專利名稱：誘導腫瘤特異性細胞毒性的方法和組合物的制作方法
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明屬于腫瘤細胞生物學和癌癥治療領(lǐng)域。更具體而言，本發(fā)明涉及病毒載體在腫瘤細胞中的選擇性特異表達。
2.背景技術(shù)2.1 H19基因H19基因是少數(shù)已知的人類印記基因之一(Hurst等，1996，自然遺傳學12234-237)。在胚胎發(fā)生的最早期，H19在2個染色體等位基因上都表達(DeGroof等，1994，滋養(yǎng)層8285-302)。自此不久，出現(xiàn)父系等位基因沉默，而僅母系遺傳的等位基因被轉(zhuǎn)錄。
H19在胚胎發(fā)生期廣泛表達，并首先被鑒定為通過反式作用基因座raf在肝中和甲胎蛋白協(xié)同調(diào)節(jié)的基因(Pachnis等，1984，美國國家科學院院報815523-5527)。另外，H19已被許多研究組用目的是分離在組織分化期表達的基因的篩選方法獨立克隆。例如，Davis等(1987，細胞51987-1000)在篩選C3H19T1/2細胞的分化過程中早期活性基因時鑒定了H19的小鼠同源物。Pourier等(1991，發(fā)育 1131105-1114)發(fā)現(xiàn)鼠H19在干細胞分化期間和植入期表達。在人胎盤滋養(yǎng)層細胞分化中也發(fā)現(xiàn)了人H19基因的轉(zhuǎn)錄(Rachmilewitz等1992，分子生殖發(fā)育32196-202)。
盡管H19 RNA的轉(zhuǎn)錄在整個胎兒期和胎盤發(fā)育期許多不同的胚胎組織中發(fā)生，H19表達在出生后下調(diào)。然而，已有報道H19轉(zhuǎn)錄在鼠成年肌肉和肝中為相對低水平(Brunkow和Tilghman，1991，基因和發(fā)育51092-1101)。在癌細胞中H19也在出生后活化。Ariel等人(1997，分子病理學5034-44)表明來源于出生前H19表達的組織的許多腫瘤中H19表達升高。另外，這些作者發(fā)現(xiàn)來源于神經(jīng)組織的腫瘤尤其是星形細胞瘤和成神經(jīng)節(jié)膠質(zhì)細胞瘤中有H19 RNA，其中這被已知與H19的表達無關(guān)。鑒于大量癌細胞表達H19 RNA，這些作者推測H19是一種癌胚RNA并建議研究作為人惡性腫瘤的腫瘤標志的H19。
已經(jīng)克隆和測序了人和鼠H19基因(Brannan等，1990，分子細胞生物學1028-36)。比較人和小鼠H19基因顯示全長77％的核苷酸序列一致性。盡管種間核苷酸同源性的保守性，根據(jù)兩種基因的開放讀框可預測非常低的氨基酸序列一致性(同上)。而且，雖然H19 RNA被RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄，然后拼接和聚腺苷化，但似乎它不被翻譯。反之，發(fā)現(xiàn)H19 RNA和28S細胞質(zhì)RNA有關(guān)，導致人們推測H19 RNA可能作為核糖核苷酸蛋白的RNA組分起作用(同上)。
H19的真正生理作用還沒有完全了解。H19能作為一種顯性致死基因起作用；H19轉(zhuǎn)基因的高異位表達引起小鼠將要出生前的致死性(Brunkow等，上文)。該致死期恰與H19的表達被抑制的時間相一致。另一個方面，在攜帶H19敲除等位基因的雜合或純合的小鼠中，沒有觀察到缺陷(Leighton等，1995，自然37534-39)。敲除母系遺傳的等位基因確實干擾遺傳連鎖和相反印記IGF-2基因的印記過程；由于增加的出生前IGF-2的表達，得到的小鼠出生時比同窩鼠更大(同上)。因為這2個相反印記基因具有順式作用的調(diào)節(jié)序列，Leighton和同事們推測H19可能涉及IGF-2基因的印記。
提出的H19基因產(chǎn)物的另一個功能是腫瘤抑制RNA。Hao等人(1993，自然365764-767)報道用H19表達構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的2種胚胎性腫瘤細胞系，RD和G401，導致在裸鼠中細胞生長阻滯，形態(tài)改變和降低致癌性。已注意到上述腫瘤抑制活性與小鼠中觀察到的異位表達的致死性(Hao等，同上)以及敲除母系H19等位基因的小鼠增加體積(Leighton等，同上)的結(jié)果一致。然而，H19是腫瘤抑制因子的建議存在爭議。某些結(jié)果被報道不能重復，可能存在另一種與H19緊密連鎖的候選腫瘤抑制基因(Areil等，同上)。建議的H19作為腫瘤抑制因子的作用還與以下實驗數(shù)據(jù)相抵觸，即H19在廣泛種類的腫瘤細胞中活化(如見例如Lustig-Yariv等，1997，癌基因23169-177)。
2.2 條件復制型病毒正常情況下，病毒編碼病毒基因組復制、包裝和釋放(即從感染宿主細胞中產(chǎn)生子代病毒)所需的全部核酸和肽因子。條件復制型病毒是一種僅在特定條件下復制的病毒。
可被制為條件復制的病毒的一個說明性的實例為腺病毒。腺病毒是無包膜的，規(guī)則的二十面體。該蛋白外殼(衣殼)由252個殼粒組成，其中240個為六鄰體，12個為五鄰體。已經(jīng)使用2和5型腺病毒實施了大多數(shù)針對腺病毒多肽的詳盡的研究。病毒DNA在2型腺病毒中為23.85×106道爾頓，其大小在不同血清型之間有輕微變化。所述DNA具有末端反向重復，其在各血清型之間具有不同的長度。
復制周期分為早(E)期和晚(L)期。晚期確定病毒DNA復制開始。腺病毒結(jié)構(gòu)蛋白通常在晚期合成。腺病毒感染后，在被大多數(shù)血清型感染的細胞中宿主DNA和蛋白的合成受到抑制。2型腺病毒和5型腺病毒的腺病毒裂解周期非常有效，結(jié)果導致大約10,000病毒體/每個感染細胞，以及過量病毒蛋白和未整合至病毒體中的DNA。腺病毒早期轉(zhuǎn)錄是一系列復雜的相關(guān)生物化學事件，但實質(zhì)上必須有病毒DNA復制開始前的病毒RNA的合成過程。
腺病毒家族中全部成員的腺病毒基因組的結(jié)構(gòu)相似，且對于已研究的每一血清型而言，其特異性功能通常定位于同樣的位置。早期胞質(zhì)信使RNA與四種已確定的，病毒DNA上的非鄰接區(qū)互補。這些區(qū)域命名為E1-E4。早期轉(zhuǎn)錄本被分為即早(immediate early)期(ELa)，延遲早期(ELb，E2a，E2b，E3和E4)和中期(IVA2.IX)區(qū)。
E1a區(qū)參與病毒和細胞性基因以及轉(zhuǎn)錄性再表達序列的轉(zhuǎn)錄性轉(zhuǎn)活(transactivation)。E1a基因具有對全部其它早期腺病毒信使RNA重要的控制功能。在正常組織中，為了有效轉(zhuǎn)錄E1b、E2a、E2b、E3、或E4，需要活化的E1a產(chǎn)物。病毒感染后事件的正常進展中需要E1b區(qū)。E1b產(chǎn)物在宿主核內(nèi)發(fā)揮作用。E1b序列內(nèi)出現(xiàn)的突變表現(xiàn)為后期病毒mRNA的積累的降低以及可在腺病毒感染后正常觀察到的宿主細胞輸送抑制中的損害。E1b是宿主細胞功能改變所需要的，從而加工和傳送移向病毒后期基因產(chǎn)物。然后這些產(chǎn)物導致病毒包裝和病毒體的釋放。E1b生成的19kD蛋白可以阻止細胞調(diào)亡。E1b還生成與p53結(jié)合的55kD蛋白。
2.3 腫瘤特異的基因治療來自腫瘤有關(guān)的基因的調(diào)節(jié)序列被用于選擇地導向表達在衍生于腫瘤細胞中的自殺基因。例如，在肝細胞癌中誘導甲胎蛋白的表達。Huber等(1991，美國國家科學院院報888039-8043)用來自白蛋白基因或胎兒蛋白基因的控制序列將水痘帶狀皰疹胸腺嘧啶激酶(VZV TK)基因編碼序列在肝癌細胞中導向表達。用含有這些表達構(gòu)建體之一的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染的肝癌細胞表達VZV TK而變得對正常無毒性的藥物原6-甲基嘌呤阿拉伯核苷(araM)敏感。Kaneko等，(1995，癌癥研究555283-5287)構(gòu)建了在甲胎蛋白控調(diào)序列控制下表達HSV TK的腺病毒載體。含有該載體的重組腺病毒顆粒被直接注射到在無胸腺裸鼠中產(chǎn)生的衍生于肝細胞癌的腫瘤。接著用更昔洛韋(ganciclovir)腹膜內(nèi)注射引起衍生于肝細胞癌的腫瘤消退。
Osaki等(1994，癌癥研究545258-5261)把一種表達構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到A549肺癌細胞中，該表達構(gòu)建體含有連接負責簡單皰疹病毒胸腺嘧啶激酶(HSV TK)的編碼序列的肺癌胚抗原基因的控制序列。所轉(zhuǎn)染的細胞對更昔洛韋敏感。另外，在裸鼠中來自皮下注射轉(zhuǎn)染細胞的腫瘤生長被重復的腹膜內(nèi)注射更昔洛韋所抑制。不過，最近描述該癌胚抗原基因在正常結(jié)腸粘膜中表達，因而限制了這些控制序列作為腫瘤特異調(diào)節(jié)區(qū)的有用性(Osaka等，同上)。
美國專利6,087,164和6,306,833(Hochberg等)公開了一種使用H19啟動子來誘導細胞毒性和/或細胞抑制基因產(chǎn)物在癌細胞中的選擇性、癌細胞特異性表達。細胞毒性基因產(chǎn)物一般為毒素(如白喉毒素)、細胞凋亡誘導因子、藥物代謝酶(如胸苷激酶)、反義、核酶和一直特定基因表達的單鏈RNA。
Alemany等(2000，自然生物工程學18723-727)的綜述文章中討論了在用于治療癌癥的具有復制能力的病毒工程學上的進步。美國專利5,998,205(Hallenbech等)描述了含有受組織特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件調(diào)控的基因(如E1a、E1b、E2和E4)的復制所需基因的條件復制型腺病毒載體。由于對于每一組織需要使用另一啟動子，因此腺病毒載體需要針對其將要在其中表達的各自和每一組織進行重新構(gòu)建。
可以通過很多方法將病毒載體施用于腫瘤。脂質(zhì)體載體已通過全身給藥途徑而用于治療肺癌(Ramesh等，2001，分子治療3(3)337-350)。含有腫瘤抑制基因的腺病毒載體可通過膀胱內(nèi)的施用方式用于治療膀胱癌(Lance C.Pagliaro，2000，World J.Uncol.18148-151)。另一項關(guān)于膀胱癌的研究報道了皰疹載體的靜脈內(nèi)施用(OYAMA等，2000，人類基因治療111683-1693)。在美國基因治療協(xié)會第4次年會上，報道了一些如下成功的實驗，如腺病毒經(jīng)動脈內(nèi)途徑用于結(jié)直腸腫瘤(871號摘要)，經(jīng)肌肉內(nèi)遞送途徑用于糖尿病患者(205號摘要)以及采用基于IL-2的質(zhì)粒通過全身給藥途徑的基因治療(分子治療3(5)，2001，學術(shù)出版社)。
本節(jié)或本申請任一節(jié)中任何參考文件的引用和標志(identification)均不應(yīng)理解為承認所屬參考文件可用作本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。
3.發(fā)明概述本發(fā)明提供了條件復制型病毒載體，所述載體能夠在癌和/或高增殖性細胞中選擇性復制，而基本上不在非癌或高增殖性細胞中復制。所述載體含有操作性與H19轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，更特別為H19啟動子、H19增強子(且啟動子或增強子的亞序列(subsequences)仍然具有轉(zhuǎn)錄活性)或它們的組合相連的核酸，所述核酸的基因產(chǎn)物為病毒復制所必需。該條件復制型病毒的復制依賴于存在與H19調(diào)節(jié)序列結(jié)合的癌癥特異性活化轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，由此使得編碼病毒復制必需基因產(chǎn)物的核酸能在H19表達控制下進行表達。本文使用的病毒復制是指包含病毒基因組的復制、子代病毒顆粒的產(chǎn)生和/或從感染細胞中釋放子代病毒顆粒。
由于癌細胞中存在H19活化轉(zhuǎn)錄因子，且其基本上不存在于非癌細胞中，編碼病毒復制所必需基因產(chǎn)物的核酸在癌細胞中選擇性表達，導致病毒選擇性復制，由此，選擇性抑制增殖或生長，或?qū)е掳┘毎呀狻３跏紩r用所述載體轉(zhuǎn)染的癌細胞中釋放出來子代能隨后感染鄰近細胞。在鄰近細胞為癌性的且含有H19活化轉(zhuǎn)錄因子時，病毒將再次復制，抑制或殺死鄰近細胞，并由于腫瘤破壞過程的“旁向(lateral)擴散”而進一步在鄰近癌細胞中擴散以及復制。對非病毒初始轉(zhuǎn)染的癌細胞破壞性過程的該旁向擴散導致治療性過程的收益增加。本發(fā)明的載體以及將其用于選擇性破壞或抑制癌細胞增殖或生長的方法可用于治療多種癌癥和高增殖性疾病。
用于本發(fā)明的H19調(diào)節(jié)序列包括但不局限于H19啟動子和增強子的序列，這些序列的轉(zhuǎn)錄活性片段、以及這些序列的組合。參見，例如

圖1A-1C、3、4、5A-5B和6A-6C(SEQ ID NOS1-6)，其為H19啟動子和增強子的序列。H19增強子及其活性部分可與H19啟動子或啟動子的活性部分任意聯(lián)合使用。本發(fā)明還包括含有所述載體的宿主細胞。本發(fā)明的另一個方面是通過施用本發(fā)明的載體治療癌癥或高增殖性疾病。
根據(jù)本發(fā)明，可以使用一種或多種編碼病毒復制必需產(chǎn)物的核酸。當使用多于一種必需核酸時，它們的表達可置于單個異源調(diào)節(jié)序列的控制之下，或分別置于異源調(diào)節(jié)序列的控制之下。異源調(diào)節(jié)序列可以是兩個相同的H19調(diào)節(jié)序列，兩個不同的H19調(diào)節(jié)序列或一個H19調(diào)節(jié)序列和另一個非H19調(diào)節(jié)序列。所述非H19調(diào)節(jié)序列可以是組織特異性啟動子，或其它癌或腫瘤特異性啟動子，如端粒酶啟動子。
本發(fā)明的一個方面涉及治療個體中癌癥的方法，包括對需要治療的個體施用條件復制型病毒載體，其中至少一種編碼其復制必需產(chǎn)物的病毒核酸操作性連接于H19調(diào)節(jié)序列。
本發(fā)明的另一個方面涉及條件復制型病毒載體，其中至少一種編碼其復制必需產(chǎn)物的病毒核酸操作性連接于H19調(diào)節(jié)序列。
而本發(fā)明的另一個方面涉及降低癌細胞生長的方法，包括將細胞與有效量的條件復制型病毒載體接觸，其中至少一種編碼其復制必需產(chǎn)物的病毒基因操作性連接于H19調(diào)節(jié)序列。
本發(fā)明的另一個方面還涉及條件復制型病毒載體在制備治療癌癥的藥物中的用途，所述載體中至少一種編碼其復制必需產(chǎn)物的病毒基因操作性連接于H19調(diào)節(jié)序列。
本發(fā)明的另一個方面還涉及治療癌癥的藥物組合物，包括藥學可接受載體和作為活性成分的條件復制型病毒載體，其中至少一種編碼其復制必需產(chǎn)物的病毒基因操作性連接于H19調(diào)節(jié)序列。
