一種抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一種抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型及其應(yīng)用，屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】?？鼓[瘤藥物篩選細(xì)胞模型是從膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中分離的、定點(diǎn)整合了報(bào)告基因的腫瘤干細(xì)胞，含有A－B－C－D結(jié)構(gòu)的DNA構(gòu)建物，其中：A，D為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞分子標(biāo)記基因啟動子及下游序列，B為報(bào)告基因序列，C為嘌呤霉素抗性基因puro序列；膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干胞分子標(biāo)記基因是包括Nestin基因；報(bào)告基因包括綠色熒光蛋白基因GFP、或紅色熒光蛋白基因RFP、及熒光素酶報(bào)告基因luciferase。該抗腫瘤藥物的細(xì)胞模型用于篩選細(xì)胞毒性和誘導(dǎo)分化的物質(zhì)。有益效果在于：1、避免了傳統(tǒng)的細(xì)胞轉(zhuǎn)基因方法的不利影響，檢測結(jié)果將能正確反映藥物作用效果。2、獲得抗腫瘤干細(xì)胞的化合物。
【專利說明】一種抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
:
[0001]本發(fā)明涉及一種抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型及其應(yīng)用，屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
:
[0002]癌癥干細(xì)胞具有與組織干細(xì)胞類似的分子標(biāo)記、自我更新和分化功能，在移植后能重現(xiàn)原癌癥的組織學(xué)、分子生物學(xué)等特征，耐常規(guī)放療和化療，是癌癥發(fā)生、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的主要原因，因此癌癥干細(xì)胞正成為癌癥研究的重要領(lǐng)域和癌癥治療的主要靶標(biāo)。但目前的抗腫瘤藥物主要用癌癥細(xì)胞系篩選獲得，缺乏針對腫瘤干細(xì)胞的藥物，也缺乏良好的基于腫瘤干細(xì)胞的藥物篩選模型。
[0003]膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是最常見的腦腫瘤，惡性程度極高。隨著癌癥研究的進(jìn)展，大部分癌癥的治愈率和生存期都獲得了明顯改善，但膠質(zhì)母細(xì)胞瘤病人的生存期在過去幾十年中沒有顯著改觀，平均僅約I年，迫切需要研發(fā)新的治療藥物。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞是最早確定的實(shí)體瘤干細(xì)胞之一，也是為數(shù)不多的在體外能穩(wěn)定長期培養(yǎng)的腫瘤干細(xì)胞之一，為利用膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞進(jìn)行藥物篩選奠定了基礎(chǔ)。
[0004]藥物篩選模型是尋找和發(fā)現(xiàn)新藥物的重要條件之一。目前抗腫瘤藥物的篩選方法主要在包括體內(nèi)和體外篩選方法，體內(nèi)篩選方法成本高，操作難度大，不利于高通量的藥物篩選；體外篩選方法主要是在分子和細(xì)胞水平上實(shí)現(xiàn)的，具有材料用量少，作用機(jī)制明確，易用于大規(guī)模篩選等優(yōu)點(diǎn)，是藥物篩選的主要方法。
[0005]藥物篩選細(xì)胞模型常用報(bào)告基因隨機(jī)插入建立穩(wěn)定細(xì)胞株，控制外源標(biāo)記基因表達(dá)的啟動子活性常受到整合位點(diǎn)附件基因組DNA的影響，因此標(biāo)記基因的變化并不能完全反映內(nèi)源基因的變化，影響藥效的評價(jià)。
[0006]綜上所述，有必要建立良好的基于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞的抗腫瘤藥物篩選模型。
【發(fā)明內(nèi)容】
:
[0007]本發(fā)明針對現(xiàn)有抗腫瘤藥物篩選技術(shù)存在的不足，提供一種簡便、快速、直接、經(jīng)濟(jì)的抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型及其建立方法和應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明的抗腫瘤藥物的細(xì)胞模型，是從膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中分離的，定點(diǎn)整合了報(bào)告基因的腫瘤干細(xì)胞，含有A — B-C-D結(jié)構(gòu)的DNA構(gòu)建物，其中:
[0009]A，D為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞分子標(biāo)記基因啟動子及下游序列，B為報(bào)告基因序列，C為嘌呤霉素抗性基因puro序列；
[0010]膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干胞分子標(biāo)記基因是但不限于Nestin基因；報(bào)告基因?yàn)榈幌抻诰G色熒光蛋白基因EGFP，或YFP、RFP熒光蛋白，或熒光素酶luciferase。
[0011]本發(fā)明的抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型的構(gòu)建方法，運(yùn)用同源重組技術(shù)，將報(bào)告基因綠色熒光蛋白EGFP定點(diǎn)整合至腫瘤干細(xì)胞分子標(biāo)記基因Nestin啟動子下游，建立藥物的細(xì)胞毒性和分化誘導(dǎo)篩選平臺。
[0012]本發(fā)明的抗腫瘤藥物的細(xì)胞模型用于篩選抗腫瘤干細(xì)胞的細(xì)胞毒性和誘導(dǎo)分化的物質(zhì)(如小分子化合物、多肽)。即:
[0013]將候選物質(zhì)加入上述的培養(yǎng)細(xì)胞中，用高內(nèi)涵設(shè)備或熒光顯微鏡檢測藥物組中報(bào)告基因的表達(dá)，并與對照組比較，所述對照組是不添加候選物質(zhì)的上述細(xì)胞。如果測試組中報(bào)告基因表達(dá)細(xì)胞數(shù)低于對照組，就表明候選物質(zhì)能夠抑制腫瘤干細(xì)胞增殖或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；如果單個(gè)細(xì)胞中報(bào)告基因表達(dá)水平降低則說明候選物質(zhì)能夠誘導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞分化。
[0014]本發(fā)明的抗腫瘤藥物的細(xì)胞模型還能對篩選出的抗腫瘤干細(xì)胞物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的細(xì)胞/動物實(shí)驗(yàn)，以確定這些物質(zhì)在抗腫瘤藥物研發(fā)中的前景。
[0015]本發(fā)明的有益效果在于:
[0016]1、避免了多拷貝轉(zhuǎn)基因所致的基因組不穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)基因插入會破壞內(nèi)源基因、轉(zhuǎn)基因所用啟動子受插入位點(diǎn)兩側(cè)序列影響不能完全反映啟動子活性變化的不利影響，檢測結(jié)果將能正確反映藥物作用效果。
[0017]2、具有簡便、快速、直接、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn)。

【專利附圖】

【附圖說明】
:
[0018]圖1是將EGFP定點(diǎn)整合至nestin啟動子下游的打祀示意圖。
[0019]圖2-a和圖2-b顯示腺病毒感染腫瘤干細(xì)胞后熒光觀察結(jié)果。
[0020]圖3-a和圖3-b顯示腺病毒感染腫瘤干細(xì)胞后PCR檢測陽性克隆細(xì)胞。

【具體實(shí)施方式】
:
[0021]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下列實(shí)施例中未注明具體的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(samtoook，J.)中所述的方法，或按照實(shí)驗(yàn)所用試劑或儀器說明書建議方法。
[0022]一、構(gòu)建物及載體
[0023]所述構(gòu)建物從5’端到3’端依次含有nestin啟動子序列，報(bào)告基因序列，內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列(IRES)或者自剪切2A肽序列，嘌呤霉素抗性基因序列(puro)，轉(zhuǎn)錄終止信號序列(PolyA)和nestin啟動子下游序列。
