用于檢測(cè)人類紅細(xì)胞Duffy血型基因分型的引物組及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種用于檢測(cè)人類紅細(xì)胞Duffy血型基因分 型的試劑盒（PCR-SSP法)。
【背景技術(shù)】
[0002] Cutbush等在1950年，在一個(gè)多次輸血的血友病病人血清中發(fā)現(xiàn)了一種抗體， 稱抗2Fya。因?yàn)樵摬∪诵誅uffy，故稱為Duffy血型?？?Fya的對(duì)偶抗體抗2Fyb是 Ikin EW等在1951年發(fā)現(xiàn)的。Sanger等在1955年使用抗2Fya、抗2Fyb二種抗血清調(diào)查 黑人，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了 Fy (a2b2)型。為此，假設(shè)存在第三個(gè)等位基因Fy。而后Chown等在 白人中檢出了另一個(gè)等位基因Fyx，該基因只產(chǎn)生少量的Fyb抗原，與某些抗2Fyb血 清只呈弱反應(yīng)。將混合的人紅細(xì)胞注射小白鼠產(chǎn)生與抗2Fy3十分相似的單克隆抗體，稱 為抗 2Fy6 (Nichols et al，1981)。
[0003] Duffy血型在染色體上的座位與先天性白內(nèi)障座位連鎖，也與遺傳性視覺異常 連鎖。從而證明Duffy座位位于第1號(hào)常染色體上（lq22223)。這是定位于常染色體上的 第一個(gè)人類遺傳標(biāo)記。國際輸血協(xié)會(huì)（ISBT) 1995年確定Fy系統(tǒng)編號(hào)為008。本系統(tǒng) 共有6個(gè)抗原，其命名及編號(hào)分別為Fya(OOl)，F(xiàn)yb (002)，F(xiàn)y3 (003)，F(xiàn)y4 (004) ，F(xiàn)y5 (005)及 Fy6 (006)。
[0004] 國內(nèi)學(xué)者調(diào)查發(fā)現(xiàn)中國漢族人絕大多數(shù)是Fya抗原陽性。1988年曾有學(xué)者對(duì)我 國部分少數(shù)民族的Fya抗原攜帶情況進(jìn)行調(diào)查，他們以滿族、藏族、蒙古族、維吾爾族、朝鮮 族、壯族、彝族和侗族為調(diào)查對(duì)象，發(fā)現(xiàn)也是Fya抗原陽性者占絕大多數(shù)。而白種人卻是 Duffy血型系統(tǒng)Fya抗原陰性者較多，因此，2008年在奧運(yùn)期間北京還專門建立了一個(gè)稀有 血型聯(lián)動(dòng)互助機(jī)制，以保證具有稀有血型的外籍人士能獲得合適的急救血源。
[0005] 臨床上，對(duì)于罕見血型新生兒溶血病患兒，換血療法可換出部分血中游離抗體和 致敏紅細(xì)胞，減輕溶血；置換出血中大量膽紅素，預(yù)防膽紅素腦病發(fā)生；同時(shí)可以糾正貧 血，改善攜氧，防止心力衰竭。適當(dāng)?shù)姆椒☉?yīng)采用罕見血型系統(tǒng)與母親同型，AB0系統(tǒng)與患 兒同型的血液，換血量一般為患兒血量的2倍(約150~180ml / kg)，大約可換出85%的 致敏紅細(xì)胞和60%的膽紅素及抗體。楊女士的兒子正是采取了這些措施，所以病情很快好 轉(zhuǎn)。
[0006] 據(jù)了解，產(chǎn)前曾多次多胎妊娠，是引起Duffy (Fya)等新生兒及胎兒血型不合溶血 病的主要原因。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是：克服血清學(xué)檢測(cè)試劑的價(jià)格昂貴，試劑不好購買等不足，提供一 種免疫學(xué)方法能夠簡單方便的檢測(cè)人類紅細(xì)胞Duffy血型基因的引物組。
[0008] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種具有靈敏、特異、經(jīng)濟(jì)、簡便、快速的用于檢測(cè)人 類紅細(xì)胞Duffy血型基因的試劑盒。
[0009] -種用于檢測(cè)人類紅細(xì)胞Duffy血型基因的引物組，其特征是包括Duffy FYA引 物對(duì)，Duffy FYB引物對(duì)及內(nèi)參引物對(duì)。
[0010] 所述Duffy FYA的上下游引物位于Duffy的DNA參考序列的Intronl 437-457和 EX0N2 131-151位置，上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 1、SEQ ID N0. 2所示的核苷 酸序列。
[0011] 所述Duffy FYB的上下游引物位于Duffy的DNA參考序列的Intronl 437-457和 EX0N2 131-151位置，上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 1、SEQ ID N0. 3所示的核苷 酸序列。
[0012] 一種用于檢測(cè)人類紅細(xì)胞Duffy血型基因的試劑盒，其特征是包括包被有Duffy FYA引物對(duì)，Duffy FYB引物對(duì)及內(nèi)參引物對(duì)的引物板和濃縮dNTP-Buffer。
[0013] 所述Duffy FYA的上下游引物位于Duffy的DNA參考序列的Intronl 437-457和 EX0N2 131-151位置，上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 1、SEQ ID N0. 2所示的核苷 酸序列。
