)照（Negative control)，2 :人冠狀病毒 HCoV-NL63, 3:人冠狀病毒HCoV-HKUl, 4:人冠狀病毒HC〇V-〇C43, 5:人冠狀病毒 HCoV-229E，6:諾如病毒Norovirus，7,甲型流感病毒H3N2亞型，8:乙型流感病毒Flu B。
[0026] 圖2為RT-LAMP濁度儀實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)圖；橫坐標(biāo)：時(shí)間（Time)，縱坐標(biāo)：濁度 (Turbidity)，只有加入HCoV-NL63病毒RNA的反應(yīng)管出現(xiàn)濁度反應(yīng)，而加入其它模板均未 出現(xiàn)濁度反應(yīng)。
[0027] 圖3a為RT-LAMP靈敏性檢測(cè)圖一；圖中：濁度儀實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)含有不同濃度 HC〇V-NL63RNA濁度情況，橫坐標(biāo)為反應(yīng)時(shí)間，縱坐標(biāo)為濁度值。
[0028] 圖3b為RT-LAMP靈敏性檢測(cè)圖二；圖中：含有不同濃度人冠狀病毒NL63RNA反應(yīng) 速率閾值>〇. 05即默認(rèn)為陽(yáng)性。
[0029] 圖3c為RT-LAMP靈敏性檢測(cè)圖三；圖中：含有不同濃度人冠狀病毒NL63RNA反應(yīng) 后顏色變化情況
【具體實(shí)施方式】
[0030] 實(shí)施例1專用引物設(shè)計(jì)
[0031] 通過(guò)Clustal