專利名稱：一種hiv藥物篩選細胞模型及其專用假型慢病毒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種HIV藥物篩選細胞模型及其專用假型慢病毒。
背景技術：
人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)，又稱艾滋病毒， 由HIV感染而引起的疾病稱為艾滋病，全稱為獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immunodeficiency syndrome, AIDS)，該病患者的免疫功能部份或完全喪失，CD4+ 細胞數(shù)目減少，繼而發(fā)生機會性感染、腫瘤等，臨床表現(xiàn)多種多樣。該病傳播速度 快、病死率高，目前無法治愈，引起了各國政府和社會的關注。HIV的流行呈世界 性分布，非洲為HIV的發(fā)源地和重災區(qū)，歐洲和美洲也為主要流行區(qū)，近年HIV在 亞洲的流行呈高速增長的趨勢。我國自1985年首次發(fā)現(xiàn)HIV感染者，至今已有60 80萬人發(fā)生了感染，專家估計，如果不迅速采取有效的預防措施，按目前的年平均 30Q/o的增長速度，到2010年，我國的HIV感染者將超過1000萬。在非洲的有些國 家，HIV的感染率達總人口 30%以上。因此，預防和治療艾滋病，已不僅僅是挽救 個人生命的問題，而是關系到民族存亡的大事。
HIV在病毒分類學上屬逆轉錄病毒科(Retroviridae)慢病毒屬(lentivirus)， 目前已發(fā)現(xiàn)兩種HIV，分別為HIV-l和HIV-2。兩者具有相似的病毒結構和傳播途 徑。HIV-2主要分布于非洲西部，在歐洲和美洲的一些感染者中也被檢測到，毒力 和傳播力都低于HIV-1，引起的艾滋病病程較慢且較緩和。HIV-1廣泛分布于世界 各地，是引起全世界AIDS流行的病原，目前HIV的研究也是以HIV-1為主進行的。
艾滋病病毒(HIV)顆粒呈球形，直徑90nra 130nm。病毒的核心呈中空錐形， 由兩條相同的單鏈RNA鏈、逆轉錄酶和蛋白質組成。核心之外為病毒衣殼，呈20 面體立體對稱，含有核衣殼蛋白質。最外層為包膜，包膜上的糖蛋白有刺突狀結構， 是HIV與宿主細胞受體結合位點和主要的中和位點。HIV RNA中含有gag、 env禾口 pol基因以及6種調控基因(tat， vif， vpr， vpx (vpu), nef， rev〕 。 gag基因 編碼病毒的核心蛋白；pol基因編碼病毒復制所需要的酶類(逆轉錄酶、整合酶和 蛋白酶)；env基因所編碼的病毒包膜蛋白，是HIV免疫學診斷的主要檢測抗原。 HIV主要侵犯人體的CD4+ T淋巴細胞和巨噬細胞，其感染過程包括病毒的吸附、 侵入、逆轉錄、基因組的整合、表達及釋放等過程。當感染發(fā)生時，病毒的外膜糖 蛋白gpl20首先與細胞表面的CD4分子結合并與輔助受體CCR5或CXCR4等結合， gpl20空間構象發(fā)生改變，暴露出跨膜蛋白gp41與細胞膜作用，導致病毒包膜與細 胞膜融合，病毒核心進入細胞內，脫殼后病毒基因組在RT作用下以病毒RNA為模 板合成cDNA，再以此cDNA為模板合成雙鏈DNA，在病毒整合酶IN的作用下隨機整 合到細胞染色體上成為前病毒而長期存在并隨細胞的分裂而傳至子代細胞。該前病 毒即為病毒復制時的轉錄模板，病毒進行復制時，早期轉錄的長鏈m咖A經(jīng)剪接后 表達病毒的調節(jié)蛋白，待調節(jié)蛋白的量到達一定閾值后，病毒進入晚期轉錄，產(chǎn)生 的未拼接的mRNA部分用來指導合成病毒的結構蛋白，部分作為病毒的基因組，與 結構蛋白進行裝配成為病毒核心顆粒，由胞膜出芽時獲得包膜及膜蛋白。
目前，國內HIV藥物篩選主要采用具有感染性的HIV病毒感染人淋巴細胞系， 這種細胞模型由于使用了野生型HIV病毒，對人具有感染性，必須嚴格限制在負壓 的P3實驗室進行，此外該系統(tǒng)不含報告基因，結果檢測程序復雜且靈敏的不高。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種HIV藥物篩選細胞模型及其專用假型慢病毒。 本發(fā)明提供了一種表達HIV的Gag基因(gag)和Pol基因(pol)的重組表達 質粒。