3.1 定義此處使用的“條件復制型病毒或病毒載體”是指僅能在細胞中表達病毒復制必需產(chǎn)物時在細胞中復制的病毒或病毒載體。在一個示例性實施例中，病毒可通過如下方法而制備為條件復制型病毒滅活編碼復制必需產(chǎn)物基因的天然轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列。所述滅活可例如，通過用外源調(diào)節(jié)序列完全置換天然調(diào)節(jié)序列、通過全部或部分刪除天然調(diào)節(jié)序列，通過其它突變，如堿基置換、插入、反轉(zhuǎn)或缺失，能夠使得天然調(diào)節(jié)序列失去活性的方法得以實施。為重新獲得復制能力，將必需基因產(chǎn)物置于異源轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列的表達控制下，從而使病毒根據(jù)外源轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列的活性而發(fā)生條件性復制。
此處使用的“治療”并非必須僅指疾病或病情的恢復，還可以指至少癥狀進展的抑制、患者病情的好轉(zhuǎn)和改善、或疾病或病情的癥狀的好轉(zhuǎn)。關(guān)于治療癌或高增殖性病情的治療，癥狀進展的抑制、患者病情的好轉(zhuǎn)和改善、或疾病或病情的癥狀的好轉(zhuǎn)可聯(lián)合或涉及至少下述之一腫瘤大小或體積的減小；腫瘤生長率的降低；腫瘤大小或體積停滯；轉(zhuǎn)移灶或繼發(fā)腫瘤數(shù)量的減少；癌的侵襲性(轉(zhuǎn)移能力)降低；腫瘤從一個階段進展到下一階段速率的降低；或由癌癥或高增殖性疾病所誘導的血管生成的降低。
此處使用的“降低癌細胞的生長”是指降低至少下述之一與對照相比的癌細胞的數(shù)量(由可以是壞死、凋亡或其二者組合的細胞死亡所致的)；細胞生長率的降低，例如細胞的全部數(shù)量可以增加但以與對照未處理的細胞的增加相比較低的水平或較低的速率增加；與對照相比，細胞對周圍環(huán)境的侵襲力降低(可通過例如軟瓊脂法測定)即使其全部數(shù)量沒有轉(zhuǎn)變；以及未分化癌細胞向更分化的表型的進展。
為了本發(fā)明此處描述的目的，術(shù)語“操作性連接于”是指核苷酸序列以能受控于調(diào)節(jié)序列而得以表達的方式連接于調(diào)節(jié)序列。
此處使用的“基因產(chǎn)物”是指有能夠由核酸編碼的任何分子，包括但不限于蛋白或其它核酸例如，DNA、RNA、dsRNAi、核酶、DNA酶等。病毒復制必需的基因產(chǎn)物為病毒基因組的天然產(chǎn)物，沒有所述產(chǎn)物該病毒無法復制。下文中所述的基因產(chǎn)物將指“必需基因產(chǎn)物”。
此處使用的“表達”是指編碼興趣物的核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄和相應(yīng)轉(zhuǎn)錄本的剪接、加工、穩(wěn)定化和可選地，翻譯。根據(jù)載體的結(jié)構(gòu)表達可以是瞬時的或連續(xù)的。
此處使用的“病毒復制”是指包括病毒基因組的復制、子代病毒顆粒的生成和/或從感染細胞中釋放子代病毒顆粒。
3.2 發(fā)明目的本發(fā)明的一個目的是提供治療個體中癌癥或高增殖性疾病的方法，包括按照所述治療所需對個體施以條件復制型病毒載體，其中至少一個編碼其復制必需產(chǎn)物的病毒核酸操作性連接于H19調(diào)節(jié)序列。本發(fā)明的另一目的是提供條件復制型病毒載體，其中至少一個編碼其復制必需產(chǎn)物的病毒核酸操作性連接于H19調(diào)節(jié)序列。本發(fā)明的另一目的是提供降低癌細胞生長的方法，包括將細胞與有效量的條件復制型病毒載體接觸，其中至少一個編碼其復制必需產(chǎn)物的病毒核酸操作性連接于H19調(diào)節(jié)序列。
本發(fā)明的另一目的是提供條件復制型病毒載體在制備治療癌癥或高增殖性疾病的藥物中的用途，所述載體中至少一個編碼其復制必需產(chǎn)物的病毒基因操作性連接于H19調(diào)節(jié)序列。本發(fā)明的另一個方面還涉及治療癌癥或高增殖性疾病的藥物組合物，包括藥學可接受載體和作為活性成分的條件復制型病毒載體，其中至少一個編碼其復制必需產(chǎn)物的病毒基因操作性連接于H19調(diào)節(jié)序列。
可參照下面的詳細描述、具體實施方案的示例性實施例和附圖更全面地理解本發(fā)明。
4.附圖簡述圖1A-1C.人H19啟動子區(qū)的核苷酸序列。顯示從核苷酸位置-837至-7(相對于轉(zhuǎn)錄起始點)的啟動子區(qū)(SEQ ID NO1)。
圖2.用于在H19調(diào)節(jié)序列控制下表達E1基因產(chǎn)物地條件復制型病毒載體地結(jié)構(gòu)簡圖?；虍a(chǎn)物，例如操作性連接于H19調(diào)節(jié)序列的腺病毒E1a首先被克隆至穿梭載體。得到的質(zhì)粒被線性化然后與病毒骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化至細菌細胞例如大腸桿菌。利用抗生素抗性選擇重組體，通過限制性核酸內(nèi)切酶分析來證實重組。線性化的重組質(zhì)粒被轉(zhuǎn)染至適用的細胞系中，來進行病毒包裝，重組病毒通常在7～12日內(nèi)生成。在這一特定圖中，病毒載體為腺病毒?！白蟊邸焙汀坝冶邸北硎敬┧筝d體和病毒骨架之間的連接同源重組的區(qū)域。BmBamHI；RIEcoRI；LITR左手ITR和包裝信號；RITR右手ITR；SpSpeI。
圖3.人H19啟動子片段的核苷酸序列(SEQ ID NO2)。
圖4.0.9kb的H19增強子片段的核苷酸序列(SEQ ID NO3)。
圖5A和5B.2kb的H19增強子片段的核苷酸序列(SEQ ID NO4)。
圖6A-6C.4kb的H19增強子片段的核苷酸序列(SEQ ID NO5)。
圖7.5型腺病毒的基因產(chǎn)物E1a(SEQ ID NO6)、E1b(SEQ IDNO8)、E2a(SEQ ID NO9)和E4(SEQ ID NO10)的編碼核苷酸序列和/或氨基酸序列。
圖8.2型腺病毒的核苷酸序列(SEQ ID NO11)。
圖9.2型腺病毒的基因產(chǎn)物E1a(SEQ ID NO12)、E1b(SEQ IDNO13)、E2a(SEQ ID NO14)和E4(SEQ ID NO15)的氨基酸序列。
圖10.1a型人乳頭瘤病毒基因產(chǎn)物E6(SEQ ID NO16)和E7(SEQID NO18，19)的編碼核苷酸序列和/或氨基酸序列。
圖11.巨細胞病毒即早期區(qū)轉(zhuǎn)錄本的核苷酸序列(SEQ ID NO20)。
圖12.猿猴病毒40的大T抗原的氨基酸序列(SEQ ID NO21)。
5.發(fā)明詳述本發(fā)明部分基于如下的發(fā)現(xiàn)，可以使用在多數(shù)腫瘤細胞中活化而基本上不在非腫瘤細胞中活化的H19啟動子使得裂解病毒在腫瘤細胞中復制，從而選擇性殺死癌細胞或減少癌細胞的生長。具體而言，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)H19的表達在各種類型的癌瘤中活化，這些腫瘤包括但不局限于膀胱癌、肝細胞癌、成肝細胞癌、成橫紋肌細胞瘤、卵巢癌、頸部癌、肺癌、乳腺癌、頭頸部扁平細胞癌、食管癌、類胸腺癌、星形細胞瘤、成神經(jīng)節(jié)膠質(zhì)神經(jīng)瘤和成神經(jīng)細胞瘤。
因此，在本發(fā)明的一個方面中，本發(fā)明提供選擇性殺死癌細胞或減少癌細胞的生長的方法和組合物，所述癌細胞優(yōu)選為在個體體內(nèi)。本目的通過把一種載體輸送到所述的細胞來完成，所述載體為條件復制型病毒載體，其能在必需基因產(chǎn)物在H19調(diào)節(jié)元件的表達控制下進行表達時而得以復制。必需基因產(chǎn)物表達時發(fā)生的病毒復制倒是癌宿主細胞的死亡或，最小化減少癌宿主細胞的生長。復制的病毒(子代病毒)從被殺死或被感染的細胞釋放至其附近，感染其它鄰近細胞，再次選擇型復制，由此選擇性殺死或減少鄰近癌細胞的生長?！皵U散”現(xiàn)象有助于破壞腫瘤。在本發(fā)明中，由于H19調(diào)節(jié)序列的腫瘤特異性活化使得病毒具有復制性，其又可以至少導致癌細胞生長的減少。
H19調(diào)節(jié)序列包括但不局限于H19啟動子和增強子的全長序列，仍然保持轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性的上述二者的亞序列、以及上述任何序列的組合。參見，例如圖1、3和4，5A-5B和6A-6C(SEQ ID NOS1-6)，其為H19啟動子和增強子的序列。
下面將描述病毒的示例性實例和可被置于H19調(diào)節(jié)序列下表達的適用的必需基因產(chǎn)物。
根據(jù)本發(fā)明，可以使用一個或多個編碼病毒復制必需產(chǎn)物的核酸。當使用多個基本核酸時，例如，腺病毒的E1a和E1b，二者可置于單個異源調(diào)節(jié)序列下，或分別置于異源調(diào)節(jié)序列下進行同時表達。異源調(diào)節(jié)序列可以是兩個相同的H19調(diào)節(jié)序列，兩個不同的H19調(diào)節(jié)序列或一個H19調(diào)節(jié)序列和另一個非H19調(diào)節(jié)序列。所述非H19調(diào)節(jié)序列可以是組織特異性啟動子，或其它癌或腫瘤特異性啟動子，如端粒酶啟動子。
5.1 H19基因的調(diào)節(jié)序列在此描述的是H19調(diào)節(jié)序列，該調(diào)節(jié)序列能用于指導異源編碼序列在腫瘤細胞中特異性表達。這些H19的調(diào)節(jié)序列包括上游H19啟動子區(qū)和/或下游H19增強子區(qū)。一種H19啟動子區(qū)的核苷酸序列在圖1A-1C顯示(SEQ ID NO1)。該830個核苷酸的序列從-837延長到帽部位點的-7(如Brannan等的描述，上文)。一個共有的TATA序列出現(xiàn)在核苷酸-27～-35處。2個共有的AP2結(jié)合位點(8/9匹配)出現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄起始位點上游大約-500和-40的核苷酸處。當如在下面更詳細討論的那樣被置于異源基因編碼區(qū)的上游時，大約830個堿基對的調(diào)節(jié)區(qū)足以指導操作性連接的異源基因在也表達內(nèi)源H19的癌細胞中表達。另外，另一個位于核苷酸-819至+14位核苷酸的H19啟動子區(qū)(圖5，SEQ IDNO2)也足以指導操作性連接的異源基因在癌細胞中表達。對于上述而言，很明顯全長H19啟動子序列的亞序列即片段也具有足夠的H19的調(diào)節(jié)序列，因此不需要使用全長啟動子序列。
為了提供增強水平的腫瘤細胞特異性的表達，可任選將人H19基因的下游增強子區(qū)加到H19啟動子/異源基因的構(gòu)建體上。如在第6節(jié)以實施例的形式更詳細描述和闡明的，下游增強子區(qū)包含在相對于轉(zhuǎn)錄起始位點從+6kb延長到+11kb的SacI限制性片段上。根據(jù)增強子序列預計，當在H19啟動子控制之下，以反向或正向(相對于內(nèi)源H19基因中的H19增強子的方向)置于異源基因編碼區(qū)的下游時，該下游增強子能發(fā)揮其作用。另外，含有在圖4、5A-5B和6A-6C(SEQ ID NOS3-5)所示的序列的該增強子片段也可用于促進基因表達。
這些在癌細胞中活化的H19調(diào)節(jié)序列可被進一步描述(delineated)以獲得所希望腫瘤特異性表達所需的最短序列，以找到仍能保持特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性的H19調(diào)節(jié)元件的最短亞序列。例如，通過添加、替換或缺失可改變啟動子區(qū)，然后分析其保留的特異于腫瘤的表達功能?？芍饌€檢測H19下游增強子的各個部分增強從H19啟動子轉(zhuǎn)錄的能力。
用各種化學和酶方法能引起調(diào)節(jié)序列中的各種改變，這些方法在本領(lǐng)域的技術(shù)人員中眾所周知。例如，由限制性位點確定的序列區(qū)能被缺失。能用寡核苷酸定點誘變方法以確定的方式改變序列和/或把限制性位點導入到序列特定區(qū)中。另外，用諸如Bal 31或ExoIII和S1核酸酶的DNA核酸酶能產(chǎn)生缺失突變體。通過把所述的DNA與核酸酶溫育更長的時間逐步產(chǎn)生調(diào)節(jié)序列中更大的缺失(見Ausubel等，1989，分子生物學現(xiàn)代技術(shù)，見誘變技術(shù)綜述)。
評價改變的序列在合適的宿主細胞，尤其是表達H19衍生于癌的細胞(例如膀胱癌細胞，作為一個實例)中指導編碼病毒復制必需產(chǎn)物序列的特異于腫瘤的表達的能力。為進一步用途保留其指導腫瘤特異表達能力并結(jié)合到重組表達載體中的任何改變的H19調(diào)節(jié)序列在本發(fā)明的范圍之中。
此處使用的腫瘤特應(yīng)性或腫瘤選擇性復制是指病毒在癌細胞中的復制是在非癌性相似細胞中復制的至少兩倍。更優(yōu)選地，在癌細胞中的復制是在非癌性相似細胞中復制的至少5倍、至少10倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍、至少1000倍、至少5000倍、至少10,000倍、至少50,000倍、至少100,000倍?？刹捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法測定選擇性復制的水平。一個示例性實例為采用如下數(shù)學公式 (見Alemany等，2000，自然生物技術(shù))。
5.2 條件復制型病毒載體和必需基因產(chǎn)物本發(fā)明提供了能夠在癌和/或高增殖性細胞中選擇性復制，而在非癌和/或非高增殖性細胞中基本不復制的條件復制型病毒載體。所述載體含有操作性連接于H19轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列的核酸，所述核酸的表達產(chǎn)物為病毒復制所必需的。
病毒的示例性實例和可被置于H19調(diào)節(jié)序列下表達的適用的必需基因產(chǎn)物包括但不局限于，DNA腫瘤病毒和RNA腫瘤病毒。DNA腫瘤病毒的示例性實例通常包括但不局限于，腺病毒、乳頭瘤病毒、巨細胞病毒、皰疹病毒(如Epstein-Barr病毒、帶狀皰疹和單純皰疹)、乳多空病毒(如多瘤和SV40)和肝炎病毒。在另一個實施例方案中，病毒載體為RNA病毒載體，優(yōu)選為逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，將任何潛在的復制性病毒載體制備為條件復制型并根據(jù)本說明書所公開的內(nèi)容進行使用是可顯而易見的。