[0024]所述的報(bào)告基因包括:綠色熒光蛋白(GFP)基因、紅色熒光蛋白(RFP)基因或者熒光素酶基因(luciferase)。GFP作為一種標(biāo)記蛋白，其內(nèi)源熒光基團(tuán)在受到藍(lán)光激發(fā)時(shí)能高效發(fā)射清晰可見的綠光。所述的GFP還包括在野生型GFP基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)的蛋白，例如進(jìn)行基因優(yōu)化(如去除隱蔽性內(nèi)含子)；或通過氨基酸替換提高GFP脫輔基蛋白在高溫條件下的正確折疊，以及改變GFP光譜特性。在本發(fā)明中，所述的GFP是增強(qiáng)型的綠色熒光蛋白(EGFP)，EGFP為對綠色熒光蛋白進(jìn)行改進(jìn)后的蛋白，與GFP具有很高的同源性，在表達(dá)后發(fā)光的效果更為理想。
[0025]紅色熒光蛋白(RFP)是從珊瑚蟲中克隆的一種與綠色熒光蛋白(GFP)同源的熒光蛋白，在紫外光的照射下會發(fā)出紅色的熒光。與GFP相比，RFP具有激發(fā)和發(fā)射波長更長，細(xì)胞內(nèi)成像背景更低的優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)也有寡聚化、成熟緩慢的限制。所述的RFP還包括在野生型RFP基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)的蛋白，例如dsRed，mKate2。
[0026]所述的“熒光素酶報(bào)告基因”系統(tǒng)是以熒光素(Iuciferin)為底物來檢測螢火蟲熒光素酶(fireflyluciferase)活性的一種報(bào)告系統(tǒng)。它具有以下優(yōu)點(diǎn):1.內(nèi)源性低，哺乳動物無內(nèi)源性的熒光素酶表達(dá)；2.靈敏度高，熒光素酶介導(dǎo)的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)效率高，發(fā)光強(qiáng)，易于檢測；3.檢測范圍廣，幅度跨越大于107 ；4.經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，并且重復(fù)性好。
[0027]所述的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)是一段核酸序列，當(dāng)這段核酸序列被翻譯為RNA時(shí),能折疊成類似于起始tRNA的結(jié)構(gòu)，從而介導(dǎo)核糖體與RNA結(jié)合,起始下游蛋白質(zhì)序列的翻譯。在本構(gòu)建物中IRES位于綠色熒光蛋白序列和嘌呤霉素抗性基因序列之間，綠色熒光蛋白靠5’帽子結(jié)構(gòu)起始翻譯，而嘌呤霉素則依靠IRES起始翻譯。因此嘌呤霉素和EGFP的表達(dá)受同一啟動子驅(qū)動。
[0028]所述的自剪切2A肽源于口蹄疫病毒，是近年使用較多的一種構(gòu)建多基因載體的工具。研究指出，通過串聯(lián)方式將2A肽和基因置于同一個(gè)開放讀碼框中能夠?qū)崿F(xiàn)在同一啟動子的調(diào)控下表達(dá)多個(gè)基因。
[0029]所述的“啟動子”是指一種核酸序列，其通常存在于目的基因編碼序列的上游，能夠引導(dǎo)核酸序列轉(zhuǎn)錄為mRNA.本發(fā)明所述的nestin啟動子序列為腫瘤干細(xì)胞/神經(jīng)干細(xì)胞內(nèi)特異性啟動子，因此由其驅(qū)動表達(dá)的EGFP及其puix)僅在腫瘤干細(xì)胞/神經(jīng)干細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。
[0030]所述的“轉(zhuǎn)錄終止信號序列”是指在結(jié)構(gòu)基因DNA分子中用于終止轉(zhuǎn)錄作用的元件，又稱終止子；終止子有一段GC富集區(qū)，隨后又有一段AT富集區(qū)。在GC富集區(qū)內(nèi)有一段反向重復(fù)序列，以致轉(zhuǎn)錄作用生成的mRNA在其相應(yīng)序列中有互補(bǔ)形成的發(fā)卡結(jié)構(gòu)。
[0031]作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的報(bào)告基因是EGFP，在不裂解細(xì)胞的情況下，能通過顯微鏡直接觀察到細(xì)胞內(nèi)EGFP的表達(dá)情況，從而判斷細(xì)胞存活、生長的變化以及細(xì)胞分化情況。
[0032]作為本發(fā)明的特別優(yōu)選的方式，所述的構(gòu)建物中，在報(bào)告基因的下游，還包括嘌呤霉素抗性基因Puro序列。當(dāng)外源基因進(jìn)入細(xì)胞后，發(fā)生同源重組的概率非常小，故常常運(yùn)用抗生素選擇標(biāo)記來篩選整合了目的基因而帶有抗性的細(xì)胞。Puro是藥物篩選中運(yùn)用非常廣泛的抗生素之一，它對于上下游元件的影響小，能良好地用于細(xì)胞株的篩選和鑒定。
[0033]在所述的構(gòu)建物中，各元件之間以可操作的方式進(jìn)行連接，各種功能性的操作性連接方式是生物領(lǐng)域常見的，為大眾所熟知的。通常，各元件之間具有O-1OOObp的間隔序列。