所述表達HIV的Gag基因和Pol基因的重組表達質粒具體可為如圖1所示的 pGag-Pol。
本發(fā)明還提供了一種混合質粒，包括表達HIV的Gag基因和Pol基因的重組表 達質粒和表達報告基因的重組慢病毒質粒。
所有常規(guī)報告基因均可使用，如熒光素酶基因(包括螢火蟲熒光素酶和海洋腔 腸熒光素酶)，熒光蛋白基因(包括綠色熒光蛋白及其各種衍生物，紅色熒光蛋白 等)，氯霉素乙酰轉移酶基因(CAT)， ！3-半乳糖苷酶基因(e-Gal)或葡萄醛酸糖 苷酶基因(GUS)。
所述混合質粒還可包括表達HIV的Rev基因(rev)的重組表達質粒和表達皰疹 性口炎病毒殼G糖蛋白(VSV外膜糖蛋白)基因的重組表達質粒。
所述表達HIV的Gag基因和Pol基因的重組表達質粒具體可為圖1所示的 pGag-Pol;所述表達報告基因的重組慢病毒質粒具體可為圖2所示的pLenti-Luc;
所述表達HIV的Rev基因的重組表達質粒具體可為如圖3所示的pRev;所述可表達 皰疹性口炎病毒殼G糖蛋白基因的重組表達質粒具體可為pVSV-G。
本發(fā)明還提供了一種假型慢病毒，是通過如下方法得到的將所述混合質粒共 轉染哺乳動物細胞，得到假型慢病毒；所述哺乳動物細胞優(yōu)選HEK 293細胞、293T 細胞、293FT細胞或Hela細胞。
含有所述假型慢病毒的細胞也屬于本發(fā)明的保護范圍。
本發(fā)明所提供的HIV藥物篩選細胞模型，是用所述假型慢病毒感染的哺乳動物 細胞；所述哺乳動物細胞優(yōu)選HEK 293細胞、293T細胞、293FT細胞或Hela細胞。
所述假型慢病毒、所述細胞模型均可應用于HIV藥物篩選。
通過用己知抗HIV藥物對本發(fā)明提供的HIV藥物篩選細胞模型進行測試，HIV藥 物處理組細胞中的熒光素酶活性低于對照組。
本發(fā)明構建了表達HIV的Gag基因和Pol基因的重組表達質粒、表達報告基因的 重組慢病毒質粒和表達HIV的Rev基因的重組表達質粒。通過將上述3種質粒和 pVSV-G質粒共轉染哺乳動物細胞，成功獲得了假型慢病毒。將該假型慢病毒感染哺 乳動物細胞，即可得到基于報告基因的HIV藥物篩選細胞模型。本發(fā)明提供的藥物 篩選模型，使用單次感染的病毒，具有良好的安全性，而報告基因使該藥物篩選模 型具備極高的敏感性。
以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。


圖1 HIV Gag和Pol基因表達質粒pGag-Pol示意圖。 圖2重組慢病毒質粒pLenti-luc示意圖。 圖3 HIV Rev基因表達質粒pRev示意圖。 圖4為質粒pLenti-Luc的構建流程圖。 圖5中間質粒pEGFP-Nl-lac示意圖。 圖6中間質粒pUC19-Luc示意圖。 圖7中間質粒pEGFP-Nl-lac-luc示意圖。 圖8中間質粒pLenti-Link示意圖。 圖9為質粒pLenti-Luc的酶切鑒定圖。
具體實施例方式
AZT (Zidovudine,齊多呋啶)是1987年美國食品與藥品管理局(FDA)批準的第
一個治療艾滋病的藥物，是一種抗逆轉錄藥物，以下以AZT為例，進一步闡述本發(fā) 明的技術方案和效果。
各種DNA限制性內切酶、T4 DNA連接酶、DNA聚合酶I (Klenow大片段)、克 隆載體質粒pUC18/pUC19及堿性磷酸酶CIAP均購自Takara公司，含EGFP的真核表 達載體pEGFP-Nl購自Clontech公司，表達VSV糖蛋白的質粒pVSV-G來源于 addgene質粒保存機構(原名pCMV-VSV-G)，真核表達質粒pcDNA3. 1 (+)和 pcDNA3. 1(-)、質粒pG5Luc、質粒pEGFP-Nl、 293FT細胞和細胞轉染試劑 Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司，細胞培養(yǎng)基DMEM購自GIBC0公司，優(yōu)等 胎牛血清購自德國BI0-C服0M公司，質粒提取試劑盒分別購自北京博大公司和 Qiagen公司，玻璃奶DNA純化試劑盒購自北京博大公司，Lucif erase Assay System 購于Proraega公司。含HIV-1 NL4-3株的重組質粒pHIV-NL4-3來源于美國國立衛(wèi)生研 究院艾滋病試劑參比品保存機構(AIDS Research and Reference Reagent Program, NIAID， NIH)
