一種檢測腸癌熱點(diǎn)基因突變位點(diǎn)的組合物及其使用方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測腸癌熱點(diǎn)基因突變位點(diǎn)的組合物，所述組合物包括SEQ?NO：1至SEQ?NO：17的引物序列，還包括SEQ?NO：18至SEQ?NO：21的block序列。本發(fā)明對腸癌相關(guān)突變的檢測方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、受污染小、操作簡單快速、安全性等優(yōu)點(diǎn)，檢測結(jié)果具有較好的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，尤其適合從血漿等體液中檢測腸癌驅(qū)動基因的熱點(diǎn)突變，可以實(shí)時、無創(chuàng)地對腸癌患者進(jìn)行診斷，復(fù)發(fā)監(jiān)控和療效評估，具有重要的價值。
【專利說明】
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因檢測領(lǐng)域，特別是涉及檢測腸癌驅(qū)動基因熱點(diǎn)突變的組合物。 -種檢測腸癌熱點(diǎn)基因突變位點(diǎn)的組合物及其使用方法

【背景技術(shù)】
[0002] 腸癌是結(jié)直腸癌和直腸癌的總稱，大腸癌的發(fā)病率從高到低依次為直腸、乙狀結(jié) 腸、盲腸、升結(jié)腸、降結(jié)腸及橫結(jié)腸，近年有向近端（右半結(jié)腸）發(fā)展的趨勢。腸癌的發(fā)病與 生活方式、遺傳、大腸腺瘤等關(guān)系密切。
[0003] 研究發(fā)現(xiàn)，腸癌的發(fā)生與KRAS、BRAF、PIK3CA熱點(diǎn)基因的突變有很大的關(guān)系。 K-ras基因位于12號染色體短臂上，35kb，屬于Ras基因家族的一員。在Ras基因中，K_Ras 對人類癌癥影響最大，它好像分子開關(guān)：正常時能控制調(diào)控細(xì)胞生長的路徑；發(fā)生異常時， 則導(dǎo)致細(xì)胞持續(xù)生長，并阻止細(xì)胞自我毀滅。它參與細(xì)胞內(nèi)的信號傳遞，當(dāng)K-ras基因突變 時，該基因永久活化，不能產(chǎn)生正常的ras蛋白，使細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)紊亂，細(xì)胞增殖失控而 癌變。K-ras基因檢測是目前醫(yī)生了解大腸癌患者癌基因狀況最直接、最有效的方法?？?K-ras基因有沒有突變，可以篩選出抗EGFR(表皮生長因子受體）靶向藥物治療有效的大腸 癌患者，實(shí)現(xiàn)腫瘤病人的個體化治療，從而延長患者生存期。BRAF基因基因編碼一種絲/蘇 氨酸特異性激酶，參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)多種生物學(xué)事件，如細(xì)胞生長、分化和凋亡等。在結(jié)直腸 癌患者中，BRAF基因突變率為15%，美國國家癌癥綜合治療聯(lián)盟《結(jié)直腸癌臨床實(shí)踐指南》 (V3. 2011)建議，在使用愛必妥或帕尼單抗等靶向藥物時，須檢測腫瘤組織KRAS基因狀態(tài)， 如果KRAS無突變，應(yīng)考慮檢測BRAF基因狀態(tài)。磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K)是EGFR下游信號 分子，可被生長因子受體酪氨酸激酶（如EGFR)激活，使絲/蘇氨酸激酶（AKT)磷酸化產(chǎn)生 多種生物學(xué)效應(yīng)，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、存活和細(xì)胞周期調(diào)控等。研究發(fā)現(xiàn)PIK3CA基因產(chǎn)生 突變與結(jié)腸癌等多種癌癥發(fā)病存在相關(guān)性，32%的結(jié)腸癌患者體內(nèi)基因 PIK3CA存在突變 而在成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、胃癌、乳腺癌和肺癌患者中，該基因存在突變的比例分別為 8%和4%。NRAS基因是RAS基因家族中的一員，參與細(xì)胞內(nèi)的信號傳遞。目前，應(yīng)用于腸 癌靶向治療的藥物主要有愛必妥（默克公司）和帕尼單抗（安進(jìn)公司），然而靶向藥物在不 同患者中有不同的療效，有效率約為20?50%。通過對腸癌患者進(jìn)行靶基因突變檢測，能 夠科學(xué)的判斷該病人能否適應(yīng)靶向藥物治療，指導(dǎo)病人用藥，實(shí)現(xiàn)病人的個體化醫(yī)療。