在一個優(yōu)選實施方案中，條件復制型病毒腺病毒。腺病毒的核苷酸和氨基酸序列是本領(lǐng)域已知的且是可以獲得的，例如獲自GenBank。例如，GenBank記錄號J01917中公開了來自腺病毒2完整基因組的核苷酸和氨基酸序列。還可以參見圖8，其中描述了腺病毒2的核苷酸序列(SEQID NO11)。Chroboczek等(1992，病毒學186(1)280-285)中公開了來自腺病毒5完整基因組的核苷酸和氨基酸序列。示例性腺病毒必需基因產(chǎn)物包括但不限于E1a、E1b、E2a和E4。圖7、8和9(SEQ ID NOS6-15)中描述了這些基因產(chǎn)物的核苷酸和/或氨基酸序列。
而且，工程化(engineering)條件復制型腺病毒的方法是本領(lǐng)域公知的，包含眾所周知的分子生物學克隆技術(shù)。例如，可工程化腺病毒載體以便任意一個或多個E1a、E1b、E2a或E4的調(diào)節(jié)序列控制的表達可置于此處所述的H19調(diào)節(jié)序列的控制下。圖2是插入含有操作性連接于E1A的編碼序列的H19調(diào)節(jié)序列的核酸的簡圖。在該特定實施方案中，腺病毒載體缺失了天然E1a區(qū)從而在將該載體引入細胞中時，病毒不會發(fā)生復制。將操作性連接于H19調(diào)節(jié)序列的E1a的編碼序列克隆入穿梭載體，例如，PadTractk-CMV。穿梭載體被線性化，然后與腺病毒骨架質(zhì)粒例如，pAdEasy-1共轉(zhuǎn)染，所述質(zhì)粒不含必需基因產(chǎn)物(該實施方案中具體為E1a)的編碼序列。利用適宜的抗生素抗性選擇重組體，通過限制性分析來證實重組。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至適用的腺病毒包裝細胞系中，重組病毒通常在7～12日內(nèi)生成。示例性載體，pAdTrack-CMV和PAdEasy-1，可商業(yè)上獲自Stratagene，LaJolla California。
在另一個實施方案中，條件復制型病毒是人乳頭瘤病毒。人乳頭瘤病毒的核苷酸和氨基酸序列是本領(lǐng)域已知的且是可以獲得的，例如獲自GenBank。例如，GenBank記錄號NC_001356中公開了來自1a型人乳頭瘤病毒完整基因組的核苷酸和氨基酸序列。示例性人乳頭瘤病毒必需基因產(chǎn)物包括但不限于E6和E7區(qū)基因產(chǎn)物。圖10(SEQ ID NOS16-19)中描述了這些基因產(chǎn)物的核苷酸和/或氨基酸序列。
而且，工程化條件復制型乳頭瘤病毒的方法是本領(lǐng)域公知的，包含眾所周知的分子生物學克隆技術(shù)。例如，可工程化乳頭瘤病毒載體以便任任意一個E6或E7的調(diào)節(jié)序列控制的表達可置于此處所述的H19調(diào)節(jié)序列的控制下。與圖2所示相似，乳頭瘤病毒載體缺失了天然E6區(qū)從而在將該載體引入細胞中時，病毒不會發(fā)生復制。將操作性連接于H19調(diào)節(jié)序列的E6的編碼序列克隆入穿梭載體。穿梭載體被線性化，然后與乳頭瘤病毒骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，所述質(zhì)粒不含必需基因產(chǎn)物(該實施方案中具體為E6)的編碼序列。利用適宜的抗生素抗性選擇重組體，通過限制性分析來證實重組。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至適用的細胞系中，生成病毒子代，即H19調(diào)節(jié)序列活化的細胞系。
在另一個實施方案中，條件復制型病毒是巨細胞病毒(CMV)。巨細胞病毒的核苷酸和氨基酸序列是本領(lǐng)域已知的且是可以獲得的，例如獲自GenBank。例如，GenBank記錄號X17403中公開了來自1a型巨細胞病毒完整基因組的核苷酸和氨基酸序列。示例性巨細胞病毒必需基因產(chǎn)物包括但不限于即早區(qū)基因產(chǎn)物。圖11(SEQ ID NOS20)中描述了所述即早區(qū)基因產(chǎn)物的核苷酸和/或氨基酸序列。
而且，工程化條件復制型巨細胞病毒的方法是本領(lǐng)域公知的，包含眾所周知的分子生物學克隆技術(shù)。例如，可工程化巨細胞病毒載體以便任任意一個即早期區(qū)基因的調(diào)節(jié)序列控制的表達可置于此處所述的H19調(diào)節(jié)序列的控制下。與圖2所示相似，巨細胞病毒載體缺失了天然即早期區(qū)從而在將該載體引入細胞中時，病毒不會發(fā)生復制。將操作性連接于H19調(diào)節(jié)序列的即早期編碼序列克隆入穿梭載體。穿梭載體被線性化，然后與巨細胞病毒骨架質(zhì)共轉(zhuǎn)化，所述質(zhì)粒不含即早區(qū)。利用適宜的抗生素抗性選擇重組體，通過限制性分析來證實重組。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至適用的細胞系中，生成病毒子代，即H19調(diào)節(jié)序列活化的細胞系。
條件復制型病毒的其它示例性實例包括但不局限于，其它DNA腫瘤病毒和RNA腫瘤病毒。DNA腫瘤病毒的示例性實例通常包括但不局限于，皰疹病毒(如Epstein-Barr病毒、帶狀皰疹和單純皰疹)、PAPOVA病毒(如多瘤和SV40)和肝炎病毒。在另一個實施例方案中，病毒載體為RNA病毒載體，優(yōu)選為逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，將任何潛在的復制性病毒載體制備為條件復制型并根據(jù)本說明書所公開的內(nèi)容進行使用是可顯而易見的。
這些示例性病毒的核苷酸和氨基酸序列可獲自GenBank。例如，GenBank記錄號NC_001489，NC_003977和NC_004102中分別公開了A型、B型和C型肝炎病毒完整基因組的核苷酸和氨基酸序列。示例性巨細胞病毒必需基因產(chǎn)物包括但不限于即早區(qū)基因產(chǎn)物。圖11(SEQ IDNOS209)中描述了所述即早區(qū)基因產(chǎn)物的核苷酸和/或氨基酸序列。GenBank記錄號NC_001806、NC_001798、NC_001348、NC_001345、NC_001347、NC_001664、NC_000898和NC_001716中分別公開了1、2、3、4、5、6、6B和7型人皰疹病毒完整基因組的核苷酸和氨基酸序列。GenBank記錄號V01555中公開了來自Epstein-Barr病毒完整基因組的核苷酸和氨基酸序列。GenBank記錄號NC_001538中公開了來自BK多瘤病毒完整基因組的核苷酸和氨基酸序列。GenBank記錄號NC_001515中公開了來自多瘤病毒完整基因組的核苷酸和氨基酸序列。GenBank記錄號NC_001669中公開了來自猿猴病毒40完整基因組的核苷酸和氨基酸序列。上述GenBank條目中的核苷酸和氨基酸序列全文引入此處作為參考。
相關(guān)病毒核酸的實例為編碼病毒載體或病毒復制必需產(chǎn)物的核酸。示例性所述必需基因產(chǎn)物包括但不限于即早區(qū)基因產(chǎn)物PAPOVA病毒的T抗原(圖12，SEQ ID NO21)、逆轉(zhuǎn)錄病毒的聚合酶等。這些基本上包括任何病毒生命周期中必需的基因。
根據(jù)本發(fā)明，可以使用一個或多個編碼病毒復制必需產(chǎn)物的核酸。當使用多個基本核酸時，例如，腺病毒的E1a和E1b，二者可置于單個異源調(diào)節(jié)序列下，或分別置于異源調(diào)節(jié)序列下進行同時表達。異源調(diào)節(jié)序列可以是兩個相同的H19調(diào)節(jié)序列，兩個不同的H19調(diào)節(jié)序列或一個H19調(diào)節(jié)序列和另一個非H19調(diào)節(jié)序列。所述非H19調(diào)節(jié)序列可以是組織特異性啟動子，或其它癌或腫瘤特異性啟動子，如端粒酶啟動子。
根據(jù)本發(fā)明，雖然病毒的自我復制有時足以選擇性抑制癌細胞的生長或破壞癌細胞，仍需要通過在病毒載體中引入編碼細胞毒或細胞生長抑制產(chǎn)物的核酸來增加破壞過程。因此，在另一實施方案中，編碼細胞毒或細胞生長抑制產(chǎn)物的核酸可與編碼必需基因產(chǎn)物一起置于單H19調(diào)節(jié)基因的控制下。通過另一實施方案，必需基因產(chǎn)物和編碼細胞毒或細胞生長抑制產(chǎn)物的核酸可分別置于異源轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列的表達控制下。所述異源轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列可以是兩個相同的H19調(diào)節(jié)序列，兩個不同的H19調(diào)節(jié)序列或?qū)⒕幋a必需基因產(chǎn)物的核酸置于一個H19調(diào)節(jié)序列表達控制之下，而將編碼細胞毒或細胞生長抑制產(chǎn)物的核酸置于非H19調(diào)節(jié)序列表達控制之下。所述非H19調(diào)節(jié)序列可以是來自另一組織特異性啟動子，或其它癌或腫瘤特異性啟動子，如端粒酶啟動子的異源序列?；蛘?，啟動子可以是僅在必需基因產(chǎn)物表達后才活化的病毒啟動子。
廣義來說，細胞毒基因產(chǎn)物定義為包括毒素和誘導凋亡劑。此外，針對本發(fā)明的目的，細胞毒基因產(chǎn)物包括把前藥轉(zhuǎn)變成細胞毒產(chǎn)物的藥物代謝酶類。用在本發(fā)明方法中的細胞毒基因產(chǎn)物的實施例包括白喉毒素、假單胞菌毒素、蓖麻毒蛋白霍亂毒素、PE 40和腫瘤抑制子基因如視網(wǎng)膜成細胞瘤和p53。此外，也可用編碼誘導細胞凋亡的凋亡肽的序列。上述凋亡肽包括阿爾茨海默Aβ肽(見LaFerla等，1995，自然遺傳學921-30)、前房鈉尿肽(見Wu等，1997，生物化學雜志27214860-14866)、降鈣素基因相關(guān)肽(見Sakuta等，1996，神經(jīng)免疫學雜志67103-109)、以及其他已知的或待發(fā)現(xiàn)的凋亡肽。
把前藥轉(zhuǎn)變成細胞毒產(chǎn)物的藥物代謝酶包括胸腺嘧啶激酶(來自單純皰疹病毒或水痘帶狀皰疹病毒)、胞嘧啶脫氨酶、硝酸還原酶、細胞色素p-450 2B1、胸腺嘧啶磷酸化酶、嘌呤核苷磷酸化酶、堿性磷酸酶、羧肽酶A和G2、亞麻苦苷酶(linamarase)、 內(nèi)酰胺酶、黃嘌呤氧化酶(見Rigg和Sikora，1997年8月，今日分子醫(yī)學，pp359-366的有關(guān)背景資料)。
此外，用本發(fā)明描述的表達構(gòu)建體可把反義、反基因(antigene)或aptameric寡核苷酸傳遞到癌細胞中。核酶或單鏈RNA也能在癌細胞中表達以抑制特殊的目的基因的表達。這些反義或核酶分子作用的靶基因應(yīng)該是那些對細胞維持或維持癌細胞表型所必需的編碼基因產(chǎn)物。上述靶基因包括但不局限于cdk2、cdk8、cdk21、cdc25A、周期蛋白D1、周期蛋白E、周期蛋白A和cdk4。
例如，為了下調(diào)內(nèi)源基因的表達，把下列載體、反義RNAS或核酶導入到細胞中，其中所述的載體在來源于在癌細胞中表達的印記基因或IGF-1啟動子的調(diào)節(jié)序列控制下；而反義RNAS或核酶對癌基因形式的p53、c-fos、c-jun、Kr-ras和/或Her2/neu的轉(zhuǎn)錄體具有特異性。表達H19和能活化H19調(diào)節(jié)序列的腫瘤細胞能特異地被導向用于表達反義RNA或核酶RNA。
反義方法包括設(shè)計與靶mRNA互補的寡核苷酸(在此情況下，mRNA)。該反義寡核苷酸將結(jié)合到互補的靶mRNA轉(zhuǎn)錄體，然后阻止翻譯。絕對的互補性，盡管是優(yōu)選的，并不需要。在此所指的對部分RNA的序列“互補性”意味著一種具有能和RNA雜交，形成穩(wěn)定的雙鏈體的足夠互補性的序列。雜交能力將依賴于互補性的程度和反義核酸的長度。一般來說，所雜交的核酸越長，它可能含有的與RNA形成的堿基錯配就越多，但仍能形成穩(wěn)定的雙鏈體(或三聯(lián)體，視具體情況而定)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可使用標準方法確定錯配的可容許程度，以確定雜交復合體的熔點。
與靶信使RNA的5′末端互補的寡核苷酸，例如直到并包括AUG起始密碼子的5′非翻譯序列，應(yīng)最有效地起抑制翻譯的作用。然而，最近研究表明，與mRNAs的3′非翻譯序列互補的序列也有效地抑制mRNAs的翻譯。一般性地參見，Wagner R，1994，自然372333-335。因此，與靶基因轉(zhuǎn)錄體的5′-或3′-非翻譯、非編碼區(qū)互補的寡核苷酸可用于反義方法，以抑制內(nèi)源基因的翻譯。與mRNA的5′非翻譯區(qū)互補的寡核苷酸應(yīng)包括AUG起始密碼子的互補部分。與mRNA編碼區(qū)互補的反義寡核苷酸是不太有效地翻譯抑制劑，但根據(jù)本發(fā)明可以使用。不管被設(shè)計成與靶mRNA的5′、3′或與編碼區(qū)雜交，反義核酸至少長為6個核苷酸，優(yōu)選地為長6-約50個核苷酸范圍的寡核苷酸。具體來說，該寡核苷酸至少有10個核苷酸、至少17個核苷酸、至少25個核苷酸或至少50個核苷酸。
不管如何選擇靶序列，首先進行體外研究以定量確定反義寡核苷酸抑制基因表達的能力是優(yōu)選。這些研究應(yīng)該使用對照組，該對照組區(qū)分寡核苷酸的反義基因抑制和非特異的生物學效應(yīng)。將所述的靶RNA或蛋白水平與內(nèi)部對照RNA或蛋白的水平進行比較的這些研究方法，也是優(yōu)選的。
設(shè)計催化性裂解必需靶基因的核酶分子也能用于阻止靶mRNA的翻譯。(如見，PCT國際公開WO 90/11364，1990年10月4日公開；Sarver等，1990，科學2471222-1255)。當該核酶特異于一種編碼對癌細胞生長必需的基因轉(zhuǎn)錄體時，上述核酶能引起癌細胞表型的逆轉(zhuǎn)。雖然在特異識別序列的位點裂解mRNA的核酶可被用于摧毀靶mRNAs時，但優(yōu)選地使用錘頭核酶。錘頭核酶在與靶mRNA形成互補堿基對的側(cè)翼區(qū)所示的位置裂解mRNAs。唯一的要求是靶mRNA具有下列2個堿基的序列5′-UG-3′。錘頭核酶的構(gòu)建和產(chǎn)生在本領(lǐng)域眾所周知，并且在Haseloff和Gerlach，1988，自然，334585-591的方法中更完整地描述。優(yōu)選工程化核酶，這樣裂解識別位點位于靶mRNA的5′末端附近；即能增加有效性并使細胞內(nèi)非功能性mRNA轉(zhuǎn)錄體的積累最少。
用于本發(fā)明的核酶也包括RNA內(nèi)切核糖核酸酶(下文被稱為“Cech型核酶”)，例如在嗜溫四膜蟲中天然產(chǎn)生的核酶(稱之為IVS，或L-19 IVS RNA)，該酶由Thomas Cech和合作者進行了深入的描述(Zaug等，1984，科學224574-578；Zaug和Cech，1986，科學，231470-475；Zaug等，1986，自然，324429-433；大學專利公司出版的公開的國際專利申請?zhí)朩O 88/04300；Been和Cech，1986，細胞，47207-216)。Cech型核酶擁有一個8堿基對的活性位點，該位點與靶RNA序列雜交，然后出現(xiàn)靶RNA的裂解。本發(fā)明設(shè)想使用靶定存在于靶基因中的8個堿基對活性位點序列的那些Cech類型的核酶。