[0034]本發(fā)明還提供了一種載體，所述的載體含有前面所述的構(gòu)建物。所述的載體之一是腺病毒載體。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的腺病毒載體是PAd-BLOCK系列載體，更優(yōu)選為pAd-BLOCK-1T-DEST載體。在含有所述構(gòu)建物的pAd-BLOCK-1T_DEST載體包裝為腺病毒后，對腫瘤干細(xì)胞感染率非常高，達(dá)100%。
[0035]所述的載體中還包含有一些對于EGFP表達(dá)以及對腫瘤干細(xì)胞生長沒有負(fù)面左右的其他元件。
[0036]二、細(xì)胞模型及用途
[0037]所述細(xì)胞為體外培養(yǎng)細(xì)胞為哺乳類細(xì)胞，其為從人膠質(zhì)瘤中分離腫瘤干細(xì)胞；并且所述細(xì)胞基因組內(nèi)定點(diǎn)整合了前面所述的構(gòu)建物。所述的細(xì)胞內(nèi)的報(bào)告基因的表達(dá)受nestin啟動子驅(qū)動，當(dāng)抗腫瘤藥物處理所述細(xì)胞后，報(bào)告基因的表達(dá)情況直接反映細(xì)胞存活、生長的變化以及細(xì)胞分化情況。
[0038]作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的細(xì)胞為人膠質(zhì)瘤腫瘤干細(xì)胞。Nestin蛋白能在人膠質(zhì)瘤干細(xì)胞內(nèi)特異性表達(dá)，因此受nestin啟動子驅(qū)動的報(bào)告基因也在人膠質(zhì)瘤干細(xì)胞內(nèi)特異性表達(dá)。
[0039]所述的細(xì)胞帶有抗生素抗性，所述的抗生素抗性為嘌呤霉素puro抗性，能良好地用于同源重組陽性細(xì)胞的篩選和鑒定。
[0040]本發(fā)明的細(xì)胞作為細(xì)胞模型，用于篩選對腫瘤干細(xì)胞有毒性的藥物，也用于篩選能引起腫瘤干細(xì)胞分化的藥物。所述的藥物包括天然藥物、人工合成藥物以及其他用于腫瘤治療的純凈物和混合物。
[0041]本發(fā)明的構(gòu)建報(bào)告基因細(xì)胞模型經(jīng)由下步驟得到；
[0042](I)將報(bào)告基因序列連接到pENTR-u6載體上，獲得包含報(bào)告基因序列的LR重組入門載體；
[0043](2)將IRES序列或者2A肽序列連接到(I)獲得的載體上，IRES或者2A肽序列位于報(bào)告基因終止密碼子之后；
[0044](3)將嘌呤霉素抗性基因pirn)連接到⑵獲得的載體上，pirn)基因序列位于IRES或者2A肽序列序列下游，與報(bào)告基因一同受nestin啟動子驅(qū)動，用于同源重組陽性細(xì)胞的篩選；
[0045](4)將nestin啟動子序列連接到(3)獲得的載體上,nestin啟動子序列位于報(bào)告基因上游，作為同源重組時(shí)的所需的5’同源臂；
[0046](5)將nestin啟動子下游序列連接到⑷獲得的載體上,nestin啟動子下游序列位于puro基因下游，作為同源重組時(shí)所需的3 ‘同源臂；
[0047](6)將(5)得到的gateway入門載體與腺病毒基因組載體pAd-BLOCK-1T-DEST進(jìn)行g(shù)ateway克隆的LR反應(yīng)，獲得包含所述構(gòu)建物的pAd-BLOCK-1T-DEST腺病毒載體；
[0048](7)設(shè)計(jì)針對nestin第一外顯子的轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(TALEN),驗(yàn)證其效率之后，克隆至gateway入門載體pENTR_u6中；
[0049](8)將(7)所獲得的gateway入門載體與腺病毒基因組載體pAd-BLOCK-1T-DEST進(jìn)行g(shù)ateway克隆的LR反應(yīng)，獲得包含talen的pAd-BLOCK-1T-DEST腺病毒載體；
[0050](9)將(6)和⑶獲得的腺病毒載體線性化后分別轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞，包裝腺病毒；
[0051](10)將(9)獲得的腺病毒共同感染人膠質(zhì)瘤腫瘤干細(xì)胞，培養(yǎng)感染后的細(xì)胞，puro篩選3周后，在顯微鏡下挑取帶報(bào)告基因的單克隆，培養(yǎng)成細(xì)胞系。
[0052]篩選方法(用途):
[0053]本發(fā)明所述的細(xì)胞為人腫瘤干細(xì)胞，篩選針對腫瘤干細(xì)胞的藥物，藥效是細(xì)胞毒性活性或者誘導(dǎo)細(xì)胞分化。