[0004] 目前檢測基因突變的方法主要有以下幾種：
[0005] (1)直接測序法。直接測序法是運(yùn)用探針進(jìn)行PCR擴(kuò)增并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序和 TA克隆并再次測序以最終確定突變的堿基位置。該方法比較繁瑣、耗時長，而且由于自身的 限制導(dǎo)致其靈敏度不高，只能對含量大于20 %的基因突變進(jìn)行檢測。因此，此法不適合在臨 床中的應(yīng)用與大量的臨床樣本分析。
[0006] (2)變性高效液相色譜法（DHPLC)。該方法的原理是基于發(fā)生錯配的雜合雙鏈DNA 與完全匹配的純合雙鏈DNA解鏈特征的差異將他們分離開。通過洗脫峰的不同判斷有無突 變存在。DHPLC可檢測出含有單個檢測的突變、插入或者缺失的異源雙鏈片段。該法對已知 和未知的突變位點(diǎn)均可以檢測，敏感性在5%左右，但檢測過程中需要打開反應(yīng)管，容易造 成污染，而且陽性結(jié)果不能確認(rèn)其具體未知，最終還需測序確認(rèn)。
[0007] (3)高分辨率熔解曲線（HRM)。高分辨率熔解曲線是基于核酸的物理性質(zhì)，通過飽 和染料結(jié)合于PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，監(jiān)控產(chǎn)物熔解曲線的變化分析基因突變。檢測敏感性在5%左 右，對于陽性結(jié)果并不能確定其具體位置，最終還需要通過測序加以確認(rèn)。
[0008] (4)探針擴(kuò)增阻滯突變法（ARMS)。利用PCR引物的3'端末位堿基必須與其模板 DNA互補(bǔ)才能有效擴(kuò)增的原理，設(shè)計針對突變位點(diǎn)的特異性PCR擴(kuò)增引物，在嚴(yán)格的條件 下，只有在引物3'堿基與模板配對時PCR擴(kuò)增反應(yīng)才能正常進(jìn)行，從而檢測出突變。通過 設(shè)計兩個5'端引物，一個與正常DNA互補(bǔ)，一個與突變DNA互補(bǔ)，對于純和性突變，分別加 入兩種引物及3'端引物進(jìn)行兩個平行的PCR，結(jié)合有與突變DNA完全互補(bǔ)的引物才可以延 伸并得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，該檢測方法的靈敏度在1 %左右。
[0009] (5)等位基因特異的Taqman聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（CAST-PCR)。CAST-PCR法采用優(yōu)化 TaqMan探針，通過一段特異設(shè)計的MGB探針來阻止引物與野生型DNA結(jié)合，選擇性的優(yōu)先擴(kuò) 增突變型DNA，該檢測方法的靈敏度在0. 1?1%左右。
[0010] 但這些技術(shù)的靈敏度都不高，檢測的特異性差，誤診率高，不能滿足對腸癌檢測的 需求。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的目的是提供一種腸癌熱點(diǎn)基因無創(chuàng)檢測的組合物，該組合物及其使用方 法特異性強(qiáng)且靈敏度高。
[0012] 為達(dá)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種檢測腸癌熱點(diǎn)基因突變位點(diǎn)的組合物， 所述組合物包括SEQ N0 :1至SEQ N0 :17的引物序列，還包括SEQ N0 :18至SEQ N0 :21的 block序列。
[0013] 其中，所述組合物在用于PCR擴(kuò)增時的反應(yīng)體系為：1?10XPCR緩沖液、0. 1? ImM dNTPs、0.1 ?luM正向引物、0.1 ?ΙμΜ反向引物、0.1 ?2μΜ block、0.05?2ng/ μ L 模版 DNA、Eva Green 染料 0· 5 ?2 μ L、0. 01 ?0· 10U/ μ 1 TaqDNA 聚合酶、1 ?5mM 氯 化鎂。
