檢測ezh2基因的引物和方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬生命科學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及檢測EZH2基因第7、8、17號外顯子 突變率的引物，采用普通PCR技術(shù)和Sanger測序，可用于快速檢測骨髓增生異常綜合征患 者體內(nèi)EZH2基因多態(tài)位點的突變情況。
【背景技術(shù)】
[0002] 骨髓增生異常綜合征（MDS)是一組異質(zhì)性克隆性疾病，其特征是血細(xì)胞減少，髓 系細(xì)胞一系或多系發(fā)育異常，無效造血，骨髓造血功能衰竭以及演變?yōu)榧毙运柘蛋籽〉?風(fēng)險增加，近年來發(fā)現(xiàn)MDS患者存在表觀遺傳調(diào)節(jié)子（epigenetic regulator)基因如EZH2 等基因的突變，提示這些基因的突變可能參與了 MDS的發(fā)生。
[0003] EZH2基因位于人類第7號染色體上，總長76978bp，共20個外顯子。EZH2基因編 碼的蛋白為一組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶。EZH2基因在MDS中突變率達(dá)6%，多亞型均可見，難治性 貧血（RA)是MDS相對早期階段，在這類患者中檢測到EZH2突變，說明該基因異常是疾病發(fā) 生的早期事件。EZH2基因可能參與MDS發(fā)病機(jī)制，Bejar等運(yùn)用基因測序及質(zhì)譜基因分型 法對493例診斷為MDS的患者檢測了 18種基因的點突變，對這些突變進(jìn)行COX多因素回歸 分析發(fā)現(xiàn)，EZH2突變與患者的外周血小板數(shù)減少、血紅蛋白含量降低、骨髓幼稚細(xì)胞數(shù)量增 加有明確聯(lián)系，EZH2突變對整體生存率有預(yù)后不良的趨勢。另外Nikoloski等和Ernst等 通過對EZH2發(fā)生的缺失、錯義及移碼突變的研宄發(fā)現(xiàn)，EZH2突變是髓系惡性血液?。ò?MDS)的不良預(yù)后指標(biāo)。目前導(dǎo)致MDS的具體機(jī)制尚不明確，但對EZH是的突變檢測無疑能 一定程度上提示不良預(yù)后。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種檢測EZH2基因多態(tài)突變熱點的引物，采用PCR技術(shù)，可 用于快速檢測骨髓增生異常綜合征患者體內(nèi)EZH2基因多態(tài)位點的突變情況。所述檢測 EZH2基因多態(tài)熱點突變情況的引物，包括：
[0005] 擴(kuò)增EZH2基因的引物，其堿基序列為：
[0006] EZH2-7F ： TGTAAAACGACGGCCAGTTTTTGTTTTTGACTGACTGGCA
[0007] EZH2-7R ：AACAGCTATGACCATGAAACAAAGTGTAGTGGCTCATCC
[0008] EZH2-8F ： TGTAAAACGACGGCCAGTATTCTTGATAACACCATGCACAA
[0009] EZH2-8R ：AACAGCTATGACCATGCAGAGCAATCCTCAAGCAACA
[0010] EZH2-17F ： TGTAAAACGACGGCCAGTGGTCCAGTATTCACTCTGTGCG
[0011] EZH2-17R :AACAGCTATGACCATGCACTGACCTCTACCCTCGTTTC。
[0012] 進(jìn)一步地，還包括測序引物，其堿基序列為：
[0013] 檢測EZH2基因的測序引物喊基序列為：
[0014] CQ F ：TGTAAAACGACGGCCAGT
[0015] CQ R:AACAGCTATGACCATG。
[0016] 進(jìn)一步地，引物序列EZH2-7F和EZH2-7R是擴(kuò)增EZH2基因第7外顯子序列的引物， 引物序列EZH2-8F和EZH2-8R是擴(kuò)增EZH2基因第8外顯子序列的引物，引物序列EZH2-17F 和EZH2-17R是擴(kuò)增EZH2基因第17外顯子序列的引物。
[0017] 本發(fā)明還提供了檢測EZH2基因第7、8、17號外顯子突變情況的方法，包括以下步 驟：
[0018] 1.抽提血液/中的DNA ;
[0019] 2.用PCR擴(kuò)增步驟1中提取的DNA ;
[0020] 3.對步驟2中的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序；
[0021] 4.對測序結(jié)果進(jìn)行判斷，確定EZH2基因是否發(fā)生突變；