在另一實施方案中，條件復制型病毒載體還包含標記基因的編碼序列，例如熒光素酶、 -半乳糖苷酶、綠色熒光蛋白等。這些構(gòu)建體可用于研究構(gòu)建體的分布、定位和穩(wěn)定性的研究或體內(nèi)實驗中和/或有助于測定適宜的施用模式和/或施用所述載體的治療方案。
5.3 基因產(chǎn)物在腫瘤細胞中的H19-依賴性表達活化內(nèi)源H19基因產(chǎn)物表達的細胞也能特異地活化表達必需基因產(chǎn)物，因此導致條件復制型病毒載體的復制。上述細胞，尤其是腫瘤(癌，癌性)細胞和/或高增殖性細胞，是本發(fā)明基因治療方法的合適靶物。應(yīng)用RNA分析、原位雜交和報道基因構(gòu)建體技術(shù)，可以測定腫瘤和非腫瘤細胞系中的H19依賴性特異表達。
對于大部分RNA分析應(yīng)用，用本領(lǐng)域熟知的任何技術(shù)制備特異與目的基因轉(zhuǎn)錄體雜交的標記探針。該標記探針可含有至少15-30個與H19核苷酸序列互補的堿基，更優(yōu)選地含有與H19轉(zhuǎn)錄體互補的50-150個堿基。針對H19表達的特別優(yōu)選的雜交探針是一種與H19信使RNA的3′末端互補，從聚A位點上游大約800個堿基對到聚A位點的多核苷酸。
在以下由實施例方式說明的本發(fā)明具體實施方案中，用T7或T3表達質(zhì)粒體外產(chǎn)生標記過的反義RNA探針。在標記核苷酸的存在下通過隨機引物法，例如用Prime-It試劑盒(Stratagene，La Jolla，CA；商品名號300392)，也能標記H19探針。另外，標記探針也能用PCR反應(yīng)或標準缺刻翻譯反應(yīng)的方法產(chǎn)生，其中在PCR反應(yīng)中，用H19編碼區(qū)的cDNA克隆和被設(shè)計用來擴增編碼區(qū)的某一區(qū)域的探針。
適于多核苷酸探針的標記物包括摻入了放射性同位素(如35S和32P)、熒光素、發(fā)光和顯色標簽分子和酶組分的核苷酸。
用標準技術(shù)原位把標記探針與細胞或組織樣品雜交，例如用以下實施例描述的方法及本文引作參考的未決美國專利5,955,273的方法。另外，如果能獲得足夠量的合適細胞，可進行標準RNA分析(如Northern分析、RNA酶保護法或RNA酶引物延伸法)，測定目的基因mRNA的表達水平。
另外，有可能“原位”進行上述基因表達分析，即直接從活檢或切除物獲得的病人組織的組織切片(固定和/或冷凍)上進行，這樣沒有必要純化核酸。諸如上面描述的那些核酸試劑可在這些原位方法中用作探針和/或引物(例如見，Nuovo，1992，“原位雜交的PCR法方法和應(yīng)用”，Raven出版社，紐約)。
確定一種細胞類型或腫瘤能特異地活化含有操作性與H19調(diào)節(jié)序列相連的編碼病毒復制必需的基因產(chǎn)物的核酸的條件復制型病毒載體的一種替代方法事實上是把上述條件復制型病毒載體轉(zhuǎn)染到細胞中。為這些目的，可以將編碼標價基因的如熒光素酶導入病毒載體中，為了鑒別適用細胞的目的。在一次對標記基因產(chǎn)物分析中的陽性結(jié)果顯示細胞或細胞系能從該調(diào)節(jié)區(qū)活化表達。
5.4 使用方法和藥物組合物本發(fā)明還涉及用含有與H19調(diào)節(jié)序列操作性連接的編碼病毒復制必需基因產(chǎn)物的核苷酸序列的條件復制型病毒載體轉(zhuǎn)染的宿主細胞。所述宿主細胞可維持在培養(yǎng)基中，或者可以是動物優(yōu)選哺乳動物，更優(yōu)選人類的一部分。所述載體可以通過如下文6節(jié)中所述方法制備。
5.4.1 培養(yǎng)細胞用條件復制型病毒載體轉(zhuǎn)染的宿主細胞可以是任一種原核或真核細胞?？梢圆捎梦⑸锘蚪M織培養(yǎng)技術(shù)中已知且廣泛使用的標準方法將載體轉(zhuǎn)染到真核(酵母、鳥類、昆蟲或哺乳動物)或原核(細菌細胞)的宿主細胞中。
5.4.2 條件復制型病毒載體和組合物的輸送本發(fā)明還涉及含有與H19調(diào)節(jié)序列操作性連接的編碼病毒復制必需基因產(chǎn)物的核苷酸序列的條件復制型病毒載體的在治療癌癥和高增殖性疾病例如特征為細胞生長不受控的疾病中的用途。對于本發(fā)明的方法，本發(fā)明的載體可用任何生物學上有效的載體如任何能在體內(nèi)有效地將載體輸送至細胞的制劑或組合物進行施用。病毒載體直接轉(zhuǎn)染細胞，因此不需要復雜的轉(zhuǎn)染技術(shù)如那些需要通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的技術(shù)。在《病毒載體基因治療和神經(jīng)科學應(yīng)用》(Caplitl和Loewy編著，學術(shù)出版社，圣迭哥(1995)中Cooper(1996，腫瘤學研討會23172-187)報道了用于癌癥治療的基因轉(zhuǎn)化和表達的近期綜述。
已經(jīng)表明通過修飾病毒顆粒表面的病毒包裝蛋白(例如見PCT公開WO 93/25234和WO 94/06920)，有可能限制病毒和接著基于病毒的載體的感染譜。例如，修飾逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的感染譜的策略包括將特異于細胞表面抗原的抗體偶聯(lián)至病毒env蛋白中(Roux等，1989，美國國家科學院院報869079-9083；Julan等，1992，普通病毒學雜志，u33251-3255；和Goud等，1983，病毒學163251-254)；或?qū)⒓毎砻媸荏w配體偶聯(lián)至病毒env蛋白中(Neda等，1991，生物化學雜志；26614143-14146)。偶聯(lián)方法可以是和蛋白或其他種類的分子化學交聯(lián)的形式(如把env蛋白轉(zhuǎn)化成脫唾液酸糖蛋白的乳糖)，以及產(chǎn)生融合蛋白(如單鏈抗體/env融合蛋白)。例如，使用該技術(shù)，例如通過將抗腫瘤有關(guān)分子的抗體或癌細胞表面蛋白的抗體偶聯(lián)至重組病毒表面可靶定癌細胞。該技術(shù)，在用于限制或另外指導對某些組織類型的感染的同時，也能用于把外向載體轉(zhuǎn)變成兼嗜性載體。更優(yōu)選的方法是在病毒基因組中插入編碼在病毒包膜上表達的蛋白，從而導致病毒載體優(yōu)選地被攝取或進入癌細胞或特定組織的細胞中。
通過使用所述方法，能夠保證雙重安全性，即不僅條件復制型病毒可在癌細胞中復制，而且其開始即可以優(yōu)選地輸送至腫瘤細胞的位點。
如優(yōu)選的實施方案中所述，優(yōu)選的用于本發(fā)明的病毒載體為腺病毒條件復制型載體，關(guān)于腺病毒的信息可參見Berkner等，1988，生物技術(shù)6616；Rosenfeld等，1991，科學252431-434；和Rosenfeld等，1992，細胞68143-155。合適的來源于腺病毒株AD型5 d1324或其他腺病毒株(如Ad2、Ad3、Ad7等)的腺病毒載體在本領(lǐng)域的技術(shù)人員中眾所周知。應(yīng)當注意的是，當條件復制型病毒載體是腺病毒載體時，其是特別有利的，因為其可用于感染各種類型的細胞類型，這些細胞包括氣管表皮(Rosenfeld等，1992，見上文的引用)、內(nèi)皮細胞(Lemarchand等，1992，美國國家科學院院報896482-6486)、肝細胞(Herz和Gerard，1993，美國國家科學院院報902812-2816)和肌肉細胞(Quantin等，1992，美國國家科學院院報892581-2584)。而且，病毒顆粒相對穩(wěn)定，容易純化和濃縮，并可被修飾以影響感染譜。此外，導入的腺病毒DNA(和含在其中的外源DNA)不整合到宿主細胞的基因組中但以附加體形式存在，因而避免可能出現(xiàn)的插入誘變的潛在問題，在插入誘變的情形中，導入的DNA成為整合到宿主基因組中(如逆病毒DNA)。再者，相對于其他基因傳遞載體，腺病毒基因組攜帶外源DNA的能力大(高達8個堿基對)(Berkner等，見上文的引用，Haj-Ahmand和Graham，1986，病毒學雜志57267)。
普遍使用并因此受本發(fā)明推崇的大部分條件復制型腺病毒載體，被缺失所有或部分病毒的E1和E3基因，但仍保留多達80％的腺病毒遺傳物質(zhì)(如見，Jones等，1979，細胞16683；Berkner等，同上；和Graham等，分子生物學方法，E.J.Murray編著(Humana，Clifton NJ，1991)7卷，109-127頁)。
在臨床應(yīng)用方面，所述條件復制型病毒載體可由眾多方法之任一種導入到病人中，其中每一種方法在本領(lǐng)域眾所周知。多種輸送系統(tǒng)是已知的，可用于施用含有條件復制型載體和藥學上可接受載體的藥物組合物。導入的方法包括但不限于如，皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、硬膜外和口腔等途徑。病毒載體或組合物的施用可通過任何便利的途徑，例如通過融合或輸液或單次快速靜脈注射、通過經(jīng)上皮或皮膚粘膜層的吸收(例如，口腔粘膜、直腸或結(jié)腸粘膜等)，還可以與其它生物活性物一起施用?？梢圆捎萌砘蚓植康氖┯谩Ａ硗?，可以通過任何適用的途徑包括腦心室內(nèi)或鞘內(nèi)注射將本發(fā)明的病毒載體或組合物導入至中樞神經(jīng)系統(tǒng)，可采用腦室內(nèi)導管輔助腦室內(nèi)注射，例如附加貯器，如奧馬耶貯器(Ommaya reservoir)。也可采用肺施用方式，例如，通過使用吸入劑或霧化器，以及霧化劑的組合。
在一個具體的實施方案中，可將本發(fā)明的病毒載體或組合物局部施用于需要治療的區(qū)域，可以采用但不限于手術(shù)期間的局部輸液、通過注射、通過導管的方法、或通過植入的方法，所述植入為多空、無孔或膠狀物質(zhì)，包括膜，如唾液酸鹽膜或纖維膜。在一個實施方案中，可通過腫瘤或瘤性或瘤前性組織位點(或前位點)直接注射施用。
在一個具體的實施方案中，術(shù)語“藥學可接受”是指由聯(lián)邦或州政府管理機構(gòu)認可的或記載于美國藥典或其它一般公認的用于動物更優(yōu)選用于人的藥典中。術(shù)語“載體”稀釋劑、佐劑、賦形劑或可施用于治療的載體。所述藥學載體可以是無菌液，如水和油，其來源包括石油、動物、植物或合成，如花生油、豆油、礦物油、芝麻油等。當藥物組合物通過靜脈內(nèi)施用時，水是優(yōu)選的載體。鹽水溶液和葡萄糖和甘油水溶液也可以用作液體載體，特別時用于注射性溶液。適用的藥物賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、凝膠、麥芽、米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉，脫脂奶粉、丙三醇、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。組合物，如有需要，還可包含少量濕潤劑和乳化劑，或pH緩沖劑。這些組合物可制成溶液、懸液、乳液、片劑、膠囊、粉末、持續(xù)釋放劑型等?？诜┬涂砂藴瘦d體如藥物級甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、鈉糖精、纖維素、碳酸鎂等。E.W.Martin在“Remington藥物學”中記載了適用的藥物載體的實例。制劑應(yīng)適用于施用途徑。
在另一實施方案中，病毒載體可通過控釋系統(tǒng)進行遞送。在一個實施方案中，可以使用泵(參見Langer，如前；Sefton，CRC Crit.Ref.Biomed.ENG.14201(1987)；Buchwald等，Surgery 88507(1980)；Saudek等，N.Engl.J.Med.321574(1989))。在另一實施方案中，可使用多聚材料(參見Medical Applicants of controlled Release，Langer和Wise(編)，CRC出版社，Boca Raton，F(xiàn)lorida(1974)；Controlled DrugBioavailability，Drug Product Design and Performance，Smolen和Ball(編)，Wiley，NEW YORK(1984)；Ranger和Peppas，J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.2361(1983)；還可以參見Levy等，科學228190(1985)；During等，Ann.Neurol.25351(1989)；Howard等，J.Neurosurg.71105(1989))。在另一實施方案中，可將控釋系統(tǒng)置于治療部位即腦附近，因此僅需要全身劑量的部分(參見，例如，Goodson，in Medical Applicationsof Controlled Release，如前，2卷，115-138(1984))。Langer在綜述中(SCIENCE 2491527-1533(1990))記載了其它控釋系統(tǒng)。在一個實施方案中，可將病毒載體置于緩釋介質(zhì)中。
在一個優(yōu)選的實施方案中，組合物根據(jù)使用途徑過程進行制備為適于對人類靜脈內(nèi)注射的劑型。通常，用于靜脈施用的組合物為無菌等滲水緩沖液中的溶液。需要時，組合物還可以含有溶解劑和局部麻醉劑如利多卡因以便減輕注射位點的疼痛。一般而言，可以按單位劑量形式例如，熔封容器如標明活性物量的安瓿或小袋中的低壓凍干的粉末或無水濃縮物分開或混合提供成分。在通過輸液施用組合物時，其可以在含有無菌藥物級水或鹽溶液的輸液瓶中配制。在通過注射施用組合物時，用于注射的無菌水或鹽溶液的安瓿可被提供以便在施用前混合成分。在優(yōu)選的實施方案中，病毒載體的藥物制劑可全身導入，例如通過如靜脈注射、動脈內(nèi)注射(例如肝血管)，靶細胞中發(fā)生的病毒的特異性復制主要來自編碼病毒復制必需產(chǎn)物的基因的表達的特異性。在另一具體實施方案中，伴隨著導入相當局限的動物中，重組表達構(gòu)建體的初始傳遞更受限制。例如，基因傳遞載體可直接注射至腫瘤位點(腫瘤內(nèi)注射)，或用導管(見美國專利5,328,470)導入身體的任何腔內(nèi)如膀胱內(nèi)的方法將其導入身體的腔室內(nèi)，或立體注射法(例如，Chen等，1994，美國國家科學院院報913054-3057)?；蛘?，藥物制劑可包含一種或多種生成條件復制型病毒載體和向環(huán)境中分泌感染性病毒細胞。
5.4.3 治療終點和劑量普通技術(shù)人員應(yīng)當懂得，從醫(yī)生或病人的角度來看，任何基本上緩解或預防和癌癥病情有關(guān)的非所希望的癥狀(如，疼痛、敏感性和體重減輕等)是合乎要求的。另外，任何腫瘤重量或生長率的降低以及改善腫瘤組織病理圖像是所希望的。特定病毒載體對癌或高增殖病的治療作用的能力可用任意本領(lǐng)域已知的體外或體內(nèi)方法來評估與對照相比的癌(癌性)細胞由于細胞死亡(由可以是壞死、凋亡或其二者組合的細胞死亡所致的)導致的數(shù)量下降；細胞生長率的降低，例如細胞的全部數(shù)量可以增加但以與對照未處理的細胞的增加相比較低的水平或較低的速率增加；與對照相比，細胞對周圍環(huán)境的侵襲力降低(可通過例如軟瓊脂法測定)即使其全部數(shù)量沒有轉(zhuǎn)變；或未分化癌細胞向更分化的表型的進展等。
