肺動脈高壓治療藥物的干細胞篩選模型及應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于應用干細胞技術建立肺動脈高壓新型治療藥物篩選方法的技術鄰域。
【背景技術】
[0002] 肺動脈高壓（PAH)是由于肺小動脈原發(fā)病變而導致的肺動脈阻力增加，是一種少 發(fā)但高致死率的病癥。肺血管阻力進行性升高，最終導致患者右心衰竭而死亡。其主要病 理特征是嚴重肺血管重構，包括內皮功能紊亂和平滑肌細胞增殖所致的小肺動脈內膜纖維 化，中膜肥厚，外膜增生，叢樣病變及動脈管腔閉塞。在過去20年里包括前列環(huán)素和其類似 物，內皮素受體拮抗劑，磷酸二酯酶抑制劑在內的幾類新藥已經批準上市，但3年死亡率仍 然在40%左右。并且這些治療方案主要針對減輕血管緊張而達到治療效果。因此我們迫切 需要研發(fā)改善血管重構，延緩肺動脈高壓病程，提高患者生存率為目的的藥物。
[0003] 優(yōu)化設計PAH理性治療方案應基于對此疾病細胞分子機理的透徹認識。研究表 明肺動脈高壓中存在著BMP二型受體（BMPRII)表達缺陷和Id基因表達下調[YangJat alCirculationReserch2008,102:1212-1221]。恢復生理水平BMP信號，尤其是血管細 胞中Id基因的表達是改善血管重構的肺動脈高壓藥物的新靶點之一[YangJatalAmJ PhysiolLungCellMolPhysiol2013 15:305(4):L312-21]〇
[0004] 骨形成蛋白BMPs是TGFP家族中的一類蛋白，它們在早期發(fā)育和分化，包括肺 的器官形成以及血管生成中起著重要作用。在BMP配體包括BMP2,BMP4,BMP6,BMP9和 BMP10存在的情況下，具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的BMPRII，通過一型受體，磷酸化受體 調節(jié)Smad蛋白（R-Smad)。在BMP/Smad誘導轉錄的效應基因中，目前研究最清楚的是DNA 結合蛋白抑制因子家族成員（inhibitorofDNAbindingprotein，Id)。Id蛋白屬于螺 旋-環(huán)-螺旋（HLH)轉錄因子，Id蛋白競爭性結合具基本螺旋-環(huán)-螺旋結構的轉錄因 子（bHLH)而抑制其轉錄活性，Id在細胞生長、衰老及分化中均發(fā)揮作用。實驗結果明顯提 示BMPR-II受體以及其下游Id基因表達下降在肺動脈高壓發(fā)生中起主導作用。提高BMP 配體濃度是一種有效的提高下游Id表達水平的方法。BMP2表達上調劑初篩模型-即包含 小鼠bmp2啟動子和熒光素酶報告基因的報告質粒穩(wěn)定轉染得到的小鼠顱骨細胞MC3T3-E1 是第一發(fā)明人2002年首次在國內建立的，并在抗骨質疏松藥物或其先導化合物的發(fā)現中 應用至今。經過十余年的BMP2上調劑藥物篩選工作，得到了包括2-乙酰苯并噻吩及其類 似物，并開展了抗骨質疏松活性方面的研究。最近BMP信號上調劑也被認為是治療肺動脈 高壓的一個有前景的藥革El，EddaSpiekerkoetter等人[EddaSpiekerkoetteratalThe JournalofClinicalInvestigation2013, 123 (8): 3600-3612]通過C2C12-BRE細胞株進 行了對BMP信號上調劑的篩選，發(fā)現FK506有較好的改善和逆轉肺動脈高壓的效果，但由于 其毒副作用未進入臨床。C2C12-BRE細胞株是通過將Id的啟動子區(qū)上的BMP效應元件（BMP ResponsiveElement，BRE)與螢火蟲熒光素酶報告基因相連，穩(wěn)定轉染C2C12細胞得到的 [KatagiriTatalGenesCells2002 7:949-960]，通過生物發(fā)光檢測可檢出pm級BMP9 低劑量刺激后引起的熒光素酶活性。本發(fā)明首先采用BMP2上調劑模型，發(fā)現獲得的BMP2 表達上調劑可提高BMP信號并應用于肺動脈高壓藥物初篩，繼而利用具有心血管分化能力 的干細胞系，構建獲得特異地改善肺血管重構的Id蛋白表達上調劑藥物篩選模型。
[0005] 本發(fā)明的創(chuàng)新點之一在于將人胚胎干細胞應用于藥物篩選：在過去的藥物篩選模 型中經常利用具有無限繁殖能力的腫瘤細胞以滿足高通量篩選的需要，但單一腫瘤細胞系 不能對不同疾病類型和患者個體進行針對性藥物篩選。這是由于患者細胞不易獲得，且培 養(yǎng)代數有限。有一些藥物在經過最先進的高通量篩選和嚴格的臨床前分析后，在臨床試驗 第三階段失敗而不能成藥時，造成的損失可能超過10億美元。之前建立的BMP2上調劑藥 物篩選平臺基于鼠骨肉瘤細胞系進行的，還存在與人類細胞有種屬差異這一缺陷。將人胚 胎干細胞應用于藥物篩選的優(yōu)勢在于1.干細胞的無限增殖能力，符合高通量藥物篩選； 2.基于其多功能潛性，可以分化形成相關的細胞類型。3.誘導多功能干細胞技術可以根據 病人個體差異'定身量衣'，打破單一細胞系缺乏有效模擬生物個體差異的局限，避免漏篩 和錯篩[WillardVPatalArthritisRheumatol. 2014, 66 (11) : 3062-72]。因此用一種可 以來自任何個體的細胞代替腫瘤細胞是一種有益的選擇。