[0014] 其中，所述block序列為PCR擴(kuò)增反應(yīng)中所用，是一段與野生型DNA序列完全匹配 的可偏向性擴(kuò)增突變DNA序列的突變型特異性引物。
[0015] 其中，所述模板DNA濃度可以低至0. 1?lng/μ L。
[0016] 其中，所述腸癌熱點(diǎn)基因?yàn)镵RAS、BRAF、PIK3CA基因野生型和KRAS、BRAF、PIK3CA 基因突變型。
[0017] 其中，所述 KRAS、BRAF、PIK3CA 基因包含 G12R、G12S、G12C、G12A、G12D、G12V、G13D、 E542K、E545K、E545D、H1047L、H1047R、H1047、V600E。
[0018] 本發(fā)明還提供了一種檢測腸癌熱點(diǎn)基因突變位點(diǎn)的組合物的使用方法，所述使用 方法的步驟為：
[0019] 第一步：將待測樣品、陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品和無模版對照進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)， 其中所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)以待測DNA為模板，設(shè)計針對目的基因突變位點(diǎn)的特異性引物，同時 加入LNA鎖核酸修飾，通過對待測DNA樣品中的目的基因進(jìn)行偏向性PCR擴(kuò)增反應(yīng)；
[0020] 第二步：根據(jù)儀器檢測結(jié)果中Ct值和MeltCure的判讀，判斷所述待測樣品中目的 基因的突變情況。
[0021] 其中，通過PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果中擴(kuò)增曲線和熔解曲線主峰來鑒別DNA特定突變。
[0022] 其中，所述根據(jù)Ct值和MeltCure的判讀來判斷待測樣品中目的基因的突變情況， 其具體步驟為：
[0023] 1).運(yùn)行CT值的計算，無模板對照應(yīng)無特異擴(kuò)增，或僅引物二聚體導(dǎo)致的熒光信 號增強(qiáng)；當(dāng)Ct值> 45. 0時，表明無模板對照有微弱的擴(kuò)增，對試驗(yàn)的影響極微，可以繼續(xù)分 析試驗(yàn)情況；
[0024] 2).運(yùn)行內(nèi)控，一般Ct值< 40. 0,可以繼續(xù)分析，如果Ct值彡40. 0,則說明樣品 DNA降解嚴(yán)重，不適合試驗(yàn)需要；
[0025] 3).運(yùn)行陽性質(zhì)控品，陽性質(zhì)控的Ct值<45.0,熔解曲線最高峰的Tm值在相應(yīng)突 變的范圍內(nèi)，說明試驗(yàn)體系正常，可以繼續(xù)分析試驗(yàn)結(jié)果；
[0026] 4).符合上述條件，運(yùn)行Tm calling程序，通過烙解曲線分析和Ct值，判讀樣本是 否存在突變：運(yùn)行Tm calling程序，若樣本熔解曲線最高峰的Tm值在相應(yīng)突變的范圍內(nèi)， 并且Ct<45,表明擴(kuò)增區(qū)段發(fā)生突變；若樣本存在以下三種情況之一，則判斷為陰性：a，無 擴(kuò)增；b，有擴(kuò)增，Ct > 45 ;c，有擴(kuò)增，Ct < 45,但是運(yùn)行Tm calling程序，熔解曲線最高峰 的Tm值不在相應(yīng)突變的范圍內(nèi)；
[0027] 5).如果不符合上述第1、3項要求，建議重做本次實(shí)驗(yàn)；如果不符合第2項要求， 建議重新從樣本中提取DNA，再次檢測。
[0028] 其中，所述待測樣品為人類基因組DNA，所述陽性質(zhì)控品為含有KRAS、BRAF、 PIK3CA基因突變的混合質(zhì)粒或者純合質(zhì)粒，所述陰性質(zhì)控品為不含有KRAS、BRAF、PIK3CA 基因突變的混合質(zhì)?；蛘呒兒腺|(zhì)粒。
[0029] 其中，所述待測DNA樣品為人類正常DNA、細(xì)胞DNA、腫瘤組織基因組DNA、外周血細(xì) 胞DNA、外周血血清或血漿DNA、體液DNA或排泄物細(xì)胞DNA。
[0030] 其中，所述腸癌熱點(diǎn)基因?yàn)镵RAS、BRAF、PIK3CA基因野生型和KRAS、BRAF、PIK3CA 基因突變型。
[0031] 其中，所述 KRAS、BRAF、PIK3CA 基因包含 G12R、G12S、G12C、G12A、G12D、G12V、G13D、 E542K、E545K、E545D、H1047L、H1047R、H1047、V600E。