具有活化H19表達的示例腫瘤類型如下癌、肉瘤、腺瘤、肝細胞癌、肝胚細胞瘤、橫紋肌肉瘤、食管癌、甲狀腺癌、惡性神經(jīng)節(jié)瘤、纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、cohndrosarcoma、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、lymphagiosarcoma、滑膜瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、rhabdotheliosarcoma、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、腎細胞癌、血腫(hematoma)、膽管癌、黑色素瘤、絨毛膜瘤、精原細胞瘤、胚胎性癌、維爾姆斯氏腫瘤、子宮頸癌、睪丸腫瘤、肺癌、小肺癌、膀胱癌、胃腸道間質(zhì)瘤、上皮癌、膠質(zhì)瘤、星形細胞瘤(glioma astrocyoma)、髓母細胞瘤、顱咽管瘤、ependynoma、松果體瘤、視網(wǎng)膜母細胞瘤、多發(fā)性骨髓瘤、直腸癌、甲狀腺癌、頭頸癌、子宮內(nèi)膜癌(cancer of the edometrium)、以及它們的轉(zhuǎn)移灶(metastases)。由此，本發(fā)明包含治療上述全部癌癥的方法。在一特別實施方案中，所述方法包含治療如下腫瘤的方法膀胱癌、肝細胞癌、肝胚細胞癌、橫紋肌肉瘤、卵巢癌、子宮頸癌、肺癌、乳癌、頭頸部鱗狀細胞癌、食管癌、甲狀腺癌、星形細胞瘤、惡性神經(jīng)節(jié)瘤或成神經(jīng)細胞瘤。
有效劑量和治療方案可通過常規(guī)方法確定，在實驗室動物中用低劑量開始，然后增加劑量并同時監(jiān)測作用效果，并也可以用全身性地改變劑量方案。動物研究，優(yōu)選地哺乳動物研究通常被用來確定每公斤體重生物活性劑的最大可耐受劑量，或MTD。本領(lǐng)域的技術(shù)人員通常外推有效劑量并避免對其他物種，包括人類的毒性。
進行對人的效能研究前，在正常個體中的I期臨床研究有助于確立安全劑量。當確定對給定個體的最佳劑量時，臨床醫(yī)生可能考慮許多因素。這些因素中最主要的是所選擇的異源基因產(chǎn)物的毒性和半衰期。其他因素包括病人的個體大小、病人的年齡、病人的一般情況、被治療的具體癌癥、疾病的嚴重度、病人所用的其他藥物、基因產(chǎn)物的體內(nèi)活性等?？紤]動物研究的結(jié)果和臨床文獻后，選擇實驗劑量。
例如，含有操作性連接于H19調(diào)節(jié)序列的編碼病毒復制所需產(chǎn)物的核酸的條件復制腺病毒載體的直接注射到腫瘤塊內(nèi)的一般人用劑量為1×107pfu-1×1012pfu/天。更優(yōu)選地，依據(jù)腫瘤大小，上述腺病毒載體直接注射到腫瘤內(nèi)的每日劑量為1×108pfu-1×1010pfu。尤其是考慮體內(nèi)使用時，本發(fā)明的各種生化組分優(yōu)選地具有高純度并且基本上無潛在的有害污染物(例如，至少國家食品(NF)級、通常至少分析級和優(yōu)選地至少藥用級)。由于所確定的化合物必須使用前合成，上述合成或隨后的純化優(yōu)選產(chǎn)生這樣的產(chǎn)物，該產(chǎn)物在合成或純化方法中基本上無任何潛在的所用的毒性劑。
對于用于治療個體的癌癥病情，本發(fā)明在其一個方面還提供了以無菌分裝的小瓶或安瓿形式的一種試劑盒或試劑包，其中含有條件復制型病毒載體，所述病毒載體包含編碼病毒復制所需產(chǎn)物的操作性連接于H19調(diào)節(jié)序列的核酸。在一實施方案中，試劑盒實質(zhì)上包含以適用的載體或其它任何穩(wěn)定的形式的上述病毒載體。另外，根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，該試劑包提供一種無菌分裝的含有上述釋放載體的細胞或細胞系的小瓶或安瓿。為了貯存和運輸，應(yīng)該冷凍載體釋放細胞或細胞系。另外，該試劑包也可以含有用于培養(yǎng)所述釋放載體的細胞或細胞系的培養(yǎng)基和試劑。另外，試劑包中含有試劑盒的使用說明書。
描述本發(fā)明后，提供下列實施例用以說明而不是限制本發(fā)明。
6.實施例制備條件復制腺病毒載體的一般方法通常，可以使用標準分子生物學技術(shù)構(gòu)建此處描述的載體。構(gòu)建所述載體的標準技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所眾所周知的，并可以參閱如Sambrook等，分子克隆實驗室手冊，冷泉港，紐約(1989)或任一種關(guān)于重組DNA技術(shù)的種類繁多的能夠廣泛得到的實驗室手冊。多種策略可用于連接DNA片段，根據(jù)DNA片段末端的性質(zhì)選擇策略，且本領(lǐng)域技術(shù)人員可以很容易地確定。
在一個實施方案種，可采用根據(jù)標準技術(shù)構(gòu)建含有，開始于5’末端，“關(guān)鍵性左末端元件”的穿梭載體來構(gòu)建腺病毒載體，所述“關(guān)鍵性左末端元件”含有腺病毒5’ITR；腺病毒包裝信號和E1a增強子序列；H19調(diào)節(jié)序列如H19啟動子或其亞序列；三聯(lián)前導序列；多克隆位點(可以是此處所描述的)；poly A信號；和相應(yīng)于腺病毒基因組片段的DNA片段。所述DNA片段作為與修飾或突變腺病毒同源重組的底物。質(zhì)粒還可用包括選擇性標記和復制起點。復制起點可以是細菌性復制起點。所述穿梭載體的代表性實例包括pAVS6，如此處所述以及參閱Trapnell等，1994，Adv.Drug Deliv.Rev 12185-189。含有異源基因的所需DNA序列可被插入至多克隆位點以制備質(zhì)粒載體。
然后用將該構(gòu)建體制備腺病毒載體。然后用修飾或突變的腺病毒進行同源重組，所述腺病毒中一個或多個天然轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列被刪除和用H19轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列取代，如用H19啟動子取代。所述同源重組可通過采用CaPO4沉淀的方法將質(zhì)粒和修飾腺病毒共轉(zhuǎn)染至輔助細胞系來實現(xiàn)。
通過所述同源重組，構(gòu)建了含有不含一個或多個天然轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列的腺病毒DNA的載體。然后可將該載體轉(zhuǎn)染至輔助細胞系中以進行病毒復制以及產(chǎn)生感染性病毒顆粒。轉(zhuǎn)染可采用電穿孔、磷酸鈣沉淀、顯微注射或通過脂蛋白體(proteoliposomes)實施。
所述載體可包含便于將含有H19調(diào)節(jié)序列的DNA序列插入載體的多克隆位點。通常，多克隆位點包括“罕見”限制性酶位點，即在真核生物基因中發(fā)現(xiàn)的概率為每10,000個堿基對中約有1個至每100,000個堿基對中約有1個的位點。因此通過標準技術(shù)在多克隆位點中的合適限制性位點剪切克隆載體來構(gòu)建適用的載體，然后將含有外源基因的DNA序列連接至克隆載體中。
在一個實施方案中，可采用含有根據(jù)Ketner等，1994，Proc.Nat.Acad.Sci.916186-6190中所描述的腺病毒基因組的酵母人工染色體并結(jié)合此處所包含的方法來構(gòu)建腺病毒。在該實施方案中，采用腺病毒DNA和攜帶腺病毒左和右基因組末端片段的酵母人工染色體之間的體內(nèi)同源重組來制備所述腺病毒酵母人工染色體。然后將含有外源基因的DNA序列克隆至腺病毒DNA中。然后從腺病毒酵母人工染色體中切斷修飾的腺病毒基因組以便將其用于生成感染性腺病毒顆粒。
6.1 材料和方法6.1.1 細胞系和轉(zhuǎn)染方法膀胱癌細胞系HT-1376、EJ28、T24P、1197和UM-UC-3從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得，并按照ATCC推薦的方法維持。
6.1.2 病毒傳代實驗為確定腺病毒變體是否在膀胱癌細胞中優(yōu)先復制，實施了針對釋放數(shù)量的病毒產(chǎn)量實驗。測定前述膀胱癌細胞系、人胚腎細胞系(293)和正常膀胱癌中的病毒復制效率。293細胞作為復制效率的陽性對照，由于該細胞構(gòu)成性表達5型腺病毒E1a和E1b蛋白。為測定病毒子代的生成，將1.5×104細胞鋪于24孔板上，然后用200μl含有2％FBS的生長介質(zhì)中的腺病毒以MOI 2(2PFU/細胞)進行感染。次日，用HBSS沖洗細胞三次，再培育在含有10％FBS的生長介質(zhì)中。感染三日后，收獲細胞和介質(zhì)，凍/融三次，然后采用針對293細胞的標準噬菌斑測定法測定病毒滴度。
6.1.3 表達載體的構(gòu)建方法將優(yōu)化的H19轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列整合至腺病毒基因組中，來驅(qū)動必需病毒基因主要是E1A基因的定向表達。
按下述方法構(gòu)建腺病毒基因組引入相應(yīng)的Pshuttle限制性位點含有XhoI限制性位點的片段，然后從522位核苷酸至3924位的Mfe4I限制性位點(核苷酸位是指GenBank中編號AD5001所示序列)Ad5基因組序列。用H19啟動子(SEQ ID NO1中所示核苷酸-810至+14)或作為對照的遍在表達的CMV增強子/啟動子置換含有腺病毒E1啟動子Ad5核苷酸346-521。另外，這些啟動子上游的合成poly A位點(來自Luc-PH19)也要整合。該元件顯示出可以避免非特異性的基因表達，由于Ad5左ITR的轉(zhuǎn)錄起始。然后采用PmeI酶切消化將這些穿梭載體線性化，并用于與pAdEasy-1的同源重組來生成分別含有重組腺病毒基因組的pAdCMV和pAdH19。質(zhì)粒用PCR和限制性酶切消化進行證實。使用Lipofectamine(Life Technologies，Inc)，按照用戶操作手冊將PacI酶切的pAd質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293細胞中，來制備腺病毒。按照AdEasy系統(tǒng)的操作方法中所述(如下)擴增病毒。病毒基因組的證實和野生型污染排除用PCR和限制性酶切消化進行。
出于多種監(jiān)測目的，也可將報告基因(綠色熒光蛋白(GFP)或熒光素酶)整合至腺病毒載體中。作為該方法的擴展，表達HSVtk的腺病毒或胞嘧啶脫氨酶基因也可以發(fā)展使用。在這些構(gòu)建體中，由H19啟動子驅(qū)動的含有HSVtk、E1a基因的表達盒整合至穿梭質(zhì)粒中。HSVtk轉(zhuǎn)錄本借助內(nèi)核糖體進入位點(IRES)與E1a相連。
6.1.4 H-19啟動子的構(gòu)建方法為構(gòu)建H19啟動子，用下列引物，從人胎盤DNA擴增含有H19啟動子序列的多核苷酸。
ESPCR21CGGTTCCCCACTTCCCCAGTTT(SEQ ID NO22)ESPCR22CGGAAGTCGACAACCCTCACCAAAGGCCAAGGT(SEQ ID NO23)用Klenow酶把該PCR產(chǎn)物的末端抹平并克隆到pBluescriptIISK+的EcoRV位點上。所插入的DNA用內(nèi)切酶PvuII、EcoRI和ApaI消化證實。該啟動子的方向與載體的lacZ編碼區(qū)的方向相反。然后用HindIII和PstI切割法切下該啟動子區(qū)，所得到的大約0.9kb的片段插入到pCAT基本質(zhì)粒HindIII-PstI位點中以產(chǎn)生pH19E。
6.1.5 AdEasyTM系統(tǒng)AdEasyTM系統(tǒng)用于快速構(gòu)建重組腺病毒載體，而無需噬斑純化的時間。AdEasyTM系統(tǒng)由He等建立，該系統(tǒng)利用了強壯(robust)、有效的大腸桿菌重組結(jié)構(gòu)，從而避免了難以處理的(36kb)腺病毒基因組的限制-連接。該技術(shù)必需的細菌性以及293細胞包括在每個試劑盒，每個試劑盒均提供生成至多5重組腺病毒的足夠的試劑。高度詳盡的用戶手冊是初學者以及本領(lǐng)域有經(jīng)驗技術(shù)人員的重要資源。
一般方案第1步如SEQ ID NO6中所示的操作性連接于上述H19調(diào)節(jié)序列的E1a腺病毒必需基因的cDNA首先克隆至傳遞載體。
第2步用PmeI將得到的質(zhì)粒線性化，然后與pAdEasy-1，病毒DNA質(zhì)粒一同共轉(zhuǎn)染至大腸桿菌BJ5183株。用對卡那霉素的耐藥性選擇重組體，并用限制性酶分析篩選。
STEP 3然后用PacI將該重組腺病毒構(gòu)建體剪切，以暴露其ITR(末端反向重復)，并轉(zhuǎn)染至QBI-293A細胞來制備病毒顆粒。
在細菌細胞中生成重組1.采用本領(lǐng)域已知的技術(shù)在20微升/管等份中制備電活性BJ5183細胞。
2.用PmeI將穿梭質(zhì)粒線性化。通常五分之一的小量制品(一般為100-500ng)即是足夠的。在酶切消化后，用酚-氯仿提取DNA，乙醇沉淀，然后用6.0微升DDH20中重懸。
3.該PmeI-酶切消化的穿梭質(zhì)粒1.0微升腺病毒骨架載體(100ng/ul)共轉(zhuǎn)化。加入20微升的電感受態(tài)大腸桿菌BJ5183細胞，電穿孔在2.0mm管中，以2,500V，200Ohms和25微-FD在Bio-Rad GenePulser電穿孔儀中實施。轉(zhuǎn)化混合物在500微升L-培養(yǎng)基(可選擇地，在37EC中孵育10～20分鐘，依賴環(huán)境)中重懸。將混合物置于3～5LB/Kan培養(yǎng)板上，于37EC過夜生長(16-20小時)。
4.挑起10～20個極小的克隆，然后使其在含有25微克/ml卡那霉素的2ml L-培養(yǎng)基生長10-15小時。
5.采用普通的堿性分離法實施小量制備，通過將五分之一的小量制品在0.8％瓊脂糖凝膠上泳動來檢查超螺旋質(zhì)粒的大小。
6.來自克隆的DNA用PacI進行限制性酶切消化。候選克隆產(chǎn)出大量(接近30kb)，加3.0kb或4.5Kb的較小片段。
7.將2微升正確重組miniprep DNA再轉(zhuǎn)化至DH10B(或任意質(zhì)粒繁殖株)。采用CSCL-BANDING或采用商業(yè)可獲得的純化試劑盒純化質(zhì)粒以用于轉(zhuǎn)染293細胞。
V293或911細胞中的病毒生成1.在轉(zhuǎn)染前，將293細胞(E1a-轉(zhuǎn)化的人胚腎細胞)或911細胞(E1-轉(zhuǎn)化的人胚視網(wǎng)膜細胞)置于一個或兩個T-25瓶內(nèi)約24小時，每瓶2×106細胞。轉(zhuǎn)染時的融合為約50％～70％。
2.轉(zhuǎn)染當日，用Pad(通常一個T-25瓶需要轉(zhuǎn)染4μg DNA)酶切消化重組腺病毒質(zhì)粒。用乙醇沉淀該質(zhì)粒，在20μl無菌水中重懸。
3.根據(jù)廠商手冊實施標準Lipofectamine轉(zhuǎn)染。4μg的PacI-酶切消化的質(zhì)粒和20μl的Lipofectamine(GIBCO BRL)在含500μl OptiMem I培養(yǎng)基的每一T-25中混合，然后于室溫下孵育15～30分鐘。