[0006] 人胚胎干細胞具有腫瘤細胞沒有的優(yōu)勢，但該細胞是否能夠成功用于抗肺動脈高 壓藥物篩選，目前沒有報道。本發(fā)明人將人胚胎干細胞應用于抗肺動脈高壓藥物的篩選，意 外的發(fā)現測定結果靈敏，穩(wěn)定，簡單，具有現有技術無法比擬的優(yōu)勢。
[0007] 所以在通過對遺傳性和特發(fā)性肺動脈高壓致病關鍵信號通路進行透徹研究后，我 們以BMP信號下游關鍵基因Idl基因為靶點，設計雙報告基因原件插入Idl基因組構建重 組載體，并轉入人胚胎干細胞株，獲得穩(wěn)定表達的細胞株，以此建立以熒光素酶表達量作為 指標，獲得對Idl表達上調的治療肺動脈高壓的化合物篩選模型。對候選化合物進行了測 試，達到了理想的技術效果。

【發(fā)明內容】

[0008] 本發(fā)明的目的是建立一種用于篩選肺動脈高壓治療藥物的干細胞模型，發(fā)現新型 的提高BMP信號的肺動脈高壓治療藥物先導化合物。
[0009] 為此，本發(fā)明提供一種保藏編號為CGMCC11091的細胞株。所述細胞命名為為 ID1-V-LUChES，保藏于：中國普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC)，地址：北京市朝陽區(qū) 北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，保藏編號：CGMCCNo. 11091。
[0010] 本發(fā)明提供一種篩選抗肺動脈高壓的化合物的模型，所述模型特征在于：
[0011] 以BMP信號下游關鍵基因Idl基因為靶點，設計雙報告基因原件插入Idl基因組 構建重組載體，并轉入人胚胎干細胞株，獲得穩(wěn)定表達的CGMCC11091的細胞株，將待測抗 肺動脈高壓的化合物刺激CGMCC11091的細胞株，再用細胞裂解液裂解細胞，按基因檢測系 統所述方法檢測熒光素酶表達活性，以Idl啟動子驅動的雙報告基因表達量作為指標，獲 得對Idl表達上調的治療肺動脈高壓化合物的篩選模型。
[0012] 本發(fā)明進一步提供構建模型的方法，步驟如下：
[0013] (1)從數據庫中找到Idl基因的基因組序列，確定打靶位點為其外顯子1，檢索包 含Idl基因完整序列的BAC質粒（5'和3'上下游5Kb序列）。
[0014] (2)生物信息學分析：利用A0S電腦程序，設計并選擇最優(yōu)的位于Idl基因1號外 顯子ATG下游231bp的U5和D3位點，用于重組打靶。
[0015] (3)PCR反應產生基因特異性重組片段：
[0016] 用于擴增重組片段的引物是由通用引物序列和Idl基因序列共同組成，電轉將抗 性篩選框插入已誘導重組酶活性的BAC質粒中，獲得帶篩選框的BAC-Idl質粒。
[0017] (4)中間載體的構建：
[0018] 將一個基于PsclOl質?？蚣堋⑺沫h(huán)素（Tet)誘導重組的質粒PsclOlgbaA，轉化至 攜帶含Idl基因BAC質粒（BAC-Idl)的E.Coli克隆中；通過第一次同源重組將帶有gateway R1/R2位點和細菌正（zeocin)負（pheS)篩選標記的DNA片段插入到BAC-Idl質粒U5/D3 位點中；第二次同源重組將帶有R3和R4兩個gateway位點的pBR322質粒片斷與BAC-Idl 進行gap-repair反應，獲得中間載體。
[0019] (5)目的重組載體的構建：
[0020] 目的載體的構建基于Gateway系統的三個質粒：本發(fā)明構建的中間載體和含有靶 向元件的pLlL2_BacT質粒以及含負篩選標記的pL3L4_DTA質粒組成。經兩次gateway的 轉換體系，最終產生高拷貝的目的重組載體Idl-Venus-Luc-MCl-DTA。
[0021] (6)篩選細胞株的獲得
[0022] 將Idl-Venus-Luc-MCl-DTA質粒用AsiSI線性化處理，電轉P57代人胚胎干 細胞即，獲得整合型Idl啟動子驅動Venus-Luci雙報告基因表達的人胚胎干細胞株， 得到CGMCC11091的細胞株，進行早期中胚層分化，將待測抗肺動脈高壓的化合物刺激 CGMCC11091的細胞株，再用細胞裂解液裂解細胞，按基因檢測系統所述方法檢測熒光素酶 表達活性，以Idl啟動子驅動的雙報告基因表達量作為指標，獲得對Idl表達上調的治療肺 動脈高壓化合物的篩選模型。
[0023] 本發(fā)明還包括用本發(fā)明的模型篩選后得到的化合物在制備抗肺動脈高壓的藥物 中的應用，所述化合物選自：
[0024] 哌啶基-嘌呤類衍生物：1H-吡唑[3, 4-d]嘧啶，1-苯-4-(1_哌啶 基）-lH-Pyrazolo[3, 4_d]pyrimidine,l-phenyl_4-(l-piperidinyl)-(Cas No:23000-46-6)，
[0025]2_ 乙醜苯并噻吩2_Acetyldibenzophen(CasNo:2272〇-75-8)，
[0026] 芒柄花