[0032] 其中，所述樣品的DNA濃度可以低至0. 1?lng/μ L。
[0033] 其中，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)的具體過程分為2個階段：
[0034] (1)擴(kuò)增反應(yīng)，92?97°C預(yù)變性5?15分鐘，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增階段，92?97°C 變性10?20s，50?65°C退火10?30s，70?75°C延伸10?35s，并進(jìn)行35?55個循 環(huán)；
[0035] (2)做熔解曲線，92?97°C預(yù)變性0· 2?5分鐘，20?55°C退火0· 2?5分鐘， 60?97°C采集熒光，每秒采集熒光10?30次。
[0036] 本發(fā)明所用引物序列和block序列如表1和表2所示。
[0037] 表1 KRAS、BRAF、PIK3CA熱點(diǎn)基因檢測引物序列
[0038]

【權(quán)利要求】
1. 一種檢測腸癌熱點(diǎn)基因突變位點(diǎn)的組合物，其特征在于，所述組合物包括SEQ NO :1 至SEQ NO :17的引物序列，還包括SEQ NO :18至SEQ NO :21的block序列。
2. 如權(quán)利要求1所述的檢測腸癌熱點(diǎn)基因突變位點(diǎn)的組合物，其特征在于，所述組合 物在用于PCR擴(kuò)增時的反應(yīng)體系為：1?10XPCR緩沖液、0. 1?ImM dNTPs、0. 1?luM正 向引物、〇· 1 ?1 μΜ反向引物、0· 1 ?2μΜ block、0. 05 ?2ng/y L 模版DNA、Eva Green染 料 0· 5 ?2 μ L、0. 01 ?0· 10U/ μ 1 TaqDNA 聚合酶、1 ?5mM 氯化鎂。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的檢測腸癌熱點(diǎn)基因突變位點(diǎn)的組合物，其特征在于，所述 block序列為PCR擴(kuò)增反應(yīng)中所用，是一段與野生型DNA序列完全匹配的可偏向性擴(kuò)增突變 DNA序列的突變型特異性引物。
4. 如權(quán)利要求1?3所述的檢測腸癌熱點(diǎn)基因突變位點(diǎn)的組合物的使用方法，其特征 在于，所述使用方法的步驟為： 第一步：將待測樣品、陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品和無模版對照進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，其中， 所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)以待測DNA為模板，設(shè)計針對目的基因突變位點(diǎn)的特異性引物，同時加入 LNA鎖核酸修飾，通過對待測DNA樣品中的目的基因進(jìn)行偏向性PCR擴(kuò)增反應(yīng)； 第二步：根據(jù)儀器檢測結(jié)果中Ct值和MeltCure的判讀，判斷所述待測樣品中目的基因 的突變情況。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測腸癌熱點(diǎn)基因突變位點(diǎn)的組合物的使用方法，其特征在 于，通過PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果中擴(kuò)增曲線和熔解曲線主峰來鑒別DNA特定突變。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測腸癌熱點(diǎn)基因突變位點(diǎn)的組合物的使用方法，其特征在 于，所述根據(jù)Ct值和MeltCure的判讀來判斷待測樣品中目的基因的突變情況，其具體步驟 為： 1) .運(yùn)行CT值的計算，無模板對照應(yīng)無特異擴(kuò)增，或僅引物二聚體導(dǎo)致的熒光信號增 強(qiáng)；當(dāng)ct值> 45. 0時，表明無模板對照有微弱的擴(kuò)增，對試驗(yàn)的影響極微，可以繼續(xù)分析試 驗(yàn)情況； 2) .運(yùn)行內(nèi)控，一般Ct值< 40. 0,可以繼續(xù)分析，如果Ct值彡40. 0,則說明樣品DNA降 解嚴(yán)重，不適合試驗(yàn)需要； 3) .