下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。 實施例1、 HIV的藥物篩選 一、質粒pLenti-Luc的構建
參見圖4構建含熒光素酶基因的重組慢病毒質粒pLenti-Luc。
1、 中間質粒pEGFP-Nl-lac的構建
BamHI和PvuII雙酶切質粒pUC19，回收209bp片段；PvuII和EcoRI雙酶切質 粒pUC19，回收92bp片段；將上述兩種片段混合，與經(jīng)BamHI和EcoRI雙酶切并脫 磷的載體pEGFP-Nl連接，轉化大腸桿菌DH5a，經(jīng)IPTG誘導后挑取綠色菌落，進行 酶切鑒定，得到能夠同時在大腸桿菌和真核細胞中表達EGFP蛋白的重組質粒 pEGFP-Nl-lac (見圖5)。
2、 中間質粒pUC19-Luc的構建
Ws/和7feo/雙酶切含熒光素酶基因的質粒p6"5Zwc，切膠回收1656bp的 基因片段，Klenow處理后，與經(jīng)5)ssl酶切的載體pUC19相連。連接產(chǎn)物轉化DH5 a后，挑選重組克隆進行酶切鑒定，得到中間質粒pUC19-Luc (見圖6)。
3、 中間質粒pEGFP-Nl-lac-luc的構建
5棚#/和&0/ /雙酶切質粒pUC19-Luc，回收含有Zwc基因的長約1700bp的片 段，連接到經(jīng)AcoW和i5^n雙酶切的含CMV啟動子的質粒pEGFP-Nl-lac上。連接產(chǎn)物轉化DH5a后，挑選重組克隆進行酶切鑒定，獲得了質粒pEGFP-N1-lac-luc (見圖7)。
4、 中間質粒pLenti-Link的構建 人工合成兩條寡核苷酸序列如下
5， - tatgaagcttggatccgaattcgggcccgtcgacggtac -3， (序列l(wèi)); 5， - cgtcgacgggcccgaattcggatccaagcttca -3， (序列2)。 上述兩條寡核苷酸經(jīng)變性后退火，形成末端分別為M/el和A^"I的 linker。用和f/wl雙酶切慢病毒載體pLenti6/V5gwLacZ (購自 Invitrogen公司)，與上述linker連接，轉化大腸桿菌DH5a，篩選陽性克 隆，得到含多克隆位點的中間質粒pLenti-Link (見圖8)。
5、 質粒pLenti-Luc的構建
vWel和^co^雙酶切質粒pEGFP-Nl-lac-luc，回收含有CMV早期啟動子和 基因的長為2056bp的DNA片段，連接到含部分CMV啟動子的經(jīng)vWel和^bo^T雙酶 切的質粒pLenti-Link上，轉化大腸桿菌DH5a，篩選陽性克隆，進行勤"I及6bsl
酶切鑒定，結果見圖9。圖9中，1: Jp/7l酶切；2: 5"scl酶切；M: DNA分子
量標準。瓊脂糖凝膠電泳結果與預期完全相符。對陽性克隆進行序列分析，證實所 篩選到克隆的插入序列是完全正確的。獲得含完整CMV啟動子的、能表達Luc基因 的重組慢病毒質粒pLenti-Luc (圖2)。
二、 表達HIV Rev基因的輔助質粒pRev的構建 人工合成下列兩條引物
Rev-rEco: 5'-CGGAATTCGGAGTGTATTAAGCTTGTGT -3'(序歹U3); Rev-fB亂.5'-AGGGATCCAAAGAGCAGTGGGAATAGGA -3'(序列4)。 以質粒pHIV-NL4-3為模板，擴增HIV Rev基因。擴增產(chǎn)物經(jīng)Sa歷HI和^coT I
雙酶切后插入經(jīng)相同酶切的真核表達載體pcDNA3. l(-)中，得到表達HIV Rev
基因的輔助質粒pRev (圖3)。
三、 表達HIV Gag和Pol基因的輔助質粒pGag-Pol的構建 人工合成下列兩條引物
RRE-fNde: 5'-CATATGAGGGACAATTGGAGA-3，(序列5);
RRE-r: 5'-GGAGTGTATTAAGCTTGTGTAATTG-3，(序歹ij6)。
以質粒pHIV-NL4-3為模板，擴增HIV的RRE序列(該序列為順勢作用元
件，能將與之相連的rna轉錄物高效轉移至胞漿以利于表達)。擴增產(chǎn)物經(jīng)