4.等待期間，從用4ml無血清培養(yǎng)基(例如，普通DMEM，或Hank′s)沖洗一次的受體細胞中去除再生長培養(yǎng)基。每個T-25瓶中加入2.5mlOptiMemI。將其再置于37EC CO2培養(yǎng)箱中約10分鐘。
5.將Lipofectamine-DNA混合物加入瓶中，然后將瓶返回37EC CO2培養(yǎng)箱。
6.四小時后，除去含有Lipofectamin-DNA混合物的培養(yǎng)基，加入6ml新的完全DMEM(10％FBS，1％Pen/Strep)。次日早晨更換培養(yǎng)基。
7.如果使用基于pAdTrack的載體，即可以采用GFP表達的方法來監(jiān)測轉(zhuǎn)染和病毒生成。
8.在轉(zhuǎn)染后7～10日，用橡皮細胞帚從瓶中刮取細胞，轉(zhuǎn)移至50ml錐形管。細胞在benchtop離心機中離心，然后在2.0ml HBSS或無菌PBS中重懸片狀沉淀物。然后在干冰/甲醇浴中冷凍細胞，然后在37攝氏度的水浴中融化，然后強烈離心渦旋。凍/融/渦旋重復超過3個循環(huán)(一共4個循環(huán))。將樣品簡單離心，將上清保藏于-20EC。
9.在每瓶中使用30-50％上述病毒上清感染兩個50％～70％融合的T-25瓶的911或293細胞。應(yīng)在感染后2～3日出現(xiàn)明顯的CPE或細胞溶解。使用AdTrack載體易于觀察到有效感染。
10.在三分之一至半數(shù)細胞分離時，通常在感染后3～5日收集病毒。可通過Western blot或PCR(對于PCR，去5μl病毒樣品，加入10μl PCR級蛋白酶K，于55EC下1小時，然后煮沸樣品5分鐘，簡單離心，取1～2μl用于證實重組腺病毒的存在。
11.刮去細胞，并按上述第8步中所述制備病毒上清。在這一階段，至少107個感染性顆粒/ml是可用的，通常會更多。每一輪擴增的病毒應(yīng)比前一輪中的病毒至少高10倍。
12.為進一步擴增，細胞感染步驟可以用來自11步中的30-50％的病毒上清重復，用T75瓶替換T25瓶?？梢匀我鈺r間檢測滴度，使用AD-Track載體使得該檢測特別容易。用多種稀釋度的病毒上清感染293細胞，然后在18小時后檢測多少細胞為綠色。
高滴度病毒株的制備1.將911或293細胞置于T-75瓶中，在感染時90％的融合(大約1×107細胞/T-75)。通常，15～20個T-75瓶足以制備高滴度原種。
2.以5～10PFU/每細胞的復合感染(MOI)，用病毒上清感染細胞。當全部細胞聚集和約半數(shù)細胞分離時(通常在感染后3～4日)，在全部瓶中收集并集中。將內(nèi)容物在benchtop離心機中離心(約500g)5分鐘，除去上清。
3.將片狀沉淀物在8.0ml無菌PBS中重懸。實施4次凍/融/渦旋循環(huán)。溶胞產(chǎn)物在Sorvall HS4轉(zhuǎn)子，6000rpm(7000g)4℃離心5分鐘。
4.在50ml錐形管中稱重CSCI的克數(shù)，然后將8.0ml的澄清病毒上清轉(zhuǎn)移至該管，通過離心使之完全混合。將CSCI溶液(約10ml，密度為1.35g/ml)轉(zhuǎn)移至12ml用于SW41轉(zhuǎn)子的polyallomer聚合物管，并覆蓋2ml液體石蠟。制備平衡管，在SW41轉(zhuǎn)子以32,000rpm，10EC，離心18～24小時。
5.病毒級分(約0.5～1.0ml)用3cc注射器和18g針頭收集，用等體積的2×儲存緩沖液混合(2×儲存緩沖液＝10mM Tris，pH8.0，100mMNaCl，0.1％BSA和50％丙三醇，滅菌濾器)。病毒保存在-20EC。
6.通過噬菌斑測定的GFP(優(yōu)選)或免疫組織化學染色或與260nm直接讀取OD來檢測病毒滴度。為了讀取OD，在加入了100μl TE/0.1％SDS的15μl空白溶液中(空白溶液＝1.35g/ml CSCI與等體積的2×儲存緩沖液混合)加入15μl病毒；攪動30秒，離心5分鐘，檢測A260。一個A260單位包含大約1012個病毒顆粒(顆粒∶感染性顆粒＝大約20∶1)。
7.實施例條件復制病毒對膀胱癌細胞的影響-體外實驗在體外測定H19調(diào)節(jié)的腺病毒的細胞毒性。1.5×104表達不同水平H19RNA的腫瘤細胞如HT-1376、EJ28、T24P、1197和UM-UC-3，和原代細胞被置于24孔板上，然后用200μl含有2％FBS的生長介質(zhì)中的腺病毒以多種MOI2(0.1-10)或模擬進行感染。將E1-缺失AdCMVLuc構(gòu)建體用作陰性對照。次日用生長培養(yǎng)基替換感染培養(yǎng)基。細胞裂解后，將細胞固定并用1％結(jié)晶紫染色。干燥培養(yǎng)板，采用Olympus數(shù)字照像機拍攝圖像來確定由本發(fā)明的載體所導致的細胞裂解的程度/水平。
8.實施例條件復制病毒對膀胱癌細胞的影響-xenographic模型中的體內(nèi)實驗在第6節(jié)(如前)中制備的載體的效能被用來研究在SCID小鼠皮下生長的人膀胱癌細胞系。這一更復雜的動物模型是研究腺病毒癌細胞溶解所需要的，因為條件復制型腺病毒通常不在小鼠和大鼠細胞中生長。用熒光素酶表達載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染用于這些實驗的人膀胱癌腫瘤系(UM-UC-3)以便在體內(nèi)對腫瘤退化成像。或者，將GFP報告子整合至條件復制載體，如上述，以便對切除的腫瘤中的表達進行成像。
更具體地，對SCID小鼠皮下注射5×106的穩(wěn)定表達熒光素酶的人UM-UC-3膀胱腫瘤細胞。對測得腫瘤體積大約為100-120mm3的小鼠組(n＝8)將用不同劑量的如第6節(jié)(如前)中制備的條件復制型H19-腺病毒載體進行瘤內(nèi)注射，所述劑量為200μl的培養(yǎng)液中107～109pfu。對照動物組僅接受介質(zhì)(PBS)。
采用測徑器和通過體內(nèi)熒光素酶(由于腫瘤細胞自身發(fā)出熒光)檢測來檢測皮下注射的腫瘤的生長率，并在處死動物后，稱重剖開的腫瘤以便確定本發(fā)明條件復制型病毒載體的治療效果。通過在接種后1、3、5、7和14日收獲腫瘤組織并評測腺病毒復制來測定作為時間函數(shù)的病毒擴散的實驗，實驗中改變是使用抗-腺病毒抗血清以及用標記基因如3-半乳糖苷酶，綠色熒光蛋白(GFP)或熒光素酶作為檢測的腺病毒。治療效果，以及病毒在腫瘤中的擴散度，每一含有H19-啟動子的細胞溶解性腺病毒與啟動子的外源活性相關(guān)(如用腫瘤細胞中的相應(yīng)RNA水平來評測)。還檢測了腫瘤-選擇性溶細胞病毒在種群種殺死陰性表現(xiàn)型(例如，H19-陰性)腫瘤細胞的能力，顯示了條件復制型病毒載體僅在表達活化H19調(diào)節(jié)序列的轉(zhuǎn)錄因子的腫瘤細胞中活化。
9.實施例H19條件復制病毒系統(tǒng)在膀胱癌的直立(orthotropic)模型中的用途該動物模型由人膀胱腫瘤細胞系UM-UC-3，RT-112和5637組成，植入嚴重聯(lián)合免疫缺陷病(SCID)小鼠的膀胱。在雌性CD-1無胸腺裸鼠中建立膀胱內(nèi)(進入腫瘤)生成的直立人膀胱癌。在植入后4和7日將按照6節(jié)中所述(如前)制備的本發(fā)明的載體通過導管注入膀胱內(nèi)。采用腺病毒載體(1×107pfu/100μl PBS)單或多重滴注處理動物。生長率可通過兩種方式中的一種進行測定通過體內(nèi)檢測熒光素酶(由于腫瘤細胞自身發(fā)出熒光，如8節(jié)中所述)，以及在處理開始后的不同時間處死動物后，稱重剖開的腫瘤以便確定本發(fā)明條件復制型病毒載體的治療效果。
10.克隆的保藏根據(jù)用于專利程序的微生物保藏的國際承認的布達佩斯條約的有關(guān)規(guī)定，將下述質(zhì)粒保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)、Manassas，VA。
克隆ATCC登記號保藏日期pH19EH192093221997年10月2日本發(fā)明的范圍并不限于前面描述的具體實施方案。的確，對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說根據(jù)前述內(nèi)容和附圖可以顯而易見地作出上述方案的各種修改方案。所述修改方案被認為在下列權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
在此引用的各種專利、出版物和GenBank記錄其全文引入本文作為參考。
序列表<110>Yissum Research and Development Company of the Hebrew University of JerusalemHochberg，Abraham Ayesh，Suhail<120>誘導腫瘤特異性細胞毒性的方法和組合物<130>1413111<140>PCT/IL02/00843<141>2002-10-22<150>10/012,131<151>2001-10-22<160>21<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>830<212>DNA<213>人<400>1ctgcagggcc ccaacaaccc tcaccaaagg ccaaggtggt gaccgacgga cccacagcgg 60ggtggctggg ggagtcgaaa ctcgccagtc tccactccac tcccaaccgt ggtgccccac120gcgggcctgg gagagtctgt gaggccgccc accgcttgtc agtagagtgc gcccgcgagc180cgtaagcaca gcccggcaac atgcggtctt cagacaggaa agtggccgcg aatgggaccg240gggtgcccag cggctgtggg gactctgtcc tgcggaaacc gcggtgacga gcacaagctc300ggtcaactgg atgggaatcg gcctgggggg ctggcaccgc gcccaccagg gggtttgcgg360cacttccctc tgcccctcag caccccaccc ctactctcca ggaacgtgag gtctgagccg420tgatggtggc aggaaggggc cctctgtgcc atccgagtcc ccagggaccc gcagctggcc480cccagccatg tgcaaagtat gtgcagggcg ctggcaggca gggagcagca ggcatggtgt540cccctgaggg gagacagtgg tctgggaggg agaggtcctg gaccctgagg gaggtgatgg600ggcaatgctc agccctgtct ccggatgcca aaggaggggt gcggggaggc cgtctttgga660gaattccagg atgggtgctg ggtgagagag acgtgtgctg gaactgtcca gggcggaggt720gggccctgcg ggggccctcg ggagggccct gctctgattg gccggcaggg caggggcggg780aattctggcg ggccacccca gttagaaaaa gcccgggcta ggaccgagga 830<210>2<211>833<212>DNA<213>人
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gctctaggct tcaggggtct gtctgcacag gggntagccc ctcccagacc tctgtgaagc2220cagtacgggc ctcccctccc tgccccgtgc tctgtccggt gcttcctgga ctgcactgcg2280ggccactggt gagagggtgg acagggaagg gccgccgtgg tgcctgttcc tgcccacctg2340gctgtgtggt cccctccaag tagggacaac ccttctgagg gcttgggggc accctggggt2400tgccagggcc tcccagagcc ctgtgagccc ctggggggtc tggcctgatg cccccctcca2460cgtccagggc cggctgtggc ccagaacccc agcttcccag caggccggtg tgcggtggtg2520acccaggaga ggcctcgcct ccactgaggg gccaccgacc tctgtcagac cacagagacc2580cccaaggagt ctgaaggctg gagacccggg gctgggacca ggtgggactt tcccacggag2640ccgtccccag gcccagctgg ggacacgtcc cccttctctc cagacacacc ctgcctgcca2700ccaggacaca ccggcctgtt gggggtctct tttaagtgct tgccactctg aggtgactgt2760ccctttccaa agaggtttct ggggcccagg tgggatgcgt cggcctgagc aggaggatct2820gggccgccag gggctgggga ctgtctcctg gggaaggaag cgcctgggag cgtgtgtgct2880gacccaggac catccaggga ggcccgtctg tggggcaagc gggaagggag cggctggaga2940ggcttggccg cccccgccct gcctcccatt ccttagctcc atgcctgtca acctctgtca3000cccagtgagt gatgtccagg ggccctggaa aggtcacagc atgtttgagc ggggtgagag3060agaggggaaa ggcgggggcg gggaaaagta cgtggaggaa gctttaggcc caaggaagga3120gacagggttc tgggagggag ggagccactg gggccgccgg gaaggtccct gcttgctgct3180gccacccaga accctcgcct cttagctagc ccccgcagcc ccagcctttc tggcntgtgg3240ccctctcccc catccccagg tgtcctgtgc aaccaggcct tggacccaaa ccctcctgcc3300ccctcctctc cctcctcacc ctcccaatgc agtggtctcc agcctggctc tgccctgccg3360caggtcccct cccctcatta ccaggcctag agcctccagt cccggtggcc cccagcccga3420gggtgaacgg cctcaccctg ggtcgtggga cagagggcac gttcatcaag agtggctccc3480aagggacacg tggctgtttg cagttcacag gaagcattcg agataaggag cttgttttcc3540cagtgggcac ggagccagca ggggggctgt ggggcagccc agggtgcaag gccaggctgt3600ggggctgcag ctgccttggg ccccactccc aggcctttgc gggaggtggg aggcgggagg3660cggcagctgc acagtggccc caggcgaggc tctcagcccc agtcgctctc cgggtgggca3720gcccaagagg gtctggctga gcctcccaca tctgggactc catcacccaa caacttaatt3780aaggctgaat ttcacgtgtc ctgtgacttg ggtagacaaa gcccctgtcc aaaggggcag3840ccagcctaag gcagtgggga cggcgtgggt ggcgggcgac gggggagatg gacaacagga3900ccgagggtgt gcgggcgatg ggggagatgg acaacaggac cgagggtgtg cgggcgatgg3960gggagatgga caacaggacc gagggtgtgc gggacacgca tgtcactcat gcacgccaat4020ggggggcgtg ggaggctggg gagcagacag actgggctgg gctgggcggg aaggacgggc4080agatg4085<210>6<211>3408<212>DNA<213>人腺病毒5型<220>