[0022] 其中PCR擴(kuò)增引物為：
[0023] 擴(kuò)增EZH2基因的引物，其堿基序列為：
[0024] EZH2-7F ： TGTAAAACGACGGCCAGTTTTTGTTTTTGACTGACTGGCA
[0025] EZH2-7R ：AACAGCTATGACCATGAAACAAAGTGTAGTGGCTCATCC
[0026] EZH2-8F ： TGTAAAACGACGGCCAGTATTCTTGATAACACCATGCACAA
[0027] EZH2-8R ：AACAGCTATGACCATGCAGAGCAATCCTCAAGCAACA
[0028] EZH2-17F ： TGTAAAACGACGGCCAGTGGTCCAGTATTCACTCTGTGCG
[0029] EZH2-17R :AACAGCTATGACCATGCACTGACCTCTACCCTCGTTTC。
[0030] 進(jìn)一步地，測序引物喊基序列為：
[0031] 檢測EZH2基因的測序引物喊基序列為：
[0032] CQ F ：TGTAAAACGACGGCCAGT
[0033] CQ R:AACAGCTATGACCATG。
[0034] 本發(fā)明還提供了一種檢測EZH2基因多態(tài)突變位點的試劑盒，包括：
[0035] ⑴血液DNA抽提試劑；
[0036] (ii)檢測體系PCR擴(kuò)增反應(yīng)液；
[0037] (iii)測序體系試劑；
[0038] 其中PCR擴(kuò)增反應(yīng)液引物為：
[0039] ( i )擴(kuò)增EZH2基因的引物，其堿基序列為：
[0040] EZH2-7F ： TGTAAAACGACGGCCAGTTTTTGTTTTTGACTGACTGGCA
[0041] EZH2-7R ：AACAGCTATGACCATGAAACAAAGTGTAGTGGCTCATCC
[0042] EZH2-8F ： TGTAAAACGACGGCCAGTATTCTTGATAACACCATGCACAA
[0043] EZH2-8R ：AACAGCTATGACCATGCAGAGCAATCCTCAAGCAACA
[0044] EZH2-17F ： TGTAAAACGACGGCCAGTGGTCCAGTATTCACTCTGTGCG
[0045] EZH2-17R :AACAGCTATGACCATGCACTGACCTCTACCCTCGTTTC。
[0046] 進(jìn)一步地，測序引物喊基序列為：
[0047] CQ F ：TGTAAAACGACGGCCAGT
[0048] CQ R:AACAGCTATGACCATG。
[0049] 有益效果：本發(fā)明設(shè)計了擴(kuò)增EZH2第7、8、17號外顯子序列的引物。采用PCR技 術(shù)，構(gòu)建了穩(wěn)定的擴(kuò)增體系。通過調(diào)整引物濃度、退火溫度等反應(yīng)條件，可使擴(kuò)增效率達(dá)到 最佳。EZH2基因的突變類型不定，因此本發(fā)明所述引物既能將所述EZH2全部7、8、17外顯 子序列都擴(kuò)增出來，也保證無論外顯子的何處位置發(fā)生突變，都不會出現(xiàn)漏檢的情況。相比 較熒光定量PCR法降低了檢測的成本和難度。熒光定量PCR法要針對不同的突變類型設(shè)計 多個探針，成本高，檢測難度大。
【附圖說明】
[0050] 圖1為EZH2基因在染色體上定位圖。
[0051] 圖2為EZH2-7F/R的電泳圖，M為Marker DL 2000,1-24為送檢的MDS患者血液 樣本1-24號，如圖2所示，引物EZH2-7F/R擴(kuò)增有效，且條帶單一。
[0052] 圖3為EZH2-8F/R的電泳圖，M為Marker DL 2000,1-24為送檢的MDS患者血液 樣本1-24號，如圖3所示，引物EZH2-8F/R擴(kuò)增有效，且條帶單一。
[0053] 圖4為EZH2-17F/R的電泳圖，M為Marker DL 2000,1-24為送檢的MDS患者血液 樣本1-24號，如圖4所示，引物EZH2-17F/R擴(kuò)增有效，且條帶單一。
[0054] 圖5、6、7分別為樣本1、2、3的EZH2第7、8、17號外顯子野生型測序截圖。
【具體實施方式】
[0055] 下面結(jié)合具體實施例和附圖，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)注意的是，實施例中未說明 的常規(guī)條件和方法，通常按照所屬領(lǐng)域?qū)嶒炄藛T常規(guī)采用方法：譬如，奧斯柏和金斯頓主編 的《精編分子生物學(xué)實驗指南》第四版，或者按照制造廠商所建議