y^/ei和^'"dn雙酶切后回收，同時用萬wn和；w/ei雙酶切phiv-nl4-3，回
收含Gag-Pol基因的DNA片段，將上述兩個片段與經(jīng)"s歷HI和^//^1II雙酶 切的整合表達載體pcDNA3. 1 (-)共同連接，得到表達HIV Gag和Pol基因的輔 助質粒pGag-Pol (圖1)。 四、抗HIV的藥物篩選
將下述四種質粒共轉染HEK 293FT細胞熒光素酶重組慢病毒表達質粒 pLenti-Luc、輔助質粒HIV Gag-Pol表達質粒pGag-Pol、輔助質粒HIV rev基因表 達質粒pRev、輔助質粒皰疹性口炎病毒殼G糖蛋白基因表達質粒pVSV-G。其中， 輔助質粒表達的HIV組分協(xié)助重組慢病毒基因組復制、包裝并且分泌出具有單次感 染能力的假型慢病毒。將假型慢病毒加入到新鮮培養(yǎng)的HEK 293FT細胞上，可導致 新鮮培養(yǎng)的細胞被感染并且表達假型慢病毒所攜帶的外源報告基因。在假型慢病毒 再感染新鮮293FT細胞的過程中，加入待選藥物，觀察藥物對細胞模型中熒光素酶 表達的影響，從而判斷待選藥物是否具有潛在HIV藥物的性能。
1、 HEK 293FT細胞的培養(yǎng)
服K 293FT細胞用含10%胎牛血清和雙抗(青霉素100U/ml，鏈霉素lOOu g/ml) 的DMEM培養(yǎng)基(GIBC0)進行培養(yǎng)。
2、 假型慢病毒的制備
HEK 293FT細胞于轉染前一天鋪于24孔板，密度約5xl(f個細胞/孔。24個孔 分為3組(甲組、乙組、丙組)，每8個孔一組。采用脂質體Lipofectamine"12000 轉染方法，參照Invitrogen公司的轉染試劑使用說明，主要步驟如下
針對每一個孔，取pLenti-Luc、 pGag-Pol、 pRev和pVSV-G各0.2嗎， 一同加 入到無血清和抗生素的DMEM培養(yǎng)液中；取Lipof ectaraine 2000試劑1 W 加入到另外50W無血清和抗生素的DMEM培養(yǎng)液中；室溫孵育5 min后將二者混合， 再于室溫放置20 min;靜置期間，用1 ml無血清和抗生素的DMEM培養(yǎng)液洗滌細胞， 總共洗滌3次，然后加入0. 5ml的含血清但不含雙抗的匿EM培養(yǎng)液；最后將上述 Lipofectamine 2000和DNA的混合物滴加到培養(yǎng)板，每孔滴加放入含5% C02 的孵箱中于37'C培養(yǎng)。次日，對不同組別進行如下處理.-
甲組(AZT組)每孔加入終濃度為lpmol/L的抗HIV藥物AZT。
乙組(維生素C對照藥物VitC組)每孔加入終濃度為lpmol/L的維生素C。 丙組(陰性對照組)每孔加入10ri無菌去離子水。
繼續(xù)培養(yǎng)2天后收集含有重組假型慢病毒的細胞培養(yǎng)液的上清進行步驟3的操作。
3、抗HIV的藥物篩選
將新鮮的HEK 293FT細胞鋪于一個新的24孔板，密度約5xl()S個細胞/孔。24 個孔分為3組(甲組、乙組、丙組)，每8個孔一組。將步驟2得到的甲、乙、丙 組含有假型病毒的細胞培養(yǎng)液上清，對應的加入新24孔板的甲、乙、丙組孔中， 每孔50(mi。次日，對不同組別進行如下處理
甲組(AZT組)每孔加入500Hl含lpmol/L AZT藥物的新鮮培養(yǎng)基。 乙組(維生素C對照藥物VitC組)每孔加入500W含lpmol/L維生素C的 新鮮培養(yǎng)基。
丙組(陰性對照組)每孔加入500W新鮮培養(yǎng)基。
兩天后，用熒光素酶檢測試劑盒檢測熒光素酶活性，具體操作如下
收集細胞，用PBS漂洗，吸出PBS后加入10(^11X裂解緩沖液(CCLR)裂解細 胞，最后將細胞及所有液體移至新離心管，離心后取上清10ul加入50ul熒光素 酶檢測底物，充分混合后，立即用照度計(Tuner Biosystem， luninoraeter)檢測 熒光素酶活性。
甲組熒光素酶的活性為93584土6212;乙組熒光素酶的活性為193039士6343; 丙組熒光素酶的活性為197604±8492。
結果發(fā)現(xiàn)，甲組和丙組熒光素酶活性差異十分顯著，表明AZT會抑制假型慢病 毒復制，最終導致第二代感染的細胞中報告基因luc表達的熒光素酶活性減弱。乙 組和丙組熒光素酶活性相似，表明維生素C不具備抑制假型慢病毒復制的能力。