[0054]本發(fā)明提供了一種基于腫瘤干細(xì)胞的藥物毒性篩選模型。具體方法為:將待篩選的藥物加入到所述細(xì)胞模型中，同時(shí)設(shè)置未加藥物的細(xì)胞模型為對照。用高內(nèi)涵設(shè)備或熒光顯微鏡的設(shè)備檢測報(bào)告基因表達(dá)情況。檢測測試組中報(bào)告基因的表達(dá)，并與對照組比較；若該藥物具有細(xì)胞毒性，則會引起細(xì)胞死亡、細(xì)胞增殖減少，報(bào)告基因陽性細(xì)胞數(shù)將減少。
[0055]同時(shí)，本發(fā)明還提供了一種基于腫瘤干細(xì)胞的藥物分化篩選模型。具體實(shí)施方法為:將待篩選的藥物加入到所述細(xì)胞模型中，同時(shí)設(shè)置未加藥物的細(xì)胞模型為對照。用高內(nèi)涵設(shè)備或熒光顯微鏡的設(shè)備檢測報(bào)告基因表達(dá)情況。若測試藥物誘導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞分化，則單個(gè)細(xì)胞的報(bào)告基因表達(dá)強(qiáng)度會減弱。
[0056]實(shí)施例1:含報(bào)告基因腺病毒載體的構(gòu)建
[0057]1.以pRL-CMV質(zhì)粒為模版，用PCR擴(kuò)增得到polyA元件片段，并在引物兩端添加限制性內(nèi)切酶Nhel，Sail位點(diǎn)。用限制性內(nèi)切酶XbaI和SalI酶切g(shù)ateway入門載體PENTR-U6，純化回收后與PCR擴(kuò)增的polyA片段連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，12h后挑取菌落，抽提質(zhì)粒，并進(jìn)行酶切鑒定。經(jīng)鑒定連接成功的質(zhì)粒記為pENTR-polyA.
[0058]polyA引物序列:
[0059]seql:
[0060]ACGTGTCGACAGTTCTAGATCAAGATCTATAGCGGCCGCTTCGAGCAGA
[0061]Seq2:
[0062]TGTCATGCTAGCACTACTAGTATCGGATCCTTATCGATTTTAC
[0063]2.以以腫瘤干細(xì)胞基因組為模版，用PCR方法擴(kuò)增nestin啟動子下游序列，得到同源重組所需的下游同源臂3’ arm，并在引物兩側(cè)添加限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)BamHI和spel。用限制性內(nèi)切酶BamHI和spel雙酶切pENTR-polyA載體，純化回收后與PCR擴(kuò)增的nestin-3’arm片段連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a, 12h后挑取菌落,抽提質(zhì)粒,并進(jìn)行酶切鑒定。經(jīng)鑒定連接成功的質(zhì)粒記為pENTR-polyA-3’ arm.
[0064]nestin-3’ arm 片段引物序列:
[0065]seq3 =ATCTggatccGACGAGCAGGATGGAGGGCT
[0066]Seq4:ATCTactagtGCA GAGTTGCCATCACCTACACC
[0067]3.以Qrich2-shCTR載體為模版，用PCR方法擴(kuò)增得到EGFP_2A-puro片段，并在引物兩側(cè)添加限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)XbaI和Notl。以腫瘤干細(xì)胞基因組為模版，用PCR方法擴(kuò)增nestin啟動子序列，得到同源重組所需的上游同源臂5’ arm，并在引物兩側(cè)添加限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)SalI和Nhel。用限制性內(nèi)切酶SalI和NotI雙酶切ENTR-polyA_3’arm載體，純化回收后與PCR擴(kuò)增的nestin-5’ arm和EGFP_2A-puro三片段連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，12h后挑取菌落，抽提質(zhì)粒，并進(jìn)行酶切鑒定。經(jīng)鑒定連接成功的質(zhì)粒記為pENTR-nes-EGFP-pur0.(質(zhì)粒不意圖見圖1)
[0068]4.將構(gòu)建的入門載體pENTR-nes-EGFP-puro與腺病毒載體pAd-BLOCK-1T-DEST進(jìn)行g(shù)ateway的LR反應(yīng)，得到含所述構(gòu)建物的腺病毒載體pAd/BLOCK-1T-DEST-nes-EGFP-puro
[0069]nestin-5’ arm 片段引物序列:
[0070]seq5:tgacgtcgacACCTGAAGTCAGGAGTTCAAACC[0071 ] seq6:tctagctagcTGACCCACTGAGGATGGACA
[0072]EGFP-2A_puro 片段引物序列:
[0073]Seq7:GCTATCTAGAGGTTTAGTGAACCGTCAGG
[0074]Seq8:GTAAGCGGCCGCTCCGGAACGCGTTCAGGCA
[0075]實(shí)施例2:含所述構(gòu)建物的腺病毒包裝
[0076]1.用 PacI 單酶切腺病毒載體 pAd/BLOCK-1T-DEST-nes-EGFP-puro，線性化載體，通過酚氯仿抽提，異丙醇沉淀，回收線性化片段
[0077]2.培養(yǎng)293A細(xì)胞于3.5cm平板，待細(xì)胞匯合度生長至80%，轉(zhuǎn)染線性化質(zhì)粒pAd/BLOCK-1T-DEST-nes-EGFP-puro。所用試劑為 Lipofectamine2000 (invitrogen)
[0078]3.轉(zhuǎn)染10-15d后，待出現(xiàn)大面積噬菌斑時(shí)，收集上清和細(xì)胞；在37度水浴和_80°C反復(fù)凍融3次，使細(xì)胞裂解，釋放出病毒顆粒。
[0079]4.將收集的病毒顆粒再次感染293A細(xì)胞，擴(kuò)增腺病毒
[0080]5.感染7d后，再次收集上清和細(xì)胞，如步驟3的方法裂解。
[0081]6.用 b1miga 腺病毒純化試劑盒 Adenovirus purificat1n miniprep Kit 純化濃縮步驟5所收集病毒 。
[0082]7.提取病毒基因組，Realtime PCR檢測腺病毒滴度
[0083]鑒定病毒所用引物:
[0084]Seq9:GCCATTACCTTTGACTCTTC TGT
[0085]SeqlO:CCTGTTGGTAG TCCTTGTATTTAGTATC
[0086]實(shí)施例3:利用腺病毒建立篩藥細(xì)胞系
[0087]設(shè)計(jì)針對nestin第一外顯子的talen,并將talen序列克隆至腺病毒載體pAd-BLOCK-1T-DEST中，然后如實(shí)施例2所述方法，將這兩個(gè)載體包裝為腺病毒，記為pAd-BLOCK-nestalenL 和 pAd-BLOCK-nestalenR。
[0088]pAd-BLOCK-nestalenL、pAd-BLOCK-nestalenR 和 pAd/BLOCK-1T-DEST-nes-EGFP-puro三個(gè)腺病毒按照1:1:1混合后，感染從人膠質(zhì)瘤中分離的腫瘤干細(xì)胞株。4天后見綠色熒光表達(dá)(圖2-a和圖2-b)。利用有限稀釋法分離單細(xì)胞，并加入lug/ml的嘌呤霉素(puro)篩選。培養(yǎng)20天后提取細(xì)胞基因組，利用跨同源臂的引物PCR鑒定陽性克隆(圖3-a和圖3-b)。將鑒定的陽性克隆細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)并凍存。
[0089]跨5’同源臂鑒定引物序列:
[0090]Seql3:CCACCCTACCTCTTTAGGGGA
[0091]Seql4:CTGCGGACCAGTTATCATCCG
[0092]跨3’同源臂鑒定引物序列:
[0093]Seql5:AGAAGAACGGCATCAAGGTGA
[0094]Seql6:TCCTTGGTCTCAGCCATTTCTA。
【權(quán)利要求】
1.一種抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型，其特征在于該抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型是從膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中分離的、定點(diǎn)整合了報(bào)告基因的腫瘤干細(xì)胞，含有A — B-C 一 D結(jié)構(gòu)的DNA構(gòu)建物，其中: A，D為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞分子標(biāo)記基因啟動子及下游序列，B為報(bào)告基因序列，C為嘌呤霉素抗性基因puro序列； 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干胞分子標(biāo)記基因包括Nestin基因；報(bào)告基因包括綠色熒光蛋白基因GFP、或紅色熒光蛋白基因RFP、或者熒光素酶報(bào)告基因luciferase。
2.權(quán)利要求1所述的抗腫瘤藥物的細(xì)胞模型用于篩選抗腫瘤干細(xì)胞的細(xì)胞毒性和誘導(dǎo)分化 的物質(zhì)。
【文檔編號】C12Q1/02GK104130977SQ201410381401
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年8月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月5日
【發(fā)明者】趙旭東, 楊東, 代智, 王路 申請人:中國科學(xué)院昆明動物研究所