運(yùn)行陽性質(zhì)控品，陽性質(zhì)控的Ct值< 45. 0,熔解曲線最高峰的Tm值在相應(yīng)突變的 范圍內(nèi)，說明試驗(yàn)體系正常，可以繼續(xù)分析試驗(yàn)結(jié)果； 4) .符合上述條件，運(yùn)行Tm calling程序，通過熔解曲線分析和Ct值，判讀樣本是否 存在突變：運(yùn)行Tm calling程序，若樣本熔解曲線最高峰的Tm值在相應(yīng)突變的范圍內(nèi)，并 且Ct < 45,表明擴(kuò)增區(qū)段發(fā)生突變；若樣本存在以下三種情況之一，則判斷為陰性：a，無擴(kuò) 增；b，有擴(kuò)增，Ct > 45 ;c，有擴(kuò)增，Ct < 45,但是運(yùn)行Tm calling程序，熔解曲線最高峰的 Tm值不在相應(yīng)突變的范圍內(nèi)； 5) .如果不符合上述第1、3項要求，建議重做本次實(shí)驗(yàn)；如果不符合第2項要求，建議 重新從樣本中提取DNA，再次檢測。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測腸癌熱點(diǎn)基因突變位點(diǎn)的組合物的使用方法，其特征在 于，所述待測樣品為人類基因組DNA，所述陽性質(zhì)控品為含有KRAS、BRAF、PIK3CA基因突變 的混合質(zhì)?；蛘呒兒腺|(zhì)粒，所述陰性質(zhì)控品為不含有KRAS、BRAF、PIK3CA基因突變的混合 質(zhì)?；蛘呒兒腺|(zhì)粒。
8. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測腸癌熱點(diǎn)基因突變位點(diǎn)的組合物的使用方法，其特征在 于，所述待測DNA為人類正常DNA、細(xì)胞DNA、腫瘤組織基因組DNA、外周血細(xì)胞DNA、外周血 血清或血漿DNA、體液DNA或排泄物細(xì)胞DNA。
9. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測腸癌熱點(diǎn)基因突變位點(diǎn)的組合物的使用方法，其特征在 于，所述腸癌熱點(diǎn)基因?yàn)镵RAS、BRAF、PIK3CA基因野生型和KRAS、BRAF、PIK3CA基因突變型。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測腸癌熱點(diǎn)基因突變位點(diǎn)的組合物的使用方法，其特征 在于，所述 KRAS、BRAF、PIK3CA 基因包含 G12R、G12S、G12C、G12A、G12D、G12V、G13D、E542K、 E545K、E545D、H1047L、H1047R、H1047、V600E。
11. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測腸癌熱點(diǎn)基因突變位點(diǎn)的組合物的使用方法，其特征 在于，所述樣品的DNA濃度可以低至0. 1?Ing/yL。
12. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測腸癌熱點(diǎn)基因突變位點(diǎn)的組合物的使用方法，其特征 在于，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)的具體過程分為2個階段： (1) 擴(kuò)增反應(yīng)，92?97°C預(yù)變性5?15分鐘，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增階段，92?97°C變 性10?20s，50?65°C退火10?30s，70?75°C延伸10?35s，并進(jìn)行35?55個循環(huán)； (2) 做熔解曲線，92?97°C預(yù)變性0· 2?5分鐘，20?55°C退火0· 2?5分鐘，60? 97 °C采集熒光，每秒采集熒光10?30次。
【文檔編號】C12N15/11GK104099422SQ201410345693
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年7月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月18日
【發(fā)明者】王弢, 李宗飛, 張利清, 張麗, 樂飚, 徐維琛 申請人:普世華康江蘇醫(yī)療技術(shù)有限公司