上述結果說明，本發(fā)明的HIV藥物篩選細胞模型可安全、靈敏進行體外HIV藥 物篩選。
序列表
<110〉中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院微生物流行病研究所
<120〉 一種HIV藥物篩選細胞模型及其專用假型慢病毒
<130> CGGNARY81599
<160〉 6
〈210〉 1
<211〉 39
<212〉 DNA <213>人工序列
<400〉 1
tatgaagctt ggatccgaat tcgggcccgt cgacggtac 39
<210〉 2
〈211〉 33
〈212〉 DNA 〈213〉人工序列
〈400〉 2
cgtcgacggg cccgaattcg gatccaagct tea 33
<210〉 3
〈211〉 28
〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 <400〉 3
cggaattcgg agtgtattaa gcttgtgt 28
<210> 4
<211〉 28
<212> 腿 〈213〉人工序列
<400> 4
agggatccaa agagcagtgg gaatagga 28
<210〉 5
<211> 21
〈212〉 DNA <213〉人工序列
〈400〉 5
catatgaggg acaattggag a 21
<210> 6
<211〉 25
<212> DNA <213〉人工序列
<400> 6
ggagtgtatt aagcttgtgt aattg 2權利要求
1、表達HIV的Gag基因和Pol基因的重組表達質粒。
2、 如權利要求l所述的質粒，其特征在于所述重組表達質粒為圖l所示的 pGag-Pol。
3、 一種混合質粒，包括表達HIV的Gag基因和Pol基因的重組表達質粒和表達 報告基因的重組慢病毒質粒。
4、 如權利要求3所述的混合質粒，其特征在于所述報告基因為熒光素酶基因。
5、 如權利要求3或4所述的混合質粒，其特征在于所述混合質粒還包括表達 HIV的Rev基因的重組表達質粒和表達皰疹性口炎病毒殼G糖蛋白基因的重組表達質 粒。
6、 如權利要求5所述的混合質粒，其特征在于所述表達HIV的Gag基因和Pol 基因的重組表達質粒為圖1所示的pGag-Pol;所述表達報告基因的重組慢病毒質粒為 圖2所示的pLenti-Luc;所述表達HIV的Rev基因的重組表達質粒為圖3所示的pRev， 所述表達皰疹性口炎病毒殼G糖蛋白基因的重組表達質粒為pVSV-G。
7、 一種假型慢病毒，是通過如下方法得到的將權利要求5或6所述的混合質 粒共轉染哺乳動物細胞，得到假型慢病毒；所述哺乳動物細胞為HEK 293細胞、293T 細胞、293FT細胞或Hela細胞。
8、 含有權利要求7所述假型慢病毒的重組細胞。
9、 一種HIV藥物篩選細胞模型，是用權利要求7所述假型慢病毒感染的哺乳動 物細胞；所述哺乳動物細胞為HEK 293細胞、293T細胞、293FT細胞或Hela細胞。
10、 權利要求7所述假型慢病毒、權利要求9所述細胞模型在HIV藥物篩選中的 應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種HIV藥物篩選細胞模型及其專用假型慢病毒。本發(fā)明構建了表達HIV的Gag基因和Pol基因的重組表達質粒、表達報告基因的重組慢病毒質粒和表達HIV Rev基因的重組質粒。將上述3種質粒和表達皰疹性口炎病毒殼G糖蛋白基因的重組表達質粒共轉染哺乳動物細胞，成功獲得了假型慢病毒。將假型慢病毒感染哺乳動物細胞，可得到基于報告基因的HIV藥物篩選細胞模型。本發(fā)明提供的藥物篩選細胞模型，使用單次感染的病毒，具有良好的安全性，并且報告基因使該細胞模型具備極高的敏感性。
文檔編號C12Q1/70GK101353666SQ20081011843
公開日2009年1月28日 申請日期2008年8月15日 優(yōu)先權日2008年8月15日
發(fā)明者周育森, 安小平, 昕 張, 李敬云, 童貽剛 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院微生物流行病研究所