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gattttttta aaaggt cct gtg tct gaa cct gag cct gag ccc gag cca gaa 750Pro Val Ser Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu190 195ccg gag cct gca aga cct acc cgc cgt cct aaa atg gcg cct gct atc 798Pro Glu Pro Ala Arg Pro Thr Arg Arg Pro Lys Met Ala Pro Ala Ile200 205 210ctg aga cgc ccg aca tca cct gtg tct aga gaa tgc aat agt agt acg 846Leu Arg Arg Pro Thr Ser Pro Val Ser Arg Glu Cys Asn Ser Ser Thr215 220 225gat agc tgt gac tcc ggt cct tct aac aca cct cct gag ata cac ccg 894Asp Ser Cys Asp Ser Gly Pro Ser Asn Thr Pro Pro Glu Ile His Pro230 235 240 245gtg gtc ccg ctg tgc ccc att aaa cca gtt gcc gtg aga gtt ggt ggg 942Val Val Pro Leu Cys Pro Ile Lys Pro Val Ala Val Arg Val Gly Gly250 255 260cgt cgc cag gct gtg gaa tgt atc gag gac ttg ctt aac gag cct ggg 990Arg Arg Gln Ala Val Glu Cys Ile Glu Asp Leu Leu Asn Glu Pro Gly265 270 275caa cct ttg gac ttg agc tgt aaa cgc ccc agg cca taaggtgtaa 1036Gln Pro Leu Asp Leu Ser Cys Lys Arg Pro Arg Pro280 285acctgtgatt gcgtgtgtgg ttaacgcctt tgtttgctga atgagttgat gtaagtttaa1096taaagggtga gataatgttt aacttgcatg gcgtgttaaa tggggcgggg cttaaagggt1156atataatgcg ccgtgggcta atcttggtta catctgacct catggaggct tgggagtgtt1216tggaagattt ttctgctgtg cgtaacttgc tggaacagag ctctaacagt acctcttggt1276tttggaggtt tctgtggggc tcatcccagg caaagttagt ctgcagaatt aaggaggatt1336acaagtggga atttgaagag cttttgaaat cctgtggtga gctgtttgat tctttgaatc1396tgggtcacca ggcgcttttc caagagaagg tcatcaagac tttggatttt tccacaccgg1456ggcgcgctgc ggctgctgtt gcttttttga gttttataaa ggataaatgg agcgaagaaa1516cccatctgag cggggggtac ctgctggatt ttctggccat gcatctgtgg agagcggttg1576tgagacacaa gaatcgcctg ctactgttgt cttccgtccg cccggcgata ataccgacgg1636aggagcagca gcagcagcag gaggaagcca ggcggcggcg gcaggagcag agcccatgga1696acccgagagc cggcctggac cctcgggaat gaatgttgta caggtggctg aactgtatcc1756agaactgaga cgcattttga caattacaga ggatgggcag gggctaaagg gggtaaagag1816ggagcggggg gcttgtgagg ctacagagga ggctaggaat ctagctttta gcttaatgac1876cagacaccgt cctgagtgta ttacttttca acagatcaag gataattgcg ctaatgagct1936tgatctgctg gcgcagaagt attccataga gcagctgacc acttactggc tgcagccagg1996ggatgatttt gaggaggcta ttagggtata tgcaaaggtg gcacttaggc cagattgcaa2056gtacaagatc agcaaacttg taaatatcag gaattgttgc tacatttctg ggaacggggc2116cgaggtggag atagatacgg aggatagggt ggcctttaga tgtagcatga taaatatgtg2176gccgggggtg cttggcatgg acggggtggt tattatgaat gtaaggttta ctggccccaa2236ttttagcggt acggttttcc tggccaatac caaccttatc ctacacggtg taagcttcta2296tgggtttaac aatacctgtg tggaagcctg gaccgatgta agggttcggg gctgtgcctt2356ttactgctgc tggaaggggg tggtgtgtcg ccccaaaagc agggcttcaa ttaagaaatg2416
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Pro Asn Leu Val Pro Glu Val Ile Asp Leu Thr Cys His Glu Ala Gly115 120 125Phe Pro Pro Ser Asp Asp Glu Asp Glu Glu Gly Glu Glu Phe Val Leu130 135 140Asp Tyr Val Glu His Pro Gly His Gly Gys Arg Ser Cys His Tyr His145 150 155 160Arg Arg Asn Thr Gly Asp Pro Asp Ile Met Cys Ser Leu Cys Tyr Met165 170 175Arg Thr Cys Gly Met Phe Val Tyr Ser Pro Val Ser Glu Pro Glu Pro180 185 190Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Ala Arg Pro Thr Arg Arg Pro Lys195 200 205Met Ala Pro Ala Ile Leu Arg Arg Pro Thr Ser Pro Val Ser Arg Glu210 215 220Cys Asn Ser Ser Thr Asp Ser Cys Asp Ser Gly Pro Ser Asn Thr Pro225 230 235 240Pro Glu Ile His Pro Val Val Pro Leu Cys Pro Ile Lys Pro Val Ala245 250 255Val Arg Val Gly Gly Arg Arg Gln Ala Val Glu Cys Ile Glu Asp Leu260 265 270Leu Asn Glu Pro Gly Gln Pro Leu Asp Leu Ser Cys Lys Arg Pro Arg275 280 285Pro<210>8<211>496<212>PRT<213>人腺病毒5型<400>8Met Glu Arg Arg Asn Pro Ser Glu Arg Gly Val Pro Ala Gly Phe Ser
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<400>21Met Asp Lys Val Leu Asn Arg Glu Glu Ser Leu Gln Leu Met Asp Leu1 5 10 15Leu Gly Leu Glu Arg Ser Ala Trp Gly Asn Ile Pro Leu Met Arg Lys20 25 30Ala Tyr Leu Lys Lys Cys Lys Glu Phe His Pro Asp Lys Gly Gly Asp35 40 45Glu Glu Lys Met Lys Lys Met Asn Thr Leu Tyr Lys Lys Met Glu Asp50 55 60Gly Val Lys Tyr Ala His Gln Pro Asp Phe Gly Gly Phe Trp Asp Ala65 70 75 80Thr Glu Ile Pro Thr Tyr Gly Thr Asp Glu Trp Glu Gln Trp Trp Asn85 90 95Ala Phe Asn Glu Glu Asn Leu Phe Cys Ser Glu Glu Met Pro Ser Ser100 105 110Asp Asp Glu Ala Thr Ala Asp Ser Gln His Ser Thr Pro Pro Lys Lys115 120 125Lys Arg Lys Val Glu Asp Pro Lys Asp Phe Pro Ser Glu Leu Leu Ser130 135 140Phe Leu Ser His Ala Val Phe Ser Asn Arg Thr Leu Ala Cys Phe Ala145 150 155 160Ile Tyr Thr Thr Lys Glu Lys Ala Ala Leu Leu Tyr Lys Lys Ile Met165 170 175Glu Lys Tyr Ser Val Thr Phe Ile Ser Arg His Asn Ser Tyr Asn His180 185 190Asn Ile Leu Phe Phe Leu Thr Pro His Arg His Arg Val Ser Ala Ile195 200 205Asn Asn Tyr Ala Gln Lys Leu Cys Thr Phe Ser Phe Leu Ile Cys Lys210 215 220Gly Val Asn Lys Glu Tyr Leu Met Tyr Ser Ala Leu Thr Arg Asp Pro225 230 235 240Phe Ser Val Ile Glu Glu Ser Leu Pro Gly Gly Leu Lys Glu His Asp245 250 255Phe Asn Pro Glu Glu Ala Glu Glu Thr Lys Gln Val Ser Trp Lys Leu260 265 270Val Thr Glu Tyr Ala Met Glu Thr Lys Cys Asp Asp Val Leu Leu Leu275 280 285Leu Gly Met Tyr Leu Glu Phe Gln Tyr Ser Phe Glu Met Cys Leu Lys290 295 300Cys Ile Lys Lys Glu Gln Pro Ser His Tyr Lys Tyr His Glu Lys His305 310 315 320Tyr Ala Asn Ala Ala Ile Phe Ala Asp Ser Lys Asn Gln Lys Thr Ile325 330 335Cys Gln Gln Ala Val Asp Thr Val Leu Ala Lys Lys Arg Val Asp Ser
340 345 350Leu Gln Leu Thr Arg Glu Gln Met Leu Thr Asn Arg Phe Asn Asp Leu355 360 365Leu Asp Arg Met Asp Ile Met Phe Gly Ser Thr Gly Ser Ala Asp Ile370 375 380Glu Glu Trp Met Ala Gly Val Ala Trp Leu His Cys Leu Leu Pro Lys385 390 395 400Met Asp Ser Val Val Tyr Asp Phe Leu Lys Cys Met Val Tyr Asn Ile405 410 415Pro Lys Lys Arg Tyr Trp Leu Phe Lys Gly Pro Ile Asp Ser Gly Lys420 425 430Thr Thr Leu Ala Ala Ala Leu Leu Glu Leu Cys Gly Gly Lys Ala Leu435 440 445Asn Val Asn Leu Pro Leu Asp Arg Leu Asn Phe Glu Leu Gly Val Ala450 455 460Ile Asp Gln Phe Leu Val Val Phe Glu Asp Val Lys Gly Thr Gly Gly465 470 475 480Glu Ser Arg Asp Leu Pro Ser Gly Gln Gly Ile Asn Asn Leu Asp Asn485 490 495Leu Arg Asp Tyr Leu Asp Gly Ser Val Lys Val Asn Leu Glu Lys Lys500 505 510His Leu Asn Lys Arg Thr Gln Ile Phe Pro Pro Gly Ile Val Thr Met515 520 525Asn Glu Tyr Ser Val Pro Lys Thr Leu Gln Ala Arg Phe Val Lys Gln530 535 540Ile Asp Phe Arg Pro Lys Asp Tyr Leu Lys His Cys Leu Glu Arg Ser545 550 555 560Glu Phe Leu Leu Glu Lys Arg Ile Ile Gln Ser Gly Ile Ala Leu Leu565 570 575Leu Met Leu Ile Trp Tyr Arg Pro Val Ala Glu Phe Ala Gln Ser Ile580 585 590Gln Ser Arg Ile Val Glu Trp Lys Glu Arg Leu Asp Lys Glu Phe Ser595 600 605Leu Ser Val Tyr Gln Lys Met Lys Phe Asn Val Ala Met Gly Ile Gly610 615 620Val Leu Asp Trp Leu Arg Asn Ser Asp Asp Asp Asp Glu Asp Ser Gln625 630 635 640Glu Asn Ala Asp Lys Asn Glu Asp Gly Gly Glu Lys Asn Met Glu Asp645 650 655Ser Gly His Glu Thr Gly Ile Asp Ser Gln Ser Gln Gly Ser Phe Gln660 665 670Ala Pro Gln Ser Ser Gln Ser Val His Asp His Asn Gln Pro Tyr His675 680 685Ile Cys Arg Gly Phe Thr Cys Phe Lys Lys Pro Pro Thr Pro Pro Pro