[0014] 所述Duffy FYB的上下游引物位于Duffy的DNA參考序列的Intronl 437-457和 EX0N2 131-151位置，上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 1、SEQ ID N0. 3所示的核苷 酸序列。
【附圖說明】
[0015] 圖1為人類紅細(xì)胞Duffy血型基因特異引物孔位圖。
[0016] 圖2為實(shí)驗(yàn)結(jié)果陰陽性判讀圖。
[0017] 圖3人類紅細(xì)胞Duffy血型基因測(cè)定結(jié)果分型讀板紙。
[0018] 圖4人類紅細(xì)胞Duffy血型基因測(cè)定試劑盒電泳結(jié)果膠圖。 具體實(shí)施方案
[0019] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
[0020] 實(shí)施例1。
[0021] 依據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心基因庫（NCBI Gene Bank)公開的Duffy等位基 因序列，設(shè)計(jì)出用于檢測(cè)人類紅細(xì)胞Duffy血型基因的引物組，該引物組包括Duffy FYA引 物對(duì)，Duffy FYB引物對(duì)及內(nèi)參引物對(duì)。
[0022] 實(shí)施例2。
[0023] -種用于檢測(cè)人類紅細(xì)胞Duffy血型基因的試劑盒，包括包被有Duffy FYA引物 對(duì)，Duffy FYB引物對(duì)及內(nèi)參引物對(duì)的引物板和濃縮dNTP-Buffer。
[0024] 用于檢測(cè)人類紅細(xì)胞Duffy血型基因的試劑盒的制備方法是： (1) 依據(jù)人類紅細(xì)胞Duffy血型基因特異引物孔位圖（見圖1)，分別將Duffy FYA引物 對(duì)，Duffy FYB引物對(duì)及內(nèi)參引物對(duì)包被至引物板的相應(yīng)位置上，干燥處理； (2) 依據(jù)配 220mM dNTP、3.5mM Mg2+、500mM KCL、100mM Tris-HCL、1% TritonX-100 制 備出 440 ii 1 濃縮 dNTP-Buffer ; (3) 將包被有引物對(duì)的引物板每人份檢測(cè)包括2孔特異性引物孔，濃縮dNTP-Buffer組 成一種用于檢測(cè)人類紅細(xì)胞Duffy血型基因的試劑盒。
[0025]實(shí)施例3。
[0026] 使用操作流程。
[0027] -、2. 5%瓊脂糖凝膠的準(zhǔn)備。
[0028] 1.將加入2. 5g瓊脂糖加入100ml1XTBE溶液（Tris-硼酸鹽-EDTA溶液)，加熱 直到形成均勻的凝膠溶液。再加入適量電泳染色劑，混合均勻。
[0029] 2.將凝膠槽置于水平位置，向凝膠槽中加入適量凝膠溶液，插入電泳梳。前后水平 移動(dòng)凝膠槽，確保凝膠溶液覆蓋均勻。
[0030] 3.待凝膠完全凝固后，堅(jiān)直拔出電泳梳。
[0031] 二、PCR循環(huán)參數(shù)見表。
[0032] 表1擴(kuò)增參數(shù)特征表。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于檢測(cè)人類紅細(xì)胞Duffy血型基因的引物組，其特征是包括DuffyFYA引物 對(duì)，DuffyFYB引物對(duì)及內(nèi)參引物對(duì)； 所述DuffyFYA的上下游引物位于Duffy的DNA參考序列的Intronl437-457和EX0N2 131-151位置，上、下游引物分別是序列表中SEQIDNO. 1、SEQIDNO. 2所示的核苷酸序列； 所述DuffyFYB的上下游引物位于Duffy的DNA參考序列的Intronl437-457和EX0N2 131-151位置，上、下游引物分別是序列表中SEQIDNO. 1、SEQIDNO. 3所示的核苷酸序列。
2. -種用于檢測(cè)人類紅細(xì)胞Duffy血型基因的試劑盒，其特征是包括包被有DufTy FYA引物對(duì)，DuffyFYB引物對(duì)及內(nèi)參引物對(duì)的引物板和濃縮dNTP-Buffer; 所述DuffyFYA的上下游引物位于Duffy的DNA參考序列的Intronl437-457和EX0N2 131-151位置，上、下游引物分別是序列表中SEQIDNO. 1、SEQIDNO. 2所示的核苷酸序列； 所述DuffyFYB的上下游引物位于Duffy的DNA參考序列的Intronl437-457和EX0N2 131-151位置，上、下游引物分別是序列表中SEQIDNO. 1、SEQIDNO. 3所示的核苷酸序列。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于檢測(cè)人類紅細(xì)胞Duffy血型基因的引物組及試劑盒。用于Duffy血型基因測(cè)定的引物組包括Duffy FYA引物對(duì)，Duffy FYB引物對(duì)及內(nèi)參引物對(duì)。本發(fā)明的試劑盒克服了血清學(xué)方法鑒定Duffy血型的種種限制、是正確判定Duffy血型不可缺少的輔助手段，具有廣泛的應(yīng)用前景和臨床參考價(jià)值。
【IPC分類】C12Q1-68, C12N15-11
【公開號(hào)】CN104694657
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510122397
【發(fā)明人】趙衛(wèi)軍
【申請(qǐng)人】天津市秀鵬生物技術(shù)開發(fā)有限公司
【公開日】2015年6月10日
【申請(qǐng)日】2015年3月20日