690 695 700Glu Pro Glu Thr70權(quán)利要求
1.一種治療癌或高增殖性疾病患者的方法，該方法包括給需要治療患者施用一種條件復制型病毒載體，其中至少一種編碼其復制必需產(chǎn)物的病毒核酸操作性連接于H19調(diào)節(jié)序列。
2.權(quán)利要求1的方法，其中H19調(diào)節(jié)序列選自H19啟動子、H19增強子、仍保持轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性的H19啟動子或H19增強子的亞序列和它們的組合。
3.權(quán)利要求2的方法，其中H19啟動子包含SEQ ID NO1的1-830位核苷酸。
4.權(quán)利要求2的方法，其中H19啟動子包含SEQ ID NO2的序列。
5.權(quán)利要求2的方法，其中H19增強子包含克隆至質(zhì)粒pH19EH19(ATCC保藏號209322)的H19增強子的序列。
6.權(quán)利要求2的方法，其中H19增強子包含SEQ ID NO3的序列。
7.權(quán)利要求2的方法，其中H19增強子包含SEQ ID NO4的序列。
8.權(quán)利要求2的方法，其中H19增強子包含SEQ ID NO5的序列。
9.權(quán)利要求2的方法，其中H19增強子被置于病毒復制必需病毒基因序列的3′側(cè)。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述的癌癥選自癌、肉瘤、腺瘤、肝細胞癌、肝胚細胞瘤、橫紋肌肉瘤、食管癌、甲狀腺癌、惡性神經(jīng)節(jié)瘤、纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、cohndrosarcoma、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、lymphagiosarcoma、滑膜瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、rhabdotheliosarcoma、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、腎細胞癌、血腫、膽管癌、黑色素瘤、絨毛膜瘤、精原細胞瘤、胚胎性癌、維爾姆斯氏腫瘤、子宮頸癌、睪丸腫瘤、肺癌、小肺癌、膀胱癌、胃腸道間質(zhì)瘤、上皮癌、膠質(zhì)瘤、星形細胞瘤、髓母細胞瘤、顱咽管瘤、ependynoma、松果體瘤、視網(wǎng)膜母細胞瘤、多發(fā)性骨髓瘤、直腸癌、甲狀腺癌、頭頸癌、子宮內(nèi)膜癌、以及它們的轉(zhuǎn)移灶。
11.權(quán)利要求10的方法，其中癌是膀胱癌且施用途徑為腔內(nèi)。
12.權(quán)利要求1的方法，其中條件復制型病毒為腺病毒。
13.權(quán)利要求12的方法，其中至少一種編碼病毒復制必需產(chǎn)物的核酸選自腺病毒的E1a、E1b、E2a和E4基因。
14.一種條件復制型病毒載體，其中至少一種編碼其復制必需產(chǎn)物的病毒核酸操作性連接于H19調(diào)節(jié)序列。
15.權(quán)利要求14的載體，其中H19調(diào)節(jié)序列選自H19啟動子、H19增強子、仍保持轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性的H19啟動子或H19增強子的亞序列和它們的組合。
16.權(quán)利要求15的載體，其中H19啟動子包含SEQ ID NO1的1-830位核苷酸。
17.權(quán)利要求15的載體，其中H19啟動子包含SEQ ID NO2的序列。
18.權(quán)利要求15的載體，其中H19增強子包含克隆至質(zhì)粒pH19EH19(ATCC保藏號209322)的H19增強子的序列。
19.權(quán)利要求15的載體，其中H19增強子包含SEQ ID NO3的序列。
20.權(quán)利要求15的載體，其中H19增強子包含SEQ ID NO4的序列。
21.權(quán)利要求15的載體，其中H19增強子包含SEQ ID NO5的序列。
22.權(quán)利要求15的載體，其中H19增強子被置于病毒復制必需病毒基因序列的3′側(cè)。
23.權(quán)利要求14的載體，其中條件復制型病毒為腺病毒。
24.權(quán)利要求23的載體，其中至少一種編碼病毒復制必需產(chǎn)物的核酸選自腺病毒的E1a、E1b、E2a和E4基因。
25.一種降低癌或高增殖性細胞生長的方法，該方法包括將細胞與有效量的條件復制型病毒載體接觸，所述病毒載體中至少一種編碼其復制必需產(chǎn)物的病毒核酸操作性連接于H19調(diào)節(jié)序列。
26.權(quán)利要求25的方法，其中H19調(diào)節(jié)序列選自H19啟動子、H19增強子、仍保持轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性的H19啟動子或H19增強子的亞序列和它們的組合。
27.權(quán)利要求26的方法，其中H19啟動子包含SEQ ID NO1的1-830位核苷酸。
28.權(quán)利要求26的方法，其中H19啟動子包含SEQ ID NO2的序列。
29.權(quán)利要求26的方法，其中H19增強子包含克隆至質(zhì)粒pH19EH19(ATCC保藏號209322)的H19增強子的序列。
30.權(quán)利要求26的方法，其中H19增強子包含SEQ ID NO3的序列。
31.權(quán)利要求26的方法，其中H19增強子包含SEQ ID NO4的序列。
32.權(quán)利要求26的方法，其中H19增強子包含SEQ ID NO5的序列。
33.權(quán)利要求26的方法，其中H19增強子被置于病毒復制必需病毒基因序列的3′側(cè)。
34.權(quán)利要求25的方法，其中所述的癌癥選自癌、肉瘤、腺瘤、肝細胞癌、肝胚細胞瘤、橫紋肌肉瘤、食管癌、甲狀腺癌、惡性神經(jīng)節(jié)瘤、纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、cohndrosarcoma、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、lymphagiosarcoma、滑膜瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、rhabdotheliosarcoma、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、腎細胞癌、血腫、膽管癌、黑色素瘤、絨毛膜瘤、精原細胞瘤、胚胎性癌、維爾姆斯氏腫瘤、子宮頸癌、睪丸腫瘤、肺癌、小肺癌、膀胱癌、胃腸道間質(zhì)瘤、上皮癌、膠質(zhì)瘤、星形細胞瘤、髓母細胞瘤、顱咽管瘤、ependynoma、松果體瘤、視網(wǎng)膜母細胞瘤、多發(fā)性骨髓瘤、直腸癌、甲狀腺癌、頭頸癌、子宮內(nèi)膜癌、以及它們的轉(zhuǎn)移灶。
35.權(quán)利要求25的方法，其中條件復制型病毒為腺病毒。
36.權(quán)利要求35的方法，其中至少一種編碼病毒復制必需產(chǎn)物的基因選自腺病毒的E1a、E1b、E2a和E4基因。
37.條件復制型病毒載體在制備治療癌或高增殖性疾病的藥物中的用途，所述載體中至少一種編碼其復制必需產(chǎn)物的病毒基因操作性連接于H19調(diào)節(jié)序列。
38.權(quán)利要求37的用途，其中H19調(diào)節(jié)序列選自H19啟動子、H19增強子、仍保持轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性的H19啟動子或H19增強子的亞序列和它們的組合。
39.權(quán)利要求38的用途，其中H19啟動子包含SEQ ID NO1的1-830位核苷酸。
40.權(quán)利要求38的用途，其中H19啟動子包含SEQ ID NO2的序列。
41.權(quán)利要求38的用途，其中H19增強子包含克隆至質(zhì)粒pH19EH19(ATCC保藏號209322)的H19增強子的序列。
42.權(quán)利要求38的用途，其中H19增強子包含SEQ ID NO3的序列。
43.權(quán)利要求38的用途，其中H19增強子包含SEQ ID NO4的序列。
44.權(quán)利要求38的用途，其中H19增強子包含SEQ ID NO5的序列。
45.權(quán)利要求38的用途，其中H19增強子被置于病毒復制必需病毒基因序列的3′側(cè)。
46.權(quán)利要求37的用途，其中所述的癌癥選自癌、肉瘤、腺瘤、肝細胞癌、肝胚細胞瘤、橫紋肌肉瘤、食管癌、甲狀腺癌、惡性神經(jīng)節(jié)瘤、纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、cohndrosarcoma、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、lymphagiosarcoma、滑膜瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、rhabdotheliosarcoma、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、腎細胞癌、血腫、膽管癌、黑色素瘤、絨毛膜瘤、精原細胞瘤、胚胎性癌、維爾姆斯氏腫瘤、子宮頸癌、睪丸腫瘤、肺癌、小肺癌、膀胱癌、胃腸道間質(zhì)瘤、上皮癌、膠質(zhì)瘤、星形細胞瘤、髓母細胞瘤、顱咽管瘤、ependynoma、松果體瘤、視網(wǎng)膜母細胞瘤、多發(fā)性骨髓瘤、直腸癌、甲狀腺癌、頭頸癌、子宮內(nèi)膜癌、以及它們的轉(zhuǎn)移灶。
47.權(quán)利要求37的用途，其中條件復制型病毒為腺病毒。
48.權(quán)利要求47的用途，其中至少一種編碼病毒復制必需產(chǎn)物的基因選自腺病毒的E1a、E1b、E2a和E4基因。
49.一種治療癌或高增殖性疾病的藥物組合物，該組合物包括藥學可接受的載體和作為活性成分的條件復制型病毒載體，所述病毒載體中至少一種編碼其復制必需產(chǎn)物的病毒基因操作性連接于H19調(diào)節(jié)序列。
50.權(quán)利要求49的組合物，其中H19調(diào)節(jié)序列選自H19啟動子、H19增強子、仍保持轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性的H19啟動子或H19增強子的亞序列和它們的組合。
51.權(quán)利要求50的組合物，其中H19啟動子包含SEQ ID NO1的1-830位核苷酸。
52.權(quán)利要求50的組合物，其中H19啟動子包含SEQ ID NO2的序列。
53.權(quán)利要求50的組合物，其中H19增強子包含克隆至質(zhì)粒pH19EH19(ATCC保藏號209322)的H19增強子的序列。
54.權(quán)利要求50的組合物，其中H19增強子包含SEQ ID NO3的序列。
55.權(quán)利要求50的組合物，其中H19增強子包含SEQ ID NO4的序列。
56.權(quán)利要求50的組合物，其中H19增強子包含SEQ ID NO5的序列。
57.權(quán)利要求50的組合物，其中H19增強子被置于病毒復制必需病毒基因序列的3′側(cè)。
58.權(quán)利要求49的組合物，其中所述的癌癥選自癌、肉瘤、腺瘤、肝細胞癌、肝胚細胞瘤、橫紋肌肉瘤、食管癌、甲狀腺癌、惡性神經(jīng)節(jié)瘤、纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、cohndrosarcoma、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、lymphagiosarcoma、滑膜瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、rhabdotheliosarcoma、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、腎細胞癌、血腫、膽管癌、黑色素瘤、絨毛膜瘤、精原細胞瘤、胚胎性癌、維爾姆斯氏腫瘤、子宮頸癌、睪丸腫瘤、肺癌、小肺癌、膀胱癌、胃腸道間質(zhì)瘤、上皮癌、膠質(zhì)瘤、星形細胞瘤、髓母細胞瘤、顱咽管瘤、ependynoma、松果體瘤、視網(wǎng)膜母細胞瘤、多發(fā)性骨髓瘤、直腸癌、甲狀腺癌、頭頸癌、子宮內(nèi)膜癌、以及它們的轉(zhuǎn)移灶。
59.權(quán)利要求49的組合物，其中條件復制型病毒為腺病毒。
60.權(quán)利要求49的組合物，其中至少一種編碼病毒復制必需產(chǎn)物的基因選自腺病毒的E1a、E1b、E2a和E4基因。
全文摘要
本發(fā)明涉及使用條件復制型病毒載體的腫瘤特異性病毒復制和/或表達，所述病毒載體中病毒復制必需基因產(chǎn)物在H19調(diào)節(jié)序列的控制下表達。本發(fā)明提供了所述病毒載體，制備所述載體的方法和所述載體的施用方法。本發(fā)明的組合物和方法可用于治療癌癥和高增殖性疾病。
文檔編號C07K14/65GK1608135SQ02825940
公開日2005年4月20日 申請日期2002年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月22日
發(fā)明者A·霍克伯格, S·亞野斯 申請人:耶路撒冷希伯來大學伊森姆研究發(fā)展公司